SIST ISO 11350:2013

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11350
First edition
2012-05-15
Water quality — Determination of the
genotoxicity of water and waste water —
Salmonella/microsome fluctuation test
(Ames fluctuation test)
Qualité de l’eau — Évaluation de la génotoxicité des eaux résiduaires —
Essai de Salmonella/microsome (essai d’Ames-fluctuation)
Reference number
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ISO 2012
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Published in Switzerland
ii © ISO 2012 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 Interferences . 3
5 Principle . 4
6 Apparatus and materials . 4
7 Reagents, media and dilutions . 5
8 Sampling and samples . 9
9 Procedure . 9
9.1 Overnight culture . 9
9.2 Preparation of S9 mix .10
9.3 Testing of water samples .10
9.4 Measurement of revertant growth .13
9.5 Calculation of cytotoxicity .13
10 Validity criteria .14
11 Assessment criteria .14
12 Test report .14
Annex A (normative) Nutrient broth and agar .15
Annex B (normative) Preparation of ampicillin agar plates and stock cultures.16
Annex C (normative) Checking of genotype .17
Annex D (normative) S9 fraction .18
Annex E (informative) Example for application of samples on a 24 well plate .19
Annex F (informative) Example for reporting .21
Annex G (informative) Testing of chemicals .22
Annex H (informative) Precision data.25
Annex I (informative) Statistical assessment .27
Annex J (informative) Measurement of the lowest ineffective dilution (LID) of a waste water —
A simplified evaluation for testing of waste water .33
Annex K (informative) Use of additional tester strains .35
Bibliography .36
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International
Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 11350 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 11350:2012(E)
Water quality — Determination of the genotoxicity of water and
waste water — Salmonella/microsome fluctuation test (Ames
fluctuation test)
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This standard does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with
its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to
ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this International Standard
be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of the genotoxic potential of water and
waste water using the bacterial strains Salmonella enterica subsp. enterica serotype Typhimurium TA 98 and
TA 100 in a fluctuation assay. This combination of strains is able to measure the genotoxicity of chemicals that
induce point mutations (base pair substitutions and frameshift mutations) in genes coding for enzymes that are
involved in the biosynthesis of the amino acid, histidine.
[8]
NOTE 1 ISO 13829 applies for the measurement of genotoxicity of samples containing DNA-crosslinking agents.
This method is applicable to:
— fresh water;
— waste water;
— aqueous extracts and leachates;
— eluates of sediments (fresh water);
— pore water;
— aqueous solutions of single substances or of chemical mixtures;
— drinking water.
NOTE 2 When testing drinking water, extraction and pre-concentration of water samples can prove necessary.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are indispensable
for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition
of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 7027, Water quality — Determination of turbidity
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
cofactor solution
aqueous solution of chemicals (e.g. NADP, glucose-6-phosphate, and inorganic salts) needed for the activity
of the enzymes in the S9 fraction
[10]
[Source: ISO 21427-2:2006, definition 3.2]
3.2
culture medium
nutrients presented in a form and phase (liquid or solidified) which support microbiological growth
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004, definition 24]
3.3
dilution level
D
denominator of the dilution coefficient (using the numerator 1) of a mixture of water or waste water with dilution
water as integral number
NOTE 1 to entry: For undiluted water or waste water, this coefficient per definition is 1→1. [In this International Standard,
the arrow indicates the transition from initial total volume to final total volume.] The corresponding and smallest possible
value of D is 1.
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004, definition 28]
3.4
lowest ineffective dilution
LID
lowest dilution within a test batch which does not show any effect, i.e. no statistically significant increase in the
number of revertant wells compared with the negative control
NOTE 1 to entry: LID is determined for each incubation condition (strain, ±S9 mix). The highest LID value is decisive for
the overall assessment.
3.5
induction rate
difference between the mean value of wells with revertant growth counted on the plates treated with a dose
of the test sample or with a positive control, and the mean value of the corresponding wells treated with the
negative control using the same strain under identical conditions
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004, definition 43, modified: “wells with revertant growth” replaces “mutant colonies”;
“corresponding wells” replaces “corresponding plates”]
3.6
inoculum
fraction of a culture of microorganisms used to start a new culture, or an exponentially growing preculture,
in fresh medium
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004, definition 44]
3.7
negative control
dilution water without test sample
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004, definition 51]
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3.8
revertant growth
visible mutant colonies on the microplate at the end of the respective test
3.9
overnight culture
culture started late in the afternoon and incubated overnight (usually about 16 h) to be ready during the following
morning for purposes such as the inoculation of a preculture
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004, definition 54]
NOTE 1 to entry For specification, see 9.1.
3.10
positive control
any well characterized material and/or substance, which, when evaluated by a specific test method, demonstrates
the suitability of the test system to yield a reproducible, appropriate positive or negative response in the test system
[7]
[Source: ISO 10993-12:—, definition 3.12]
NOTE 1 to entry The positive controls mentioned in this International Standard are dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO)
prior to use. For the purposes of this International Standard, the positive controls are known mutagens which are suitable
for the verification of the sensitivity of the method and/or the activity of the S9 mix.
3.11
S9 fraction
supernatant at 9 000g of a tissue homogenate in 0,15 mol/l KCl, obtained from livers of male rats (200 g to
300 g) pretreated with a substance or substance combination appropriate for enzyme induction
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004, definition 74]
3.12
S9 mix
mixture of S9 fraction and cofactor solution
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004, definition 75]
3.13
stock culture
culture of a strain of organisms maintained under conditions to preserve original features such as
nucleotide sequences
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004, definition 87]
3.14
test sample
undiluted, diluted or otherwise prepared portion of a sample to be tested, after completion of all preparation
steps such as centrifugation, filtration, homogenization, pH adjustment and determination of ionic strength
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004, definition 92]
4 Interferences
Bacteriotoxic effects of the test sample can lead to a reduction of viable bacteria and to a reduction of wells with
revertants due to a repression of revertant growth.
This method includes sterile filtration of water and waste water prior to the test. Due to this filtration, solid
particles are separated from the test sample. Thus, there is a possibility that genotoxic substances adsorbed
on particles are not detected.
5 Principle
The bacteria are exposed under defined conditions to various concentrations of the test sample and incubated
for 100 min at 37 °C ± 1 °C in 24 well plates. Due to this exposure, genotoxic agents enclosed in the test sample
can induce mutations in one or both marker genes of the bacterial strains used (hisG46 for TA 100 and hisD3052
for TA 98) in correlation with the applied concentrations. Induction of mutations causes a concentration-related
increase in the number of mutant colonies.
After exposure of the bacteria, reversion indicator medium (7.40), containing
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 11350
Première édition
2012-05-15
Qualité de l’eau — Évaluation de la
génotoxicité des eaux résiduaires —
Essai de Salmonella/microsome (essai
d’Ames-fluctuation)
Water quality — Determination of the genotoxicity of water and waste
water — Salmonella/microsome fluctuation test (Ames fluctuation test)
Numéro de référence
©
ISO 2012
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de l’ISO à l’adresse ci-après ou du comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Web www.iso.org
Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Interférences . 3
5 Principe . 4
6 Appareillage et matériaux . 4
7 Réactifs, milieux et dilutions . 5
8 Échantillonnage et échantillons .10
9 Mode opératoire .10
9.1 Culture d’une nuit .10
9.2 Préparation du mélange S9 .10
9.3 Essais des échantillons d’eau . 11
9.4 Mesure de la croissance des révertants .13
9.5 Calcul de la cytotoxicité .14
10 Critères de validité .14
11 Critères d’évaluation .14
12 Rapport d’essai .14
Annexe A (normative) Bouillon nutritif et gélose .16
Annexe B (normative) Préparation des plaques de gélose à l’ampicilline et des cultures mères .17
Annexe C (normative) Vérification du génotype .18
Annexe D (normative) Fraction S9 .19
Annexe E (informative) Exemple d’application d’échantillons sur une plaque à 24 puits.20
Annexe F (informative) Exemple de rapport .22
Annexe G (informative) Essai des substances chimiques .23
Annexe H (informative) Données de fidélité .26
Annexe I (informative) Évaluation statistique .28
Annexe J (informative) Mesure de la plus faible dilution sans effet (LID) d’une eau résiduaire —
Évaluation simplifiée des essais portant sur les eaux résiduaires .34
Annexe K (informative) Utilisation de souches de contrôle supplémentaires .36
Bibliographie .37
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits
de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir
identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 11350 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
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NORME INTERNATIONALE ISO 11350:2012(F)
Qualité de l’eau — Évaluation de la génotoxicité des eaux
résiduaires — Essai de Salmonella/microsome (essai
d’Ames-fluctuation)
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale connaisse bien
les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n’a pas pour but de traiter
tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur
d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité, et de s’assurer de la conformité
à la réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément à la présente Norme
internationale soient exécutés par un personnel ayant reçu une formation adéquate.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode d’évaluation de la génotoxicité des eaux résiduaires
en utilisant les souches bactériennes Salmonella enterica subsp. enterica sérotype Typhimurium TA 98 et
TA 100 au cours d’un essai en fluctuation. Cette combinaison de souches permet d’évaluer la génotoxicité des
substances chimiques qui produisent des mutations ponctuelles (substitutions de paires de base et mutations
de changement de phase) dans les gènes codant pour les enzymes impliquées dans la biosynthèse de l’acide
aminé histidine.
[8]
NOTE 1 L’ISO 13829 est applicable pour la détermination de la génotoxicité des échantillons contenant des agents
de réticulation de l’ADN.
Cette méthode est applicable aux substances suivantes:
— eau douce;
— eaux résiduaires;
— extraits aqueux et lixiviats;
— éluats de sédiments (eau douce);
— eau interstitielle;
— solutions aqueuses contenant des substances uniques ou des mélanges chimiques;
— eau potable.
NOTE 2 Lors de l’analyse de l’eau potable, il peut être nécessaire d’extraire et de préconcentrer les échantillons d’eau.
2 Références normatives
Les documents suivants, en tout ou partie, sont référencés de manière normative dans le présent document
et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
ISO 7027, Qualité de l’eau — Détermination de la turbidité
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
solution de cofacteurs
solution aqueuse de produits chimiques (par exemple NADP, glucose-6-phosphate et sels inorganiques)
nécessaires à l’activité des enzymes de la fraction S9
[10]
[Source: ISO 21427-2:2006 , définition 3.2]
3.2
milieu de culture
substances nutritives se présentant sous une forme et une phase (liquide ou solidifiée) favorisant la croissance
microbiologique
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004 , définition 24]
3.3
niveau de dilution
D
dénominateur du coefficient de dilution (le numérateur étant 1) d’un mélange d’eau ou d’eaux résiduaires et
d’eau de dilution en tant que nombre entier
NOTE 1 à l’article: Pour de l’eau ou pour des eaux résiduaires non diluées, ce coefficient est, par définition, égal à
1→1. [Dans la présente Norme internationale, la flèche indique la transition de volume total initial à volume total final.] La
valeur D correspondante la plus petite possible est 1.
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004 , définition 28]
3.4
plus faible dilution sans effet
LID
plus faible dilution dans un lot d’essai qui ne présente aucun effet, c’est-à-dire aucune augmentation
statistiquement significative du nombre de puits de révertants par rapport au témoin négatif
NOTE 1 à l’article: La LID est déterminée pour chaque condition d’incubation (souche, ± mélange S9). La valeur
LID maximale est décisive pour l’évaluation globale.
3.5
taux d’induction
différence entre la valeur moyenne des puits avec croissance de révertants dénombrés sur les plaques et
traités avec une dose de l’échantillon pour essai ou avec un témoin positif, ainsi que des puits correspondants
traités avec le témoin négatif en utilisant la même souche, dans les mêmes conditions
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004 , définition 43, modifiée: “puits avec croissance de révertants dénombrés” remplace
“colonies mutantes dénombrées”; “puits correspondants” remplace “plaques correspondantes”]
3.6
inoculum
fraction d’une culture de micro-organismes utilisée pour démarrer une nouvelle culture ou une préculture à
croissance exponentielle dans un nouveau milieu de culture
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004 , définition 44]
3.7
témoin négatif
eau de dilution sans l’échantillon pour essai
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004 , définition 51]
2 © ISO 2012 – Tous droits réservés

3.8
croissance de révertants
colonies mutantes visibles sur la microplaque à la fin de l’essai respectif
3.9
culture d’une nuit
culture commencée en fin d’après-midi et dont l’incubation dure toute une nuit (généralement environ 16 h), afin
qu’elle puisse être utilisée le matin suivant à des fins, par exemple, d’inoculation d’une préculture
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004 , définition 54]
NOTE 1 à l’article: Pour les spécifications, voir 9.1.
3.10
témoin positif
matériau et/ou substance bien caractérisés qui, lors d’essais réalisés selon un mode opératoire spécifique,
démontrent l’aptitude du système à fournir une réponse positive ou négative reproductible lors de
l’expérimentation
[7]
[Source: ISO 10993-12:— , définition 3.12]
NOTE 1 à l’article: Les témoins positifs mentionnés dans la présente Norme internationale sont dissous dans du
diméthylsulfoxyde (DMSO) avant utilisation. Pour les besoins de la présente Norme internationale, les témoins positifs
sont des mutagènes connus pour vérifier la sensibilité de la méthode et/ou l’activité du mélange S9.
3.11
fraction S9
surnageant à 9 000g d’un homogénat de tissus dans du KCl à 0,15 mol/l, obtenu à partir de foies de rats mâles (200 g
à 300 g), prétraités avec une substance ou une combinaison de substances appropriée pour l’induction d’enzymes
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004 , définition 74]
3.12
mélange S9
mélange de la fraction S9 et de la solution de cofacteurs
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004 , définition 75]
3.13
culture mère
culture d’une souche d’organismes maintenue dans certaines conditions afin de conserver ses caractéristiques
d’origine, telles que les séquences des nucléotides
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004 , définition 87]
3.14
échantillon pour essai
portion non diluée, diluée ou préparée autrement d’un échantillon soumis à essai, après exécution de toutes
les étapes de préparation, telles que la centrifugation, la filtration, l’homogénéisation, l’ajustement du pH et la
détermination de la force ionique
[6]
[Source: ISO 6107-6:2004 , définition 92]
4 Interférences
Les effets bactériotoxiques de l’échantillon pour essai peuvent entraîner une réduction du nombre de bactéries
viables et des puits contenant des révertants, en raison d’une répression de la croissance des révertants.
Cette méthode inclut la filtration stérile de l’eau et des eaux résiduaires avant essai
...