SIST ISO 16266-2:2019

SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 16266-2:2019
01-maj-2019
Kakovost vode - Ugotavljanje prisotnosti in števila Pseudomonas aeruginosa - 2.
del: Metoda najverjetnejšega števila
Water quality - Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa - Part 2: Most
probable number method
Qualité de l'eau - Recherche et dénombrement de Pseudomonas aeruginosa - Partie 2:
Méthode du nombre le plus probable
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 16266-2:2018
ICS:
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
SIST ISO 16266-2:2019 en
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.

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SIST ISO 16266-2:2019

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SIST ISO 16266-2:2019
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16266-2
First edition
2018-07
Water quality — Detection and
enumeration of Pseudomonas
aeruginosa —
Part 2:
Most probable number method
Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement de Pseudomonas
aeruginosa —
Partie 2: Méthode du nombre le plus probable
Reference number
ISO 16266-2:2018(E)
©
ISO 2018

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SIST ISO 16266-2:2019
ISO 16266-2:2018(E)

COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2018
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Published in Switzerland
ii © ISO 2018 – All rights reserved

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ISO 16266-2:2018(E)
Contents Page
Foreword . v
Introduction . vi
1  Scope . 1
2  Normative references . 1
3  Terms and definitions . 2
4  Principle . 2
5  Apparatus and gla sswa r e . 2
6  Culture media, diluents and reagents . 3
6.1  Basic materials . 3
6.2  Diluent . 3
6.3  Antifoam B . 3
7  Sampling . 4
8  Procedure . 4
8.1  Transport and storage of the samples . 4
8.2  Preparation of the sample and inoculation of media . 4
8.2.1  Preparation of 100 ml samples . 4
8.2.2  Preparation of 250 ml samples . 4
8.3  Incubation and differentiation . 4
8.4  Examination of results . 5
9  Expression of results . 5
10  Quality assurance . 5
11  Test report . 5
Annex A (informative) Further microbiological information about Pseudomonas
aeruginosa . 7
Annex B (normative) The Quanti-Tray Sealer and calculation of results . 8
Annex C (normative) Composition of the Pseudalert medium . 120
Annex D (informative) Performance characteristics . 121
Bibliography . 122
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SIST ISO 16266-2:2019
ISO 16266-2:2018(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national
standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally
carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a
technical committee has been established has the right to be represented on that committee.
International organizations, governmental and non‐governmental, in liaison with ISO, also take part in
the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,
Microbibiological methods.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
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SIST ISO 16266-2:2019
ISO 16266-2:2018(E)
Introduction
Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen of man that is capable of growth in water at very
low nutrient concentrations. At source and during marketing, a natural mineral water or a spring water
is to be free from Pseudomonas aeruginosa in any 250 ml sample examined (see, for example, Council
Directive 2009/54/EC, Reference [1]). Other bottled waters offered for sale are also to be free of
Pseudomonas aeruginosa in any 250 ml sample (see e.g. Council Directive 98/83/EC, Reference [2]).
Other waters, including swimming and spa pool waters, water for human consumption and hospital
waters, may sometimes be tested for Pseudomonas aeruginosa for reasons of public health. In these
cases, it is typical to examine 100 ml volumes.
The method described in this document can be applied to a range of types of water, for example,
hospital waters, drinking water and non‐carbonated bottled waters intended for human consumption,
groundwater, swimming pool and spa pool waters including those containing high background counts
of heterotrophic bacteria (see References [3], [4], [5], [6] and [7]).
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SIST ISO 16266-2:2019

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SIST ISO 16266-2:2019
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16266‐2:2018(E)

Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas
aeruginosa — Part 2: Most probable number method
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document
are carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This document specifies a method for the enumeration of Pseudomonas aeruginosa in water. The
method is based on the growth of target organisms in a liquid medium and calculation of the most
probable number (MPN) of organisms by reference to MPN tables.
This document is applicable to a range of types of water. For example, hospital waters, drinking water
and non‐carbonated bottled waters intended for human consumption, groundwater, swimming pool
and spa pool waters including those containing high background counts of heterotrophic bacteria.
This document does not apply to carbonated bottled waters, flavoured bottle waters, cooling tower
waters or marine waters, for which the method has not been validated. These waters are, therefore,
outside the scope of this document. Laboratories can employ the method presented in this document
for these matrices by undertaking appropriate validation of performance of this method prior to use.
The test is based on a bacterial enzyme detection technology that signals the presence of P. aeruginosa
through the hydrolysis of a 7‐amino‐4‐methylcoumarin aminopeptidase substrate present in a special
reagent. P. aeruginosa cells rapidly grow and reproduce using the rich supply of amino acids, vitamins
and other nutrients present in the reagent. Actively growing strains of P. aeruginosa have an enzyme
that cleaves the 7‐amido‐coumarin aminopeptidase substrate releasing a product which fluoresces
under ultraviolet (UV) light. The test described in this document provides a confirmed result within
24 h with no requirement for further confirmation of positive wells.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 8199, Water quality — General guide to the enumeration of micro-organisms by culture
ISO 11133, Microbiology of food, animal feeding stuffs, food production, environment and water —
Preparation, production, storage and performance testing of culture media
ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis
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SIST ISO 16266-2:2019
ISO 16266-2:2018(E)
ISO/IEC Guide 2, Standardization and related activities — General vocabulary
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO/IEC Guide 2 and the following
apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https://www.iso.org/obp
— IEC Electropedia: available at http://www.electropedia.org/
3.1
Pseudomonas aeruginosa
species of microorganism that is capable of growing in a selective broth and capable of hydrolyzing a
diagnostic 7‐amino‐4‐methylcoumarin aminopeptidase substrate present in the reagent
Note 1 to entry: See Annex A for further information on P. aeruginosa.
4 Principle
A snap pack of dehydrated medium is added to a sample of water (100 ml or 250 ml), or to a dilution of
a sample made up to 100 ml. Sample plus medium is gently shaken to ensure adequate mixing and to
afford dissolution of the medium. When enumeration is required, the sample plus medium (100 ml) is
1) 1)
then aseptically poured into either a Quanti‐Tray or Quanti‐Tray/2000 to enumerate up to 201
organisms or 2 419 organisms respectively per 100 ml sample. The procedure for the enumeration of
1) 1)
250 ml samples is described in 8.2. Trays are sealed with a Quanti‐Tray Sealer. Quanti‐Trays or
vessels (for presence/absence tests) are then incubated at (38 ± 0,5) °C for 24 h to 28 h. Results are
confirmed at 24 h but may be read up to 28 h.
1)
After incubation, vessels or Quanti‐Tray sample wells that exhibit any degree of blue fluorescence
under long wavelength ultraviolet light (365 nm) are considered positive for P. aeruginosa.
By means of statistical tables, or a simple computer program, the MPN of P. aeruginosa in 100 ml or
250 ml of the sample can be determined.
This method is also suitable as a qualitative procedure.
5 Apparatus and glassware
Usual microbiological laboratory equipment, and, in particular, the following equipment.



1)
Quanti‐Tray is a trademark or registered trademark of IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the United
States and/or other countries. This information is given for the convenience of users of this document and does
not constitute an endorsement by ISO of this product.
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ISO 16266-2:2018(E)
5.1 Apparatus for sterilization by steam (autoclave).
Apparatus and glassware not supplied sterile shall be sterilized according to the instructions given in
ISO 8199.
5.2 Hot air oven, for dry heat sterilization.
5.3 Incubator, thermostatically controlled at (38 ± 0,5) °C.
1)
5.4 Quanti-Tray sealer and rubber insert.
5.5 Sterile wide mouthed vessels of at least 110 ml.
5.6 Ultraviolet lamp, 365 nm, 6 watt, long wavelength.
1) 1)
5.7 Quanti-Tray or Quanti-Tray/2000 , in accordance with Annex B.
6 Culture media, diluents and reagents
6.1 Basic materials
2)
The method utilises Pseudalert , a medium available as a ready‐to‐use powder dispensed in snap
packs. Each snap pack contains sufficient medium (2,45 g for 100 ml samples) for a single test. For
quantitative enumeration of 250 ml samples, one snap pack of 2,45 g is added to each aliquot of divided
2)
sample as described in 8.2. The Pseudalert reagent should be tan in colour and free flowing. The
medium contains nutrients such as amino acids and vitamins, buffer, sodium chloride, magnesium
sulfate, growth indicators, antibiotics and nitrogen sources. The medium is stored under ambient
conditions (2 °C to 30 °C) out of direct sunlight and should be used before the expiry date listed on the
snap pack. The reagent has a shelf‐life of 12 months from the date of manufacture.
2)
The composition of the Pseudalert medium shall be in accordance with Annex C. Performance
characteristics for this method are provided in Annex D.
6.2 Diluent
2)
For dilutions to be used with Pseudalert , use only sterile, non‐inhibitory, oxidant‐free water. The use
of buffered, saline or peptone‐containing diluents interferes with the performance of the test.
6.3 Antifoam B
Antifoam B used as a 1 % active, water soluble suspension of silicone. This reagent is added to samples
in order to minimize the formation of air bubbles during mixing.
NOTE Vessels already containing antifoam are available.

2)
Pseudalert is a trademark or registered trademark of IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the United
States and/or other countries. This information is given for the convenience of users of this document and does
not constitute an endorsement by ISO of this product.
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SIST ISO 16266-2:2019
ISO 16266-2:2018(E)
7 Sampling
Carry out the collection, preservation and handling of samples as specified in ISO 19458.
8 Procedure
8.1 Transport and storage of the samples
Samples should be transported and stored in accordance with ISO 19458. Analysis should be
commenced on the day of collection or within 12 h. Under exceptional circumstances, the samples may
be kept at (5 ± 3) °C for up to 24 h prior to examination. In this case, the storage time shall be reported
in the test report.
8.2 Preparation of the sample and inoculation of media
8.2.1 Preparation of 100 ml samples
2)
For enumeration of 100 ml samples, aseptically add a single snap pack of Pseudalert medium to each
100 ml volume of sample or dilution of sample in a sterile, transparent vessel and mix well. When the
medium is completely dissolved, the sample plus medium is aseptically poured into either a Quanti‐
1) 1) 1)
or Quanti‐Tray/2000 and then sealed with the Quanti‐Tray Sealer. In order to minimize air
Tray
bubbles within wells, samples can be prepared in pre‐sterilized vessels containing antifoam B.
Alternatively, antifoam B can be added to each vessel using a dropper bottle. An alternative MPN
2)
method is where the water sample in which the Pseudalert has been dissolved is distributed into
sterile tubes for determination of the MPN using a more traditional MPN format (e.g. 1 × 50 ml and
5 × 10 ml).
NOTE The presence of high mineral content (especially magnesium and/or calcium) can cause the
2)
Pseudalert reagent mixture to become cloudy but this does not affect the outcome of the test.
8.2.2 Preparation of 250 ml samples
For enumeration of 250 ml samples, divide the sample into three sterile, transparent vessels with two
samples having aliquots of 100 ml and one sample having an aliquot of 50 ml. Make the 50 ml sample up
to 100 ml by the addition of 50 ml of sterile, non‐inhibitory, oxidant‐free water. Aseptically add a single
2)
snap pack of Pseudalert medium to each of the three 100 ml volumes of sample and mix well. When
the medium is completely dissolved, the three 100 ml volumes of sample plus medium are each
1) 1)
aseptically poured into three separate Quanti‐Tray or Quanti‐Tray/2000 and then sealed with the
1)
Quanti‐Tray Sealer. In order to minimize air bubbles within wells, samples can be prepared in pre‐
sterilized vessels containing antifoam B. Alternatively, antifoam B can be added to each vessel using a
1)
dropper bottle. Appropriate labelling of the three Quanti‐Tray where the tray containing the 50 ml
portion of the sample (i.e. the diluted portion) is clearly distinguishable from the two trays containing
the 100 ml undiluted portions of the sample is essential. This is important for the correct calculation of
the final count.
8.3 Incubation and differentiation
1)
Incubate the inoculated Quanti‐Tray for 24 h to 28 h at (38 ± 0,5) °C for P. aeruginosa.
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4

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SIST ISO 16266-2:2019
ISO 16266-2:2018(E)
8.4 Examination of results
1) 1)
Examine the Quanti‐Tray or Quanti‐Tray/2000 after incubation under UV irradiation (365 nm) in a
dark room or in a chamber that obscures ambient light. Ensure that the UV light is facing away from
your eyes and toward the sample. The efficacy of the UV lamp should be checked regularly using a
fluorescence positive control in accordance with Clause 10. The lamp should also be replaced according
to the manufacturer’s stated lamp life (e.g. 6 000 h) or annually, whichever is sooner. Regard and count
any wells that exhibit any degree of blue fluorescence as positive for P. aeruginosa. For interpretation
purposes compare with a negative control. If there is doubt about the fluorescence for a well at 24 h,
return the tray to the incubator for further incubation without exceeding a maximum incubation time of
1) 1)
28 h. Placing the Quanti‐Tray or Quanti‐Tray/2000 rubber insert over the sample can facilitate
identification of fluorescing wells.
9 Expression of results
1) 1)
From the number of wells on a Quanti‐Tray or Quanti‐Tray/2000 that are positive, the MPN/100 ml
for P. aeruginosa can be calculated by reference to statistical tables or by using a computer MPN
generator program, see Tables B.1 and B.2. For enumeration from 250 ml samples the MPN is calculated
1)
containing undiluted portions of the sample as
using the sum of the counts from the two Quanti‐Tray
1)
one count and the count from the Quanti‐Tray containing the diluted portion of sample as the second
count, see Table B.3.
10 Quality assurance
The laboratory shall have a clearly defined quality control system to ensure that the apparatus, reagents
and techniques are suitable for the test. The use of positive controls, negative controls and blanks is
part of the test.
2)
For the definition of productivity and selectivity refer to ISO 11133. The performance of Pseudalert
shall be tested according to the methods and criteria described in ISO 11133 (see Table 1).
2)
Table 1 — Performance testing of Pseudalert
Reference Method of Characteristic
a
Function Incubation Control strain Criteria
medium control reactions
Productivity 24 h to 28 h/ P. aeruginosa TSA Quantitative PR ≥ 0,5 Blue fluorescence
(38 ± 0,5) °C WDCM 00024 or
WDCM 00025
Selectivity 24 h to 28 h/ P. fluorescens — Qualitative Total No blue
(38 ± 0,5) °C WDCM 00115 inhibition fluorescence
a
Refer to the reference strain catalogue available on http://www.wfcc.info/pdf/WDCM_Reference_Strain_Catalogue.pdf
on culture collection strain numbers and contact details.

11 Test report
The test report shall contain at least the following information:
a) the test method used, together with a reference to this document, i.e. ISO 16266‐2:2018;
b) all information required for the complete identification of the sample;
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SIST ISO 16266-2:2019
ISO 16266-2:2018(E)
c) the results expressed in accordance with Clause 9;
d) any particular occurrence(s) observed during the course of the analysis and any operation(s) not
specified in this document that may have influenced the results.
If, under exceptional circumstances, the sample was kept at (5 ± 3) °C for up to 24 h prior to
examination, the storage time shall be reported in the test report.
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ISO 16266-2:2018(E)
Annex A
(informative)

Further microbiological information about Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa is the type species of the genus Pseudomonas which is the type genus of the
family Pseudomonadaceae of the order Pseudomonadales.
It is a Gram negative, non‐spore forming rod which is oxidase and catalase positive. It exhibits oxidative
metabolism as indicated by the Hugh and Leifson test, generally reduces nitrate beyond the stage of
nitrite and produces ammonia from the breakdown of acetamide. Most strains (98 %) produce a water‐
soluble fluorescing pigment. The majority of strains are able to grow at 42 °C but not at 4 °C which
differentiates P. aeruginosa from P. fluorescens which grows at 4 °C but not at 42 °C.
Gelatin is liquefied, casein is hydrolysed, but starch is not hydrolysed. The pigment pyocyanin (blue‐
green) is produced by more than 90 % of strains of P. aeruginosa.
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SIST ISO 16266-2:2019
ISO 16266-2:2018(E)
Annex B
(normative)

The Quanti-Tray Sealer and calculation of results
B.1 General
1) 1)
The Quanti‐Tray Sealer is a thermal sealing unit that forms a seal between wells in the Quanti‐Tray .
1) 1)
The sealer automatically distributes liquid into the wells of the Quanti‐Tray or Quanti‐Tray/2000 .
1)
The Quanti‐Tray is used when anticipated counts are below 200 MPN/100 ml. The Quanti‐
1)
Tray/2000 can be used to calculate MPN values up to 2 419 MPN/100 ml. When calculating MPN the
tables supplied with the trays and sealers are the reference for all counts. A simple statistical program
can also be used to calculate results. If required, the MPN can be calculated manually according to the
procedures given below.
B.2 Calculation of the most probable number (MPN)
B.2.1 Calculation of MPN for IDEXX Quanti-Tray (51-well)
1)
Quanti‐Tray MPN and the MPN for this dilution series can be found at the US Food and Drug
Association in the Bacteriological Analytical Manual, see Reference [8].
Each sample well has approximate volume of 1,96 ml.
The overflow well will hold approximately 8,5 ml and should be counted together with the other wells.
1)
For the calculation of the Quanti‐Tray MPN (Table B.1), see Formula (B.1):
NNlnN/NX

MPN

(B.1)
where
N is the most probable number (MPN);
MPN
N is the total number of wells (tubes) used in a test;
X is the number of positive wells (tubes) observed in a test.
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8

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SIST ISO 16266-2:2019
ISO 16266-2:2018(E)
B.2.2 Calculation of MPN for IDEXX Quanti-Tray/2000 (97-well)
1)
Quanti‐Tray/2000 MPN was originally derived as described by Reference [9].
Small wells have a mean volume of 0,16 ml.
Large wells have a mean volume of approximately 1,9 ml.
Overflow well will hold approximately 11 ml and should be counted as part of the large well count.
1)
For the calculation of the Quanti‐Tray/2000 MPN (Table B.2), see Formula (B.2):
KK
Vd P
ii i
 Vd n
ii i

Vd N
ii MPN
1exp
ii11
(B.2)
where
d is the dilution factor at level i (e.g. 0,1 for 1→10 dilution);
i
K is the number of dilution levels;
n is the number of wells at level i;
i
N is the MPN;
MPN
P is the number of positive wells at level i;
i
V is the volume of the wells at level i.
i

B.2.3 Calculation of confidence limits
Confidence limits for the MPNs calculated as indicated in B.2.1.1 and B.2.1.3 [Formulae (B.1) and (B.2)]
can be obtained using the approaches of either Reference [10] or ISO 29201 (Reference [11]). In Tables
B.1, B.2 and B.3 for all MPN values the 95 % confidence limits are indicated.
B.2.4 Calculation of the MPN and confidence limits for 250 ml samples
1)
Calculating MPN for 250 ml samples will require the use of three Quanti‐Tray . Two trays are to be
filled with 100 ml of sample each and the remaining tray is to be filled with 50 ml of sample and 50 ml
sterile water for a 1 in 2 dilution. The number of positive wells would be summed for the two trays with
no dilution.
Each sample well has approximate volume of 1,96 ml.
Each overflow well will hold approximately 8,5 ml and should be counted together with the other wells.
Two trays will be undiluted and one tray will have a dilution of 1 in 2.
1)
For the calculation of the MPN for 250 ml samples using three Quanti‐Tray ; see Formula (B.2).
With two dilutions, Formula (B.2) expands to Formula (B.3):
vd p vd p
121 222
vd nv d n
111 222
1exp vd N 1expvd N
 
11 MPN 22 MPN
(B.3)
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9

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SIST ISO 16266-2:2019
ISO 16266-2:2018(E)
1)
For the 250 ml test with three Quanti‐Tray with two undiluted (d = 1) and one in dilution level in 1 in
1
2 (d = 0,50) then the formula for bacteria per ml of sample becomes Formula (B.4):
2

1,961pp1,960,5
12


1exp 1,961NN1exp 1,960,5

MPN MPN


1,9
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 16266-2
Première édition
2018-07
Qualité de l'eau — Recherche et
dénombrement de Pseudomonas
aeruginosa —
Partie 2:
Méthode du nombre le plus probable
Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas
aeruginosa —
Part 2: Most probable number method
Numéro de référence
ISO 16266-2:2018(F)
© ISO 2018

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ISO 16266-2:2018(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2018
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
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ISO 16266-2:2018(F)
Sommaire Page
Avant-propos.iv
Introduction . v
1 Domaine d'application . 1
2 Références normatives . 2
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 3
5 Appareillage et verrerie . 3
6 Milieux de culture, diluants et réactifs . 4
6.1 Substances de base . 4
6.2 Diluant . 4
6.3 Antimousse B . 4
7 Échantillonnage . 4
8 Mode opératoire . 4
8.1 Transport et conservation des échantillons . 4
8.2 Préparation de l'échantillon et ensemencement des milieux . 5
8.2.1 Préparation des échantillons de 100 ml . 5
8.2.2 Préparation des échantillons de 250 ml . 5
8.3 Incubation et différenciation . 5
8.4 Examen des résultats . 6
9 Expression des résultats . 6
10 Assurance qualité . 6
11 Rapport d'essai . 7
Annexe A (informative) Informations microbiologiques complémentaires sur Pseudomonas
aeruginosa . 8
Annexe B (normative) Scelleuse Quanti-Tray et calcul des résultats . 9
Annexe C (normative) Composition du milieu Pseudalert . 131
Annexe D (informative) Caractéristiques de performance . 132
Bibliographie . 133
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iii

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ISO 16266-2:2018(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le
droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité
SC 4, Méthodes microbiologiques.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
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ISO 16266-2:2018(F)
Introduction
Pseudomonas aeruginosa est un organisme pathogène pour l'homme, capable de croître dans l'eau à de
très faibles concentrations nutritives. Toute eau minérale naturelle et toute eau de source doivent être
exemptes de Pseudomonas aeruginosa à la source ainsi qu'à la date de commercialisation, dans 250 ml
d'échantillon examiné (voir, par exemple, la Directive du Conseil 2009/54/CE, Référence [1]). Les
autres eaux commercialisées en bouteille doivent aussi être exemptes de Pseudomonas aeruginosa,
dans 250 ml d'échantillon (voir, par exemple, la directive du Conseil 98/83/CE, Référence [2]). D'autres
eaux, dont les eaux de piscine et de spa, les eaux destinées à la consommation humaine et les eaux
destinées aux hôpitaux, peuvent parfois, pour des raisons de santé publique, faire l'objet d'une
recherche de Pseudomonas aeruginos. Des volumes de 100 ml sont alors généralement étudiés.
La méthode décrite dans le présent document peut être appliquée à différents types d'eau, par exemple,
les eaux destinées aux hôpitaux, l'eau potable et les eaux en bouteille non gazéifiées destinées à la
consommation humaine, les eaux souterraines, les eaux de piscine et de spa, y compris celles contenant
des nombres importants de bactéries hétérotrophes (voir Références [3], [4], [5], [6] et [7]).

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v

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NORME INTERNATIONALE ISO 16266-2:2018(F)

Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement de Pseudomonas
aeruginosa — Partie 2: Méthode du nombre le plus probable
AVERTISSEMENT — Il convient que l'utilisateur du présent document connaisse bien les
pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n'a pas pour but de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il est de la responsabilité de
l'utilisateur de mettre en place des mesures de sécurité et d'hygiène appropriées.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais conduits conformément au présent
document soient réalisés par un personnel convenablement qualifié.
1 Domaine d'application
Le présent document spécifie une méthode permettant de dénombrer Pseudomonas aeruginosa dans
l'eau. Cette méthode se fonde sur la croissance d'organismes cibles dans un milieu liquide et le calcul du
nombre le plus probable (NPP) d'organismes en se référant aux tables du NPP.
Le présent document s'applique à différents types d'eau. Par exemple, les eaux destinées aux hôpitaux,
l'eau potable et les eaux en bouteille non gazéifiées destinées à la consommation humaine, les eaux
souterraines, les eaux de piscine et de spa, y compris celles contenant des nombres importants de
bactéries hétérotrophes.
Le présent document ne s'applique pas aux eaux en bouteille gazéifiées, aux eaux en bouteille
aromatisées, aux eaux de tour de refroidissement ou à l'eau de mer, pour lesquelles cette méthode n'a
pas été validée. Par conséquent, ces eaux ne relèvent pas du domaine d'application du présent
document. Les laboratoires peuvent utiliser la méthode présentée dans le présent document pour ces
matrices en prenant les mesures adéquates de validation des performances de cette méthode avant son
utilisation.
L'essai se fonde sur une technologie de recherche des enzymes bactériennes qui signale la présence de
P. aeruginosa en hydrolysant un substrat de 7-amino-4-méthylcoumarine aminopeptidase présent dans
un réactif spécial. Les cellules de P. aeruginosa se développent et se reproduisent rapidement à l'aide de
l'apport important en acides aminés, vitamines et autres nutriments présents dans le réactif. Les
souches de P. aeruginosa en développement actif présentent une enzyme qui dissocie le substrat de
7-amido-coumarine aminopeptidase, générant un produit qui présente une fluorescence sous une
lumière ultraviolette (UV). L'essai décrit dans le présent document fournit un résultat confirmé dans un
délai de 24 h sans avoir besoin de confirmer les puits positifs.
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1

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ISO 16266-2:2018(F)
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 8199, Qualité de l'eau — Exigences et lignes directrices générales pour les examens microbiologiques
sur milieu de culture
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
ISO 19458, Qualité de l'eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique
ISO/IEC Guide 2, Normalisation et activités connexes — Vocabulaire général
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l'ISO/IEC Guide 2 ainsi que les
suivants, s'appliquent.
L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l'adresse https://www.iso.org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l'adresse http://www.electropedia.org/
3.1
Pseudomonas aeruginosa
espèce de micro-organismes capable de se développer dans un bouillon sélectif et capable d'hydrolyser
un substrat de diagnostic de 7-amino-4-méthylcoumarine aminopeptidase présent dans le réactif
Note 1 à l'article: Voir l'Annexe A pour des informations supplémentaires sur P. aeruginosa.
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2

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ISO 16266-2:2018(F)
4 Principe
Un sachet de milieu déshydraté est ajouté à un échantillon d'eau (100 ml ou 250 ml), ou à une dilution
d'un échantillon complété à 100 ml. L'échantillon contenant le milieu est doucement agité pour garantir
un mélange adéquat et pour dissoudre le milieu. Lorsque le dénombrement est exigé, l'échantillon
1)
contenant le milieu (100 ml) est versé dans des conditions aseptiques dans un Quanti-Tray ou un
1)
Quanti-Tray/2000 pour dénombrer jusqu'à 201 organismes ou 2 419 organismes respectivement par
échantillon de 100 ml. Le mode opératoire pour le dénombrement des échantillons de 250 ml est décrit
1) 1)
en 8.2. Les plateaux sont étanchéifiés à l'aide d'une scelleuse Quanti-Tray . Les Quanti-Tray ou flacons
(pour les essais de type présence/absence) sont ensuite incubés à (38 ± 0,5) °C pendant 24 h à 28 h. Les
résultats sont confirmés au bout de 24 h, mais peuvent être consultés jusque dans un délai de 28 h.
1)
Après l'incubation, les puits d'échantillon des flacons ou des Quanti-Tray qui présentent un certain
degré de fluorescence bleue sous une lumière ultraviolette de grande longueur d'onde (365 nm) sont
considérés comme étant positifs pour P. aeruginosa.
À l'aide de tables statistiques ou d'un simple programme informatique, le nombre le plus probable
(NPP) de P. aeruginosa dans 100 ml ou 250 ml d'échantillon peut être déterminé.
Cette méthode est également adaptée en tant que procédure qualitative.
5 Appareillage et verrerie
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en particulier, le matériel ci-après.
5.1 Appareil de stérilisation à la vapeur (autoclave).
Tout appareil ou toute verrerie fourni(e) non stérile doit être stérilisé(e) conformément aux
instructions de l'ISO 8199.
5.2 Four à air chaud, pour la stérilisation à la vapeur.
5.3 Incubateur, contrôlé par thermostat réglable à (38 ± 0,5) °C.
1)
5.4 Scelleuse Quanti-Tray et insert en caoutchouc.
5.5 Flacons stériles à col large d'au moins 110 ml.
5.6 Lampe à rayons ultraviolets, 365 nm, 6 watt, grande longueur d'onde.
1) 1)
5.7 Quanti-Tray ou Quanti-Tray/2000 , conformément à l'Annexe B.

1)
Quanti-Tray est une appellation commerciale ou une marque déposée d'IDEXX Laboratories, Inc. ou de ses
filiales aux États-Unis et/ou dans d'autres pays. Cette information est donnée à l'attention des utilisateurs du
présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve l'emploi du produit ainsi désigné.
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ISO 16266-2:2018(F)
6 Milieux de culture, diluants et réactifs
6.1 Substances de base
2)
La méthode utilise Pseudalert , un milieu disponible sous la forme d'une poudre prête à l'emploi
répartie dans des sachets. Chaque sachet contient suffisamment de milieu (2,45 g pour des échantillons
de 100 ml) pour un seul essai. Pour le dénombrement quantitatif des échantillons de 250 ml, un sachet
de 2,45 g est ajouté à chaque aliquote d'échantillon divisé tel que décrit en 8.2. Il convient que le réactif
2)
Pseudalert soit de couleur beige et fluide. Le milieu contient des nutriments tels que des acides aminés
et des vitamines, un tampon, du chlorure de sodium, du sulfate de magnésium, des indicateurs de
développement, des antibiotiques et des sources d'azote. Le milieu est conservé dans des conditions
ambiantes (2 °C à 30 °C) à l'abri de la lumière directe du soleil et il convient de l'utiliser avant la date de
péremption indiquée sur le sachet. Le réactif présente une durée de conservation de 12 mois à compter
de la date de fabrication.
2)
La composition du milieu Pseudalert doit être conforme à l'Annexe C. Les caractéristiques de
performance pour la présente méthode sont fournies à l'Annexe D.
6.2 Diluant
2)
Pour les dilutions à employer avec Pseudalert , n'utiliser que de l'eau stérile, non inhibitrice et exempte
d'oxydants. L'utilisation de diluants à base d'eau saline ou peptonée tamponnée interfère avec les
performances de l'essai.
6.3 Antimousse B
Antimousse B utilisé comme une suspension de silicone hydrosoluble active à 1 %. Ce réactif est ajouté
aux échantillons afin de réduire autant que possible la formation de bulles d'air pendant le mélange.
NOTE Des flacons préremplis d'antimousse sont disponibles.
7 Échantillonnage
Procéder au prélèvement, à la conservation et à la manipulation des échantillons comme spécifié dans
l'ISO 19458.
8 Mode opératoire
8.1 Transport et conservation des échantillons
Il convient de transporter et de conserver les échantillons conformément à l'ISO 19458. Il convient de
commencer l'analyse le jour du prélèvement ou dans les 12 h qui le suivent. Dans certains cas
exceptionnels, les échantillons peuvent être conservés à (5 ± 3) °C pendant une durée maximale de 24 h
jusqu'à ce qu'ils soient examinés. Dans ce cas, le temps de stockage doit figurer dans le rapport d'essai.

2)
Pseudalert est une appellation commerciale ou une marque déposée d'IDEXX Laboratories, Inc. ou de ses filiales
aux États-Unis et/ou dans d'autres pays. Cette information est donnée à l'attention des utilisateurs du présent
document et ne signifie nullement que l'ISO approuve l'emploi du produit ainsi désigné.
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4

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ISO 16266-2:2018(F)
8.2 Préparation de l'échantillon et ensemencement des milieux
8.2.1 Préparation des échantillons de 100 ml
Pour le dénombrement des échantillons de 100 ml, ajouter, dans des conditions aseptiques, un seul
2)
sachet de milieu Pseudalert à chaque échantillon ou dilution d'échantillon de 100 ml dans un flacon
stérile et transparent, puis bien mélanger. Une fois que le milieu est complètement dissous, l'échantillon
1)
contenant le milieu est versé dans des conditions aseptiques dans un Quanti-Tray ou Quanti-
1) 1)
Tray/2000 puis étanchéifié à l'aide de la scelleuse Quanti-Tray . Pour réduire au minimum la
formation de bulles d'air dans les puits, les échantillons peuvent être préparés dans des flacons
préalablement stérilisés contenant l'antimousse B. L'antimousse B peut aussi être ajouté dans chaque
flacon à l'aide d'un flacon compte-gouttes. Une autre méthode du NPP consiste à répartir l'échantillon
2)
d'eau dans lequel le Pseudalert a été dissous dans des tubes stériles pour déterminer le NPP selon un
format NPP plus classique (par exemple, 1 × 50 ml et 5 × 10 ml).
2)
NOTE Le mélange de réactif Pseudalert peut devenir trouble en raison de la teneur élevée en minéraux (en
particulier, magnésium et/ou calcium), mais cela n'affecte en rien le résultat de l'essai.
8.2.2 Préparation des échantillons de 250 ml
Pour le dénombrement des échantillons de 250 ml, diviser l'échantillon dans trois flacons stériles et
transparents, de manière à obtenir deux échantillons avec des aliquotes de 100 ml et un échantillon
avec une aliquote de 50 ml. Compléter l'échantillon de 50 ml à 100 ml en ajoutant 50 ml d'eau stérile,
non inhibitrice et exempte d'oxydants. Ajouter, dans des conditions aseptiques, un seul sachet de milieu
2)
Pseudalert à chacun des trois échantillons de 100 ml, puis bien mélanger. Une fois que le milieu est
complètement dissous, les trois échantillons de 100 ml contenant le milieu sont chacun versés dans des
1) 1)
conditions aseptiques dans trois Quanti-Tray ou Quanti-Tray/2000 séparés, puis étanchéifiés à l'aide
1)
de la scelleuse Quanti-Tray . Pour réduire au minimum la formation de bulles d'air dans les puits, les
échantillons peuvent être préparés dans des flacons préalablement stérilisés contenant l'antimousse B.
L'antimousse B peut aussi être ajouté dans chaque flacon à l'aide d'un flacon compte-gouttes. Il est
1)
essentiel de prévoir un étiquetage adéquat des trois Quanti-Tray permettant de distinguer clairement
le plateau contenant la portion d'échantillon de 50 ml (c'est-à-dire la portion diluée) des deux plateaux
contenant les portions d'échantillon non diluées de 100 ml. Ceci est important pour le calcul correct du
dénombrement final.
8.3 Incubation et différenciation
1)
Incuber les Quanti-Tray ensemencés pendant 24 h à 28 h à (38 ± 0,5) °C pour détecter P. aeruginosa.
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ISO 16266-2:2018(F)
8.4 Examen des résultats
1) 1)
Examiner les Quanti-Tray ou Quanti-Tray/2000 après incubation sous rayonnement ultraviolet
(365 nm) dans une pièce sombre ou dans une chambre dont la lumière ambiante est tamisée. S'assurer
que la lumière ultraviolette est éloignée des yeux et dirigée vers l'échantillon. Il convient de vérifier
l'efficacité de la lumière à rayons ultraviolets régulièrement à l'aide d'un témoin positif à fluorescence
conformément à l'Article 10. Il convient également de remplacer la lampe conformément à la durée de
vie de la lampe indiquée par le fabricant (par exemple, 6 000 h) ou tous les ans, l'échéance la plus courte
étant retenue. Considérer comme positifs à P. aeruginosa et dénombrer tous les puits présentant un
certain degré de fluorescence bleue. À des fins d'interprétation, comparer avec un témoin négatif. En
cas de doute concernant la fluorescence d'un puits au bout de 24 h, remettre le plateau dans
l'incubateur pour une incubation supplémentaire en veillant à ne pas dépasser un temps d'incubation
1) 1)
maximal de 28 h. Le positionnement de l'insert en caoutchouc du Quanti-Tray ou Quanti-Tray/2000
sur l'échantillon peut faciliter l'identification des puits fluorescents.
9 Expression des résultats
1) 1)
D'après le nombre de puits positifs présents sur un Quanti-Tray ou Quanti-Tray/2000 , le
NPP/100 ml de P. aeruginosa peut être calculé en référence aux tables statistiques ou à l'aide d'un
programme informatique de génération de NPP (voir les Tableaux B.1 et B.2). Pour le dénombrement
des échantillons de 250 ml, le NPP est calculé en utilisant la somme des dénombrements des deux
1)
Quanti-Tray contenant les portions d'échantillon non diluées, comme premier dénombrement, et le
1)
contenant la portion d'échantillon diluée, comme deuxième
dénombrement du Quanti-Tray
dénombrement (voir le Tableau B.3).
10 Assurance qualité
Le laboratoire doit être doté d'un système de contrôle de la qualité clairement défini garantissant que
l'appareillage, les réactifs et les techniques sont adaptés à l'essai. L'utilisation de contrôles positifs, de
contrôles négatifs et de blancs fait partie de l'essai.
Pour la définition de la productivité et de la sélectivité, se référer à l'ISO 11133. Les performances de
2)
Pseudalert doivent être soumises à essai conformément aux méthodes et critères décrits dans
l'ISO 11133 (voir le Tableau 1).
2)
Tableau 1 — Essai de performance de Pseudalert
Souche de Milieu de Méthode de Réactions
Fonction Incubation Critères
a
contrôle référence contrôle caractéristiques
24 h à 28 h/ P. aeruginosa Fluorescence
Productivité TSA Quantitative PR ≥ 0,5
(38 ± 0,5) °C WDCM 00024 ou bleue
WDCM 00025
Sélectivité 24 h à 28 h/ P. fluorescens — Qualitative Inhibition Absence de
(38 ± 0,5) °C WDCM 00115 totale fluorescence
bleue
a
  Se référer au catalogue des souches de référence disponible à l'adresse:
http://www.wfcc.info/pdf/WDCM_Reference_Strain_Catalogue.pdf pour connaître les numéros de collection des souches
de culture et les détails de contact.

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ISO 16266-2:2018(F)
11 Rapport d'essai
Le rapport d'essai doit contenir au moins les informations suivantes:
a) la méthode d'essai employée ainsi que la référence du présent document, à savoir
ISO 16266-2:2018;
b) toutes les informations nécessaires à l'identification complète de l'échantillon;
c) les résultats exprimés conformément à l'Article 9;
d) tout phénomène particulier observé au cours de l'analyse et toute opération non spécifiée dans le
présent document ayant pu influencer les résultats.
Si, dans certains cas exceptionnels, l'échantillon est conservé à (5 ± 3) °C pendant une durée maximale
de 24 h jusqu'à ce qu'il soit examiné, le temps de stockage doit figurer dans le rapport d'essai.
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ISO 16266-2:2018(F)
Annexe A
(informative)

Informations microbiologiques complémentaires sur Pseudomonas
aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa est l'espèce type du genre Pseudomonas, qui est le genre type de la famille des
Pseudomonadaceae de l'ordre des Pseudomonadales.
C'est une bactérie Gram négative, non sporulée, oxydase positive et catalase positive. Elle présente un
métabolisme oxydatif tel qu'indiqué par l'essai selon Hugh et Leifson, réduit généralement les nitrates
au-delà des nitrites et produit de l'ammoniac à partir de la dégradation de l'acétamide. La plupart des
souches (98 %) produisent un pigment fluorescent soluble dans l'eau. La majorité des souches sont
capables de se développer à 42 °C, mais pas à 4 °C, ce qui différencie P. aeruginosa de P. fluorescens qui
se développe à 4 °C et non à 42 °C.
Elle liquéfie la gélatine et hydrolyse la caséine, mais pas l'amidon. Plus de 90 % des souches de
P. aeruginosa produisent le pigment pyocyanine (bleu vert).
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ISO 16266-2:2018(F)
Annexe B
(normative)

Scelleuse Quanti-Tray et calcul des résultats
B.1 Généralités
1)
La scelleuse Quanti-Tray est une scelleuse thermique qui forme un joint entre les puits du
1) 1)
Quanti-Tray . La scelleuse distribue automatiquement le liquide dans les puits du Quanti-Tray ou
1) 1)
Quanti-Tray/2000 . Le Quanti-Tray est utilisé lorsque l'on prévoit des dénombrements inférieurs à
1)
200 NPP/100 ml. Le Quanti-Tray/2000 peut être utilisé pour calculer des valeurs NPP pouvant
atteindre 2 419 NPP/100 ml. Lors du calcul du NPP, les tables fournies avec les plateaux et les
scelleuses servent de référence pour tous les dénombrements. Un simple programme statistique peut
aussi être utilisé pour calculer les résultats. Si nécessaire, le NPP peut être calculé manuellement à l'aide
des modes opératoires donnés ci-après.
B.2 Calcul du nombre le plus probable (NPP)
B.2.1 Calcul du NPP pour IDEXX Quanti-Tray (51 puits)
1)
Le NPP de Quanti-Tray et le NPP pour cette série de dilutions sont consultables auprès de la Food and
Drug Association des États-Unis dans l'ouvrage intitulé « Bacteriological Analytical Manual » (voir
Référence [8]).
Chaque puits d'échantillon contient un volume d'environ 1,96 ml.
Le trop-plein peut contenir environ 8,5 ml et il convient de le dénombrer parmi les autres puits.
1)
Pour calculer le NPP du Quanti-Tray (Tableau B.1), voir la Formule (B.1):
N =N×−lnN / NX (B.1)
( )
NPP

où
 NNPP est le nombre le plus probable (NPP);
 N est le nombre total de puits (tubes) utilisés lors d'un essai;
 X est le nombre de puits (tubes) positifs observés lors d'un essai.
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B.2.2 Calcul du NPP pour IDEXX Quanti-Tray/2000 (97 puits)
1)
Le NPP du Quanti-Tray/2000 a été calculé pour la première fois conformément à la description
donnée dans la Référence [9].
Les petits puits ont un volume moyen de 0,16 ml.
Les grands puits ont un volume moyen d'environ 1,9 ml.
Le trop-plein peut contenir environ 11 ml et il convient de le dénombrer parmi les grands puits.
1)
Pour calculer le NPP du Quanti-Tray/2000 (Tableau B.2), voir la Formule (B.2):
KK
Vd P
i ii
= Vdn
∑∑ i ii
−Vd N
ii NPP
1− exp
ii11
(B.2)
où
 d est le facteur de dilution au niveau i (par exemple, 0,1 pour une dilution 1→10);
i
 K est le nombre de niveaux de dilution;
...

ISO/TC 147/SC 4
Date : 2018-07
ISO 16266-2:2018 (F)
ISO/TC 147/SC 4
Secrétariat : DIN
Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement de Pseudomonas
aeruginosa — Partie 2 : Méthode du nombre le plus probable
Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa — Part 2: Most probable
number method

ICS : 13.060.70

Type du document:  Norme internationale
Sous-type du document:
Stade du document:  (60) Publication
Langue du document:  F

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Type du document:  Norme internationale
Sous-type du document:
Stade du document:  (60) Publication
Langue du document:  F

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Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Avant-propos . vi
Introduction . vii
1 Domaine d'application . 1
2 Références normatives . 2
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 3
5 Appareillage et verrerie . 3
6 Milieux de culture, diluants et réactifs . 4
6.1 Substances de base . 4
6.2 Diluant . 4
6.3 Antimousse B . 4
7 Échantillonnage . 4
8 Mode opératoire . 4
8.1 Transport et conservation des échantillons . 4
8.2 Préparation de l'échantillon et ensemencement des milieux . 5
8.2.1 Préparation des échantillons de 100 ml . 5
8.2.2 Préparation des échantillons de 250 ml . 5
8.3 Incubation et différenciation . 5
8.4 Examen des résultats . 6
9 Expression des résultats . 6
10 Assurance qualité . 6
11 Rapport d'essai . 7
Annexe A (informative) Informations microbiologiques complémentaires sur Pseudomonas
aeruginosa . 8
Annexe B (normative) Scelleuse Quanti-Tray et calcul des résultats . 9
Annexe C (normative) Composition du milieu Pseudalert . 131
Annexe D (informative) Caractéristiques de performance . 132
Bibliographie . 133
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ISO 16266-2:2018(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le
droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant : www.iso.org/iso/fr/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité
SC 4, Méthodes microbiologiques.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
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ISO 16266-2:2018(F)
Introduction
Pseudomonas aeruginosa est un organisme pathogène pour l'homme, capable de croître dans l'eau à de
très faibles concentrations nutritives. Toute eau minérale naturelle et toute eau de source doivent être
exemptes de Pseudomonas aeruginosa à la source ainsi qu'à la date de commercialisation, dans 250 ml
d'échantillon examiné (voir, par exemple, la Directive du Conseil 2009/54/CE, Référence [1]). Les
autres eaux commercialisées en bouteille doivent aussi être exemptes de Pseudomonas aeruginosa,
dans 250 ml d'échantillon (voir, par exemple, la directive du Conseil 98/83/CE, Référence [2]). D'autres
eaux, dont les eaux de piscine et de spa, les eaux destinées à la consommation humaine et les eaux
destinées aux hôpitaux, peuvent parfois, pour des raisons de santé publique, faire l'objet d'une
recherche de Pseudomonas aeruginos. Des volumes de 100 ml sont alors généralement étudiés.
La méthode décrite dans le présent document peut être appliquée à différents types d'eau, par exemple,
les eaux destinées aux hôpitaux, l'eau potable et les eaux en bouteille non gazéifiées destinées à la
consommation humaine, les eaux souterraines, les eaux de piscine et de spa, y compris celles contenant
des nombres importants de bactéries hétérotrophes (voir Références [3], [4], [5], [6] et [7]).

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NORME INTERNATIONALE ISO 16266-2:2018(F)

Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement de Pseudomonas
aeruginosa — Partie 2 : Méthode du nombre le plus probable
AVERTISSEMENT — Il convient que l'utilisateur du présent document connaisse bien les
pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n'a pas pour but de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il est de la responsabilité de
l'utilisateur de mettre en place des mesures de sécurité et d'hygiène appropriées.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais conduits conformément au présent
document soient réalisés par un personnel convenablement qualifié.
1 Domaine d'application
Le présent document spécifie une méthode permettant de dénombrer Pseudomonas aeruginosa dans
l'eau. Cette méthode se fonde sur la croissance d'organismes cibles dans un milieu liquide et le calcul du
nombre le plus probable (NPP) d'organismes en se référant aux tables du NPP.
Le présent document s'applique à différents types d'eau. Par exemple, les eaux destinées aux hôpitaux,
l'eau potable et les eaux en bouteille non gazéifiées destinées à la consommation humaine, les eaux
souterraines, les eaux de piscine et de spa, y compris celles contenant des nombres importants de
bactéries hétérotrophes.
Le présent document ne s'applique pas aux eaux en bouteille gazéifiées, aux eaux en bouteille
aromatisées, aux eaux de tour de refroidissement ou à l'eau de mer, pour lesquelles cette méthode n'a
pas été validée. Par conséquent, ces eaux ne relèvent pas du domaine d'application du présent
document. Les laboratoires peuvent utiliser la méthode présentée dans le présent document pour ces
matrices en prenant les mesures adéquates de validation des performances de cette méthode avant son
utilisation.
L'essai se fonde sur une technologie de recherche des enzymes bactériennes qui signale la présence de
P. aeruginosa en hydrolysant un substrat de 7-amino-4-méthylcoumarine aminopeptidase présent dans
un réactif spécial. Les cellules de P. aeruginosa se développent et se reproduisent rapidement à l'aide de
l'apport important en acides aminés, vitamines et autres nutriments présents dans le réactif. Les
souches de P. aeruginosa en développement actif présentent une enzyme qui dissocie le substrat de
7-amido-coumarine aminopeptidase, générant un produit qui présente une fluorescence sous une
lumière ultraviolette (UV). L'essai décrit dans le présent document fournit un résultat confirmé dans un
délai de 24 h sans avoir besoin de confirmer les puits positifs.
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1

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ISO 16266-2:2018(F)
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 8199, Qualité de l'eau — Exigences et lignes directrices générales pour les examens microbiologiques
sur milieu de culture
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
ISO 19458, Qualité de l'eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique
ISO/IEC Guide 2, Normalisation et activités connexes — Vocabulaire général
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l'ISO/IEC Guide 2 ainsi que les
suivants, s'appliquent.
L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes :
— ISO Online browsing platform : disponible à l'adresse https://www.iso.org/obp
— IEC Electropedia : disponible à l'adresse http://www.electropedia.org/./
3.1
Pseudomonas aeruginosa
espèce de micro-organismes capable de se développer dans un bouillon sélectif et capable d'hydrolyser
un substrat de diagnostic de 7-amino-4-méthylcoumarine aminopeptidase présent dans le réactif
Note 1 à l'article : Voir l'Annexe A pour des informations supplémentaires sur P. aeruginosa.
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2

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ISO 16266-2:2018(F)
4 Principe
Un sachet de milieu déshydraté est ajouté à un échantillon d'eau (100 ml ou 250 ml), ou à une dilution
d'un échantillon complété à 100 ml. L'échantillon contenant le milieu est doucement agité pour garantir
un mélange adéquat et pour dissoudre le milieu. Lorsque le dénombrement est exigé, l'échantillon
1)
contenant le milieu (100 ml) est versé dans des conditions aseptiques dans un Quanti-Tray ou un
1)
Quanti-Tray/2000 pour dénombrer jusqu'à 201 organismes ou 2 419 organismes respectivement par
échantillon de 100 ml. Le mode opératoire pour le dénombrement des échantillons de 250 ml est décrit
1) 1)
. Les Quanti-Tray ou flacons
en 8.2. Les plateaux sont étanchéifiés à l'aide d'une scelleuse Quanti-Tray
(pour les essais de type présence/absence) sont ensuite incubés à (38 ± 0,5) °C pendant 24 h à 28 h. Les
résultats sont confirmés au bout de 24 h, mais peuvent être consultés jusque dans un délai de 28 h.
1)
Après l'incubation, les puits d'échantillon des flacons ou des Quanti-Tray qui présentent un certain
degré de fluorescence bleue sous une lumière ultraviolette de grande longueur d'onde (365 nm) sont
considérés comme étant positifs pour P. aeruginosa.
À l'aide de tables statistiques ou d'un simple programme informatique, le nombre le plus probable
(NPP) de P. aeruginosa dans 100 ml ou 250 ml d'échantillon peut être déterminé.
Cette méthode est également adaptée en tant que procédure qualitative.
5 Appareillage et verrerie
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en particulier, le matériel ci-après.
5.1 Appareil de stérilisation à la vapeur (autoclave).
Tout appareil ou toute verrerie fourni(e) non stérile doit être stérilisé(e) conformément aux
instructions de l'ISO 8199.
5.2 Four à air chaud, pour la stérilisation à la vapeur.
5.3 Incubateur, contrôlé par thermostat réglable à (38 ± 0,5) °C.
1)
5.4 Scelleuse Quanti-Tray et insert en caoutchouc.
5.5 Flacons stériles à col large d'au moins 110 ml.
5.6 Lampe à rayons ultraviolets, 365 nm, 6 watt, grande longueur d'onde.
1) 1)
5.7 Quanti-Tray ou Quanti-Tray/2000 , conformément à l'Annexe B.

1)
Quanti-Tray est une appellation commerciale ou une marque déposée d'IDEXX Laboratories, Inc. ou de ses
filiales aux États-Unis et/ou dans d'autres pays. Cette information est donnée à l'attention des utilisateurs du
présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve l'emploi du produit ainsi désigné.
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3

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ISO 16266-2:2018(F)
6 Milieux de culture, diluants et réactifs
6.1 Substances de base
2)
La méthode utilise Pseudalert , un milieu disponible sous la forme d'une poudre prête à l'emploi
répartie dans des sachets. Chaque sachet contient suffisamment de milieu (2,45 g pour des échantillons
de 100 ml) pour un seul essai. Pour le dénombrement quantitatif des échantillons de 250 ml, un sachet
de 2,45 g est ajouté à chaque aliquote d'échantillon divisé tel que décrit en 8.2. Il convient que le réactif
2)
Pseudalert soit de couleur beige et fluide. Le milieu contient des nutriments tels que des acides aminés
et des vitamines, un tampon, du chlorure de sodium, du sulfate de magnésium, des indicateurs de
développement, des antibiotiques et des sources d'azote. Le milieu est conservé dans des conditions
ambiantes (2 °C à 30 °C) à l'abri de la lumière directe du soleil et il convient de l'utiliser avant la date de
péremption indiquée sur le sachet. Le réactif présente une durée de conservation de 12 mois à compter
de la date de fabrication.
2)
La composition du milieu Pseudalert doit être conforme à l'Annexe C. Les caractéristiques de
performance pour la présente méthode sont fournies à l'Annexe D.
6.2 Diluant
2)
Pour les dilutions à employer avec Pseudalert , n'utiliser que de l'eau stérile, non inhibitrice et exempte
d'oxydants. L'utilisation de diluants à base d'eau saline ou peptonée tamponnée interfère avec les
performances de l'essai.
6.3 Antimousse B
Antimousse B utilisé comme une suspension de silicone hydrosoluble active à 1 %. Ce réactif est ajouté
aux échantillons afin de réduire autant que possible la formation de bulles d'air pendant le mélange.
NOTE Des flacons préremplis d'antimousse sont disponibles.
7 Échantillonnage
Procéder au prélèvement, à la conservation et à la manipulation des échantillons comme spécifié dans
l'ISO 19458.
8 Mode opératoire
8.1 Transport et conservation des échantillons
Il convient de transporter et de conserver les échantillons conformément à l'ISO 19458. Il convient de
commencer l'analyse le jour du prélèvement ou dans les 12 h qui le suivent. Dans certains cas

2)
Pseudalert est une appellation commerciale ou une marque déposée d'IDEXX Laboratories, Inc. ou de ses filiales
aux États-Unis et/ou dans d'autres pays. Cette information est donnée à l'attention des utilisateurs du présent
document et ne signifie nullement que l'ISO approuve l'emploi du produit ainsi désigné.
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4

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ISO 16266-2:2018(F)
exceptionnels, les échantillons peuvent être conservés à (5 ± 3) °C pendant une durée maximale de 24 h
jusqu'à ce qu'ils soient examinés. Dans ce cas, le temps de stockage doit figurer dans le rapport d'essai.
8.2 Préparation de l'échantillon et ensemencement des milieux
8.2.1 Préparation des échantillons de 100 ml
Pour le dénombrement des échantillons de 100 ml, ajouter, dans des conditions aseptiques, un seul
2)
sachet de milieu Pseudalert à chaque échantillon ou dilution d'échantillon de 100 ml dans un flacon
stérile et transparent, puis bien mélanger. Une fois que le milieu est complètement dissous, l'échantillon
1)
contenant le milieu est versé dans des conditions aseptiques dans un Quanti-Tray ou Quanti-
1) 1)
Tray/2000 puis étanchéifié à l'aide de la scelleuse Quanti-Tray . Pour réduire au minimum la
formation de bulles d'air dans les puits, les échantillons peuvent être préparés dans des flacons
préalablement stérilisés contenant l'antimousse B. L'antimousse B peut aussi être ajouté dans chaque
flacon à l'aide d'un flacon compte-gouttes. Une autre méthode du NPP consiste à répartir l'échantillon
2)
d'eau dans lequel le Pseudalert a été dissous dans des tubes stériles pour déterminer le NPP selon un
format NPP plus classique (par exemple, 1 × 50 ml et 5 × 10 ml).
2)
NOTE Le mélange de réactif Pseudalert peut devenir trouble en raison de la teneur élevée en minéraux (en
particulier, magnésium et/ou calcium), mais cela n'affecte en rien le résultat de l'essai.
8.2.2 Préparation des échantillons de 250 ml
Pour le dénombrement des échantillons de 250 ml, diviser l'échantillon dans trois flacons stériles et
transparents, de manière à obtenir deux échantillons avec des aliquotes de 100 ml et un échantillon
avec une aliquote de 50 ml. Compléter l'échantillon de 50 ml à 100 ml en ajoutant 50 ml d'eau stérile,
non inhibitrice et exempte d'oxydants. Ajouter, dans des conditions aseptiques, un seul sachet de milieu
2)
Pseudalert à chacun des trois échantillons de 100 ml, puis bien mélanger. Une fois que le milieu est
complètement dissous, les trois échantillons de 100 ml contenant le milieu sont chacun versés dans des
1) 1)
conditions aseptiques dans trois Quanti-Tray ou Quanti-Tray/2000 séparés, puis étanchéifiés à l'aide
1)
de la scelleuse Quanti-Tray . Pour réduire au minimum la formation de bulles d'air dans les puits, les
échantillons peuvent être préparés dans des flacons préalablement stérilisés contenant l'antimousse B.
L'antimousse B peut aussi être ajouté dans chaque flacon à l'aide d'un flacon compte-gouttes. Il est
1)
essentiel de prévoir un étiquetage adéquat des trois Quanti-Tray permettant de distinguer clairement
le plateau contenant la portion d'échantillon de 50 ml (c'est-à-dire la portion diluée) des deux plateaux
contenant les portions d'échantillon non diluées de 100 ml. Ceci est important pour le calcul correct du
dénombrement final.
8.3 Incubation et différenciation
1)
Incuber les Quanti-Tray ensemencés pendant 24 h à 28 h à (38 ± 0,5) °C pour détecter P. aeruginosa.
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5

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8.4 Examen des résultats
1) 1)
Examiner les Quanti-Tray ou Quanti-Tray/2000 après incubation sous rayonnement ultraviolet
(365 nm) dans une pièce sombre ou dans une chambre dont la lumière ambiante est tamisée. S'assurer
que la lumière ultraviolette est éloignée des yeux et dirigée vers l'échantillon. Il convient de vérifier
l'efficacité de la lumière à rayons ultraviolets régulièrement à l'aide d'un témoin positif à fluorescence
conformément à l'Article 10. Il convient également de remplacer la lampe conformément à la durée de
vie de la lampe indiquée par le fabricant (par exemple, 6 000 h) ou tous les ans, l'échéance la plus courte
étant retenue. Considérer comme positifs à P. aeruginosa et dénombrer tous les puits présentant un
certain degré de fluorescence bleue. À des fins d'interprétation, comparer avec un témoin négatif. En
cas de doute concernant la fluorescence d'un puits au bout de 24 h, remettre le plateau dans
l'incubateur pour une incubation supplémentaire en veillant à ne pas dépasser un temps d'incubation
1) 1)
maximal de 28 h. Le positionnement de l'insert en caoutchouc du Quanti-Tray ou Quanti-Tray/2000
sur l'échantillon peut faciliter l'identification des puits fluorescents.
9 Expression des résultats
1) 1)
D'après le nombre de puits positifs présents sur un Quanti-Tray ou Quanti-Tray/2000 , le
NPP/100 ml de P. aeruginosa peut être calculé en référence aux tables statistiques ou à l'aide d'un
programme informatique de génération de NPP (voir les Tableaux B.1 et B.2). Pour le dénombrement
des échantillons de 250 ml, le NPP est calculé en utilisant la somme des dénombrements des deux
1)
Quanti-Tray contenant les portions d'échantillon non diluées, comme premier dénombrement, et le
1)
dénombrement du Quanti-Tray contenant la portion d'échantillon diluée, comme deuxième
dénombrement (voir le Tableau B.3).
10 Assurance qualité
Le laboratoire doit être doté d'un système de contrôle de la qualité clairement défini garantissant que
l'appareillage, les réactifs et les techniques sont adaptés à l'essai. L'utilisation de contrôles positifs, de
contrôles négatifs et de blancs fait partie de l'essai.
Pour la définition de la productivité et de la sélectivité, se référer à l'ISO 11133. Les performances de
2)
Pseudalert doivent être soumises à essai conformément aux méthodes et critères décrits dans
l'ISO 11133 (voir le Tableau 1).
2)
Tableau 1 — Essai de performance de Pseudalert
Souche de Milieu de Méthode de Réactions
Fonction Incubation Critères
a
contrôle référence contrôle caractéristiques
Productivité 24 h à 28 h/ P. aeruginosa TSA Quantitative PR ≥ 0,5 Fluorescence
(38 ± 0,5) °C WDCM 00024 ou bleue
WDCM 00025
Sélectivité 24 h à 28 h/ P. fluorescens — Qualitative Inhibition Absence de
(38 ± 0,5) °C WDCM 00115 totale fluorescence
bleue
a
  Se référer au catalogue des souches de référence disponible à l'adresse :
http://www.wfcc.info/pdf/WDCM_Reference_Strain_Catalogue.pdf pour connaître les numéros de collection des souches
de culture et les détails de contact.

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ISO 16266-2:2018(F)
11 Rapport d'essai
Le rapport d'essai doit contenir au moins les informations suivantes :
a) la méthode d'essai employée ainsi que la référence du présent document, à savoir
ISO 16266-2:2018 ;
b) toutes les informations nécessaires à l'identification complète de l'échantillon ;
c) les résultats exprimés conformément à l'Article 9 ;
d) tout phénomène particulier observé au cours de l'analyse et toute opération non spécifiée dans le
présent document ayant pu influencer les résultats.
Si, dans certains cas exceptionnels, l'échantillon est conservé à (5 ± 3) °C pendant une durée maximale
de 24 h jusqu'à ce qu'il soit examiné, le temps de stockage doit figurer dans le rapport d'essai.
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ISO 16266-2:2018(F)
Annexe A
(informative)

Informations microbiologiques complémentaires sur Pseudomonas
aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa est l'espèce type du genre Pseudomonas, qui est le genre type de la famille des
Pseudomonadaceae de l'ordre des Pseudomonadales.
C'est une bactérie Gram négative, non sporulée, oxydase positive et catalase positive. Elle présente un
métabolisme oxydatif tel qu'indiqué par l'essai selon Hugh et Leifson, réduit généralement les nitrates
au-delà des nitrites et produit de l'ammoniac à partir de la dégradation de l'acétamide. La plupart des
souches (98 %) produisent un pigment fluorescent soluble dans l'eau. La majorité des souches sont
capables de se développer à 42 °C, mais pas à 4 °C, ce qui différencie P. aeruginosa de P. fluorescens qui
se développe à 4 °C et non à 42 °C.
Elle liquéfie la gélatine et hydrolyse la caséine, mais pas l'amidon. Plus de 90 % des souches de
P. aeruginosa produisent le pigment pyocyanine (bleu vert).
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Annexe B
(normative)

Scelleuse Quanti-Tray et calcul des résultats
B.1 Généralités
1)
La scelleuse Quanti-Tray est une scelleuse thermique qui forme un joint entre les puits du
1) 1)
Quanti-Tray . La scelleuse distribue automatiquement le liquide dans les puits du Quanti-Tray ou
1) 1)
Quanti-Tray/2000 . Le Quanti-Tray est utilisé lorsque l'on prévoit des dénombrements inférieurs à
1)
200 NPP/100 ml. Le Quanti-Tray/2000 peut être utilisé pour calculer des valeurs NPP pouvant
atteindre 2 419 NPP/100 ml. Lors du calcul du NPP, les tables fournies avec les plateaux et les
scelleuses servent de référence pour tous les dénombrements. Un simple programme statistique peut
aussi être utilisé pour calculer les résultats. Si nécessaire, le NPP peut être calculé manuellement à l'aide
des modes opératoires donnés ci-après.
B.2 Calcul du nombre le plus probable (NPP)
B.2.1 Calcul du NPP pour IDEXX Quanti-Tray (51 puits)
1)
Le NPP de Quanti-Tray et le NPP pour cette série de dilutions sont consultables auprès de la Food and
Drug Association des États-Unis dans l'ouvrage intitulé « Bacteriological Analytical Manual » (voir
Référence [8]).
Chaque puits d'échantillon contient un volume d'environ 1,96 ml.
Le trop-plein peut contenir environ 8,5 ml et il convient de le dénombrer parmi les autres puits.
1)
Pour calculer le NPP du Quanti-Tray (Tableau B.1), voir la Formule (B.1) :):
N =N×−lnN / NX (B.1)
( )
NPP

où
 N est le nombre le plus probable (NPP) ;);
NPP
 N est le nombre total de puits (tubes) utilisés lors d'un essai ;
 X est le nombre de puits (tubes) positifs observés lors d'un essai.
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