SIST ISO 16266-2:2019

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16266-2
First edition
2018-07
Water quality — Detection and
enumeration of Pseudomonas
aeruginosa —
Part 2:
Most probable number method
Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement de Pseudomonas
aeruginosa —
Partie 2: Méthode du nombre le plus probable
Reference number
©
ISO 2018
© ISO 2018
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address
below or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: +41 22 749 01 11
Fax: +41 22 749 09 47
Email: copyright@iso.org
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2018 – All rights reserved

Contents Page
Foreword . v
Introduction . vi
1  Scope . 1
2  Normative references . 1
3  Terms and definitions . 2
4  Principle . 2
5  Apparatus and gla sswa r e . 2
6  Culture media, diluents and reagents . 3
6.1  Basic materials . 3
6.2  Diluent . 3
6.3  Antifoam B . 3
7  Sampling . 4
8  Procedure . 4
8.1  Transport and storage of the samples . 4
8.2  Preparation of the sample and inoculation of media . 4
8.2.1  Preparation of 100 ml samples . 4
8.2.2  Preparation of 250 ml samples . 4
8.3  Incubation and differentiation . 4
8.4  Examination of results . 5
9  Expression of results . 5
10  Quality assurance . 5
11  Test report . 5
Annex A (informative) Further microbiological information about Pseudomonas
aeruginosa . 7
Annex B (normative) The Quanti-Tray Sealer and calculation of results . 8
Annex C (normative) Composition of the Pseudalert medium . 120
Annex D (informative) Performance characteristics . 121
Bibliography . 122
© ISO 2018 – All rights reserved
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national
standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally
carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a
technical committee has been established has the right to be represented on that committee.
International organizations, governmental and non‐governmental, in liaison with ISO, also take part in
the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,
Microbibiological methods.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
© ISO 2018 – All rights reserved

Introduction
Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen of man that is capable of growth in water at very
low nutrient concentrations. At source and during marketing, a natural mineral water or a spring water
is to be free from Pseudomonas aeruginosa in any 250 ml sample examined (see, for example, Council
Directive 2009/54/EC, Reference [1]). Other bottled waters offered for sale are also to be free of
Pseudomonas aeruginosa in any 250 ml sample (see e.g. Council Directive 98/83/EC, Reference [2]).
Other waters, including swimming and spa pool waters, water for human consumption and hospital
waters, may sometimes be tested for Pseudomonas aeruginosa for reasons of public health. In these
cases, it is typical to examine 100 ml volumes.
The method described in this document can be applied to a range of types of water, for example,
hospital waters, drinking water and non‐carbonated bottled waters intended for human consumption,
groundwater, swimming pool and spa pool waters including those containing high background counts
of heterotrophic bacteria (see References [3], [4], [5], [6] and [7]).
© ISO 2018 – All rights reserved
v
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16266‐2:2018(E)

Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas
aeruginosa — Part 2: Most probable number method
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document
are carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This document specifies a method for the enumeration of Pseudomonas aeruginosa in water. The
method is based on the growth of target organisms in a liquid medium and calculation of the most
probable number (MPN) of organisms by reference to MPN tables.
This document is applicable to a range of types of water. For example, hospital waters, drinking water
and non‐carbonated bottled waters intended for human consumption, groundwater, swimming pool
and spa pool waters including those containing high background counts of heterotrophic bacteria.
This document does not apply to carbonated bottled waters, flavoured bottle waters, cooling tower
waters or marine waters, for which the method has not been validated. These waters are, therefore,
outside the scope of this document. Laboratories can employ the method presented in this document
for these matrices by undertaking appropriate validation of performance of this method prior to use.
The test is based on a bacterial enzyme detection technology that signals the presence of P. aeruginosa
through the hydrolysis of a 7‐amino‐4‐methylcoumarin aminopeptidase substrate present in a special
reagent. P. aeruginosa cells rapidly grow and reproduce using the rich supply of amino acids, vitamins
and other nutrients present in the reagent. Actively growing strains of P. aeruginosa have an enzyme
that cleaves the 7‐amido‐coumarin aminopeptidase substrate releasing a product which fluoresces
under ultraviolet (UV) light. The test described in this document provides a confirmed result within
24 h with no requirement for further confirmation of positive wells.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 8199, Water quality — General guide to the enumeration of micro-organisms by culture
ISO 11133, Microbiology of food, animal feeding stuffs, food production, environment and water —
Preparation, production, storage and performance testing of culture media
ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis
© ISO 2018 – All rights reserved
ISO/IEC Guide 2, Standardization and related activities — General vocabulary
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO/IEC Guide 2 and the following
apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https://www.iso.org/obp
— IEC Electropedia: available at http://www.electropedia.org/
3.1
Pseudomonas aeruginosa
species of microorganism that is capable of growing in a selective broth and capable of hydrolyzing a
diagnostic 7‐amino‐4‐methylcoumarin aminopeptidase substrate present in the reagent
Note 1 to entry: See Annex A for further information on P. aeruginosa.
4 Principle
A snap pack of dehydrated medium is added to a sample of water (100 ml or 250 ml), or to a dilution of
a sample made up to 100 ml. Sample plus medium is gently shaken to ensure adequate mixing and to
afford dissolution of the medium. When enumeration is required, the sample plus medium (100 ml) is
1) 1)
then aseptically poured into either a Quanti‐Tray or Quanti‐Tray/2000 to enumerate up to 201
organisms or 2 419 organisms respectively per 100 ml sample. The procedure for the enumeration of
1) 1)
250 ml samples is described in 8.2. Trays are sealed with a Quanti‐Tray Sealer. Quanti‐Trays or
vessels (for presence/absence tests) are then incubated at (38 ± 0,5) °C for 24 h to 28 h. Results are
confirmed at 24 h but may be read up to 28 h.
1)
After incubation, vessels or Quanti‐Tray sample wells that exhibit any degree of blue fluorescence
under long wavelength ultraviolet light (365 nm) are considered positive for P. aeruginosa.
By means of statistical tables, or a simple computer program, the MPN of P. aeruginosa in 100 ml or
250 ml of the sample can be determined.
This method is also suitable as a qualitative procedure.
5 Apparatus and glassware
Usual microbiological laboratory equipment, and, in particular, the following equipment.

1)
Quanti‐Tray is a trademark or registered trademark of IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the United
States and/or other countries. This information is given for the convenience of users of this document and does
not constitute an endorsement by ISO of this product.
© ISO 2018 – All rights reserved
5.1 Apparatus for sterilization by steam (autoclave).
Apparatus and glassware not supplied sterile shall be sterilized according to the instructions given in
ISO 8199.
5.2 Hot air oven, for dry heat ster
...

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16266-2
First edition
2018-07
Water quality — Detection and
enumeration of Pseudomonas
aeruginosa —
Part 2:
Most probable number method
Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement de Pseudomonas
aeruginosa —
Partie 2: Méthode du nombre le plus probable
Reference number
©
ISO 2018
© ISO 2018
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address
below or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: +41 22 749 01 11
Fax: +41 22 749 09 47
Email: copyright@iso.org
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2018 – All rights reserved

Contents Page
Foreword . v
Introduction . vi
1  Scope . 1
2  Normative references . 1
3  Terms and definitions . 2
4  Principle . 2
5  Apparatus and gla sswa r e . 2
6  Culture media, diluents and reagents . 3
6.1  Basic materials . 3
6.2  Diluent . 3
6.3  Antifoam B . 3
7  Sampling . 4
8  Procedure . 4
8.1  Transport and storage of the samples . 4
8.2  Preparation of the sample and inoculation of media . 4
8.2.1  Preparation of 100 ml samples . 4
8.2.2  Preparation of 250 ml samples . 4
8.3  Incubation and differentiation . 4
8.4  Examination of results . 5
9  Expression of results . 5
10  Quality assurance . 5
11  Test report . 5
Annex A (informative) Further microbiological information about Pseudomonas
aeruginosa . 7
Annex B (normative) The Quanti-Tray Sealer and calculation of results . 8
Annex C (normative) Composition of the Pseudalert medium . 120
Annex D (informative) Performance characteristics . 121
Bibliography . 122
© ISO 2018 – All rights reserved
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national
standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally
carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a
technical committee has been established has the right to be represented on that committee.
International organizations, governmental and non‐governmental, in liaison with ISO, also take part in
the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,
Microbibiological methods.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
© ISO 2018 – All rights reserved

Introduction
Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen of man that is capable of growth in water at very
low nutrient concentrations. At source and during marketing, a natural mineral water or a spring water
is to be free from Pseudomonas aeruginosa in any 250 ml sample examined (see, for example, Council
Directive 2009/54/EC, Reference [1]). Other bottled waters offered for sale are also to be free of
Pseudomonas aeruginosa in any 250 ml sample (see e.g. Council Directive 98/83/EC, Reference [2]).
Other waters, including swimming and spa pool waters, water for human consumption and hospital
waters, may sometimes be tested for Pseudomonas aeruginosa for reasons of public health. In these
cases, it is typical to examine 100 ml volumes.
The method described in this document can be applied to a range of types of water, for example,
hospital waters, drinking water and non‐carbonated bottled waters intended for human consumption,
groundwater, swimming pool and spa pool waters including those containing high background counts
of heterotrophic bacteria (see References [3], [4], [5], [6] and [7]).
© ISO 2018 – All rights reserved
v
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16266‐2:2018(E)

Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas
aeruginosa — Part 2: Most probable number method
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document
are carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This document specifies a method for the enumeration of Pseudomonas aeruginosa in water. The
method is based on the growth of target organisms in a liquid medium and calculation of the most
probable number (MPN) of organisms by reference to MPN tables.
This document is applicable to a range of types of water. For example, hospital waters, drinking water
and non‐carbonated bottled waters intended for human consumption, groundwater, swimming pool
and spa pool waters including those containing high background counts of heterotrophic bacteria.
This document does not apply to carbonated bottled waters, flavoured bottle waters, cooling tower
waters or marine waters, for which the method has not been validated. These waters are, therefore,
outside the scope of this document. Laboratories can employ the method presented in this document
for these matrices by undertaking appropriate validation of performance of this method prior to use.
The test is based on a bacterial enzyme detection technology that signals the presence of P. aeruginosa
through the hydrolysis of a 7‐amino‐4‐methylcoumarin aminopeptidase substrate present in a special
reagent. P. aeruginosa cells rapidly grow and reproduce using the rich supply of amino acids, vitamins
and other nutrients present in the reagent. Actively growing strains of P. aeruginosa have an enzyme
that cleaves the 7‐amido‐coumarin aminopeptidase substrate releasing a product which fluoresces
under ultraviolet (UV) light. The test described in this document provides a confirmed result within
24 h with no requirement for further confirmation of positive wells.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 8199, Water quality — General guide to the enumeration of micro-organisms by culture
ISO 11133, Microbiology of food, animal feeding stuffs, food production, environment and water —
Preparation, production, storage and performance testing of culture media
ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis
© ISO 2018 – All rights reserved
ISO/IEC Guide 2, Standardization and related activities — General vocabulary
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO/IEC Guide 2 and the following
apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https://www.iso.org/obp
— IEC Electropedia: available at http://www.electropedia.org/
3.1
Pseudomonas aeruginosa
species of microorganism that is capable of growing in a selective broth and capable of hydrolyzing a
diagnostic 7‐amino‐4‐methylcoumarin aminopeptidase substrate present in the reagent
Note 1 to entry: See Annex A for further information on P. aeruginosa.
4 Principle
A snap pack of dehydrated medium is added to a sample of water (100 ml or 250 ml), or to a dilution of
a sample made up to 100 ml. Sample plus medium is gently shaken to ensure adequate mixing and to
afford dissolution of the medium. When enumeration is required, the sample plus medium (100 ml) is
1) 1)
then aseptically poured into either a Quanti‐Tray or Quanti‐Tray/2000 to enumerate up to 201
organisms or 2 419 organisms respectively per 100 ml sample. The procedure for the enumeration of
1) 1)
250 ml samples is described in 8.2. Trays are sealed with a Quanti‐Tray Sealer. Quanti‐Trays or
vessels (for presence/absence tests) are then incubated at (38 ± 0,5) °C for 24 h to 28 h. Results are
confirmed at 24 h but may be read up to 28 h.
1)
After incubation, vessels or Quanti‐Tray sample wells that exhibit any degree of blue fluorescence
under long wavelength ultraviolet light (365 nm) are considered positive for P. aeruginosa.
By means of statistical tables, or a simple computer program, the MPN of P. aeruginosa in 100 ml or
250 ml of the sample can be determined.
This method is also suitable as a qualitative procedure.
5 Apparatus and glassware
Usual microbiological laboratory equipment, and, in particular, the following equipment.

1)
Quanti‐Tray is a trademark or registered trademark of IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the United
States and/or other countries. This information is given for the convenience of users of this document and does
not constitute an endorsement by ISO of this product.
© ISO 2018 – All rights reserved
5.1 Apparatus for sterilization by steam (autoclave).
Apparatus and glassware not supplied sterile shall be sterilized according to the instructions given in
ISO 8199.
5.2 Hot air oven, for dry heat ster
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 16266-2
Première édition
2018-07
Qualité de l'eau — Recherche et
dénombrement de Pseudomonas
aeruginosa —
Partie 2:
Méthode du nombre le plus probable
Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas
aeruginosa —
Part 2: Most probable number method
Numéro de référence
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2018
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos.iv
Introduction . v
1 Domaine d'application . 1
2 Références normatives . 2
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 3
5 Appareillage et verrerie . 3
6 Milieux de culture, diluants et réactifs . 4
6.1 Substances de base . 4
6.2 Diluant . 4
6.3 Antimousse B . 4
7 Échantillonnage . 4
8 Mode opératoire . 4
8.1 Transport et conservation des échantillons . 4
8.2 Préparation de l'échantillon et ensemencement des milieux . 5
8.2.1 Préparation des échantillons de 100 ml . 5
8.2.2 Préparation des échantillons de 250 ml . 5
8.3 Incubation et différenciation . 5
8.4 Examen des résultats . 6
9 Expression des résultats . 6
10 Assurance qualité . 6
11 Rapport d'essai . 7
Annexe A (informative) Informations microbiologiques complémentaires sur Pseudomonas
aeruginosa . 8
Annexe B (normative) Scelleuse Quanti-Tray et calcul des résultats . 9
Annexe C (normative) Composition du milieu Pseudalert . 131
Annexe D (informative) Caractéristiques de performance . 132
Bibliographie . 133
iii
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le
droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité
SC 4, Méthodes microbiologiques.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
Pseudomonas aeruginosa est un organisme pathogène pour l'homme, capable de croître dans l'eau à de
très faibles concentrations nutritives. Toute eau minérale naturelle et toute eau de source doivent être
exemptes de Pseudomonas aeruginosa à la source ainsi qu'à la date de commercialisation, dans 250 ml
d'échantillon examiné (voir, par exemple, la Directive du Conseil 2009/54/CE, Référence [1]). Les
autres eaux commercialisées en bouteille doivent aussi être exemptes de Pseudomonas aeruginosa,
dans 250 ml d'échantillon (voir, par exemple, la directive du Conseil 98/83/CE, Référence [2]). D'autres
eaux, dont les eaux de piscine et de spa, les eaux destinées à la consommation humaine et les eaux
destinées aux hôpitaux, peuvent parfois, pour des raisons de santé publique, faire l'objet d'une
recherche de Pseudomonas aeruginos. Des volumes de 100 ml sont alors généralement étudiés.
La méthode décrite dans le présent document peut être appliquée à différents types d'eau, par exemple,
les eaux destinées aux hôpitaux, l'eau potable et les eaux en bouteille non gazéifiées destinées à la
consommation humaine, les eaux souterraines, les eaux de piscine et de spa, y compris celles contenant
des nombres importants de bactéries hétérotrophes (voir Références [3], [4], [5], [6] et [7]).

v
NORME INTERNATIONALE ISO 16266-2:2018(F)

Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement de Pseudomonas
aeruginosa — Partie 2: Méthode du nombre le plus probable
AVERTISSEMENT — Il convient que l'utilisateur du présent document connaisse bien les
pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n'a pas pour but de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il est de la responsabilité de
l'utilisateur de mettre en place des mesures de sécurité et d'hygiène appropriées.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais conduits conformément au présent
document soient réalisés par un personnel convenablement qualifié.
1 Domaine d'application
Le présent document spécifie une méthode permettant de dénombrer Pseudomonas aeruginosa dans
l'eau. Cette méthode se fonde sur la croissance d'organismes cibles dans un milieu liquide et le calcul du
nombre le plus probable (NPP) d'organismes en se référant aux tables du NPP.
Le présent document s'applique à différents types d'eau. Par exemple, les eaux destinées aux hôpitaux,
l'eau potable et les eaux en bouteille non gazéifiées destinées à la consommation humaine, les eaux
souterraines, les eaux de piscine et de spa, y compris celles contenant des nombres importants de
bactéries hétérotrophes.
Le présent document ne s'applique pas aux eaux en bouteille gazéifiées, aux eaux en bouteille
aromatisées, aux eaux de tour de refroidissement ou à l'eau de mer, pour lesquelles cette méthode n'a
pas été validée. Par conséquent, ces eaux ne relèvent pas du domaine d'application du présent
document. Les laboratoires peuvent utiliser la méthode présentée dans le présent document pour ces
matrices en prenant les mesures adéquates de validation des performances de cette méthode avant son
utilisation.
L'essai se fonde sur une technologie de recherche des enzymes bactériennes qui signale la présence de
P. aeruginosa en hydrolysant un substrat de 7-amino-4-méthylcoumarine aminopeptidase présent dans
un réactif spécial. Les cellules de P. aeruginosa se développent et se reproduisent rapidement à l'aide de
l'apport important en acides aminés, vitamines et autres nutriments présents dans le réactif. Les
souches de P. aeruginosa en développement actif présentent une enzyme qui dissocie le substrat de
7-amido-coumarine aminopeptidase, générant un produit qui présente une fluorescence sous une
lumière ultraviolette (UV). L'essai décrit dans le présent document fournit un résultat confirmé dans un
délai de 24 h sans avoir besoin de confirmer les puits positifs.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 8199, Qualité de l'eau — Exigences et lignes directrices générales pour les examens microbiologiques
sur milieu de culture
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
ISO 19458, Qualité de l'eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique
ISO/IEC Guide 2, Normalisation et activités connexes — Vocabulaire général
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l'ISO/IEC Guide 2 ainsi que les
suivants, s'appliquent.
L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l'adresse https://www.iso.org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l'adresse http://www.electropedia.org/
3.1
Pseudomonas aeruginosa
espèce de micro-organismes capable de se développer dans un bouillon sélectif et capable d'hydrolyser
un substrat de diagnostic de 7-amino-4-méthylcoumarine aminopeptidase présent dans le réactif
Note 1 à l'article: Voir l'Annexe A pour des informations supplémentaires sur P. aeruginosa.
4 Principe
Un sachet de milieu déshydraté est ajouté à un échantillon d'eau (100 ml ou 250 ml), ou à une dilution
d'un échantillon complété à 100 ml. L'échantillon contenant le milieu est doucement agité pour garantir
un mélange adéquat et pour dissoudre le milieu. Lorsque le dénombrement est exigé, l'échantillon
1)
contenant le milieu (100 ml) est versé dans des conditions aseptiques dans un Quanti-Tray ou un
1)
Quanti-Tray/2000 pour dénombrer jusqu'à 201 organismes ou 2 419 organismes respectivement par
échantillon de 100 ml. Le mode opératoire pour le dénombrement des échantillons de 250 ml est décrit
1) 1)
en 8.2. Les plateaux sont étanchéifiés à l'aide d'une scelleuse Quanti-Tray . Les Quanti-Tray ou flacons
(pour les essais de type présence/absence) sont ensuite incubés à (38 ± 0,5) °C pendant 24 h à 28 h. Le
...

ISO/TC 147/SC 4
Date : 2018-07
ISO/TC 147/SC 4
Secrétariat : DIN
Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement de Pseudomonas
aeruginosa — Partie 2 : Méthode du nombre le plus probable
Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa — Part 2: Most probable
number method
ICS : 13.060.70
Type du document:  Norme internationale
Sous-type du document:
Stade du document:  (60) Publication
Langue du document:  F
Type du document:  Norme internationale
Sous-type du document:
Stade du document:  (60) Publication
Langue du document:  F
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Fax : + 41 22 749 09 47
E-mail : copyright@iso.org
Web : www.iso.org
Publié en Suisse
iv
Sommaire Page
Avant-propos . vi
Introduction . vii
1 Domaine d'application . 1
2 Références normatives . 2
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 3
5 Appareillage et verrerie . 3
6 Milieux de culture, diluants et réactifs . 4
6.1 Substances de base . 4
6.2 Diluant . 4
6.3 Antimousse B . 4
7 Échantillonnage . 4
8 Mode opératoire . 4
8.1 Transport et conservation des échantillons . 4
8.2 Préparation de l'échantillon et ensemencement des milieux . 5
8.2.1 Préparation des échantillons de 100 ml . 5
8.2.2 Préparation des échantillons de 250 ml . 5
8.3 Incubation et différenciation . 5
8.4 Examen des résultats . 6
9 Expression des résultats . 6
10 Assurance qualité . 6
11 Rapport d'essai . 7
Annexe A (informative) Informations microbiologiques complémentaires sur Pseudomonas
aeruginosa . 8
Annexe B (normative) Scelleuse Quanti-Tray et calcul des résultats . 9
Annexe C (normative) Composition du milieu Pseudalert . 131
Annexe D (informative) Caractéristiques de performance . 132
Bibliographie . 133
v
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le
droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant : www.iso.org/iso/fr/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité
SC 4, Méthodes microbiologiques.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
vi
Introduction
Pseudomonas aeruginosa est un organisme pathogène pour l'homme, capable de croître dans l'eau à de
très faibles concentrations nutritives. Toute eau minérale naturelle et toute eau de source doivent être
exemptes de Pseudomonas aeruginosa à la source ainsi qu'à la date de commercialisation, dans 250 ml
d'échantillon examiné (voir, par exemple, la Directive du Conseil 2009/54/CE, Référence [1]). Les
autres eaux commercialisées en bouteille doivent aussi être exemptes de Pseudomonas aeruginosa,
dans 250 ml d'échantillon (voir, par exemple, la directive du Conseil 98/83/CE, Référence [2]). D'autres
eaux, dont les eaux de piscine et de spa, les eaux destinées à la consommation humaine et les eaux
destinées aux hôpitaux, peuvent parfois, pour des raisons de santé publique, faire l'objet d'une
recherche de Pseudomonas aeruginos. Des volumes de 100 ml sont alors généralement étudiés.
La méthode décrite dans le présent document peut être appliquée à différents types d'eau, par exemple,
les eaux destinées aux hôpitaux, l'eau potable et les eaux en bouteille non gazéifiées destinées à la
consommation humaine, les eaux souterraines, les eaux de piscine et de spa, y compris celles contenant
des nombres importants de bactéries hétérotrophes (voir Références [3], [4], [5], [6] et [7]).

vii
NORME INTERNATIONALE ISO 16266-2:2018(F)

Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement de Pseudomonas
aeruginosa — Partie 2 : Méthode du nombre le plus probable
AVERTISSEMENT — Il convient que l'utilisateur du présent document connaisse bien les
pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n'a pas pour but de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il est de la responsabilité de
l'utilisateur de mettre en place des mesures de sécurité et d'hygiène appropriées.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais conduits conformément au présent
document soient réalisés par un personnel convenablement qualifié.
1 Domaine d'application
Le présent document spécifie une méthode permettant de dénombrer Pseudomonas aeruginosa dans
l'eau. Cette méthode se fonde sur la croissance d'organismes cibles dans un milieu liquide et le calcul du
nombre le plus probable (NPP) d'organismes en se référant aux tables du NPP.
Le présent document s'applique à différents types d'eau. Par exemple, les eaux destinées aux hôpitaux,
l'eau potable et les eaux en bouteille non gazéifiées destinées à la consommation humaine, les eaux
souterraines, les eaux de piscine et de spa, y compris celles contenant des nombres importants de
bactéries hétérotrophes.
Le présent document ne s'applique pas aux eaux en bouteille gazéifiées, aux eaux en bouteille
aromatisées, aux eaux de tour de refroidissement ou à l'eau de mer, pour lesquelles cette méthode n'a
pas été validée. Par conséquent, ces eaux ne relèvent pas du domaine d'application du présent
document. Les laboratoires peuvent utiliser la méthode présentée dans le présent document pour ces
matrices en prenant les mesures adéquates de validation des performances de cette méthode avant son
utilisation.
L'essai se fonde sur une technologie de recherche des enzymes bactériennes qui signale la présence de
P. aeruginosa en hydrolysant un substrat de 7-amino-4-méthylcoumarine aminopeptidase présent dans
un réactif spécial. Les cellules de P. aeruginosa se développent et se reproduisent rapidement à l'aide de
l'apport important en acides aminés, vitamines et autres nutriments présents dans le réactif. Les
souches de P. aeruginosa en développement actif présentent une enzyme qui dissocie le substrat de
7-amido-coumarine aminopeptidase, générant un produit qui présente une fluorescence sous une
lumière ultraviolette (UV). L'essai décrit dans le présent document fournit un résultat confirmé dans un
délai de 24 h sans avoir besoin de confirmer les puits positifs.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 8199, Qualité de l'eau — Exigences et lignes directrices générales pour les examens microbiologiques
sur milieu de culture
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
ISO 19458, Qualité de l'eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique
ISO/IEC Guide 2, Normalisation et activités connexes — Vocabulaire général
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l'ISO/IEC Guide 2 ainsi que les
suivants, s'appliquent.
L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes :
— ISO Online browsing platform : disponible à l'adresse https://www.iso.org/obp
— IEC Electropedia : disponible à l'adresse http://www.electropedia.org/./
3.1
Pseudomonas aeruginosa
espèce de micro-organismes capable de se développer dans un bouillon sélectif et capable d'hydrolyser
un substrat de diagnostic de 7-amino-4-méthylcoumarine aminopeptidase présent dans le réactif
Note 1 à l'article : Voir l'Annexe A pour des informations supplémentaires sur P. aeruginosa.
4 Principe
Un sachet de milieu déshydraté est ajouté à un échantillon d'eau (100 ml ou 250 ml), ou à une dilution
d'un échantillon complété à 100 ml. L'échantillon contenant le milieu est doucement agité pour garantir
un mélange adéquat et pour dissoudre le milieu. Lorsque le dénom
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