ISO 15088:2007
(Main)Water quality — Determination of the acute toxicity of waste water to zebrafish eggs (Danio rerio)
Water quality — Determination of the acute toxicity of waste water to zebrafish eggs (Danio rerio)
ISO 15088:2007 specifies a method for the determination of degrees of dilution or concentrations as a measure of the acute toxic effect of waste water to fish eggs within 48 h. It is also applicable to treated municipal waste water and industrial effluents.
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité aiguë des eaux résiduaires vis-à-vis des oeufs de poisson-zèbre (Danio rerio)
L'ISO 15088:2007 spécifie une méthode pour déterminer les degrés de dilution ou les concentrations d'eaux résiduaires produisant un effet toxique aigu vis-à-vis des oeufs de poisson en l'espace de 48 h. Elle est également applicable aux eaux résiduaires municipales traitées et aux effluents industriels.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15088
First edition
2007-10-01
Water quality — Determination of the
acute toxicity of waste water to zebrafish
eggs (Danio rerio)
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité aiguë des eaux
résiduaires vis-à-vis des œufs de poisson-zèbre (Danio rerio)
Reference number
ISO 15088:2007(E)
©
ISO 2007
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ISO 15088:2007(E)
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ISO 15088:2007(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction.v
1 Scope.1
2 Normative references.1
3 Terms and definitions .1
4 Interferences .2
5 Principle.3
6 Reagents.3
7 Apparatus.3
8 Procedure.4
9 Determination of toxicological endpoints.7
10 Validity criteria.8
11 Determination of LID .9
egg
12 Expression of results.9
13 Test report.9
14 Reproducibility .9
Annex A (informative) Scheme for layout and distribution of eggs in microplates.11
Bibliography.12
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ISO 15088:2007(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 15088 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological
methods.
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ISO 15088:2007(E)
Introduction
Fish play a major role in the aquatic food web. They are high-order consumers (often final consumers) and
have important functions of regulation in aquatic ecosystems. They are a confirmed part within test concepts
regarding aquatic organisms from different trophic levels.
The eggs of the zebrafish (Danio rerio Hamilton-Buchanan) are used as test material. The zebrafish belongs
to the family of Cyprinidae (carp-related fish) within the class of Osteichthyes (teleost fish). Zebrafish are easy
to keep and produce transparent, nonadhesive eggs (diameter about 1 mm) throughout the whole year. Their
embryonic development is well described. The zebrafish is one of the most important model fish in research
on the developmental biology of vertebrates and is recommended as a test fish, i.e. in the OECD Guidelines
203, 204 and 210.
The development of fertilized fish eggs can be affected by water constituents and effluents. Death of embryos
and certain defined disturbances of embryonic development, which finally lead to death, are considered
effects.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 15088:2007(E)
Water quality — Determination of the acute toxicity of waste
water to zebrafish eggs (Danio rerio)
WARNING — Persons using this International Standard shall be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if any,
associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health
practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this International Standard
be carried out by suitably qualified staff. When applying this International Standard, it is necessary in
each case to determine if and to what extent additional conditions should be established.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of degrees of dilution or of concentrations
as a measure of the acute toxic effect of waste water to fish eggs within 48 h. This International Standard is
also applicable to treated municipal waste water and industrial effluents.
NOTE This International Standard has been elaborated as a substitute for the acute fish toxicity test. Applied to
waste water, it gives the same or similar results as achieved from the acute fish toxicity test (e.g. ISO 7346-1 or
ISO 7346-2). If used for single substances, different sensitivities from both test systems are possible.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
ISO 5814, Water quality — Determination of dissolved oxygen — Electrochemical probe method
ISO 7346-1, Water quality — Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish
(Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] — Part 1: Static method
ISO 7346-2, Water quality — Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish
(Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] — Part 2: Semi-static method
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
control
dilution water with fertilized fish eggs
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ISO 15088:2007(E)
3.2
dilution level
D
reciprocal value of the volume fraction of waste water in dilution water in which the test is conducted
EXAMPLE 250 ml of waste water in a total volume of 1 000 ml (volume fraction of 25 %) represents dilution level
D = 4.
NOTE See ISO 5667-16.
3.3
EC
50
concentration at which there is an effect on 50 % of the organisms in line with the test criterion
NOTE In this International Standard, LC is the lethal concentration at which 50 % of the organisms are dead.
50
3.4
fish egg
generally used term for all development stages of an egg cell (inside the chorion) within this International
Standard
NOTE If necessary, the following qualifiers for this term are used: “not fertilized”, immediately after spawning; “freshly
fertilized”, between 4-cell stage and 128-cell stage; “embryo”, if the developing embryo is visible inside the egg before
hatching.
3.5
lowest ineffective dilution
dilution factor
LID
lowest ineffective dilution tested, expressed as dilution level D (3.2), at which no inhibition, or only effects not
exceeding the test-specific variability, are observed
3.6
LID
egg
lowest ineffective dilution within a test batch in which at least 90 % of the fish eggs do not show any effect
according to this International Standard
NOTE See Clauses 11 and 12 and Figure 2.
3.7
test batch
defined dilutions with fertilized fish eggs
4 Interferences
The differentiation of eggs can be difficult in the case of heavily coloured and/or turbid waste water. In such
cases, the following modified preparation order is used before starting the exposure:
⎯ spawning;
⎯ differentiation into fertilized and unfertilized eggs (8.2.2);
⎯ transfer into dilution water (7.10, crystallization bowls);
⎯ transfer into microplates without previous exposure.
While transferring into microplates, the error in dilution caused by adherent water should be kept as small as
possible.
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ISO 15088:2007(E)
5 Principle
In a dilution series, waste water graduated to integral volume ratio is mixed with dilution water giving defined
dilution levels, D,. After exposure of fertilized fish eggs to the test batches for 48 h using microplates, the
dilution limit in which no acute toxic effect occurs is determined (LID). At 26 °C, the embryos hatch after 72 h
to 96 h. The test duration is 48 h. As a positive control, a solution of 3,7 mg/l of the reference substance,
3,4-dichloroaniline, is tested with 10 fertilized eggs (8.3).
This International Standard may also be used to calculate dose-response-based EC values as percentages
50
of waste water without changing the test design.
6 Reagents
As far as available, use only reagent grade chemicals.
6.1 Water, deionized or of equivalent purity (conductivity < 10 µS/cm).
6.2 Hydrochloric acid, e.g. c(HCl) = 0,1 mol/l.
6.3 Sodium hydroxide solution, e.g. c(NaOH) = 0,1 mol/l.
6.4 Reference substance 3,4-dichloroaniline, stock solution, ρ(C H Cl N) = 100 mg/l.
6 5 2
Stir 0,05 g of dichloroaniline in 500 ml of dilution water (6.5) for 24 h. Adjust the pH to 7,0.
Kept dark in a refrigerator, this stock solution may be stored for up to 6 months. A concentration of 3,7 mg/l is
used as positive control, (8.3).
6.5 Dilution water
Use standard dilution water as specified in ISO 7346-1 and ISO 7346-2.
⎯ 294,0 mg/l of calcium chloride dihydrate, CaCl ⋅ 2 H O;
2 2
⎯ 123,3 mg/l of magnesium sulfate heptahydrate, MgSO ⋅ 7 H O;
4 2
⎯ 63,0 mg/l of sodium hydrogen carbonate, NaHCO ;
3
⎯ 5,5 mg/l of potassium chloride, KCl.
Before adding the reference substance (6.4) or waste water samples to be tested, the dilution water shall be
equilibrated with air to 100 % oxygen saturation at 26 °C ± 1 °C.
7 Apparatus
7.1 Inverse microscope and/or binocular, with a minimum magnification of 30×.
7.2 Exposure vessels, with a volume of 2,5 ml to 5 ml, plain ground, i.e. polystyrene one-way microplates
(24 wells).
7.3 Self-adhesive foil, to cover the microplates.
7.4 Temperature-controlled incubator or climatization of the room to 26 °C ± 1 °C, controlled
illumination during the keeping of parental fish and exposure of eggs.
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ISO 15088:2007(E)
7.5 pH-meter.
7.6 Oxygen probe, see ISO 5814.
7.7 Spawning dishes of inert plastic or glass to sample the eggs during spawning.
7.8 Artificial plants of glass or plastic.
7.9 Pipette, for transfer of the eggs.
7.10 Crystallization dishes or bowls.
7.11 Glassware to prepare the concentration levels and dilution water.
7.11.1 Volumetric flasks.
7.11.2 Graduated cylinders.
7.11.3 G
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 15088
Première édition
2007-10-01
Qualité de l'eau — Détermination de la
toxicité aiguë des eaux résiduaires
vis-à-vis des œufs de poisson-zèbre
(Danio rerio)
Water quality — Determination of the acute toxicity of waste water to
zebrafish eggs (Danio rerio)
Numéro de référence
ISO 15088:2007(F)
©
ISO 2007
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ISO 15088:2007(F)
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Publié en Suisse
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ISO 15088:2007(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction.v
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives.1
3 Termes et définitions .2
4 Interférences .3
5 Principe.3
6 Réactifs.3
7 Appareillage .4
8 Mode opératoire.4
9 Détermination des paramètres toxicologiques .7
10 Critères de validité .9
11 Détermination de LID .9
egg
12 Expression des résultats.9
13 Rapport d'essai.9
14 Reproductibilité .10
Annexe A (informative) Schéma de représentation et de répartition des œufs
sur les microplaques.11
Bibliographie.12
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ISO 15088:2007(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 15088 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
iv © ISO 2007 – Tous droits réservés
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ISO 15088:2007(F)
Introduction
Les poissons jouent un rôle majeur dans la chaîne alimentaire aquatique et sont des consommateurs de
premier ordre (souvent situés en bout de chaîne) qui remplissent d'importantes fonctions de régulation des
écosystèmes aquatiques. Les poissons sont des organismes reconnus dans les stratégies d'essais
concernant les différents niveaux trophiques.
Les œufs de poisson-zèbre (Danio rerio Hamilton-Buchanan) sont utilisés comme matériau d'essai. Les
poissons-zèbres appartiennent à la famille des cyprinidés (carpes) dans le groupe des ostéichtyens
(téléostéens). Ils sont faciles à élever et produisent tout au long de l'année des œufs transparents et non
collants (ayant un diamètre d'environ 1 mm). Leur développement embryonnaire est parfaitement connu. Le
poissons-zèbre constitue l'un des modèles de recherche les plus importants dans le domaine de la biologie du
développement des vertébrés et fait partie des espèces recommandées dans les Lignes directrices 203, 204
et 210 de l'OCDE.
Les constituants de l'eau et les effluents peuvent avoir un impact sur le développement des œufs de poissons
fécondés. La mort des embryons et certaines anomalies définies du développement embryonnaire qui
aboutissent finalement à la mort sont considérés comme des effets.
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NORME INTERNATIONALE ISO 15088:2007(F)
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité aiguë des eaux
résiduaires vis-à-vis des œufs de poisson-zèbre (Danio rerio)
AVERTISSEMENT — Les personnes qui utilisent la présente Norme internationale doivent
parfaitement connaître les pratiques de travail habituelles des laboratoires. La présente Norme
internationale n'a pas pour but de traiter tous les problèmes de sécurité éventuellement liés à son
utilisation. L'utilisateur est tenu d'établir des pratiques de sécurité et d'hygiène adaptées et de
s'assurer que les conditions réglementaires nationales sont respectées.
IMPORTANT — Les essais entrant dans le cadre de la présente Norme internationale doivent
impérativement être réalisés par des personnes ayant une qualification appropriée. Lors de
l'application de la présente Norme internationale, il est nécessaire de déterminer systématiquement
s'il convient d'établir des conditions d'essai supplémentaires, ainsi que leur étendue.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode pour déterminer les degrés de dilution ou les
concentrations d'eaux résiduaires produisant un effet toxique aigu vis-à-vis des œufs de poisson en l'espace
de 48 h. La présente Norme internationale est également applicable aux eaux résiduaires municipales traitées
et aux effluents industriels.
NOTE La présente Norme internationale a été élaborée dans le but de remplacer l'essai de toxicité aiguë vis-à-vis
des poissons. Appliquée aux eaux résiduaires, elle donne des résultats identiques ou similaires à ceux obtenus avec
l'essai de toxicité aiguë sur poisson (par exemple l'ISO 7346-1 et l'ISO 7346-2). Si elle est utilisée pour des substances
individuelles, il convient de tenir compte des éventuelles différences de sensibilité entre les deux systèmes d'essai.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 5667-16, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques
des échantillons
ISO 5814, Qualité de l'eau — Dosage de l'oxygène dissous — Méthode électrochimique à la sonde
ISO 7346-1, Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis d'un poisson
d'eau douce [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei, Cyprinidae)] — Partie 1: Méthode statique
ISO 7346-2, Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité aiguë létale de substances vis-à-vis d'un poisson
d'eau douce [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Téléostei, Cyprinidae)] — Partie 2: Méthode
semi-statique
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ISO 15088:2007(F)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
lot témoin
eau de dilution contenant des œufs de poisson fécondés
3.2
niveau de dilution
D
inverse de la valeur de la fraction volumique des eaux résiduaires dans l'eau de dilution dans laquelle l'essai
est réalisé
EXEMPLE 250 ml d'eaux résiduaires dans un volume total de 1 000 ml (fraction volumique de 25 %) représentent
un niveau de dilution D = 4.
NOTE Voir l'ISO 5667-16.
3.3
CE
50
concentration à laquelle un effet conforme au critère d'essai est observé sur 50 % des organismes
NOTE Dans la présente Norme internationale, CL est la concentration léthale à laquelle 50 % des organismes sont
50
morts.
3.4
œuf de poisson
terme générique désignant tous les stades de développement d'une cellule d’œuf (à l’intérieur du chorion)
dans la présente Norme internationale
NOTE Si nécessaire, on utilise pour ce terme les qualificatifs suivants: «non fécondé», immédiatement après la
ponte; «fraîchement fécondé», stade de développement compris entre 4 et 128 cellules; «embryon», si l'embryon en cours
de développement est visible à l'intérieur de l'œuf avant l'éclosion.
3.5
plus faible dilution sans effet
facteur de dilution
LID
niveau de dilution D (3.2) pour lequel aucune inhibition n'est observée ou bien uniquement des effets ne
dépassant pas la variabilité spécifique à l'essai
3.6
LID
egg
niveau de dilution pour lequel aucune inhibition n’est observée dans un lot d'essai dans lequel au moins 90 %
des œufs de poissons ne présentent aucun effet décrit dans la présente Norme internationale
NOTE Voir Articles 11 et 12 et Figure 2.
3.7
lot d'essai
dilutions définies contenant des œufs de poisson fécondés
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ISO 15088:2007(F)
4 Interférences
Dans le cas d'eaux résiduaires fortement colorées et/ou troubles, la différenciation des œufs peut s'avérer
difficile. L'ordre de préparation est alors modifié de la manière suivante avant de débuter l'exposition:
⎯ ponte;
⎯ différenciation des œufs fécondés et non fécondés (8.2.2);
⎯ transfert dans l'eau de dilution (7.10, cristallisoirs);
⎯ transfert dans des microplaques sans exposition préalable.
Lors du transfert dans les microplaques, il convient de minimiser l'erreur de dilution due à l'eau adhérente.
5 Principe
Dans une série de dilutions, les eaux résiduaires sont mélangées à l'eau de dilution pour obtenir des niveaux
de dilution, D, définis. Après l'exposition des œufs de poisson fécondés aux lots d'essai pendant 48 h dans
des microplaques, on détermine la limite de dilution (LID) à laquelle aucun effet toxique aigu n'apparaît.
À 26 °C, les embryons éclosent après une période comprise entre 72 h et 96 h. La durée de l'essai est
de 48 h. En tant que lot témoin positif, une solution de 3,7 mg/l de substance de référence de 3,4-
dichloroaniline est soumise à l'essai avec 10 œufs fécondés (8.3).
La présente Norme internationale peut également être utilisée pour calculer des valeurs de CE basées sur
50
des relations dose-réponse exprimées en pourcentage d'eaux résiduaires, sans modifier la conception de
l'essai.
6 Réactifs
Dans la mesure du possible, utiliser uniquement des produits chimiques de qualité analytique reconnue.
6.1 Eau, déminéralisée ou de pureté équivalente (conductivité < 10 µS/cm).
6.2 Acide chlorhydrique, par exemple c(HCl) = 0,1 mol/l.
6.3 Solution d'hydroxyde de sodium, par exemple c(NaOH) = 0,1 mol/l.
6.4 Substance de référence 3,4-dichloroaniline, solution mère, ρ(C H Cl N) = 100 mg/l.
6 5 2
Verser 0,05 g de dichloroaniline dans 500 ml d'eau de dilution (6.5) et agiter pendant 24 h. Ajuster le pH à 7,0.
Conserver cette solution mère au réfrigérateur, à l'abri de la lumière, pendant une durée maximale de 6 mois.
Une concentration de 3,7 mg/l est utilisée comme lot témoin positif (8.3).
6.5 Eau de dilution
Utiliser de l'eau de dilution normalisée, tel que spécifié dans l'ISO 7346-1 et l'ISO 7346-2.
⎯ 294,0 mg/l de chlorure de calcium dihydraté, CaCl ,2 H O;
2 2
⎯ 123,3 mg/l de sulfate de magnésium heptahydraté, MgSO ,7 H O;
4 2
⎯ 63,0 mg/l d'hydrogénocarbonate de sodium, NaHCO ;
3
⎯ 5,5 mg/l de chlorure de potassium, KCl.
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ISO 15088:2007(F)
Avant d'ajouter la substance de référence (6.4) ou les échantillons d'eaux résiduaires à soumettre à essai,
équilibrer l'eau de dilution avec de l'air jusqu'à 100 % de saturation en oxygène à 26 °C ± 1 °C.
7 Appareillage
7.1 Microscope inversé et/ou binoculaire, ayant un facteur de grossissement minimal de ×30.
7.2 Récipients d'exposition, ayant un volume de 2,5 ml à 5 ml, à fond plat, par exemple des microplaques
à usage unique en polystyrène (24 puits).
7.3 Film adhésif, pour recouvrir les microplaques.
7.4 Incubateur régulé en température ou climatisation de la pièce à 26 °C ± 1 °C, éclairage contrôlé
pendant la conservation des poissons parents et l'exposition des œufs.
7.5 pH-mètre.
7.6 Sonde à oxygène, voir ISO 5814.
7.7 Bacs de ponte en matière plastique inerte ou en verre pour recueillir les œufs pendant la ponte.
7.8 Plantes artificielles en verre ou en matière plastique.
7.9 Pipette, pour transférer les œufs.
7.10 Cristallisoirs.
7.11 Verrerie pour préparer les niveaux de concentration et l'eau de dilution.
7.11.1 Fioles jaugées.
7.11.2 Éprouvettes graduées.
7.11.3 Pipettes graduées.
7.11.4 Boîtes de Petri
...
Questions, Comments and Discussion
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