ISO 9408:1999
(Main)Water quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium by determination of oxygen demand in a closed respirometer
Water quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium by determination of oxygen demand in a closed respirometer
Qualité de l'eau — Évaluation, en milieu aqueux, de la biodégradabilité aérobie ultime des composés organiques par détermination de la demande en oxygène dans un respiromètre fermé
La présente Norme internationale spécifie une méthode d'évaluation, en milieu aqueux, de la biodégradabilité ultime de composés organiques et d'eaux résiduaires présents à une concentration donnée sous l'action de microorganismes aérobies, par détermination de la demande en oxygène dans un respiromètre fermé. La méthode est applicable à des composés organiques : a) solubles dans l'eau dans les conditions de l'essai; b) peu solubles dans l'eau dans les conditions de l'essai, auquel cas il peut être nécessaire de prendre des mesures particulières assurant une bonne dispersion du composé (voir, par exemple, l'ISO 10634) ; c) n'atteignant pas l'absorbant de C02 et ne réagissant pas avec lui ; d) volatils, à condition d'utiliser un respiromètre adapté ou des conditions appropriées (par exemple un plus petit rapport entre les volumes de l'espace de tête et du milieu liquide) ; e) n'ayant pas d'effet inhibiteur sur les micro-organismes d'essai à la concentration choisie pour l'essai. La présence d'un effet inhibiteur peut être mis en évidence suivant la méthode spécifiée en 7.3, ou par toute autre méthode de détermination de l'effet inhibiteur d'un composé sur les bactéries (voir, par exemple, l'ISO 8192). NOTE Les conditions décrites dans la présente Norme internationale ne correspondent pas toujours aux conditions optimales d'obtention de la biodégradation maximale. D'autres méthodes de biodégradation sont données dans l'ISO 15462.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 9408
Second edition
1999-08-01
Water quality — Evaluation of ultimate
aerobic biodegradability of organic
compounds in aqueous medium
by determination of oxygen demand
in a closed respirometer
Qualité de l'eau — Évaluation, en milieu aqueux, de la biodégradabilité
aérobie ultime des composés organiques par détermination de la demande
en oxygène dans un respiromètre fermé
A
Reference number
Contents Page
1 Scope .1
2 Terms and definitions .1
3 Principle.3
4 Test environment.3
5 Reagents.4
6 Apparatus .5
7 Procedure .5
8 Calculation and expression of results.8
9 Validity of results.10
10 Test report .11
Annex A (informative) Example of calculation of theoretical oxygen demand.12
Annex B (informative) Correction of oxygen uptake for interference by nitrification.14
(informative)
Annex C Example of a biodegradation curve .16
Annex D (informative) Closed respirometer .17
Bibliography.18
© ISO 1999
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Printed in Switzerland
ii
© ISO
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard ISO 9408 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee
SC 5, Biological methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 9408:1991), which has been technically revised.
Annexes A to D of this International Standard are for information only.
iii
INTERNATIONAL STANDARD © ISO ISO 9408:1999(E)
Water quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability
of organic compounds in aqueous medium by determination
of oxygen demand in a closed respirometer
WARNING — Activated sludge and sewage contain potentially pathogenic organisms. Take appropriate
precautions when handling them. Handle with care toxic test compounds and those whose properties are
unknown.
1 Scope
This International Standard specifies a method, by determination of the oxygen demand in a closed respirometer, for
the evaluation in aqueous medium of the ultimate biodegradability of organic compounds and waste waters at a given
concentration by aerobic microorganisms.
The method applies to organic compounds which
a) are water-soluble under the conditions of the test;
b) are poorly water-soluble under the conditions of the test, in which case special measures may be necessary to
achieve good dispersion of the compound (see for example, ISO 10634);
c) do not reach and react with the CO absorbent;
d) are volatile, provided that a suitable respirometer or suitable conditions (e.g. a smaller ratio of volume head
space to volume liquid medium) are used;
e) are not inhibitory to the test microorganisms at the concentration chosen for the test. The presence of inhibitory
effects can be determined as specified in 7.3, or by using any other method for determining the inhibitory effect of
a compound on bacteria (see, for example, ISO 8192).
NOTE The conditions described in this International Standard do not always correspond to the optimal conditions for
allowing the maximum degree of biodegradation to occur. For alternative biodegradation methods, see ISO 15462.
2 Terms and definitions
For the purposes of this International Standard, the following terms and definitions apply.
2.1
ultimate aerobic biodegradation
breakdown of a chemical compound or organic matter by microorganisms in the presence of oxygen to carbon
dioxide, water and mineral salts of any other elements present (mineralization) and the production of new biomass
2.2
primary biodegradation
structural change (transformation) of a chemical compound by microorganisms, resulting in the loss of a specific
property
© ISO
2.3
activated sludge
biomass produced in the aerobic treatment of wastewater by the growth of bacteria and other microorganisms in the
presence of dissolved oxygen
2.4
concentration of suspended solids of an activated sludge
amount of solids obtained by filtration or centrifugation of a known volume of activated sludge and drying at about
105 °C to constant mass
2.5
biochemical oxygen demand
BOD
mass concentration of dissolved oxygen consumed under specified conditions by the aerobic biological oxidation of
a chemical compound or organic matter in water
NOTE It is expressed in this case as milligrams oxygen uptake per milligram (or gram) test compound.
2.6
chemical oxygen demand
COD
mass concentration of oxygen equivalent to the amount of a specified oxidant consumed by a chemical compound
or organic matter when a water sample is treated with that oxidant under defined conditions
NOTE It is expressed in this case as milligrams oxygen consumed per milligram (or gram) test compound.
2.7
theoretical oxygen demand
ThOD
theoretical maximum amount of oxygen required to oxidize a chemical compound completely, calculated from the
molecular formula
NOTE It is expressed in this case as milligrams oxygen required per milligram (or gram) test compound.
2.8
dissolved organic carbon
DOC
that part of the organic carbon in the water which cannot be removed by specified phase separation
–2
NOTE Examples of specified phase separation are centrifugation at 40 000 m{s for 15 min or by membrane filtration
using membranes with pores of 0,2 mm to 0,45 mm diameter.
2.9
lag phase
time from the start of a test until adaptation and/or selection of the degrading microorganisms are achieved and the
biodegradation degree of a chemical compound or organic matter has increased to about 10 % of the maximum
level of biodegradation
NOTE It is expressed in days.
2.10
maximum level of biodegradation
maximum biodegradation degree of a chemical compound or organic matter in a test, above which no further
biodegradation takes place during the test
NOTE It is expressed in percent.
© ISO
2.11
biodegradation phase
time from the end of the lag phase of a test until about 90 % of the maximum level of biodegradation has been
reached
NOTE It is expressed in days.
2.12
plateau phase
time from the end of the biodegradation phase until the end of the test
NOTE It is expressed in days.
2.13
pre-exposure
pre-incubation of an inoculum in the presence of the test chemical compound or organic matter, with the aim of
enhancing the ability of this inoculum to biodegrade the test material by adaptation and/or selection of the
microorganisms
2.14
preconditioning
pre-incubation of an inoculum under the conditions of the subsequent test in the absence of the test chemical
compound or organic matter, with the aim of improving the performance of the test by acclimatization of the
microorganisms to the test conditions
3 Principle
Determination of the biodegradation of organic compounds by aerobic microorganisms is carried out using a static
aqueous test system. Organic compounds in the context of this International Standard include waste waters. The
test mixture contains an inorganic medium, the organic compound as the sole source of carbon and energy at a
mass concentration of normally 100 mg/l organic carbon [but its theoretical oxygen demand (ThOD) shall be at least
100 mg/l], and a mixed inoculum obtained from a waste-water treatment plant or from another source in the
environment.
The mixture is agitated in a closed test vessel and the consumption of oxygen is determined either by measuring
the amount of oxygen required to maintain a constant gas volume in the respirometer vessel, or by measuring the
change in volume or pressure (or a combination of the two) in the apparatus. The evolved carbon dioxide is
absorbed in a suitable substance in the test vessel.
The degradation is followed over a period of 28 d, or longer if necessary, by determining the consumption of oxygen
either automatically or manually. The amount of oxygen consumed by the organic compound (after correction by
comparison with blank control) is expressed as a percentage of either the theoretical oxygen demand (ThOD),
calculated from the formula of the compound, or the chemical oxygen demand (COD).
For sufficiently water-soluble compounds, removal of dissolved organic carbon (DOC) may be determined
(optionally) by measuring the concentration of DOC at the beginning and the end of incubation to obtain additional
information on the ultimate biodegradability. If a substance-specific analytical method is available, information on the
primary degradability may be obtained.
4 Test environment
o o
Incubation shall take place in the dark or in diffused light, at a temperature within the range 20 C to 25 C which
o
shall not vary by more than ± 1 C during the test.
© ISO
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade.
5.1 Water
Distilled or deionized water containing less than 1 mg/l DOC.
5.2 Test medium
5.2.1 Composition
5.2.1.1 Solution a)
Dissolve
anhydrous potassium dihydrogenphosphate (KH PO ) 8,5 g
2 4
anhydrous dipotassium hydrogenphosphate (K HPO ) 21,75 g
2 4
.
disodium hydrogenphosphate dihydrate (Na HPO 2H O) 33,4 g
2 4 2
ammonium chloride (NH Cl) 0,5 g
water (5.1), in quantity necessary to make up to 1000 ml
In order to check this buffer solution, it is recommended to measure the pH, which should be at about 7,4. If this is
not the case prepare a new solution.
5.2.1.2 Solution b)
Dissolve 22,5 g magnesium sulfate heptahydrate (MgSO {H O) in water (5.1), quantity necessary to make up to
4 2
1000 ml.
5.2.1.3 Solution c)
Dissolve 36,4 g calcium chloride dihydrate (CaCl {2H O) in water (5.1), quantity necessary to make up to 1000 ml.
2 2
5.2.1.4 Solution d)
Dissolve 0,25 g iron(III) chloride hexahydrate (FeCl {6H O) in water (5.1), quantity necessary to make up to
3 2
1000 ml. Prepare this solution freshly before use, or add a drop of concentrated hydrochloric acid (HCl) to avoid
precipitation
5.2.2 Preparation of the test medium
For 1000 ml of test medium, add to about 800 ml of water (5.1):
10 ml of solution a);
1 ml of each of the solutions b) to d).
Make up to 1000 ml with the water (5.1). Prepare the test medium freshly before use. The solutions a) to c) may be
stored up to 6 months in the dark at room temperature.
5.3 Carbon dioxide absorber
Potassium hydroxide solution (about 10 mol/l), soda lime pellets or other suitable absorbent.
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5.4 Mercury chloride solution
Dissolve 1 g of mercury(II) chloride (HgCl ) in 100 ml of the water (5.1).
5.5 Sodium hydroxide solution
Dissolve sodium hydroxide (NaOH) in the water (5.1) to obtain a solution of concentration 0,1 mol/l to 0,5 mol/l.
5.6 Hydrochloric acid solution
Dilute concentrated hydrochloric acid (HCl) in the water (5.1) to obtain a solution of concentration 0,1 mol/l to
0,5 mol/l.
6 Apparatus
Ensure that all glassware is thoroughly cleaned and free from organic or toxic matter.
6.1 Closed respirometer
The principle of a closed respirometer is given in annex D. The respirometer contains test vessels allowing oxygen
supply and stirring, including tubing nonpermeable to oxygen and carbon dioxide. The respirometer vessels are
located in a constant temperature room or in a thermostatically controlled water-bath. When testing volatile
compounds, the apparatus used shall be appropriate or adapted to this particular purpose. Care shall be taken that
there is no loss of compound due to the apparatus.
6.2 Water-bath or constant temperature room (to comply with clause 4)
6.3 Equipment for measurement of dissolved organic carbon
Instrument of sufficient sensitivity for the measurement of dissolved organic carbon (DOC) (optional).
)
6.4 Device for determining chemical oxygen demand (COD) (optional
6.5 Centrifuge or device for filtration
The centrifuge shall be capable of producing an acceleration of 4 000 g.
The filtration apparatus shall be equipped with membrane filters (nominal aperture diameter of 0,2 mm to 0,45 mm
pore size) which do not adsorb or release organic carbon.
6.6 pH meter (usual laboratory equipment)
7 Procedure
7.1 Preparation of the test solutions
7.1.1 Test compound
Prepare a stock solution of a sufficiently water-soluble test compound in the test medium (5.2) and add a suitable
amount of this solution to the test vessels to obtain a final mass concentration of 100 mg/l test compound, but
equivalent to at least 100 mg/l ThOD. Depending on the properties of the test compound (e.g. toxicity) and the
purpose of the test, other concentrations may be used. Add compounds of low water-solubility directly into the test
vessels. Determine the added amount exactly. Determine, if required, the COD of the test compound using e.g.
ISO 6060.
NOTE For more details on handling poorly water-soluble compounds, see ISO 10634.
© ISO
7.1.2 Solution of the reference compound
Use as reference compound an organic compound of known biodegradability, such as aniline or sodium benzoate
which have degradation degrees >60 %. Prepare a stock solution of the reference compound in the test medium
(5.2) in the same way as with a water-soluble test compound (7.1.1), in order to obtain a final mass concentration of
100 mg reference compound per litre test medium.
7.1.3 Solution to check inhibition
If required (e.g. when no information on the toxicity of test compound is available), prepare a solution containing, in
the test medium (5.2), both the test compound (7.1.1) and the reference compound (7.1.2) preferably at mass
concentrations of 100 mg/l for each.
7.2 Preparation of the inoculum
7.2.1 General
Prepare the inoculum, using preferably activated sludge or the following sources (7.2.2 to 7.2.4) or a mixture of
these sources, to obtain a microbial population that offers sufficient biodegradative activity. Check the activity of the
inoculum by means of the reference compound (7.1.2 and clause 9). The BOD of the blank shall fulfil the validity
criteria (see clause 9). To reduce the influence of the blank, it may be helpful to precondition the inoculum, e.g. by
aerating it, up to one week before use. Use a suitable volume for inoculation.
NOTE Normally the inoculum should not be pre-exposed to the test compound, to allow a general prediction of the
degradation behaviour in the environment. In certain circumstances, depending on the purpose of the test, pre-exposed inocula
may be used, provided that this is clearly stated in the test report (e.g. percent biodegradation = x %, using pre-exposed
inocula) and the method of pre-exposure is detailed in the test report. Pre-exposed inocula can be obtained from laboratory
biodegradation tests conducted under a variety of conditions [e.g. Zahn-Wellens test (ISO 9888) and SCAS test (ISO 9887)] or
from samples collected from locations where relevant environmental conditions exist (e.g. treatment plants dealing with similar
compounds or contaminated areas).
Based on experience, suitable volume means:
sufficient to give a population which offers enough biodegradation activity;
degrades the reference compound by the stipulated percentage (see clause 9);
3 6
gives between 10 to 10 colony-forming units per millilitre in the final mixture;
gives not greater than the equivalent of 30 mg/l suspended solids of activated sludge in the final mixture;
the quantity of dissolved organic carbon provided by the inoculum should be less than 10 % of the initial
concentration of organic carbon introduced by the test compound;
generally 1 ml to 10 ml of inoculum are sufficient for 1000 ml of test solution.
7.2.2 Inoculum from an activated sludge plant
Take a sample of activated sludge collected from the aeration tank of a full-scale or a laboratory waste water
treatment plant dealing with predominantly domestic sewage. Mix well and determine the concentration of
suspended solids of the activated sludge (use e.g. ISO 11923). If necessary, concentrate the sludge by settling so
that the volume of sludge added to the test assay is minimal but nevertheless fulfils the criteria of 7.2.1. If it is
suspected that the sludge contains inhibiting matter, centrifuge, wash with medium (5.2), recentrifuge and resuspend in
the medium. Keep the sample under aerobic conditions and use preferably on the day of collection. Use a suitable
volume (s
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 9408
Deuxième édition
1999-08-01
Qualité de l'eau — Évaluation, en milieu
aqueux, de la biodégradabilité aérobie
ultime des composés organiques par
détermination de la demande en oxygène
dans un respiromètre fermé
Water quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic
compounds in aqueous medium by determination of oxygen demand
in a closed respirometer
.
A
Numéro de référence
Sommaire Page
1 Domaine d’application .1
2 Termes et définitions.1
3 Principe.3
4 Environnement d'essai.3
5 Réactifs.4
6 Appareillage .5
7 Mode opératoire.5
8 Calcul et expression des résultats.8
9 Validité des résultats.10
10 Rapport d'essai .11
Annexe A (informative) Exemple de calcul de la demande théorique en oxygène.12
Annexe B (informative) Correction de la consommation d'oxygène pour éliminer l'interférence
avec la nitrification .14
Annexe C (informative) Exemple de courbe de biodégradation.16
Annexe D (informative) Respiromètre fermé .17
Bibliographie.18
© ISO 1999
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
Internet iso@iso.ch
Imprimé en Suisse
ii
© ISO
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 9408 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-
comité SC 5, Méthodes biologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 9408:1991), dont elle constitue une révision
technique.
Les annexes A à D de la présente Norme internationale sont données uniquement à titre d'information.
iii
NORME INTERNATIONALE © ISO ISO 9408:1999(F)
Qualité de l'eau — Évaluation, en milieu aqueux, de la
biodégradabilité aérobie ultime des composés organiques par
détermination de la demande en oxygène dans un respiromètre
fermé
AVERTISSEMENT — Les boues activées et les eaux usées contiennent des organismes potentiellement
pathogènes. Prendre les précautions appropriées en les manipulant. Manipuler avec précaution les
composés d'essai toxiques et ceux dont on ne connaît pas les propriétés.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode d'évaluation, en milieu aqueux, de la biodégradabilité ultime
de composés organiques et d'eaux résiduaires présents à une concentration donnée sous l'action de micro-
organismes aérobies, par détermination de la demande en oxygène dans un respiromètre fermé.
La méthode est applicable à des composés organiques
a) solubles dans l’eau dans les conditions de l'essai;
b) peu solubles dans l’eau dans les conditions de l'essai, auquel cas il peut être nécessaire de prendre des
mesures particulières assurant une bonne dispersion du composé (voir, par exemple, l'ISO 10634);
c) n'atteignant pas l'absorbant de CO et ne réagissant pas avec lui;
d) volatils, à condition d'utiliser un respiromètre adapté ou des conditions appropriées (par exemple un plus petit
rapport entre les volumes de l'espace de tête et du milieu liquide);
e) n'ayant pas d'effet inhibiteur sur les micro-organismes d'essai à la concentration choisie pour l'essai. La
présence d’un effet inhibiteur peut être mis en évidence suivant la méthode spécifiée en 7.3, ou par toute autre
méthode de détermination de l'effet inhibiteur d'un composé sur les bactéries (voir, par exemple, l'ISO 8192).
NOTE Les conditions décrites dans la présente Norme internationale ne correspondent pas toujours aux conditions
optimales d'obtention de la biodégradation maximale. D'autres méthodes de biodégradation sont données dans l'ISO 15462.
2 Termes et définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
biodégradation aérobie ultime
en présence d'oxygène, décomposition par des micro-organismes d'un composé chimique ou d'une matière
organique en dioxyde de carbone, eau et sels minéraux issus de tout autre élément présent (minéralisation) et
production de nouvelle biomasse
© ISO
2.2
biodégradation primaire
modification structurelle (transformation) d'un composé chimique sous l'action de micro-organismes, entraînant la
perte d'une propriété spécifique
2.3
boue activée
biomasse produite, lors du traitement aérobie des eaux résiduaires, par la croissance de bactéries ou d'autres
micro-organismes en présence d'oxygène dissous
2.4
concentration de matières en suspension dans une boue activée
quantité de matière solide obtenue par filtration ou centrifugation d'un volume connu de boues activées et séchage
à 105 °C environ jusqu’à masse constante
2.5
demande biochimique en oxygène
DBO
concentration en masse de l’oxygène dissous consommé dans des conditions définies lors de l’oxydation biologique
aérobie d’un composé chimique ou d’une matière organique dans l’eau
NOTE La DBO s'exprime ici en milligrammes d’oxygène consommé par milligramme (ou gramme) de composé d'essai.
2.6
demande chimique en oxygène
DCO
concentration en masse d'oxygène équivalente à la quantité d'oxydant spécifié consommée par un composé
chimique ou une matière organique lorsqu'un échantillon d'eau est traité avec cet oxydant dans des conditions
définies
NOTE La DCO s'exprime ici en milligrammes d'oxygène consommé par milligramme (ou gramme) de composé d'essai.
2.7
demande théorique en oxygène
DThO
quantité théorique maximale d’oxygène nécessaire pour oxyder complètement un composé chimique, calculée à
partir de la formule moléculaire
NOTE La DThO s'exprime ici en milligrammes d’oxygène nécessaire par milligramme (ou gramme) de composé d'essai.
2.8
carbone organique dissous
COD
partie du carbone organique présent dans l'eau qui ne peut être éliminé par la méthode de séparation de phases
spécifiée
–2
NOTE Une séparation de phases peut être spécifiée, par exemple, par centrifugation à 40 000 m·s pendant 15 min ou
par filtration sur membrane de diamètre de pores de 0,2 μm à 0,45 μm.
2.9
phase de latence
durée entre le début d'un essai et le moment où l'adaptation et/ou la sélection des micro-organismes de
dégradation sont achevées et où le taux de biodégradation d'un composé chimique ou d'une matière organique a
atteint environ 10 % du niveau maximal de biodégradation
NOTE La phase de latence est exprimée en jours.
2.10
niveau maximal de biodégradation
dans un essai, taux maximal de biodégradation d'un composé chimique ou d'une matière organique au-delà duquel
aucune biodégradation ne survient plus pendant l'essai
NOTE Le niveau maximal de biodégradation est exprimé en pourcentage.
© ISO
2.11
phase de biodégradation
durée entre la fin de la phase de latence d'un essai et le moment où environ 90 % du niveau maximal de
biodégradation est atteint
NOTE La phase de biodégradation est exprimée en jours.
2.12
phase de plateau
durée entre la fin de la phase de biodégradation et la fin de l'essai
NOTE La phase de plateau est exprimée en jours.
2.13
préexposition
préincubation d'un inoculum en présence du composé chimique ou d'une matière organique, destinée à accroître
l'aptitude de l'inoculum à dégrader le matériau d'essai par adaptation et/ou sélection des micro-organismes
2.14
préconditionnement
préincubation d'un inoculum dans les conditions d'essai, mais en l'absence du composé chimique ou de la matière
organique, destinée à améliorer l'efficacité de l'essai par acclimatation des micro-organismes aux conditions de
l'essai
3 Principe
Détermination de la biodégradation des composés organiques par des micro-organismes aérobies dans un milieu
d’essai aqueux en condition statique. Dans le contexte de la présente Norme internationale, les composés
organiques comprennent également les eaux résiduaires. Le mélange pour essai contient un milieu inorganique, le
composé organique comme seule source de carbone et d’énergie à une concentration normalement égale à
100 mg/l [mais sa demande théorique en oxygène (DThO) doit être d’au moins 100 mg/l] ainsi qu’un inoculum mixte
provenant d’une usine de traitement des eaux résiduaires ou d'une autre source de l’environnement.
Le mélange est agité dans un récipient d'essai fermé et la consommation d'oxygène est déterminée soit par
mesurage de la quantité d'oxygène nécessaire au maintien d'un volume de gaz constant dans le respiromètre, soit
par mesurage des variations de volume et/ou de pression dans l'appareil. Le dioxyde de carbone dégagé est
absorbé par une substance appropriée, à l'intérieur du récipient d'essai.
La dégradation est suivie sur une période de 28 jours, ou davantage si nécessaire, en déterminant la
consommation d'oxygène de façon automatique ou manuelle. La quantité d'oxygène consommée par le composé
organique (après correction par comparaison avec un essai à blanc) est exprimée soit en pourcentage de la
demande théorique en oxygène (DThO), calculée à partir de la formule du composé, soit en pourcentage de la
demande chimique en oxygène (DCO).
Lorsque les composés sont suffisamment solubles dans l'eau, il est possible de déterminer (facultativement)
l'élimination du carbone organique dissous (COD) par mesurage de la concentration en COD en début et en fin
d'incubation, de manière à obtenir des informations complémentaires sur la biodégradabilité ultime. Si une méthode
d'analyse spécifique de la substance est disponible, des informations sur la biodégradabilité primaire peuvent être
obtenues.
4 Environnement d'essai
L'incubation doit être menée à l'abri de la lumière ou sous lumière diffuse, à une température maintenue constante
durant l'essai (à ± 1 °C près) comprise entre 20 °C et 25 °C.
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5 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
5.1 Eau, distillée ou dé-ionisée, dont la teneur en COD est inférieure à 1 mg/l.
5.2 Milieu d'essai
5.2.1 Composition
5.2.1.1 Solution a)
Dihydrogénophosphate de potassium anhydre (KH PO ) 8,5 g
2 4
Monohydrogénophosphate de dipotassium anhydre (K HPO ) 21,75 g
2 4
Monohydrogénophosphate de disodium dihydraté (Na HPO ,2H O) 33,4 g
2 4 2
Chlorure d'ammonium (NH Cl) 0,5 g
Dissoudre dans une quantité suffisante d'eau (5.1) pour complèter à 1 000 ml
NOTE Afin de vérifier cette solution tampon, il est recommandé d'effectuer un mesurage du pH. Si celui-ci n'est pas d'environ
7,4, il convient de préparer une nouvelle solution.
5.2.1.2 Solution b)
Dissoudre 22,5 g de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO ,7H O) dans l'eau (5.1) et compléter à 1 000 ml.
4 2
5.2.1.3 Solution c)
Dissoudre 36,4 g de chlorure de calcium dihydraté (CaCl ,2H O) dans l'eau (5.1) et compléter à 1 000 ml.
2 2
5.2.1.4 Solution d)
Dissoudre 0,25 g de chlorure de fer(III) hexahydraté (FeCl ,6H O) dans l'eau (5.1) et compléter à 1 000 ml. Pour
3 2
éviter les précipités, préparer cette solution juste avant emploi ou ajouter une goutte d'acide chlorhydrique
concentré (HCl).
5.2.2 Préparation du milieu d'essai
Pour 1 000 ml de milieu d'essai, ajouter à environ 800 ml d'eau (5.1):
10 ml de solution a);
1 ml de chacune des solutions b) à d).
Compléter à 1 000 ml avec de l'eau (5.1). Préparer cette solution extemporanément. Les solutions a) à c) peuvent
être conservées pendant 6 mois à l'abri de la lumière et à température ambiante.
5.3 Absorbant du dioxyde de carbone
Solution d'hydroxyde de potassium (à environ 10 mol/l), comprimés de chaux sodée ou tout autre absorbant
approprié.
5.4 Solution de chlorure de mercure
Dissoudre 1 g de chlorure de mercure(II) (HgCl ) dans 100 ml d'eau (5.1).
© ISO
5.5 Solution d'hydroxyde de sodium
Dissoudre l'hydroxyde de sodium (NaOH) dans l'eau (5.1) pour obtenir une solution ayant une concentration de
0,1 mol/l à 0,5 mol/l.
5.6 Solution d'acide chlorhydrique
Diluer de l'acide chlorhydrique concentré (HCl) avec de l'eau (5.1) pour obtenir une solution ayant une
concentration de 0,1 mol/l à 0,5 mol/l.
6 Appareillage
S'assurer que la verrerie de laboratoire a été soigneusement nettoyée et qu'elle est exempte de matières
organiques ou toxiques.
6.1 Respiromètre fermé
Le principe d'un respiromètre fermé est décrit à l'annexe D. Le respiromètre contient des récipients d'essai
permettant l'arrivée d'oxygène et l'agitation ainsi que des tubes imperméables à l'oxygène et au dioxyde de
carbone. Ces récipients sont conservés dans une enceinte isotherme ou un bain-marie thermostaté. Pour les
essais portant sur des composés volatils, utiliser un appareil spécifique ou adapté à cet usage particulier. Veiller à
ce qu'aucune perte de composé ne se produise du fait de l'appareil.
6.2 Bain-marie ou enceinte isotherme (satisfaisant aux exigences de l'article 4).
6.3 Appareil de mesure, d'une sensibilité suffisante pour le dosage du carbone organique dissous (COD)
(facultatif).
6.4 Dispositif de détermination de la demande chimique en oxygène (DCO) (facultatif).
6.5 Centrifugeuse, capable de produire une accélération de 4 000 g, ou dispositif de filtration, équipé de
membranes filtrantes (diamètre nominal des pores de 0,2 μm à 0,45 μm), qui empêchent l'adsorption ou le
relargage du carbone organique.
6.6 pH-mètre (équipement courant de laboratoire).
7 Mode opératoire
7.1 Préparation des solutions d’essai
7.1.1 Composé d'essai
Préparer une solution mère de composé d'essai suffisamment soluble dans l’eau, dans le milieu d’essai (5.2) et
ajouter dans les récipients d’essai une quantité suffisante de cette solution pour obtenir une concentration finale de
100 mg de composé d'essai par litre, mais équivalent au minimum à une demande théorique en oxygène (DThO)
de 100 mg/l. Il est possible d’utiliser d’autres concentrations en fonction des propriétés du composé d'essai (par
exemple toxicité) et de l’objectif de l’essai. Ajouter les composés à faible solubilité dans l’eau directement dans les
récipients d’essai. Déterminer exactement la quantité ajoutée. Déterminer, si nécessaire, la DCO du composé
d'essai, par exemple à l’aide de l’ISO 6060.
NOTE Pour plus de détails sur la manière de procéder avec les composés faiblement solubles dans l’eau, voir l’ISO 10634.
7.1.2 Composé de référence
Utiliser comme composé de référence un composé organique de biodégradabilité connue, tel que l’aniline ou le
benzoate de sodium, qui ont un degré de dégradation supérieur à 60 %. Préparer la solution mère du composé de
référence dans le milieu d’essai (5.2) de la même manière que pour le composé d'essai soluble dans l’eau (7.1.1)
pour obtenir une concentration finale de 100 mg de composé de référence par litre de milieu d'essai.
© ISO
7.1.3 Solution de contrôle de l’inhibition
Si besoin est (par exemple lorsqu’on ne dispose d’aucune information quant à la toxicité du composé d'essai),
préparer une solution contenant dans le milieu d’essai (5.2) à la fois le composé d'essai (7.1.1) et le composé de
référence (7.1.2), de préférence à des concentrations de 100 mg/l pour chacun.
7.2 Préparation de l’inoculum
7.2.1 Généralités
Préparer l’inoculum en utilisant de préférence une boue activée ou les sources suivantes (7.2.2 à 7.2.4) ou encore
un mélange de ces sources, de manière à obtenir une population microbienne qui offre une activité biodégradante
suffisante. Vérifier l’activité de l’inoculum à l’aide du composé de référence (7.1.2 et article 9). Il convient que la
DBO du blanc remplisse les critères de validité (voir l'article 9). Pour réduire l’influence du blanc, il peut être utile de
préconditionner l’inoculum, par exemple en l’aérant pendant une semaine au plus avant l’emploi. Utiliser un volume
convenable pour l’inoculation.
NOTE Afin de permettre une prévision générale du comportement de la dégradation dans l’environnement, il convient,
normalement, de ne pas préexposer l’inoculum au composé d'essai. Dans certaines circonstances, selon l’objectif de l’essai, il
est admis d’utiliser des inoculums préexposés, à condition d'en faire clairement état dans le rapport d’essai (par exemple:
pourcentage de biodégradation = x %, avec des inoculums préexposés) et à condition que la méthode de préexposition soit
détaillée dans le rapport d'essai. Les inoculums préexposés peuvent être obtenus à partir d'essais de biodégradation en
laboratoire effectués dans diverses conditions (par exemple essai de Zahn-Wellens selon l’ISO 9888 ou essai SCAS selon
l’ISO 9887) ou à partir d’échantillons prélevés en des lieux où sont réunies les conditions d'environnement appropriées (par
exemple usines assurant le traitement de composés identiques ou zones contaminées).
Compte tenu de l’expérience, un «volume convenable» signifie
qu'il permet d'obtenir une population offrant une activité de biodégradation suffisante;
qu'il dégrade le composé de référence au pourcentage spécifié (voir l'article 9);
3 6
qu'il fournit entre 10 et 10 unités formant colonies par millilitre dans le mélange final;
que, dans le mélange final, il ne fournit pas plus de l’équivalent de 30 mg/l de matières en suspension
provenant de boues activées;
qu'il convient que la quantité de carbone organique dissous apportée par l'inoculum soit inférieure à 10 % de la
concentration initiale en carbone organique introduite par le composé d'essai.
En règle générale, 1 ml à 10 ml d’inoculum est un volume suffisant pour 1 000 ml de solution d’essai.
7.2.2 Inoculum provenant d’une installation de traitement de boues activées
Prélever un échantillon de boue activée recueillie dans le bassin d’aération d’un laboratoire ou d'une usine de
traitement d'eaux résiduaires d’origine essentiellement domestique. Bien mélanger et déterminer la concentration
des particules solides contenues dans la boue activée (utiliser par exemple l’ISO 11923). Si nécessaire, concentrer
la boue par décantation afin que le volume de boue ajouté à la quantité analysée soit minimal, mais tout en
respectant les critères de 7.2.1. S'il est supposé que la boue contient des matières inhibitrices, centrifuger, laver à
l’aide du milieu d’essai (5.2), centrifuger de nouveau et remettre en suspension dans le milieu d’essai. Conserver
l’échantillon dans des conditions aérobies et l’utiliser de préférence le jour du prélèvement. Utiliser un volume
convenable (voir 7.2.1) pour obtenir 30 mg/l de matières solides en suspension dans le mélange final.
7.2.3 Inoculum provenant d’eaux résiduaires
Prélever un échantillon dans l'affluent ou l'effluent d'un laboratoire ou d'une usine de traitement d'eaux résiduaires
d’origine essentiellemen
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