ISO 14442:1999
(Main)Water quality — Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waste water
Water quality — Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waste water
Qualité de l'eau — Lignes directrices pour essais d'inhibition de la croissance algale avec des matières peu solubles, composés volatiles, métaux et eaux résiduaires
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14442
First edition
1999-12-15
Water quality — Guidelines for algal growth
inhibition tests with poorly soluble
materials, volatile compounds, metals and
waste water
Qualité de l'eau — Lignes directrices pour essais d'inhibition de la
croissance algale avec matières peu solubles, composés volatiles, métaux
et eaux résiduaires
Reference number
ISO 14442:1999(E)
©
ISO 1999
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ISO 14442:1999(E)
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ISO 14442:1999(E)
Contents Page
Foreword.iv
1 Scope .1
2 Analytical characterization of test materials and confirmation of concentrations and stability .1
3 Poorly soluble pure organic substances.2
3.1 General.2
3.2 Preparation of saturated solutions .3
3.3 Solvent addition.3
3.4 Dispersion using an emulsifying agent.4
3.5 Interference with algal growth and its measurement.5
4 Poorly soluble mixtures of organic substances.5
4.1 General.5
4.2 Preparation of test media.6
4.3 Test performance.6
5 Poorly soluble solid inorganic materials.6
6 Volatile substances .7
6.1 General.7
6.2 Test system and growth medium.7
6.3 Test procedure.8
6.4 Interference with algal growth.8
7 Waste waters and environmental samples containing water and sediments .9
8 Coloured and/or turbid samples .9
9 Metals and metal compounds .10
9.1 General.10
9.2 pH buffering.11
9.3 Metal buffering .11
10 Interpretation of results.12
Annex A (informative) Sampling method for testing of volatile substances using a partly filled closed
test system .13
Bibliography .14
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ISO 14442:1999(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
International Standard ISO 14442 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee
SC 5, Biological methods.
Annex A of this International Standard is for information only.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 14442:1999(E)
Water quality — Guidelines for algal growth inhibition tests with
poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waste
water
1 Scope
This International Standard provides guidelines for testing substances for algal growth-inhibition that are difficult to
test and thus not covered by the methods described in ISO 8692 and ISO 10253.
Guidelines are given for preparing the substance for testing and for carrying out an appropriate test. This
International Standard is applicable to the following test substances:
a) poorly soluble pure organic compounds;
b) poorly soluble mixtures of organic substances;
c) poorly soluble inorganic materials;
d) volatile substances;
e) waste waters and environmental samples containing water and sediments;
f) coloured and/or turbid samples;
g) compounds of heavy metals.
The following methods of addition are covered:
� direct;
� dispersion;
� water-soluble and water-accommodated fractions.
Some guidelines related to analytical procedures and interpretation of results have also been included.
References to documents describing the background for the testing of difficult substances are given in the
Bibliography.
2 Analytical characterization of test materials and confirmation of concentrations and
stability
Analytical characterization of test substances and materials and the confirmation of their concentrations and stability
in the testing environment is of major concern to regulatory authorities. Such activities are usually not an integral
part of International Standards concerning algal growth inhibition test methods.
However, there may be situations where analysis may assist in defining the appropriate exposure conditions for test
materials and chemicals, and/or in the interpretation of the results.
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ISO 14442:1999(E)
The relevant properties of substances and materials can be assessed from basic properties such as solubility in
water, partition coefficient (logPow), Henry's constant, photochemical and hydrolytic stability, and biodegradability.
Analytical confirmation is strongly recommended in order to verify test substance concentrations, and is required for
the calculation of EC values of volatile substances (see clause 6). If losses due to adsorption on the test vessels or
during transfer of test solutions and media occur, then analytical confirmation is of particular importance. This
aspect is also addressed in ISO 5667-16.
Due to the static test system used for algal growth inhibition tests, loss of substances due to biodegradation (nearly
all algal cultures contain bacteria), photodegradation, hydrolysis and/or adsorption cannot always be avoided. A
decrease in measured concentrations is difficult to prevent by technical means, and is therefore considered
acceptable for algal growth inhibition tests.
The following precautions are suggested for maintaining test substance concentrations in algal growth inhibition
tests:
a) sterilize media and equipment to reduce the effect of bacterial growth;
b) change the light quality to prevent photodegradation of test substances;
c) avoid contact with water prior to testing to reduce hydrolytic decomposition;
d) treat glassware (e.g. silanization);
NOTE The effectiveness of such a treatment varies from chemical to chemical.
e) pre-condition the glassware with solutions at the test concentrations before addition of the test media.
The effects of such technical measures are, if relevant or possible, monitored by chemical analysis.
Water, waste water and organic/inorganic solids/liquids may contain components that can modify the composition of
the algal growth medium (e.g. by precipitation of a limiting nutrient, complexation of essential elements, addition of
nutrients) and subsequently cause effects on algal growth not related to any toxic components. If such problems
occur, it may be advisable to determine the content of key components of the test material. Some relevant
components are: calcium, magnesium, sodium, potassium, sulfate, chloride, ammonium, nitrate, phosphate,
copper, cobalt, nickel, zinc, cadmium, organic matter [i.e. measured as Chemical Oxygen Demand (COD) and/or
Total Organic Carbon (TOC)].
If the test substance contains a high concentration of readily degradable organic material, subsequent bacterial
growth can disturb the algal growth measurement. When untreated (not filtered or centrifuged) waste water is
tested, contamination with other algal species can occur.
3 Poorly soluble pure organic substances
3.1 General
A pure substance is a substance containing one major component, with minor components as impurities. A poorly
soluble substance is one with a solubility limit below 100 mg/l in water. If, however, growth inhibition occurs at
concentrations much lower than the solubility in water, then the poorly soluble substance can be tested as a water-
soluble substance (added via a stock solution in test medium). This approach is usually not applicable to
substances with a water solubility below 1 mg/l to 10 mg/l (substances of a very low solubility).
The methods described in this clause therefore refer to testing of substances which cause effects on algal growth at
concentrations at or around the solubility limit in water and to testing substances of very low solubility.
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Testing of concentrations nominally above the solubility limit is not recommended. It may, however, be unavoidable
if the solubility limit in water or algal growth medium (which may be different) is not well established or if a
substance spontaneously forms dispersions in the test medium.
NOTE Terminology according to [3] (see Bibliography):
Water solubility below 100 mg/l: "sparingly soluble".
Water solubility below 1 mg/l: "very low solubility".
A number of methods available for preparing test solutions of pure substances are described in ISO 5667-16.
Generally it is preferred to use mechanical means to prepare stock solutions.
3.2 Preparation of saturated solutions
If the solubility of a substance in water is between 1 mg/l and 100 mg/l, saturated solutions can be prepared by
direct addition of the test substance to the test medium. A saturated solution is usually prepared by stirring (e.g.
using a magnetic stirrer or shaking; see also 4.1) an excess amount of the test substance in test medium for a
period of time. A period of 20 h is practical for most substances, but a stirring period of up to three days may be
considered to ensure saturation, provided the substance is stable. Lengthy stirring should be carried out in the dark,
and in the same temperature range in which the growth inhibition test is carried out.
Preferably, the equilibrium should be confirmed by chemical analysis. After a phase separation period of varying
length, the clear phase is collected and tested as the highest concentration. Filtration (through a membrane filter of
poresize0,45�m) or centrifugation may be useful for removing particulate matter.
NOTE Certain membrane filters may interfere with the test substance. The filter should be chosen according to the
physicochemical properties of the test substance and the recommendations of the filter supplier.
Further test concentrations can be prepared by dilution of the saturated solution with test medium. A small volume
of a concentrated suspension of algal culture is then added to the test media to start the test.
NOTE A disadvantage of preparing saturated solutions in this way is that trace impurities in the test substance may be
preferentially enhanced in the solution, if they are more soluble than the major component. For this reason the quantity of test
substance should be the minimum required to ensure that a saturated solution of the test substance can be achieved.
Where possible, prepare stable supersaturated stock solutions with a substance (i.e. stock solution concentrations
in the range 2 to 10 times the saturation value) in test medium by high speed mechanical stirring (e.g. a high speed
1)
blender ) or ultrasonic treatment (a recommended frequency of 20 kHz and a power output of at least 60 W) for a
few minutes to several hours. With both methods, a constant temperature should be maintained during the
treatment by cooling. If phase separation takes place immediately after the treatment has ended, one may choose
2)
to remove (sinking or floating) particles by filtration through a paper filter or by centrifugation. If dissolved
substances are removed by filtration, it is essential to confirm the actual concentrations in the final solution by
chemical analysis. The test solutions can be prepared by dilution of the supersaturated stock solution.
3.3 Solvent addition
The use of a solvent as a carrier to add a substance to a test medium is considered to be a practical and
convenient method for handling organic substances tested at concentrations below 10 mg/l. The recommended
concentration of solvent will not influence the solubility of substances but assist in a rapid and complete mixing of
substances and test medium.
At concentrations of the test substance below 1 mg/l, the solvent addition may be combined with the methods
described in 3.2 to prepare saturated solutions.
1) "Ultra Turrax" is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of
users of ISO 14442 and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
2) Schleicher & Schüll 604 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of ISO 14442 and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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ISO 14442:1999(E)
In principle any organic solvent can be used that meets the following criteria, i.e.:
a) does not inhibit the algal growth at the highest concentration added;
b) is soluble in water at the recommended concentration;
c) does not interact with medium components;
d) does not react with the test substance;
e) does not biodegrade rapidly;
f) does not interfere with the conditions of illumination.
The concentration of a solvent should not exceed 100 �l/l test medium according to ISO 10253 and ISO 8692. In
practice, this solvent concentration for algal tests is obtained by addition of 10 μl solvent per 100 ml of test medium,
a solvent volume that can be added with precision. Solvents such as acetone and t-butanol have been
demonstrated to meet most of the stated criteria in algal growth inhibition tests. t-Butanol, however, is the less
biodegradable. Dimethylsulfoxide (DMSO) is a very efficient solvent, but might in some cases interact more easily
with test substances and the test organism. Tests have shown that none of the solvents alone has any effect on
algal growth up to a concentration of at least 1 ml/l (see ref. [3]). In exceptional cases, higher solvent concentrations
can be used to add higher concentrations of the test substance than possible with 100�l/l.
It is recommended that a concentration series be prepared in the selected solvent, and that aliquots of the stock
solutions be added to the algae-containing test medium already present in the test flasks. Controls with and without
solvent shall be added to the test concentration series. The solvent concentration should be the same for all test
solutions.
3.4 Dispersion using an emulsifying agent
The use of an emulsifier to prepare stock or test dispersions is generally the least preferable method. The nominal
test concentrations may easily be considerably higher than the solubility limit in water, and the emulsifying agent
may also influence the availability of a substance to the algal cells. However, if the exposure conditions with an
emulsifier reflect the actual environmental exposure (e.g. pesticide formulations), and other addition methods
appear to be impracticable, this method may be used. No dispersant should be added to formulated products.
Any emulsifier may be used if it meets the following requirements:
a) no inhibiting effects (direct or indirect) on algal growth at a concentration of 100 mg/l;
b) no or only slight biodegradation within a three-day exposure period;
c) no interference with the nutrient balance of the test medium.
The following emulsifying agents have been demonstrated to meet the stated criteria, but others may be used if
required by the properties of the test substance:
3)
a) polyoxyethylene ethers ;
4)
b) alkyl polyoxyethylene sorbitan ;
5)
c) alkyl sorbitan .
3) Brij 56 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of users of
ISO 14442 and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
4) Tween 80 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of
users of ISO 14442 and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
5) Span 20 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of users
of ISO 14442 and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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A dispersion may be prepared by mixing appropriate amounts of the test substance and the chosen emulsifier by
one of the methods described in 3.2. The concentration of the emulsifier should not exceed 100 mg/l. The selection
of the best emulsifier is made by visually assessing the homogeneity of the stock dispersion.
Additional controls shall be added containing the same emulsifier concentration as in the test media.
3.5 Interference with algal growth and its measurement
If nominal test substance concentrations above the solubility limit or dispersions are tested, relatively high particle
densities may occur in the test medium. High background particle numbers may disturb the growth measurements
when using a particle counter or a spectrophotometer. For this reason, a background test substance concentration
series without algae should be included as a background correction of the measurements. Usually quite high
particle densities (i.e. at the same density level as the inoculum) are acceptable at the start of the test, as their
influence on the subsequent measurements is progressively less due to algal growth.
If treatments to reduce particle density (i.e. by filtration or centrifugation) should lead to considerable loss of soluble
substance, testing with particles present is preferred. In extreme cases, algal growth can be determined by other
methods or validated by counting of algal cells with a microscope.
Fluorimetric measurement of solvent-extracted pigments (see ref. [5]) may be an attractive indirect method of
estimating the algal biomass, which eliminates interferences from particulates. The method however is indirect, as
pigment content may vary with growth conditions.
Bacterial growth on biodegradable test substances or auxiliary substances (i.e. solvents or emulsifiers) cannot be
prevented, as the algal cultures will nearly always contain bacteria. The growth can be delayed, however, by
working under aseptic conditions as much as possible and by using sterilized equipment and media. Significant
interference is expected only at the highest concentrations tested (i.e. in the range of 10 mg/l to 100 mg/l) of highly
degradable substances (e.g. with a five-day biological oxygen demand (BOD )/COD ratio of 0,5 or higher).
5
Solvents and emulsifiers in particular may inhibit or stimulate algal growth. A stimulating effect is probably due to
carbon dioxide or other nutrients released by degradation (at high cell densities the growth of the algal culture is
often carbon-limited). Stimulating effects may complicate the calculation of the EC values (see clause 10).
4 Poorly soluble mixtures of organic substances
4.1 General
Mixtures of organic substances refer to both homogeneous aggregates of a number of compounds with different
physicochemical and/or chemical properties, which can be separated by physical means (e.g. oil products, mixtures
of isomers), and to formulated products (such as formulated pesticides and oil-based drilling fluids) (see ref. [3]).
The method of choice for testing mixtures containing poorly soluble substances and/or volatile substances is the
preparation of water-accommodated fractions (WAFs) by stirring and phase separation (see ref [2]). A WAF is an
aqueous medium containing only that fraction of a substance which remains in the aqueous phase after the
preparation procedure has been terminated. Components of the test substance may be present either in true
solution or as a stable emulsion. When filtered through suitable filters, water-soluble fractions (WSFs) are obtained.
As the (assumed) equilibrium between the test substance and the aqueous phase depends on the ratio of test
substance to liquid, a WAF is prepared for each test concentration separately and should not be diluted. If,
however, stable dispersions are formed by the WAF preparation, these can further be treated in accordance with
3.4.
In 4.2 the general procedure for preparation of a WAF is described.
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In testing WAFs, the results are expressed in terms of the loading rate instead of the usual concentration units. The
loading rate is the amount of test substance from which a WAF is prepared, and is equivalent to the nominal
concentration. The final results shall also be expressed as EL ,EL and NOEL values, where EL represents the
50 10
loading rate and NOEL represents the No Observed Effect Loading rate.
4.2 Preparation of test media
Prepare water-accommodated fractions (WAFs) by mixing the test substance with the algal growth medium at a
range of loading rates in clean mixing vessels, using a suitable mixing apparatus. The mixing vessels should be
cylindrical and fitted with a drain port near the bottom for drawing off the WAF (commercially available aspirator
bottles are quite acceptable). The volume of the mixing vessel should be large enough to contain the volume of
WAF required for the exposure (and for sampling for analysis if relevant). The vessel volume shall also be small
enough to minimize headspace whilst maintaining optimum surface contact between test material and growth
medium. The container should preferably be sealed with ground glass stoppers, although PTFE-lined screw caps or
tightly fitted, aluminium foil-covered neoprene stoppers may be acceptable. The vessel should be tightly sealed to
prevent loss of volatiles and should be incubated in the dark to prevent photochemical degradation of dissolved
components.
Place a magnetic stirring bar (or other stirring apparatus) in each vessel and add the appropriate volume of algal
growth medium. Add the test material last to the surface of the medium, being careful not to contaminate the
sampling port. Initiate mixing with the vortex in the centre extending approximately one third of the distance from the
top to bottom of the vessel. Take care not to draw a vortex of test material all the way to the bottom. If the test
material appears to be forming an emulsion, the stirring speed should be reduced. Make observations of the vortex
depth and mixture appearance.
The mixing period may be determined by carrying out an equilibration study (with analytical monitoring) under the
conditions used to prepare the WAFs. As a guide, a mixing period of 20 h to 24 h has been found to yield a WAF
containing dissolved components of hydrocarbons at equilibrium concentrations between aqueous and undissolved
phases.
Following mixing, allow the contents of the vessels to stand undisturbed for 1 h to 4 h to allow separation of the
aqueous and undissolved phases. Then transfer the aqueous phase (the WAF) directly into the test flasks.
Take care to ensure that any undissolved material is not transferred to the test vessels. Test the WAFs as soon as
possible unless evidence is provided to demonstrate that their composition does not change during storage.
4.3 Test performance
Tests are started by the addition of a small volume of algal suspension to the WAFs. The WAFs usually contain a
relative high number of particles that may prevent the use of a particle counter or a spectrophotometer for the
determination of algal growth at high loading rates (test substance loading rates W 10 g/l required by some
regulations).
Algal cell counting with a microscope can be used to determine the algal growth in such cases. However, if
appropriate, WSFs can be tested instead of WAFs.
If the test substance contains appreciable amounts of biodegradable components, bacterial growth may be
considerable. Its occurrence should be checked by microscopy (or by monitoring the appropriate channels of a
particle counter) and, if relevant, a statement on its influence on the test results should be included in the test report
(see also 3.5).
5 Poorly soluble solid inorganic materials
The materials considered in this clause may be solid metals, metal compounds, minerals, mineral-containing
wastes and mineral products. For such materials, WSFs should be prepared as described in 4.2.
For the WSF preparation, the materials should be in a powder sufficiently fine to be dispersed in the test medium.
Prepare each test substance concentration separately by stirring until the equilibrium of relevant components in the
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test medium has been reached. As a guide, a contact period of 20 h (in the dark at the temperature range of the
algal growth inhibition test) can be maintained. Thereaf
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 14442
Première édition
1999-12-15
Qualité de l'eau — Lignes directrices pour
essais d'inhibition de la croissance algale
avec des matières peu solubles, composés
volatiles, métaux et eaux résiduaires
Water quality — Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly
soluble materials, volatile compounds, metal and waste water
Numéro de référence
ISO 14442:1999(F)
©
ISO 1999
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ISO 14442:1999(F)
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Version française parue en 2000
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ii © ISO 1999 – Tous droits réservés
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ISO 14442:1999(F)
Sommaire Page
Avant-propos.iv
1 Domaine d'application.1
2 Caractérisation analytique des matériaux d’essai et confirmation des concentrations et de la
stabilité .2
3 Substances organiques pures peu solubles .3
3.1 Généralités .3
3.2 Préparation de solutions saturées.3
3.3 Addition de solvants .4
3.4 Dispersion à l’aide d’un agent émulsifiant.5
3.5 Interférence avec la croissance algale et son mesurage .5
4 Mélanges peu solubles de substances organiques.6
4.1 Généralités .6
4.2 Préparation des milieux d’essai.7
4.3 Exécution de l’essai .7
5 Matériaux solides inorganiques peu solubles.7
6 Substances volatiles .8
6.1 Généralités .8
6.2 Système d’essai et milieu de culture.9
6.3 Mode opératoire de l’essai.9
6.4 Interférences avec la croissance algale .9
7 Eaux résiduaires et échantillons environnementaux contenant de l’eau et des sédiments .10
8 Échantillons colorés et/ou turbides.11
9 Métaux et composés métalliques.12
9.1 Généralités .12
9.2 Tamponnage du pH .13
9.3 Tamponnage des métaux.13
10 Interprétation des résultats .13
Annexe A (informative) Méthode d’échantillonnage pour les essais portant sur des substances
volatiles, utilisant un système d’essai clos partiellement rempli.15
Bibliographie .16
© ISO 1999 – Tous droits réservés iii
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ISO 14442:1999(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments de la présente Norme internationale peuvent faire
l’objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
La Norme internationale ISO 14442 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau,
sous-comité SC 5, Méthodes biologiques.
L’annexe A de la présente Norme internationale est donnée uniquement à titre d’information.
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NORME INTERNATIONALE ISO 14442:1999(F)
Qualité de l'eau — Lignes directrices pour essais d'inhibition de la
croissance algale avec des matières peu solubles, composés
volatiles, métaux et eaux résiduaires
1 Domaine d'application
Les présentes lignes directrices ont pour objectif de fournir des modes opératoires applicables aux essais
d’inhibition de la croissance algale impliquant des substances difficiles, lorsque ces essais n’entrent pas dans le
domaine d’application de l’ISO 8692 et de l’ISO 10253.
Les principaux sujets traités dans ces lignes directrices sont les méthodes de préparation de la substance d’essai
ainsi que les modes opératoires nécessaires pour effectuer ces essais dans les règles de l’art. Ces lignes
directrices sont applicables aux substances d’essai suivantes:
a) composés organiques purs peu solubles;
b) mélanges de substances organiques peu solubles;
c) matériaux minéraux peu solubles;
d) substances volatiles;
e) eaux résiduaires et échantillons environnementaux contenant de l’eau et des sédiments;
f) échantillons colorés et/ou turbides;
g) composés de métaux lourds.
Les méthodes d’addition suivantes sont couvertes:
� directe;
� dispersion;
� fractions en suspension dans l’eau et fractions solubles dans l’eau.
Certaines lignes directrices traitant des modes opératoires d’analyse et de l’interprétation des résultats sont
également incluses.
Les références faites à des documents décrivant le contexte présidant aux essais sur des substances difficiles sont
récapitulées dans la bibliographie.
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2 Caractérisation analytique des matériaux d’essai et confirmation des concentrations
et de la stabilité
La caractérisation analytique des substances et matériaux pour essai ainsi que la confirmation de leur
concentration et de leur stabilité dans l’environnement pour essai est un souci majeur pour les autorités
réglementaires. Ces activités ne font normalement pas partie intégrante des méthodes d’essai d’inhibition de la
croissance algale développées dans les Normes internationales.
Cependant, il peut exister des situations dans lesquelles l’analyse peut contribuer à mieux définir les conditions
d'exposition des matériaux et des substances chimiques d'essai et/ou à faciliter l’interprétation des résultats.
Les caractéristiques importantes des substances et matériaux peuvent être évaluées à partir des caractéristiques
de base telles que la solubilité dans l’eau, le coefficient de partage (logPow), la constante de Henry, la stabilité
photochimique et hydrolytique ainsi que la biodégradabilité.
Il est fortement conseillé de procéder à une analyse des concentrations de la substance chimique d’essai,
concentrations qui sont exigées dans le cadre du calcul des valeurs CE des substances volatiles (article 6). Si des
pertes par adsorption sur les parois des récipients pour essai, ou pendant le transfert des solutions et du milieu de
culture, sont à craindre, cette confirmation par analyse sera essentielle. Cet aspect est également traité dans
l’ISO 5667-16.
En raison du caractère statique du système d’essai utilisé pour les essais d’inhibition de la croissance algale, il
n’est pas toujours possible d’éviter les pertes de substances dues à la biodégradation (la plupart des cultures
algales contenant des bactéries), la photodégradation, l’hydrolyse et/ou l’adsorption. En raison des difficultés
inhérentes à la prévention d’une diminution des concentrations mesurées par des moyens techniques, ce
phénomène est donc considéré comme acceptable dans le cadre d’essai d’inhibition de la croissance algale.
Dans le cadre d’essais d’inhibition de la croissance algale, il est suggéré de prendre les précautions suivantes pour
maintenir à un niveau constant les concentrations de la substance d’essai:
a) stériliser les milieux de culture et les matériels utilisés pour réduire au minimum les effets de la croissance
bactérienne;
b) changer la qualité de la lumière pour empêcher une photodégradation des substances d’essai;
c) éviter tout contact avec l’eau avant l’essai pour réduire les risques liés à la décomposition hydrolytique;
d) traiter la verrerie (par exemple par silanisation);
NOTE Ce type de traitement est plus ou moins efficace selon la substance chimique concernée.
e) préconditionner la verrerie avec des solutions aux concentrations d’essai avant l’ajout du milieu d’essai.
Si nécessaire et si possible, contrôler par des analyses chimiques l’effet de ces mesures techniques.
L’eau, les eaux résiduaires, les liquides/solides organiques/inorganiques peuvent contenir des composés
susceptibles de modifier la composition du milieu de culture algale (par précipitation d’un nutriment inhibiteur,
combinaison d’éléments simples, addition de nutriments), et, partant, d’affecter la croissance algale sans
implication de composés toxiques. En présence de ce type de problèmes, il est recommandé de déterminer la
teneur des principaux composés du matériau d’essai. Parmi ces composés on compte: le calcium, le magnésium,
le sodium, le potassium, les sulfates, les chlorures, l’ammoniac, les nitrates, les phosphates, le cuivre, le cobalt, le
nickel, le zinc, le cadmium, les matières organiques [mesurées en termes de demande chimique en oxygène
(DCO) et/ou de carbone organique total (COT)].
Si le matériau contient une forte teneur en substances organiques facilement dégradables, la croissance
bactérienne qui en résulte peut perturber les mesurages de la croissance algale. Les essais portant sur des eaux
résiduaires non traitées (non filtrées, non centrifugées) peuvent entraîner une contamination par d’autres espèces
algales.
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3 Substances organiques pures peu solubles
3.1 Généralités
Une substance pure est une substance constituée d’un composé principal, et de composés secondaires à l’état
d’impuretés. On entend par substance peu soluble une substance dont la limite de solubilité dans l’eau est
inférieure à 100 mg/l. Cependant, si le phénomène d’inhibition de la croissance se produit à des concentrations
bien inférieures à la valeur de solubilité dans l’eau, les substances peu solubles peuvent alors être expérimentées
comme des substances solubles dans l’eau (ajoutées via une solution mère dans le milieu d’essai). Cette approche
ne s’applique généralement pas aux substances dont la solubilité dans l’eau se situe au-dessous de 1 mg/l à
10 mg/l (substances très peu solubles).
Les méthodes décrites dans le présent article font donc référence à des essais de substances affectant la
croissance algale à des concentrations proches de la limite de solubilité dans l’eau, ainsi qu’à des substances
ayant une solubilité très faible.
Il n’est pas conseillé de procéder à des essais faisant intervenir des concentrations nominales supérieures à la
limite de solubilité. Cependant, il peut arriver que cela se produise si les limites de solubilité dans l’eau ou dans le
milieu de culture algale (qui peuvent être différentes) ne sont pas connues avec exactitude, ou bien si une
substance se disperse spontanément dans le milieu d’essai.
NOTE Terminologie selon la référence [3] (voir la bibliographie):
Solubilité dans l’eau inférieure à 100 mg/l: «peu soluble».
Solubilité dans l’eau inférieure à 1 mg/l: «très peu soluble».
L’ISO 5667-16 décrit un certain nombre de méthodes permettant de préparer les solutions pour essai des
substances pures. Pour préparer les solutions mères, il est conseillé, en général, d’utiliser des moyens
mécaniques.
3.2 Préparation de solutions saturées
Si la solubilité dans l’eau d’une substance est comprise entre 1 mg/l et 100 mg/l, il est possible de préparer des
solutions saturées par addition directe de la substance d’essai. Une solution saturée est en général préparée en
agitant (par exemple à l’aide d’un agitateur magnétique, ou en secouant le récipient; voir également 4.2) pendant
un certain temps une quantité en excès de la substance d’essai dans le milieu d’essai. Une période de 20 h suffit
dans la plupart des cas, mais on peut envisager de la prolonger à trois jours pour obtenir une saturation, à
condition que la substance soit stable. Il convient que les agitations prolongées soient faites dans l’obscurité et
dans la même gamme de températures que celle de l’essai d'inhibition de la croissance.
Il est conseillé de confirmer l’état d’équilibre en procédant à une analyse chimique. Après une période plus ou
moins longue pendant laquelle s’opère la séparation des phases, recueillir la phase limpide et la soumettre à
l’essai comme la concentration la plus élevée. Pour éliminer les particules en suspension, il peut s’avérer utile
d’avoir recours à une filtration (sur une membrane de 0,45 μm) ou à une centrifugation.
NOTE 1 Certains types de membranes filtrantes peuvent créer des interférences avec la substance soumise à l’essai. Il
convient de la choisir en tenant compte des propriétés physico-chimiques de la substance d’essai et des recommandations du
fabricant.
D’autres concentrations d’essai peuvent être préparées en diluant la solution saturée avec le milieu d’essai. Pour
commencer l’essai, ajouter aux milieux d’essai un petit volume de la suspension concentrée contenant l’algue mise
en culture.
NOTE 2 L’inconvénient qu’il y a à préparer les solutions saturées de cette manière réside dans le fait que les impuretés se
trouvant à l’état de trace dans la substance d’essai peuvent être accrues dans la solution si elles sont plus solubles que le
composé principal. En conséquence, il convient que la quantité de substance soumise à l’essai corresponde au minimum requis
pour obtenir une solution saturée de la substance d’essai.
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Si possible, préparer des solutions mères supersaturées stables à partir de la substance (c’est-à-dire des solutions
mères à des concentrations multipliant par un facteur de 2 à 10 la valeur de saturation) dans le milieu d’essai à
l’aide d’un dispositif mécanique d’agitation à grande vitesse (par exemple un mélangeur grande vitesse «Ultra
1)
Turrax» ) ou en leur appliquant un traitement aux ultrasons (la fréquence recommandée étant de 20 kHz pour une
puissance d’au moins 60 W en sortie) pendant une période pouvant varier de quelques minutes à plusieurs heures.
Quelle que soit la méthode, il convient de maintenir une température constante pendant le traitement par
refroidissement. Si la séparation des phases se produit immédiatement après la fin du traitement, il est possible
d’éliminer les particules (submergées ou flottantes) par filtration sur un papier-filtre (par exemple Schleicher &
2)
Schüll 604 ) ou par centrifugation. Si cette filtration contribue à éliminer certaines substances dissoutes, il est
essentiel de confirmer les concentrations réelles de la solution finale en procédant à une analyse chimique. Les
solutions d’essai peuvent être préparées en diluant la solution mère supersaturée.
3.3 Addition de solvants
L’utilisation d’un solvant comme vecteur de transfert de la substance dans un milieu d’essai est un moyen très
pratique de manipulation des substances organiques d’essai à des concentrations inférieures à 10 mg/l. La
concentration recommandée de solvant sera sans effet sur la solubilité des substances mais facilitera un mélange
rapide et complet des substances et du milieu d’essai.
Lorsque la concentration de la substance d’essai est inférieure à 1 mg/l, il est possible d’avoir recours, en plus du
solvant, aux méthodes décrites en 3.2 pour préparer des solutions saturées.
En principe, n’importe quel solvant organique peut être utilisé à condition qu’il satisfasse aux critères suivants:
a) ne pas inhiber la croissance algale à la concentration la plus élevée;
b) être soluble dans l’eau à la concentration recommandée;
c) ne pas interagir avec les composés du milieu;
d) ne pas réagir avec la substance d’essai;
e) ne pas être soumis à une biodégradation rapide;
f) ne pas interférer avec les conditions d’éclairage.
Il convient que la concentration d’un solvant ne soit pas supérieure à 100 μl/l de milieu d’essai conformément à
l’ISO 10253 et l’ISO 8692. En pratique, pour les essais d’inhibition de la croissance algale, cette concentration en
solvant est obtenue en ajoutant 10 μl de solvant pour 100 ml de milieu d’essai, l’addition de ce volume de solvant
devant être faite avec précision. Utilisés dans les essais d’inhibition de la croissance algale, les solvants tels que
l’acétone et le t-butanol ont démontré qu’ils remplissaient la plupart des critères indiqués. Le t-butanol est,
cependant, le moins biodégradable des deux. Le diméthylsulfoxyde (DMSO) est un solvant très efficace, mais qui
peut, dans certains cas, interagir trop facilement avec les substances expérimentées et l’organisme pour essai.
Des essais ont permis de démontrer qu’aucun des solvants, lorsqu'il est utilisé seul à une concentration inférieure
ou égale à 1 ml/l (voir la référence [3]), n’a d’effet sur la croissance algale. Dans certains cas exceptionnels, il est
possible d’utiliser des concentrations de solvants supérieures à 100 μl/l, pour pouvoir ajouter des concentrations
plus élevées de la substance d’essai.
1) Le mélangeur grande vitesse «Ultra Turrax» est un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette
information est donnée à l’intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullemement que l’ISO
approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
2) Le papier-filtre «Schleicher & Schüll 604» est un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette
information est donnée à l’intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullemement que l’ISO
approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
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Il est recommandé de préparer une série de concentrations dans le solvant choisi et d’ajouter des parties aliquotes
des solutions mères dans les fioles contenant déjà le milieu d’essai et les algues. Des témoins avec et sans solvant
devront être ajoutés à cette série de concentrations d’essai. Il convient que la concentration en solvant soit la
même pour toutes les solutions soumises à l’essai.
3.4 Dispersion à l’aide d’un agent émulsifiant
Il est déconseillé d’utiliser un agent émulsifiant pour préparer des solutions mères ou des dispersions d’essai. Les
concentrations nominales d’essai peuvent être facilement bien supérieures à la limite de solubilité dans l’eau, et
l’agent émulsifiant peut également influer sur la disponibilité d’une substance vis-à-vis des cellules d’algue.
Toutefois, si les conditions d’exposition avec un émulsifiant sont le reflet des conditions réelles d’exposition (par
exemple formulations de pesticides), et que les autres méthodes d’addition s’avèrent impossibles à mettre en
œuvre, il est possible d’avoir recours à cette méthode. Il y a lieu de ne pas ajouter de dispersant au produit.
Un émulsifiant, quel qu’il soit, peut être utilisé à condition qu’il réponde aux exigences suivantes:
a) pas d’effet inhibiteur (direct ou indirect) sur la croissance algale à une concentration de 100 mg/l;
b) pas ou peu de biodégradation observable sur une période d’exposition de trois jours;
c) pas d’interférence avec l’équilibre nutritionnel du milieu d’essai.
Des essais ont permis de démontrer que les agents émulsifiants suivants remplissaient les critères énoncés,
d’autres peuvent toutefois être utilisés si les propriétés de la substance le nécessitent:
3)
a) éthers de polyoxyéthylène ;
4)
b) alkyl polyoxyéthylène sorbitan ;
5)
c) alkyl sorbitan .
Une dispersion peut être préparée en mélangeant, en quantités appropriées, la substance d’essai et l’émulsifiant
choisi, selon une des méthodes décrites en 3.2. Il convient que la concentration de l’émulsifiant ne dépasse pas
100 mg/l. Le choix de l’émulsifiant le mieux adapté s’opère en évaluant visuellement l’homogénéité de la
suspension mère.
D’autres témoins doivent être ajoutés contenant la même concentration d’émulsifiant que dans le milieu d’essai.
3.5 Interférence avec la croissance algale et son mesurage
Si les essais portent sur des concentrations nominales de la substance d’essai supérieures à la limite de solubilité
ou bien sur des suspensions, la concentration en particules dans le milieu d’essai pourra s’avérer relativement
élevée. Un nombre élevé de particules présentes perturbe les mesurages de la croissance effectués à l’aide d’un
compte-particules ou d’un spectrophotomètre. Pour cette raison, il convient d’inclure une série de concentrations
de la substance d’essai ne contenant pas d’algue pour pouvoir effectuer une correction des mesurages. En
général, des concentrations en particules relativement élevées (c’est-à-dire du même niveau de concentration que
3) Le «Brij 56» est un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée à l’intention
des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullemement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi
exclusif du produit ainsi désigné.
4) Le «Tween 80» est un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée à
l’intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullemement que l’ISO approuve ou recommande
l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
5) Le «Span 20» est un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée à l’intention
des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullemement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi
exclusif du produit ainsi désigné.
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l’inoculum) sont acceptables au début de l’essai, car leur influence sur les mesurages suivants décroît
progressivement à mesure que la croissance algale augmente.
Si les traitements pour réduire les densités des particules (par filtration ou centrifugation) conduisent à une perte
non négligeable en substance soluble, il est préférable d’effectuer les essais sans éliminer les particules. Dans
certains cas extrêmes, la croissance peut être déterminée par d’autres méthodes ou bien validée par un comptage
au microscope des cellules d’algues.
Le mesurage fluorimétrique de pigments extraits à l’aide de solvants (voir la référence [5]) peut s’avérer comme
méthode indirecte satisfaisante pour estimer la biomasse algale, ce qui élimine les interférences dues aux
particules en suspension. Cette méthode est cependant considérée comme indirecte en ce sens que la quantité de
pigments est variable selon les conditions de croissance.
La croissance bactérienne sur des substances pour essai biodégradables ou des substances auxiliaires (telles que
solvants ou émulsifiants) est inévitable en ce sens que les cultures d’algues contiennent pratiquement toujours des
bactéries. Cette croissance peut cependant être freinée en travaillant autant que possible dans des conditions
d’asepsie et en utilisant du matériel et des milieux stériles. Une interférence significative n’est à craindre qu’avec
les concentrations les plus élevées (de l’ordre de 10 mg/l à 100 mg/l) de substances facilement dégradables (c’est-
à-dire ayant un rapport de DBO /DCO supérieur ou égal à 0,5, DBO étant la demande biochimique en oxygène
5 5
après 5 jours).
Les solvants et les émulsifiants en particulier peuvent inhiber ou au contraire stimuler la croissance algale. L’effet
stimulant est probablement dû aux émissions d’oxyde de carbone ou d’autres nutriments résultant du processus de
dégradation (à des concentrations cellulaires élevées, la croissance d’une culture algale est souvent limitée par la
disponibilité du carbone). Les effets stimulants peuvent compliquer le calcul des valeurs CE (voir l’article 10).
4 Mélanges peu solubles de substances organiques
4.1 Généralités
On entend par mélanges de substances organiques des agrégats homogènes de plusieurs composés de
caractéristiques physico-chimiques et/ou chimiques différentes, et pouvant être séparés par des moyens physiques
(par exemple corps gras, mélanges d’isomères) ainsi que des formulations (telles que les pesticides ou les fluides
de forages à base d’huile minérale) (voir la référence [3]).
La méthode la mieux adaptée pour expérimenter les mélanges contenant des substances peu solubles et/ou des
substances volatiles est la préparation de fractions en suspension dans l’eau (WAF) par agitation et séparation des
phases (voir la référence [2]). Une fraction en suspension dans l’eau (WAF) est un milieu aqueux contenant
uniquement la fraction d’une substance qui reste dans la phase aqueuse une fois la préparation terminée. Les
composés de la substance pour essai peuvent être présents soit sous la forme d’une solution proprement dite, soit
d’une émulsion stable. Lorsqu’on les filtre sur des filtres appropriés, on obtient des fractions solubles dans l’eau
(WSF).
Comme l’équilibre (supposé) entre la substance pour essai et la phase aqueuse dépend du rapport substance
d’essai/liquide, préparer une WAF par concentration d’essai, sans dilution. Si, cependant, la préparation de WAF
résulte en des di
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.