ISO 19040-2:2018
(Main)Water quality — Determination of the estrogenic potential of water and waste water — Part 2: Yeast estrogen screen (A-YES, Arxula adeninivorans)
Water quality — Determination of the estrogenic potential of water and waste water — Part 2: Yeast estrogen screen (A-YES, Arxula adeninivorans)
This document specifies a method for the determination of the estrogenic potential of water and waste water by means of a reporter gene assay with a genetically modified yeast strain Arxula adeninivorans. This reporter gene assay is based on the activation of the human estrogen receptor alpha. Arxula adeninivorans is a highly robust and salt- and temperature-tolerant test organism and is especially suitable for the analysis of samples with high salinity (conductivity up to 70 mS/cm). The test organism can be cultivated in medium with sodium chloride content up to 20 %. This method is applicable to: — fresh water; — waste water; — sea water; — brackish water; — aqueous extracts and leachates; — eluates of sediments (fresh water); — pore water; — aqueous solutions of single substances or of chemical mixtures; — drinking water. The limit of quantification (LOQ) of this method for the direct analysis of water samples is between 1,5 ng/l and 3 ng/l 17β-estradiol equivalents (EEQ). The upper threshold of the dynamic range for this test is between 25 ng/l and 40 ng/l 17β-estradiol equivalents (EEQ). Samples showing estrogenic potencies above this threshold have to be diluted for a valid quantification. Extraction and pre-concentration of water samples can prove necessary, if their estrogenic potential is below the given LOQ. An international interlaboratory trial for the validation of this document has been carried out. The results are summarized in Annex F. NOTE Extraction and pre-concentration of water samples can prove necessary.
Qualité de l'eau — Détermination du potentiel œstrogène de l'eau et des eaux résiduaires — Partie 2: Test d'œstrogénicité (A-YES, Arxula adeninivorans)
Le présent document spécifie une méthode permettant de déterminer le potentiel œstrogénique de l’eau et des eaux résiduaires au moyen d’un essai avec un gène rapporteur à l’aide d’une souche de levure génétiquement modifiée Arxula adeninivorans. Cet essai avec gène rapporteur se fonde sur l’activation du récepteur des œstrogènes humains alpha. L’essai détecte la fraction du potentiel œstrogénique ou de l’œstrogénicité d’un échantillon qui est induite par les molécules interagissant avec le récepteur; il ne répond pas aux molécules ayant des modes d’action qui ne passent pas directement par le récepteur comme les modulateurs de la stéroïdogenèse, du transport ou de la clairance des stéroïdes sexuels. L’essai A-YES (essai d’œstrogénicité sur levure Arxula) est un essai avec gène rapporteur qui peut être utilisé pour mesurer l'activation du récepteur alpha des œstrogènes humains (ERα) en présence d'un échantillon contenant des composés qui provoquent des effets œstrogéniques en interagissant avec le récepteur. Ainsi, le dosage détecte l’activité œstrogénique de l’ensemble de l’échantillon dans son état réel comme une mesure intégrale incluant les effets additifs, synergique et antagoniste possibles du mélange sur le récepteur des œstrogènes humains. Arxula adeninivorans est un organisme d’essai très robuste, résistant au sel et à la température qui est particulièrement adapté à l’analyse d’échantillons ayant une salinité élevée (conductivité jusqu’à 70 mS/cm). L’organisme d’essai peut être cultivé dans un milieu contenant jusqu’à 20 % de chlorure de sodium. Cette méthode est applicable: — aux eaux douces; — aux eaux résiduaires; — à l’eau de mer; — à l’eau saumâtre; — aux extraits aqueux et lixiviats; — aux éluats de sédiments (eau douce); — aux eaux interstitielles; — aux solutions aqueuses contenant des substances uniques ou des mélanges chimiques; — à l’eau potable. La limite de quantification (LDQ) de cette méthode pour l’analyse directe d’échantillons d’eau est comprise entre 1,5 ng/l et 3 ng/l d’équivalents 17β-œstradiol (EEQ). Le seuil supérieur de la gamme dynamique pour cet essai est compris entre 25 ng/l et 40 ng/l d’équivalent 17β-œstradiol (EEQ). Les échantillons présentant un potentiel œstrogénique supérieur à ce seuil doivent être dilués pour une quantification valable. L’extraction et la préconcentration des échantillons d’eau peuvent s’avérer nécessaires, si leur potentiel œstrogénique est inférieur à la LDQ donnée. Un essai interlaboratoires international a été réalisé pour la validation du présent document. L’Annexe F fournit un récapitulatif des résultats. NOTE L’extraction et la préconcentration des échantillons d’eau peuvent s’avérer nécessaires.
General Information
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 19040-2
First edition
2018-08
Water quality — Determination of
the estrogenic potential of water and
waste water —
Part 2:
Yeast estrogen screen (A-YES, Arxula
adeninivorans)
Qualité de l'eau — Détermination du potentiel oestrogène de l'eau et
des eaux résiduaires —
Partie 2: Test d'oestrogénicité (A-YES, Arxula adeninivorans)
Reference number
©
ISO 2018
© ISO 2018
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Published in Switzerland
ii © ISO 2018 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 2
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 4
5 Interferences . 4
6 Apparatus and materials. 4
7 Reagents, media and test strains . 5
8 Sampling and samples . 9
8.1 General . 9
8.2 Bottles and material for sampling . 9
8.3 Bottles and material pre-cleaning .10
8.4 Sampling procedure .10
8.5 Transport of samples .10
8.6 Pretreatment of samples .10
8.7 Storage of samples .11
9 Procedure.11
9.1 Test set up .11
9.1.1 Preparation of the reference dilution series .11
9.1.2 Reactivation of the yeast .11
9.1.3 Negative control .12
9.1.4 Blank replicate .12
9.1.5 Sample dilution .12
9.1.6 Field blank .13
9.1.7 Plate set up .13
9.1.8 Inoculation of the test plate .13
9.2 Measurement .14
9.2.1 Measurement of the reporter gene activity .14
9.2.2 Measurement of the cell density .15
9.3 Calculations .15
9.3.1 Background correction .15
9.3.2 Calculation of the relative growth .16
9.3.3 Calculations for assessment of sample blanks .17
9.3.4 Calculation of the reporter gene induction .19
10 Validity criteria .22
11 Assessment criteria .23
12 Test report .23
13 Verification .23
Annex A (informative) Plate set up .25
Annex B (informative) Lyophilization of Arxula adeninivorans cells .26
Annex C (informative) Scheme of test principle .28
Annex D (informative) Test set up for chemicals and extracts .29
Annex E (informative) Preparation of dilution series .30
Annex F (informative) Performance data .31
Annex G (informative) Statistical assessment .41
Annex H (informative) Calculation of estradiol equivalents.42
Annex I (informative) Alternative test design for EEQ determination .45
Annex J (informative) Measurement of the lowest ineffective dilution (LID) of a waste water
— A simplified evaluation for testing of waste water .46
Annex K (informative) Example for statistical evaluation .48
Bibliography .55
iv © ISO 2018 – All rights reserved
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
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constitute an endorsement.
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This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
A list of all parts in the ISO 19040 series can be found on the ISO website.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 19040-2:2018(E)
Water quality — Determination of the estrogenic potential
of water and waste water —
Part 2:
Yeast estrogen screen (A-YES, Arxula adeninivorans)
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document
be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This document specifies a method for the determination of the estrogenic potential of water and waste
water by means of a reporter gene assay with a genetically modified yeast strain Arxula adeninivorans.
This reporter gene assay is based on the activation of the human estrogen receptor alpha.
Arxula adeninivorans is a highly robust and salt- and temperature-tolerant test organism and is
especially suitable for the analysis of samples with high salinity (conductivity up to 70 mS/cm). The test
organism can be cultivated in medium with sodium chloride content up to 20 %.
This method is applicable to:
— fresh water;
— waste water;
— sea water;
— brackish water;
— aqueous extracts and leachates;
— eluates of sediments (fresh water);
— pore water;
— aqueous solutions of single substances or of chemical mixtures;
— drinking water.
The limit of quantification (LOQ) of this method for the direct analysis of water samples is between
1,5 ng/l and 3 ng/l 17β-estradiol equivalents (EEQ). The upper threshold of the dynamic range for
this test is between 25 ng/l and 40 ng/l 17β-estradiol equivalents (EEQ). Samples showing estrogenic
potencies above this threshold have to be diluted for a valid quantification. Extraction and pre-
concentration of water samples can prove necessary, if their estrogenic potential is below the given LOQ.
An international interlaboratory trial for the validation of this document has been carried out. The
results are summarized in Annex F.
NOTE Extraction and pre-concentration of water samples can prove necessary.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org ./obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
blank replicate
additional replicate that contains no test organism, but is treated in the same way as the other replicates
of a sample
[SOURCE: ISO 10872:2010, 3.5]
3.2
culture medium
nutrients presented in a form and phase (liquid or solidified) which support microbiological growth
3.3
dilution level
D
denominator of the dilution coefficient (using the numerator 1) of a mixture of water or waste water
with dilution water as integral number
Note 1 to entry: For undiluted water or waste water, this coefficient per definition is 1→1. The corresponding and
smallest possible value of D is 1. In this document, the arrow indicates the transition from initial total volume to
final total volume.
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 28]
3.4
dilution water
water added to the test sample to prepare a series of defined dilutions
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.7]
3.5
50 % effect concentration
EC
concentration of a compound which causes 50 % of an effect
Note 1 to entry: In the sense of this document the EC is the concentration of a compound which induces 50 % of
the maximal reporter gene activity which can be achieved by this compound.
3.6
field blank
container prepared in the laboratory, using reagent water or other blank matrix, and sent with the
sampling personnel for exposure to the sampling environment to verify possible contamination during
sampling
[SOURCE: ISO 11074:2015, 4.5.3]
2 © ISO 2018 – All rights reserved
3.7
growth rate
proportional rate of increase in cell density
[SOURCE: ISO 10253:2006, 3.2]
3.8
induction rate
quotient of the mean value of wells with enhanced reporter gene activity measured on the plates
treated with a dose of the test sample, and the mean value of the corresponding wells treated with the
negative control using the same strain under identical conditions
Note 1 to entry: Instead of the negative control, the estimated parameter A of the four-parameter model, which
describes the dose response relationship between reference compound and the induction rate, can be used.
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 43, modified — "wells with enhanced reporter gene activity measured"
replaces "mutant colonies"; "corresponding wells" replaces "corresponding plates"; “quotient” replaces
“difference”.]
3.9
inoculum
fraction of a culture of microorganisms used to start a new culture, or an exponentially growing
preculture, in fresh medium
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 44]
3.10
lowest ineffective dilution value
LID
lowest dilution within a test batch which does not show any effect, i.e. no statistically significant
increase in the reporter gene activity compared with the negative control
[SOURCE: ISO 11350:2012, 3.4, modified — “increase in the reporter gene activity” replaces “increase
in the number of revertant wells”.]
3.11
negative control
dilution water without test sample
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 51]
3.12
reference compound
compound with one or more property values that are sufficiently reproducible and well established to
enable the calibration of the measurement method
[SOURCE: ISO 7405:2008, 3.6, modified — “compound” replaces “material”; “the calibration of the
measurement method” replaces “use of the material or substance for the calibration of an apparatus,
the assessment of a measurement method or for the assignment of values to materials”.]
3.13
reporter gene activity
quantitative activity of a gene attached to the promoter sequence of another gene
3.14
test sample
undiluted, diluted or otherwise prepared portion of a sample to be tested, after completion of all
preparation steps such as centrifugation, filtration, homogenization, pH adjustment and determination
of ionic strength
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 92]
4 Principle
The A-YES (Arxula Yeast Estrogen Screen) is a reporter gene assay which can be used for the
measurement of the activation of the human estrogen receptor alpha (ERα) in the presence of a sample
containing compounds which cause estrogenic effects. By this means the assay detects the estrogenic
activity of the whole sample in its actual state as an integral measure including possible additive,
synergistic and antagonistic mixture-effects.
The human estrogen receptor α is constitutively expressed in the yeast cell under control of a TEF1
promoter. The estrogen receptor belongs to the family of nuclear hormone receptors. If agonists of the
estrogen receptor enter the yeast cell, they bind to the estrogen receptor protein and thus induce its
conformational change. As a consequence two receptor proteins form a receptor dimer. This activation
of the estrogen receptor is measured by the induction of the reporter gene phyK which encodes the
enzyme phytase. The phyK is fused to an estrogen dependent promoter which contains estrogen
responsive elements (ERE). The ER-dimer binds to the promoter and by this activates the expression
and secretion of the phytase. Finally, the activity of the phytase as a measure for the estrogenic
potential of the sample is determined using an appropriate substrate which is cleaved to a coloured
reaction product. The reaction product can be measured photometrically. See Annex C for a scheme of
the test principle.
5 Interferences
Coloured or turbid samples might interfere with the photometric detection of the cell density and/
or the detection of the cleaved substrate of the reporter enzyme phytase (see Clause 10 for further
information).
Effects of the sample matrix may lead to a reduction or increase of viable cells and to a reduction or
increase of the measurable signal. Estrogenic effects of a sample may be masked by matrix effects
leading to false negative or false positive test results.
High salinity can cause toxic effects due to the resulting osmotic pressure. The conductivity of a sample
is a measure for its salinity. The Arxula adeninivorans yeast tolerates a conductivity of the sample up to
20 % sodium chloride which meets a conductivity of 180 mS/cm.
Bacterial growth in the test wells is assessed by the blank replicate (3.1). See Clause 10 for further
information.
If filtered samples are tested in order to remove bacteria from the sample solid particles are separated
from the sample also. Thus, substances with estrogenic activity which are adsorbed on particles might
not be detected.
For detailed information about appropriate sampling material that does not influence the test result
see Clause 8.
6 Apparatus and materials
For suitable sampling devices see Clause 8. Use usual laboratory apparatus and glassware if required.
In particular, the following material is needed:
6.1 Temperature- and time-controlled incubator shaker, shaker orbit at least 3 mm, 30 °C to
37 °C with an accuracy of ±1 °C.
If the shaker has no incubation function use a lab shaker with a shaker orbit of at least 3 mm in
combination with an incubator (6.17).
6.2 Lab mini shaker.
4 © ISO 2018 – All rights reserved
6.3 Multi-parameter measurement device for pH and conductivity or separate devices for each
parameter.
6.4 Steam sterilizer.
6.5 Centrifuge, with a rotor for 96-well plates up to 1 000 g and a rotor for 2 ml reaction tubes.
6.6 Sterile filters, cellulose acetat, 0,2 µm pore size.
6.7 Single-channel pipettes, nominal volume 10 µl up to 10 000 µl.
6.8 Multi-channel pipettes, nominal volume 100 µl and 300 µl.
6.9 Transparent polystyrene 96-well plates with flat bottom (F-profile, 300 µl) and lid.
6.10 96-deep well plates with at least 1 ml volume with round bottom and square wells.
6.11 Microplate photometer for 96-well plates, for absorbance measurement for wavelength
405 nm ± 20 nm and 630 nm ± 5 nm or alternatively 600 nm ± 20 nm.
6.12 Air-permeable adhesive foil for deep well plates.
6.13 Reaction tubes, 2 ml.
6.14 Test tubes, 15 ml and 50 ml.
6.15 Multi-channel pipette trough.
6.16 Balance, minimum load 1 mg, d = 0,1 mg.
6.17 Incubator, 30 °C to 37 °C with an accuracy of ±1 °C. For the purpose of using the incubator in
combination with a shaker a cooled incubator is required.
7 Reagents, media and test strains
7.1 Reagents
As far as possible, use “reagent grade“-chemicals.
7.1.1 Hydrochloric acid solution, c(HCl) = 1 mol/l, molecular weight 36,46 g/mol, CAS: 7647-01-0.
7.1.2 Sodium hydroxide solution, c(NaOH) = 1 mol/l, molecular weight 40,00 g/mol, CAS: 1310-73-2.
7.1.3 Ethanol, ≥99,8 %, C H OH, molecular weight 46,07 g/mol, CAS: 64-17-5.
2 5
7.1.4 17β-estradiol, ≥98 %, C H O , molecular weight 272,38 g/mol, CAS: 50-28-2.
18 24 2
7.1.5 Maltose monohydrate, >95 %, C H O ·H O, molecular weight 360,32 g/mol, CAS: 6363-53-7.
12 22 11 2
7.1.6 Sodium nitrate, >99 %, NaNO , molecular weight 84,98 g/mol, CAS: 7631-99-4.
7.1.7 Potassium dihydrogen phosphate, ≥99 %, KH PO , molecular weight 136,09 g/mol,
2 4
CAS: 7778-77-0.
7.1.8 Magnesium sulfate pure, MgSO , molecular weight 120,37 g/mol (water free), CAS: 7487-88-9.
7.1.9 Iron(III) chloride hexahydrate, >97 %, FeCl ·6H O, molecular weight 270,29 g/mol,
3 2
CAS: 10025-77-1.
7.1.10 Calcium nitrate, >99 %, Ca(NO ) , molecular weight 164,09 g/mol, CAS: 10124-37-5.
3 2
7.1.11 Calcium D-pantothenate, >98 %, C H CaN O molecular weight 238,27 g/mol, CAS: 137-08-6.
18 32 2 10
7.1.12 Thiamine hydrochloride, >98,5 %, C H Cl N OS, molecular weight 337,27 g/mol,
12 18 2 4
CAS: 67-03-8.
7.1.13 Niacin, >99,5 %, C H NO , molecular weight 123,11 g/mol, CAS: 59-67-6.
6 5 2
7.1.14 Pyridoxine hydrochloride, >99 %, C H NO ·HCl, molecular weight 205,64 g/mol, CAS: 58-56-0.
8 11 3
7.1.15 D-(+)-Biotin, ≥98,5 %, C H N O S, molecular weight 244,31 g/mol, CAS: 58-85-5.
10 16 2 3
7.1.16 Inositol, ≥99 %, C H O , molecular weight 180,16 g/mol, CAS: 87-89-8.
6 12 6
7.1.17 Boric acid, >99,8 %, H BO , molecular weight 61,83 g/mol, CAS: 10043-35-3.
3 3
7.1.18 Copper(II) sulfate pentahydrate, >99,5 %, CuSO ·5H O, molecular weight 249,68 g/mol,
4 2
CAS: 7758-99-8.
7.1.19 Potassium iodide, >99 %, KI molecular weight 166,00 g/mol, CAS: 7681-11-0.
7.1.20 Manganese sulfate monohydrate, >99 %, MnSO ·H O, molecular weight 169,02 g/mol,
4 2
CAS: 10034-96-5.
7.1.21 Zinc sulfate heptahydrate, >99,5 %, ZnSO ·7H O, molecular weight 287,56 g/mol, CAS:
4 2
7446-20-0.
7.1.22 Sodium molybdate dihydrate, >99,5 %, Na MoO ·2H O, molecular weight 241,95 g/mol,
2 4 2
CAS: 10102-40-6.
7.1.23 Cobalt(II) chloride for synthesis, CoCl , molecular weight 129,84 g/mol, CAS: 7646-79-9.
7.1.24 Trisodium citrate dihydrate, >99 %, C H Na O ·2H O, molecular weight 294,10 g/mol,
6 5 3 7 2
CAS: 6132-04-3.
7.1.25 Citric acid, >99,5 %, C H O , molecular weight 192,12 g/mol, CAS: 77-92-9.
6 8 7
7.1.26 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP), C H NNa O P·6H O, molecular
6 4 2 6 2
weight 371,14 g/mol, CAS: 333338-18-4.
7.1.27 Sodium hydroxide, ≥99 %, NaOH, molecular weight 40,00 g/mol, CAS: 1310-73-2.
6 © ISO 2018 – All rights reserved
7.1.28 Sea salt with the specifications: chloride (Cl) 19 290 mg/l, sodium 10 780 mg/l, sulfate
2 660 mg/l, potassium 420 mg/l, calcium 400 mg/l, carbonate (bicarbonate) 200 mg/l, strontium
8,8 mg/l, boron 5,6 mg/l, bromide 56 mg/l, iodide 0,24 mg/l, lithium 0,3 mg/l, fluoride 1,0 mg/l,
magnesium (Mg) 1 320 mg/l.
7.1.29 Sodium chloride, ≥99 %, NaCl, molecular weight 58,44 g/mol, CAS: 7647-14-5.
7.1.30 Aceton (purity p.a.), C H O, molecular weight 58,08 g/mol, CAS: 67-64-1.
3 6
7.2 Water, grade 3, as defined in ISO 3696; water with conductivity up to 5 µS/cm is acceptable, or
ultrapure water.
If sterile water is needed, autoclave or sterilize by filtration (cellulose acetate, 0,2 µm).
Water as specified here is also used for the preparation of dilution water which is used for the stepwise
dilution of the test sample.
7.3 Test strain
This test strain is derived from Blastobotrys adeninivorans G1214 Syn.: Arxula adeninivorans G1214
(aleu2 aura3::ALEU2), Reference [1]. This strain displays an uracil auxotrophy. To prevent any formations
of antibiotic resistances in environment and to increase acceptance regarding legal requirements the
test organism contains no antibiotic resistance markers.
Genetic modifications: Integration of the selection marker AURA3mm in the plasmid Xplor2-102-hERα-
GAA2(ERE107)-phyK after exchange of the marker ALEU2 promoter-ATRP1m. The selection marker
AURA3mm was isolated from the plasmid pCR4-AURA3mm-13. The sequences of E. coli and Kanamycin
resistant marker were eliminated through restriction digestion. Stable integration of Xplor2-102-hERα-
GAA2(ERE107)-phyK in Arxula adeninivorans genome was achieved by transformation the cassette in
uracil auxotroph mutant of A. adeninivorans G1214 (aleu2 aura3::ALEU2) through recombination with
25S-rDNA.
The yeast cell suspension for determination of the estrogenic potential of aqueous samples is prepared
from lyophilized yeast cells. As the Arxula adeninivorans cells are lyophilized the test can be conducted
under highly standardized conditions and no specific lab equipment for long-term cell cultivation is
required.
The yeast cells are available commercially. Store the lyophilized yeast cells between 4 °C and 8 °C and
follow the manufacturer’s recommendations. After reactivation, the yeast cells can directly be used for
the test, precultivation is not needed for testing.
An alternative to commercially available lyophilized yeast cells are self-made lyophilized yeast cells.
The preparation procedure is described in Annex B. The yeast strain can be isolated from commercially
available lyophilisate.
7.4 Media.
If autoclaving is necessary autoclave for 20 min at 121 °C ± 2 °C. Cover vessels loosely (e.g. with
aluminium foil). Never seal air-tight.
7.4.1 17β-estradiol (E2) stock solution.
Dissolve 10 mg of 17β-estradiol (E2) (7.1.4) in 10 ml ethanol (7.1.3). Store the 17β-estradiol (E2) stock
solution at ≤−18 °C. Store the stock solution no longer than 18 months.
If available certified 17β-estradiol reference standard of equal concentration can be used as stock
solution.
7.4.2 17β-estradiol (E2) working solution.
Dilute 17β-estradiol (E2) stock solution (7.4.1) 1→100 by adding 10 µl of the 17β-estradiol (E2) stock
solution (7.4.1) to 990 µl ethanol (7.1.3) and mix well. Make a further 1→10 dilution by adding 100 µl of
the first dilution to 900 µl ethanol (7.1.3) and mix well. The final concentration is 1 mg/l. The working
solution shall be aliquoted in order to avoid thawing and freezing of the working solution. Store the
17β-estradiol (E2) working solution at ≤−18 °C. Store the working solution no longer than six months.
NOTE Pipetting of organic solvents requires the usage of adequate calibrated pipettes or other suitable
liquid handling equipment.
7.4.3 Maltose solution.
Dissolve 20 g of maltose monohydrate (7.1.5) in 70 ml ultrapure water (7.2). Fill the maltose solution up
to 100 ml with ultrapure water (7.2). Autoclave the solution. Store the maltose solution at 2 °C to 8 °C.
Store the maltose solution no longer than six months.
7.4.4 Salt solution for yeast minimal medium.
Dissolve 3,7 g of NaNO (7.1.6), 8,4 g KH PO (7.1.7) and 1 g of MgSO (7.1.8) in 70 ml ultrapure
3 2 4 4
water (7.2). Fill up to 100 ml with ultrapure water (7.2). Autoclave the solution. Store the salt solution
for yeast minimal medium at 2 °C to 8 °C. Store the salt solution no longer than six months.
7.4.5 Salt solution for saline yeast minimal medium.
Dissolve 28 g of NaCl (7.1.29), 3,7 g of NaNO (7.1.6), 8,4 g KH PO (7.1.7) and 1 g of MgSO (7.1.8) in
3 2 4 4
70 ml ultrapure water (7.2). Fill up to 100 ml with ultrapure water (7.2). For the analysis of sea water
samples and brackish water samples the 28 g of NaCl may be replaced by 28 g of a salt composition
similar to the salt composition of sea water. Autoclave the solution. Store the salt solution for saline
yeast minimal medium at 2 °C to 8 °C no longer than six months.
7.4.6 Micronutrient solution.
Weigh the following chemicals separately:
0,05 g H BO (7.1.17), 0,01 g CuSO ·5H O (7.1.18), 0,01 g KI (7.1.19), 0,04 g MnSO ·H O (7.1.20),
3 3 4 2 4 2
0,04 g ZnSO ·7H O (7.1.21), 0,02 g Na MoO ·2H O (7.1.22), 0,01 g CoCl (7.1.23).
4 2 2 4 2 2
Merge the chemicals and dissolve them in 100 ml ultrapure water (7.2). Autoclave the solution.
Precipitation after autoclaving has no influence on quality. Shake the solution before using it. Store the
micronutrient solution at 2 °C to 8 °C. Store the micronutrient solution no longer than 12 months.
7.4.7 FeCl solution.
Weigh 0,2 g of Fe(III)Cl hexahydrate (7.1.9) and dissolve it in 20 ml ultrapure water (7.2). Sterilize the
FeCl solution by filtration (0,2 µm). Store the FeCl solution at 2 °C to 8 °C. Store the FeCl solution no
3 3 3
longer than six months.
7.4.8 Ca(NO ) solution.
3 2
Weigh 10 g of Ca(NO ) (7.1.10) and dissolve it in 10 ml of ultrapure water (7.2). Sterilize the Ca(NO )
3 2 3 2
solution by filtration (0,2 µm). Store the Ca(NO ) solution at 2 °C to 8 °C. Store the Ca(NO ) solution no
3 2 3 2
longer than six months.
7.4.9 Vitamin mix.
Weigh the following chemicals separately:
8 © ISO 2018 – All rights reserved
0,2 g Calcium-D-panthothenate (7.1.11), 0,2 g thiamin hydrochloride (7.1.12), 0,05 g niacin (7.1.13),
0,02 g biotin (7.1.15), 0,2 g pyridoxin hydrochloride (7.1.14), 2 g inositol (7.1.16).
Merge and dissolve the vitamins in 50 ml ultrapure water (7.2). Sterilize the vitamin mix by
filtration (0,2 µm). Store the vitamin mix at 2 °C to 8 °C no longer than six months.
7.4.10 Yeast minimal medium with maltose.
Pipette 1 ml of FeCl solution (7.4.7), 1 ml of Ca(NO ) solution (7.4.8), 1 ml of micronutrient
3 3 2
solution (7.4.6) and 0,5 ml vitamin mix (7.4.9) to 96,5 ml of the salt solution (7.4.4). Add 100 ml maltose
solution (7.4.3).
The yeast minimal medium with maltose is five-fold concentrated. Store the yeast minimal medium at
2 °C to 8 °C. Store the yeast minimal medium no longer than six months.
7.4.11 Saline yeast minimal medium with maltose.
Pipette 1 ml of FeCl solution (7.4.7), 1 ml of Ca(NO ) solution (7.4.8), 1 ml of micronutrient
3 3 2
solution (7.4.6) and 0,5 ml vitamin mix (7.4.9) to 96,5 ml of the salt solution for saline yeast minimal
medium (7.4.5). Add 100 ml maltose solution (7.4.3).
The saline yeast minimal medium with maltose is five-fold concentrated. Store the saline yeast minimal
medium at 2 °C to 8 °C. Store the saline yeast minimal medium no longer than six months.
7.4.12 Substrate buffer.
Weigh 10,35 g of trisodiumcitrate dihydrate (7.1.24) and 12,45 g of citric acid (7.1.25) separately.
Dissolve every reagent in 60 ml of ultrapure water (7.2). Merge the two solutions and fill up to 200 ml
with ultrapure water (7.2). Autoclave the substrate buffer and cool down before using it. Store the
substrate buffer at 2 °C to 8 °C. Store the substrate buffer no longer than six months.
7.4.13 Phytase substrate solution.
Weigh at least 15 mg of 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (7.1.26) and dissolve it in
equivalent volume substrate buffer. A volume of 15 ml phytase substrate solution is sufficient for two
test plates. Prepare phytase substrate solution always fresh and use within 2 h.
7.4.14 Developer.
Dissolve 24 g of solid sodium hydroxide (7.1.27) in 200 ml ultrapure water (7.2). Autoclave the sodium
hydroxide solution and cool down before using it. Store the developer at room temperature. Store the
developer solution no longer than six months.
8 Sampling and samples
8.1 General
This document describes specific requirements for the sampling with respect to the determination of
estrogenic activity in water samples. For general information about sampling consider ISO 5667-16.
8.2 Bottles and material for sampling
Use clean glass bottles (borosilicate glass) with polytetrafluoroethylene (PTFE)-lined caps. To avoid
photo-degradation of compounds of interest, use amber glass bottles. If transparent glass bottles are
used, wrap the bottles in aluminium foil or store them in a dark container.
Alternatively, bottles made from aluminium or stainless steel (both uncoated) may be used. Assess that
a material different from borosilicate glass does not affect results.
8.3 Bottles and material pre-cleaning
After the routine cleaning procedure, additionally clean the bottles and the caps as follows: rinse the
clean bottles and the caps three times with a minimum amount of acetone (7.1.30). Let the residual
acetone evaporate (e.g. drying oven). Close the bottles immediately after drying.
Rinse all glassware, spatulas etc. getting in contact with the sample three times with a minimum
amount of acetone (7.1.30). Let the residual acetone evaporate.
8.4 Sampling procedure
Use disposable nitrile-gloves during sampling. Do not use any hand-cream prior to sampling and avoid
skin contact with the sample. Use material from glass, PTFE, aluminium or stainless steel only.
Fill the bottles completely. Consider possible expansion of the sample due to a change of temperature. If
the samples are to be frozen as part of their preservation, the bottles shall not be completely filled. This
is in order to prevent breakage which may arise from expansion of ice during the freezing and thawing
process.
Do not stabilize the samples with chemicals.
Either cool down the samples to 2 °C to 8 °C or freeze the samples at ≤−18 °C.
8.5 Transport of samples
Deliver the samples to the laboratory as soon as possible after sampling.
During transport keep the sample container frost- and break-proof, protected from exposure to light,
temperature increase and external contamination.
Cooling or freezing procedures shall be applied to the samples in order to increase the time period
available for transport and storage. Cooling should commence as soon as possible after sampling for
instance in cool boxes with ice, frozen gel packs, or cooling elements. A cooling device in the transport
vehicle is also suitable. A cooling temperature during transport of 2 °C to 8 °C has been found suitable.
The suggested cooling temperature applies to the surrounding of the sample (e.g. inside the cooling
box) and not for the sample itself.
If the sample is frozen, avoid thawing of the sample (e.g. transport on dry ice). If dry ice is chosen for
transport, the bottles should be wrapped in paper or in air bubble film to avoid direct contact with the
dry ice.
8.6 Pretreatment of samples
Preferably analyse the samples non-filtered immediately after sampling because of the possible loss
of particle associated estrogenic activity. The decision about a sample filtration (e.g. cellulose acetate,
0,45 μm pore size) is to be taken by the performing laboratory according to the application and based
on the experience with the sample type under investigation. Report in any case if a filtered or non-
filtered sample was tested. Further information about possible impacts of filtration on samples with
estrogenic activity is given in References [13] and [14].
Adjust the sample to a pH of 7,2 ± 0,2 using either HCl (7.1.1) or NaOH solution (7.1.2). Select the acid or
alkali concentrations such that the added volumes are as small as possible. Avoid over-titration. Dilute
HCl (7.1.1) or NaOH solution (7.1.2) if necessary. The adjustment of the sample pH might affect the
sample. Report all visible changes caused by the adjustment of the pH value (See ISO 5667-16).
Measure the conductivity of the sample.
10 © ISO 2018 – All rights reserved
8.7 Storage of samples
Test the samples immediately after sampling. If this is not possible, keep water samples at 2 °C to
8 °C (<7 d) or below −18 °C (up to two months). For multiple testing divide larger samples in advance
into appropriate portions, since thawed samples can only be used on the same day. Avoid thawing
and freezing of samples more than once before analysis. Thaw the sample in the dark at a maximal
temperature of 25 °C (e.g. water bath) or between 2 °C and 8 °C over night. Do not use a microwave to
thaw samples.
Storage of the sample may impact the estrogenic activity of the sample. Possible changes are sample
depending. Specify the duration and conditions of sample storage based on experience with the specific
sample type. Further information about possible impacts of storage on samples with estrogenic activity
is given in References [15] and [16].
9 Procedure
9.1 Test set up
9.1.1 Preparation of the reference dilution series
Thaw the 17β-estradiol working solution (7.4.2). Dilute the working solution 1→100 [e.g. by adding
10 µl of the 17β-estradiol working solution (7.4.2) to 990 µl ultrapure water (7.2)]. Make a further
1→10 dilution [e.g. by adding 100 µl of the first dilution to 900 µl ultrapure water (7.2)]. The final
concentration is 1 µg/l.
Dilution series of the E2-reference: Prepare the dilutions of E2 for the dose response curve in amber
glass vials with a cap which is lined with polytetrafluoroethylene (PTFE). Table 1 summarizes the
preparation of the E2 dilution series for the dose response curve. Use ultrapure water (7.2) for the
dilution series. For the dose response curve, seven E2 concentrations are used (1 ng/l, 2 ng/l, 4 ng/l,
8 ng/l, 20 ng/l, 40 ng/l, 80 ng/l E2). After addition of the yeast cells to the test well the final E2
concentrations are 0,8 ng/l, 1,6 ng/l, 3,2 ng/l, 6,4 ng/l, 16 ng/l, 32 ng/l, 64 ng/l E2.
The total volumes of the E2 dilutions shown in Table 1 are sufficient for one test plate with two
replicates per dilution level (400 µl per replicate).
Table 1 — Preparation of E2 dilution series for the dose response curve
E2 starting Volume E2 starting
Volume of water c(E2) final solution Total volume
solution solution
1 µg/l 0,56 ml 6,44 ml 80 ng/l 7 ml
80 ng/l 2,5 ml 2,5 ml 40 ng/l 5 ml
40 ng/l 2,5 ml 2,5 ml 20 ng/l 5 ml
20 ng/l 2,0 ml 3,0 ml 8 ng/l 5 ml
8 ng/l 2,5 ml 2,5 ml 4 ng/l 5 ml
4 ng/l 2,5 ml 2,5 ml 2 ng/l 5 ml
2 ng/l 2,5 ml 2,5 ml 1 ng/l 5 ml
9.1.2 Reactivation of the yeast
For one 96-well test plate one vial with lyophilized yeast is required.
Bring the yeast minimal medium with maltose (7.4.10) to room temperature before using it. Dilute the
yeast minimal medium with maltose (7.4.10) 1→ 5 by adding 8 ml of ultrapure water (7.2) to 2 ml of the
yeast minimal medium with maltose (7.4.10).
Add to the vial with the lyophilized yeast 2 ml of the diluted yeast minimal medium with maltose
and mix it well until the pellet is completely solved (e.g. use a lab mini shaker). Transfer the yeast in
a closable reaction tube and centrifuge for approx. 20 s at 3 000 g. After that carefully remove and
discard the supernatant liquid and transfer it into a collecting vessel.
Add 1 ml of the diluted yeast minimal medium with maltose to the pellet and resuspend it (carefully up
and down pipetting is recommended). Afterwards, centrifuge the reaction tube for approx. 20 s at 3 000 g.
After that carefully remove and discard the supernatant liquid and transfer it into a collecting vessel.
Add 1 ml of the diluted yeast minimal medium maltose to the pellet and resuspend it (carefully up and
down pipetting is recommended). Afterwards, centrifuge the reaction tube for approx. 20 s at 3 000 g.
After that carefully remove and discard the supernatant liquid and transfer it into a collecting vessel.
Add 1 ml of the diluted yeast minimal medium with maltose to the pellet and resuspend it (carefully up
and down pipetting is recommended). Fix the reaction tube with the yeast in a horizontal position on a
shaker platform and incubate for approx. 1 h at 30 °C ± 2 °C. The frequency of the shaker depends on the
orbit and should be 50 % of the frequency range given in Table 2.
Table 2 — Shaker frequency subject to the shaker orbit
Orbit Frequency
mm rpm
3 to 4,5 750 to 1 000
15 to 20 450 to 480
25 370 t
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 19040-2
Première édition
2018-08
Qualité de l'eau — Détermination du
potentiel œstrogène de l'eau et des
eaux résiduaires —
Partie 2:
Test d'œstrogénicité (A-YES, Arxula
adeninivorans)
Water quality — Determination of the estrogenic potential of water
and waste water —
Part 2: Yeast estrogen screen (A-YES, Arxula adeninivorans)
Numéro de référence
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y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
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CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .2
3 Termes et définitions . 2
4 Principe. 4
5 Interférences . 4
6 Appareillage et matériel .5
7 Réactifs, milieux et souches d’essai .6
8 Échantillonnage et échantillons .10
8.1 Généralités . 10
8.2 Flacons et matériel d’échantillonnage . 10
8.3 Nettoyage préalable des flacons et du matériel . 10
8.4 Mode opératoire d’échantillonnage . 11
8.5 Transport des échantillons . 11
8.6 Prétraitement des échantillons . 11
8.7 Conservation des échantillons .12
9 Mode opératoire .12
9.1 Configuration d’essai .12
9.1.1 Préparation de la gamme de dilution de référence .12
9.1.2 Réactivation de la levure.12
9.1.3 Témoin négatif .13
9.1.4 Réplicat à blanc .13
9.1.5 Dilution de l’échantillon . 14
9.1.6 Blanc de terrain . 14
9.1.7 Préparation de la plaque . 14
9.1.8 Inoculation de la plaque d’essai. 15
9.2 Mesurage . . 16
9.2.1 Mesurage de l’activité du gène rapporteur . 16
9.2.2 Mesurage de la densité cellulaire . 16
9.3 Calculs . 17
9.3.1 Correction du bruit de fond . 17
9.3.2 Calcul de la croissance relative . 18
9.3.3 Calculs pour l’évaluation des blancs d’échantillon . 18
9.3.4 Calcul de l’induction du gène rapporteur . 20
10 Critères de validité .23
11 Critères d’évaluation .24
12 Rapport d’essai .24
13 Vérification .25
Annexe A (informative) Préparation de la plaque .26
Annexe B (informative) Lyophilisation des cellules d’Arxula adeninivorans .27
Annexe C (informative) Schéma de principe de l’essai .29
Annexe D (informative) Configuration d’essai pour les produits chimiques et les extraits .30
Annexe E (informative) Préparation d’une gamme de dilution .31
Annexe F (informative) Données de performances .32
Annexe G (informative) Évaluation statistique .43
iii
Annexe H (informative) Calcul des équivalents œstradiol . 44
Annexe I (informative) Autre conception d’essai pour la détermination de EEQ .47
Annexe J (informative) Mesurage de la plus faible dilution sans effet (LID) d’eaux
résiduaires — Évaluation simplifiée pour les essais d’eaux résiduaires .48
Annexe K (informative) Exemple d’évaluation statistique .50
Bibliographie .57
iv
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/iso/fr/avant-propos.html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité
SC 5, Méthodes biologiques.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 19040 se trouve sur le site web de l’ISO
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
v
NORME INTERNATIONALE ISO 19040-2:2018(F)
Qualité de l'eau — Détermination du potentiel œstrogène
de l'eau et des eaux résiduaires —
Partie 2:
Test d'œstrogénicité (A-YES, Arxula adeninivorans)
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les
pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il relève de la responsabilité
de l’utilisateur d’établir des pratiques de santé et de sécurité appropriées.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément au présent
document soient effectués par du personnel dûment formé.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode permettant de déterminer le potentiel œstrogénique de l’eau
et des eaux résiduaires au moyen d’un essai avec un gène rapporteur à l’aide d’une souche de levure
génétiquement modifiée Arxula adeninivorans. Cet essai avec gène rapporteur se fonde sur l’activation
du récepteur des œstrogènes humains alpha. L’essai détecte la fraction du potentiel œstrogénique ou
de l’œstrogénicité d’un échantillon qui est induite par les molécules interagissant avec le récepteur; il
ne répond pas aux molécules ayant des modes d’action qui ne passent pas directement par le récepteur
comme les modulateurs de la stéroïdogenèse, du transport ou de la clairance des stéroïdes sexuels.
L’essai A-YES (essai d’œstrogénicité sur levure Arxula) est un essai avec gène rapporteur qui peut être
utilisé pour mesurer l'activation du récepteur alpha des œstrogènes humains (ERα) en présence d'un
échantillon contenant des composés qui provoquent des effets œstrogéniques en interagissant avec le
récepteur. Ainsi, le dosage détecte l’activité œstrogénique de l’ensemble de l’échantillon dans son état
réel comme une mesure intégrale incluant les effets additifs, synergique et antagoniste possibles du
mélange sur le récepteur des œstrogènes humains.
Arxula adeninivorans est un organisme d’essai très robuste, résistant au sel et à la température qui est
particulièrement adapté à l’analyse d’échantillons ayant une salinité élevée (conductivité jusqu’à 70 mS/
cm). L’organisme d’essai peut être cultivé dans un milieu contenant jusqu’à 20 % de chlorure de sodium.
Cette méthode est applicable:
— aux eaux douces;
— aux eaux résiduaires;
— à l’eau de mer;
— à l’eau saumâtre;
— aux extraits aqueux et lixiviats;
— aux éluats de sédiments (eau douce);
— aux eaux interstitielles;
— aux solutions aqueuses contenant des substances uniques ou des mélanges chimiques;
— à l’eau potable.
La limite de quantification (LDQ) de cette méthode pour l’analyse directe d’échantillons d’eau est
comprise entre 1,5 ng/l et 3 ng/l d’équivalents 17β-œstradiol (EEQ). Le seuil supérieur de la gamme
dynamique pour cet essai est compris entre 25 ng/l et 40 ng/l d’équivalent 17β-œstradiol (EEQ).
Les échantillons présentant un potentiel œstrogénique supérieur à ce seuil doivent être dilués pour
une quantification valable. L’extraction et la préconcentration des échantillons d’eau peuvent s’avérer
nécessaires, si leur potentiel œstrogénique est inférieur à la LDQ donnée.
Un essai interlaboratoires international a été réalisé pour la validation du présent document. L’Annexe F
fournit un récapitulatif des résultats.
NOTE L’extraction et la préconcentration des échantillons d’eau peuvent s’avérer nécessaires.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/ .
3.1
réplicat à blanc
réplicat supplémentaire ne contenant pas d’organisme d’essai mais traité de la même façon que les
autres réplicats d’un échantillon
[SOURCE: ISO 10872:2010, 3.5]
3.2
milieu de culture
substances nutritives se présentant sous une forme et une phase (liquide ou solidifiée) favorisant la
croissance microbiologique
3.3
niveau de dilution
D
dénominateur du coefficient de dilution (le numérateur étant 1) d’un mélange d’eau ou d’eaux
résiduaires et d’eau de dilution en tant que nombre entier
Note 1 à l'article: Pour de l’eau ou pour des eaux résiduaires non diluées, ce coefficient est par définition de 1→1.
La valeur D correspondante la plus petite possible est 1. Dans le présent document, la flèche indique la transition
entre le volume total initial et le volume total final.
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 28]
3.4
eau de dilution
eau ajoutée à l’échantillon soumis à essai afin de préparer une série définie de dilutions
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.7]
3.5
concentration efficace 50 %
CE
concentration d’un composé produisant 50 % d’un effet
Note 1 à l'article: Au sens du présent document, la CE est la concentration d’un composé qui induit 50 % de
l’activité maximale du gène rapporteur qui peut être atteinte par ce composé.
3.6
blanc de terrain
récipient préparé dans le laboratoire, utilisant comme réactif de l’eau ou toute autre matrice de blanc,
et destiné à être emporté par le personnel d’échantillonnage pour être exposé à l’environnement
dans lequel l’échantillonnage est effectué afin de vérifier l’absence de contamination au cours de
l’échantillonnage
[SOURCE: ISO 11074:2015, 4.5.3]
3.7
taux de croissance
taux proportionnel d’augmentation de la densité cellulaire
[SOURCE: ISO 10253:2006, 3.2]
3.8
taux d’induction
rapport de la valeur moyenne de puits ayant une activité accrue du gène rapporteur mesurée sur les
plaques traitées avec une dose de l’échantillon pour essai, à la valeur moyenne des puits correspondants
traités avec le témoin négatif à l’aide de la même souche, dans des conditions identiques
Note 1 à l'article: Au lieu du témoin négatif, il est possible d’utiliser le paramètre estimé A du modèle à quatre
paramètres, qui décrit la relation dose-effet entre un composé de référence et le taux d’induction.
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 43, modifiée — «puits ayant une activité accrue du gène rapporteur
mesurée» remplace «colonies mutantes dénombrées»; «puits correspondants» remplace «plaques
correspondantes»; «rapport» remplace «différence».]
3.9
inoculum
fraction d’une culture de micro-organismes utilisée pour démarrer une nouvelle culture ou une
préculture à croissance exponentielle dans un nouveau milieu de culture
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 44]
3.10
plus faible dilution sans effet
LID
plus faible dilution dans un lot d’essai qui ne présente aucun effet, c’est-à-dire aucune augmentation
statistiquement significative de l’activité du gène rapporteur par rapport au témoin négatif
[SOURCE: ISO 11350:2012, 3.4, modifiée — «augmentation de l’activité du gène rapporteur» remplace
«augmentation du nombre de puits de révertants».]
3.11
témoin négatif
eau de dilution sans l’échantillon pour essai
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 51]
3.12
composé de référence
composé avec une ou plusieurs valeurs de propriété suffisamment reproductibles et bien établies pour
permettre l’étalonnage de la méthode de mesure
[SOURCE: ISO 7405:2008, 3.6, modifiée —« composé » remplace «produit»; «l’étalonnage de la méthode
de mesure» remplace «l’utilisation du produit ou de la substance pour l’étalonnage d’un appareil,
l’évaluation d’une méthode de mesure, ou pour l’attribution de valeurs à des produits».]
3.13
activité du gène rapporteur
activité quantitative d’un gène fixé au promoteur d’un autre gène
3.14
échantillon pour essai
portion non diluée, diluée ou préparée autrement d’un échantillon soumis à l’essai, après exécution
de toutes les étapes de préparation, telles que la centrifugation, la filtration, l’homogénéisation,
l’ajustement du pH et la détermination de la force ionique
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 92]
4 Principe
L’essai A-YES (essai d’œstrogénicité sur levure Arxula) est un essai avec gène rapporteur qui peut être
utilisé pour mesurer l’activation du récepteur alpha des œstrogènes humains (ERa) en présence d’un
échantillon contenant des composés qui provoquent des effets œstrogéniques. Ainsi, le dosage détecte
l’activité œstrogénique de l’ensemble de l’échantillon dans son état réel comme une mesure intégrale
incluant les effets additifs, synergique et antagoniste possibles du mélange.
Le récepteur α des œstrogènes humains est exprimé de façon constitutive dans la cellule de levure sous
le contrôle du promoteur TEF1. Le récepteur des œstrogènes appartient à la famille des récepteurs
nucléaires d’hormones. Lorsque des agonistes du récepteur des œstrogènes pénètrent dans la cellule
de levure, ils se lient à la protéine réceptrice des œstrogènes et induisent ainsi son changement
conformationnel. En conséquence, deux protéines réceptrices forment un dimère récepteur. Cette
activation du récepteur des œstrogènes est mesurée par l’induction du gène rapporteur phyK qui code
l’enzyme phytase. Le gène phyK fusionne avec un promoteur œstrogéno-dépendant qui contient des
éléments de réponse aux œstrogènes (ERE). L’ER dimère se lie au promoteur et active ainsi l’expression
et la sécrétion de la phytase. Enfin, l’activité de la phytase en tant que mesure du potentiel œstrogénique
de l’échantillon est déterminée en utilisant un substrat approprié dont le clivage génère un produit
de réaction coloré. Le produit de réaction peut être mesuré par photométrie. Voir l’Annexe C pour un
schéma du principe de l’essai.
5 Interférences
Les échantillons colorés ou troubles peuvent interférer avec la détection photométrique de la densité
cellulaire et/ou la détection du substrat clivé de l’enzyme rapportrice phytase (voir l’Article 10 pour de
plus amples informations).
Les effets de la matrice de l’échantillon peuvent entraîner une réduction ou une augmentation des
cellules viables et une réduction ou une augmentation du signal mesurable. Les effets œstrogéniques
d’un échantillon peuvent être masqués par les effets de matrice, conduisant ainsi à des résultats d’essai
faux négatifs ou faux positifs.
Une salinité élevée peut provoquer des effets toxiques dus à la pression osmotique résultante. La
conductivité d’un échantillon est une mesure de sa salinité. La levure Arxula adeninivorans tolère une
conductivité de l’échantillon jusqu’à 20 % de chlorure de sodium, ce qui correspond à une conductivité
de 180 mS/cm.
La croissance bactérienne dans les puits d’essai est évaluée par le réplicat à blanc (3.1). Voir l’Article 10
pour de plus amples informations.
Lorsque des échantillons filtrés sont soumis à essai afin d’éliminer les bactéries de l’échantillon, des
particules solides sont également séparées de l’échantillon. Ainsi, les substances ayant une activité
œstrogénique qui sont adsorbées sur les particules peuvent ne pas être détectées.
Pour des informations détaillées sur un matériel d’échantillonnage approprié qui n’influence pas le
résultat d’essai, voir l’Article 8.
6 Appareillage et matériel
Pour des dispositifs d’échantillonnage appropriés, voir l’Article 8. Utiliser le matériel et la verrerie de
laboratoire courants si nécessaire. En particulier, le matériel suivant est nécessaire:
6.1 Incubateur agitateur avec minuteur et régulation de température, agitateur décrivant une
orbite d’au moins 3 mm, 30 °C à 37 °C avec une précision de ±1 °C.
Si l’agitateur n’a pas de fonction d’incubation, utiliser un agitateur de laboratoire décrivant une orbite
d’au moins 3 mm en combinaison avec un incubateur (6.17).
6.2 Mini-agitateur de laboratoire.
6.3 Dispositif de mesurage multiparamètres pour pH et conductivité ou dispositifs séparés
pour chaque paramètre.
6.4 Stérilisateur à vapeur.
6.5 Centrifugeuse, avec un rotor pour plaques à 96 puits jusqu’à 1 000 g et un rotor pour tubes de
réaction de 2 ml.
6.6 Filtres stériles, en acétate de cellulose, diamètre des pores 0,2 µm.
6.7 Pipettes à canal unique, volume nominal de 10 µl à 10 000 µl.
6.8 Pipettes à canaux multiples, volume nominal de 100 µl et 300 µl.
6.9 Plaques à 96 puits en polystyrène transparent à fond plat (profil F, 300 µl) et couvercle.
6.10 Plaques à 96 puits profonds d’un volume d’au moins 1 ml, avec puits carrés à fond rond.
6.11 Photomètre pour microplaques à 96 puits, pour mesurage de l’absorbance à une longueur
d’onde de 405 nm ± 20 nm et de 630 nm ± 5 nm, ou de 600 nm ± 20 nm.
6.12 Film adhésif perméable à l’air pour plaques à puits profonds.
6.13 Tubes de réaction, 2 ml.
6.14 Tubes à essai, 15 ml et 50 ml.
6.15 Réservoir pour pipettes à canaux multiples.
6.16 Balance, charge minimale 1 mg, d = 0,1 mg.
6.17 Incubateur, 30 °C à 37 °C avec une précision de ±1 °C. Pour utiliser l’incubateur en combinaison
avec un agitateur, un incubateur réfrigéré est nécessaire.
7 Réactifs, milieux et souches d’essai
7.1 Réactifs
Dans la mesure du possible, utiliser des produits chimiques de «qualité réactif».
7.1.1 Solution d’acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l, masse moléculaire 36,46 g/mol, CAS: 7647-
01-0.
7.1.2 Solution d’hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 1 mol/l, masse moléculaire 40,00 g/mol,
CAS: 1310-73-2.
7.1.3 Éthanol, ≥ 99,8 %, C H OH, masse moléculaire 46,07 g/mol, CAS: 64-17-5.
2 5
7.1.4 17β-œstradiol, ≥ 98 %, C H O , masse moléculaire 272,38 g/mol, CAS: 50-28-2.
18 24 2
7.1.5 Maltose monohydraté, > 95 %, C H O , H O, masse moléculaire 360,32 g/mol, CAS: 6363-
12 22 11 2
53-7.
7.1.6 Nitrate de sodium, > 99 %, NaNO , masse moléculaire 84,98 g/mol, CAS: 7631-99-4.
7.1.7 Dihydrogénophosphate de potassium, ≥ 99 %, KH PO , masse moléculaire 136,09 g/mol,
2 4
CAS: 7778-77-0.
7.1.8 Sulfate de magnésium pur, MgSO , masse moléculaire 120,37 g/mol (anhydre), CAS: 7487-88-
9.
7.1.9 Chlorure de fer(III) hexahydraté, > 97 %, FeCl ·6H O, masse moléculaire 270,29 g/mol,
3 2
CAS: 10025-77-1.
7.1.10 Nitrate de calcium, > 99 %, Ca(NO ) , masse moléculaire 164,09 g/mol, CAS: 10124-37-5.
3 2
7.1.11 D-pantothénate de calcium, > 98 %, C H CaN O masse moléculaire 238,27 g/mol,
18 32 2 10
CAS: 137-08-6.
7.1.12 Chlorhydrate de thiamine, > 98,5 %, C H Cl N OS, masse moléculaire 337,27 g/mol, CAS: 67-
12 18 2 4
03-8.
7.1.13 Niacine, > 99,5 %, C H NO , masse moléculaire 123,11 g/mol, CAS: 59-67-6.
6 5 2
7.1.14 Chlorhydrate de pyridoxine, > 99 %, C H NO ·HCl, masse moléculaire 205,64 g/mol, CAS: 58-
8 11 3
56-0.
7.1.15 D-(+)-biotine, ≥ 98,5 %, C H N O S, masse moléculaire 244,31 g/mol, CAS: 58-85-5.
10 16 2 3
7.1.16 Inositol, ≥ 99 %, C H O , masse moléculaire 180,16 g/mol, CAS: 87-89-8.
6 12 6
7.1.17 Acide borique, > 99,8 %, H BO , masse moléculaire 61,83 g/mol, CAS: 10043-35-3.
3 3
7.1.18 Sulfate de cuivre(II) pentahydraté, > 99,5 %, CuSO ·5H O, masse moléculaire 249,68 g/mol,
4 2
CAS: 7758-99-8.
7.1.19 Iodure de potassium, > 99 %, masse moléculaire KI 166,00 g/mol, CAS: 7681-11-0.
7.1.20 Sulfate de manganèse monohydraté, > 99 %, MnSO , H O, masse moléculaire 169,02 g/mol,
4 2
CAS: 10034-96-5.
7.1.21 Sulfate de zinc heptahydraté, > 99,5 %, ZnSO ·7H O, masse moléculaire 287,56 g/mol,
4 2
CAS: 7446-20-0.
7.1.22 Molybdate de sodium dihydraté, > 99,5 %, Na MoO ·2H O, masse moléculaire 241,95 g/mol,
2 4 2
CAS: 10102-40-6.
7.1.23 Chlorure de cobalt(II) pour synthèse, CoCl , masse moléculaire 129,84 g/mol, CAS: 7646-79-
9.
7.1.24 Citrate trisodique dihydraté, > 99 %, C H Na O ·2H O, masse moléculaire 294,10 g/mol,
6 5 3 7 2
CAS: 6132-04-3.
7.1.25 Acide citrique, > 99,5 %, C H O , masse moléculaire 192,12 g/mol, CAS: 77-92-9.
6 8 7
7.1.26 4-nitrophénylphosphate, sel disodique hexahydraté (pNPP), C H NNa O P·6H O, masse
6 4 2 6 2
moléculaire 371,14 g/mol, CAS: 333338-18-4.
7.1.27 Hydroxyde de sodium, ≥ 99 %, NaOH, masse moléculaire 40,00 g/mol, CAS: 1310-73-2.
7.1.28 Eau de mer répondant aux spécifications suivantes: chlorure (Cl) 19 290 mg/l, sodium
10 780 mg/l, sulfate 2 660 mg/l, potassium 420 mg/l, calcium 400 mg/l, carbonate (bicarbonate)
200 mg/l, strontium 8,8 mg/l, bore 5,6 mg/l, bromure 56 mg/l, iodure 0,24 mg/l, lithium 0,3 mg/l,
fluorure 1,0 mg/l, magnésium (Mg) 1 320 mg/l.
7.1.29 Chlorure de sodium, ≥ 99 %, NaCl, masse moléculaire 58,44 g/mol, CAS: 7647-14-5.
7.1.30 Acétone (pureté «pour analyses »), C H O, masse moléculaire 58,08 g/mol, CAS: 67-64-1.
3 6
7.2 Eau, qualité 3, telle que définie dans l’ISO 3696; une eau dont la conductivité est inférieure ou
égale à 5 µS/cm est acceptable, ou de l’eau ultrapure.
Lorsqu’une eau stérile est nécessaire, la stériliser à l’autoclave ou par filtration (acétate de cellulose,
0,2 µm).
L’eau telle que spécifiée ici est également utilisée pour la préparation de l’eau de dilution employée pour
la dilution progressive de l’échantillon pour essai.
7.3 Souche d’essai
Cette souche d’essai est dérivée de Blastobotrys adeninivorans G1214 Syn.: Arxula adeninivorans
G1214 (aleu2 aura3::ALEU2), Référence [1]. Cette souche est auxotrophe pour l’uracile. Pour empêcher
l’apparition de résistances aux antibiotiques dans l’environnement et pour accroître l’acceptation en ce
qui concerne les exigences légales, l’organisme d’essai ne contient aucun marqueur de résistance aux
antibiotiques.
Modifications génétiques: intégration du marqueur de sélection AURA3mm dans le plasmide Xplor2-102-
hERα-GAA2(ERE107)-phyK après échange du promoteur ATRP1m du marqueur ALEU2. Le marqueur de
sélection AURA3mm a été isolé du plasmide pCR4-AURA3mm-13. Les séquences de E. coli et de marqueur
résistant à la kanamycine ont été éliminées par une digestion par enzymes de restriction. L’intégration
stable de Xplor2-102-hERα-GAA2(ERE107)-phyK dans le génome de Arxula adeninivorans a été obtenue
par transformation de la cassette en un mutant auxotrophe pour l’uracile de A. adeninivorans G1214
(aleu2 aura3::ALEU2) par recombinaison avec l’ADNr 25S.
Pour la détermination du potentiel œstrogénique des échantillons aqueux, une suspension de cellules
de levure est préparée à l’aide de cellules de levure lyophilisées. Étant donné que les cellules de Arxula
adeninivorans sont lyophilisées, l’essai peut être réalisé dans des conditions hautement normalisées et
aucun matériel de laboratoire spécifique n’est requis pour la culture de cellules à long terme.
Les cellules de levure sont disponibles dans le commerce. Conserver les cellules de levure lyophilisées
à une température comprise entre 4 °C et 8 °C et suivre les recommandations du fabricant. Après
réactivation, les cellules de levure peuvent être utilisées directement pour l’essai; une préculture n’est
pas nécessaire pour les essais.
Une alternative aux cellules de levure lyophilisées disponibles dans le commerce consiste à préparer
soi-même des cellules de levure lyophilisées. Le mode opératoire de préparation est décrit à l’Annexe B.
La souche de levure peut être isolée à partir d’un lyophilisat disponible dans le commerce.
7.4 Milieu.
Lorsqu’un passage en autoclave est nécessaire, le réaliser pendant 20 min à 121 °C ± 2 °C. Couvrir
légèrement les récipients (par exemple avec une feuille d’aluminium). Ne jamais fermer hermétiquement.
7.4.1 Solution mère de 17β-œstradiol (E2).
Dissoudre 10 mg de 17b-œstradiol (E2) (7.1.4) dans 10 ml d’éthanol (7.1.3). Conserver la solution mère
de 17β-œstradiol (E2) à ≤ −18 °C. Ne pas conserver la solution mère plus de 18 mois.
S’il est disponible, un étalon de référence certifié de 17β-œstradiol de même concentration peut être
utilisé comme solution mère.
7.4.2 Solution de travail de 17β-œstradiol (E2).
Diluer la solution mère de 17β-œstradiol (E2) (7.4.1) à 1→100 en ajoutant 10 µl de la solution mère
de 17β-œstradiol (E2) (7.4.1) à 990 µl d’éthanol (7.1.3) et bien mélanger. Effectuer une dilution
supplémentaire à 1→10 en ajoutant 100 µl de la première dilution à 900 µl d’éthanol (7.1.3) et bien
mélanger. La concentration finale est de 1 mg/l. La solution de travail doit être préparée sous forme
d’aliquote pour éviter toute congélation et décongélation de la solution de travail. Conserver la solution
de travail de 17β-œstradiol (E2) à ≤ −18 °C. Ne pas conserver la solution de travail plus de 6 mois.
NOTE Le pipetage de solvants organiques nécessite l’utilisation de pipettes calibrées adéquates ou d’un
autre matériel adapté à la manipulation de liquides.
7.4.3 Solution de maltose.
Dissoudre 20 g de maltose monohydraté (7.1.5) dans 70 ml d’eau ultrapure (7.2). Compléter la solution
de maltose à 100 ml avec de l’eau ultrapure (7.2). Passer la solution à l’autoclave. Conserver la solution
de maltose à une température comprise entre 2 °C et 8 °C. Ne pas conserver la solution de maltose plus
de six mois.
7.4.4 Solution saline pour milieu minimal pour levures.
Dissoudre 3,7 g de NaNO (7.1.6), 8,4 g de KH PO (7.1.7) et 1 g de MgSO (7.1.8) dans 70 ml d’eau
3 2 4 4
ultrapure (7.2). Compléter à 100 ml avec de l’eau ultrapure (7.2). Passer la solution à l’autoclave.
Conserver la solution saline pour milieu minimal pour levures à une température comprise entre 2 °C
et 8 °C. Ne pas conserver la solution saline plus de six mois.
7.4.5 Solution saline pour milieu salin minimal pour levures.
Dissoudre 28 g de NaCl (7.1.29), 3,7 g de NaNO3 (7.1.6), 8,4 g de KH PO (7.1.7) et 1 g de MgSO (7.1.8)
2 4 4
dans 70 ml d’eau ultrapure (7.2). Compléter à 100 ml avec de l’eau ultrapure (7.2). Pour l’analyse
d’échantillons d’eau de mer et d’échantillons d’eau saumâtre, les 28 g de NaCl peuvent être remplacés
par 28 g d’une composition saline similaire à celle de l’eau de mer. Passer la solution à l’autoclave.
Conserver la solution saline pour milieu salin minimal pour levures à une température comprise
entre 2 °C et 8 °C pendant six mois au maximum.
7.4.6 Solution de micronutriments.
Peser séparément les produits chimiques suivants:
0,05 g de H BO (7.1.17), 0,01 g de CuSO ·5H O (7.1.18), 0,01 g de KI (7.1.19), 0,04 g de MnSO , H O (7.1.20),
3 3 4 2 4 2
0,04 g de ZnSO ·7H O (7.1.21), 0,02 g de Na MoO ·2H O (7.1.22), 0,01 g de CoCl (7.1.23).
4 2 2 4 2 2
Mélanger les produits chimiques et les dissoudre dans 100 ml d’eau ultrapure (7.2). Passer la solution
à l’autoclave. La précipitation qui suit le passage à l’autoclave n’a pas d’influence sur la qualité. Agiter
la solution avant de l’utiliser. Conserver la solution de micronutriments à une température comprise
entre 2 °C et 8 °C. Ne pas conserver la solution de micronutriments plus de 12 mois.
7.4.7 Solution de FeCl .
Peser 0,2 g de Fe(III)Cl hexahydraté (7.1.9) et le dissoudre dans 20 ml d’eau ultrapure (7.2). Stériliser
la solution de FeCl par filtration (0,2 µm). Conserver la solution de FeCl à une température comprise
3 3
entre 2 °C et 8 °C. Ne pas conserver la solution de FeCl plus de six mois.
7.4.8 Solution de Ca(NO ) .
3 2
Peser 10 g de Ca(NO ) (7.1.10) et les dissoudre dans 10 ml d’eau ultrapure (7.2). Stériliser la solution
3 2
de Ca(NO ) par filtration (0,2 µm). Conserver la solution de Ca(NO ) à une température comprise
3 2 3 2
entre 2 °C et 8 °C. Ne pas conserver la solution de Ca(NO ) plus de six mois.
3 2
7.4.9 Mélange de vitamines.
Peser séparément les produits chimiques suivants:
0,2 g de D-pantothénate de calcium (7.1.11), 0,2 g de chlorhydrate de thiamine (7.1.12), 0,05 g de niacine
(7.1.13), 0,02 g de biotine (7.1.15), 0,2 g de chlorhydrate de pyridoxine (7.1.14), 2 g d’inositol (7.1.16).
Mélanger et dissoudre les vitamines dans 50 ml d’eau ultrapure (7.2). Stériliser le mélange de vitamines
par filtration (0,2 µm). Conserver le mélange de vitamines à une température comprise entre 2 °C
et 8 °C. Ne pas conserver le mélange de vitamines plus de six mois.
7.4.10 Milieu minimal maltosé pour levures.
Ajouter à la pipette 1 ml de solution de FeCl (7.4.7), 1 ml de solution de Ca(NO ) (7.4.8), 1 ml de solution
3 3 2
de micronutriments (7.4.6) et 0,5 ml de mélange de vitamines (7.4.9) à 96,5 ml de la solution saline
(7.4.4). Ajouter 100 ml de solution de maltose (7.4.3).
Le milieu minimal maltosé pour levures est concentré cinq fois. Conserver le milieu minimal pour
levures à une température comprise entre 2 °C et 8 °C. Ne pas conserver le milieu minimal pour levures
plus de six mois.
7.4.11 Milieu salin minimal maltosé pour levures.
Ajouter à la pipette 1 ml de solution de FeCl (7.4.7), 1 ml de solution de Ca(NO ) (7.4.8), 1 ml de solution
3 3 2
de micronutriments (7.4.6) et 0,5 ml de mélange de vitamines (7.4.9) à 96,5 ml de solution saline pour
milieu salin minimal pour levures (7.4.5). Ajouter 100 ml de solution de maltose (7.4.3).
Le milieu salin minimal maltosé pour levures est concentré cinq fois. Conserver le milieu salin minimal
pour levures à une température comprise entre 2 °C et 8 °C. Ne pas conserver le milieu salin minimal
pour levures plus de six mois.
7.4.12 Tampon de substrat.
Peser séparément 10,35 g de citrate trisodique dihydraté (7.1.24) et 12,45 g d’acide citrique (7.1.25).
Dissoudre chaque réactif dans 60 ml d’eau ultrapure (7.2). Mélanger les deux solutions et compléter
à 200 ml avec de l’eau ultrapure (7.2). Passer le tampon de substrat à l’autoclave et le laisser refroidir
avant de l’utiliser. Conserver le tampon de substrat à une température comprise entre 2 °C et 8 °C. Ne
pas conserver le tampon de substrat plus de six mois.
7.4.13 Solution de substrat pour phytase.
Peser au moins 15 mg de 4-nitrophénylphosphate, sel disodique hexahydraté (7.1.26) et les dissoudre
dans un volume équivalent de tampon de substrat. Un volume de 15 ml de solution de substrat pour
phytase suffit pour deux plaques d’essai. Préparer toujours une solution fraîche de substrat pour
phytase et l’utiliser dans les 2 h qui suivent.
7.4.14 Révélateur.
Dissoudre 24 g d’hydroxyde de sodium solide (7.1.27) dans 200 ml d’eau ultrapure (7.2). Passer la
solution d’hydroxyde de sodium à l’autoclave et la laisser refroidir avant de l’utiliser. Conserver le
révélateur à température ambiante. Ne pas conserver la solution de révélateur plus de six mois.
8 Échantillonnage et échantillons
8.1 Généralités
Le présent document décrit les exigences spécifiques relatives à l’échantillonnage en vue de la
détermination de l’activité œstrogénique dans des échantillons d’eau. Pour des informations générales
sur l’échantillonnage, se reporter à l’ISO 5667-16.
8.2 Flacons et matériel d’échantillonnage
Utiliser des flacons en verre (verre borosilicaté) propres avec des bouchons revêtus de
polytétrafluoroéthylène (PTFE). Pour éviter la photodégradation des composés présentant un intérêt,
utiliser des flacons en verre ambré. Lorsque des flacons en verre transparent sont utilisés, envelopper
les flacons d’une feuille d’aluminium ou les conserver dans un récipient sombre.
En variante, des flacons en aluminium ou en acier inoxydable (tous deux non revêtus) peuvent être
utilisés. S’assurer qu’un matériau autre que le verre borosilicaté n’a pas d’incidence sur les résultats.
8.3 Nettoyage préalable des flacons et du matériel
Après le mode opératoire de nettoyage de routine, effectuer un nettoyage complémentaire des flacons
et des bouchons comme suit: rincer les flacons et bouchons propres trois fois avec une quantité
minimale d’acétone (7.1.30). Laisser l’acétone résiduelle s’évaporer (par exemple dans une étuve). Après
le séchage, fermer immédiatement les flacons.
Rincer trois fois toute la verrerie, les spatules, etc. entrant en contact avec l’échantillon avec une
quantité minimale d’acétone (7.1.30). Laisser l’acétone résiduelle s’évaporer.
8.4 Mode opératoire d’échantillonnage
Pendant l’échantillonnage, utiliser des gants en nitrile à usage unique. Ne pas appliquer de crème sur les
mains avant l’échantillonnage et éviter tout contact entre la peau et l’échantillon. Utiliser uniquement
un matériel en verre, PTFE, aluminium ou acier inoxydable.
Remplir complètement les flacons. Tenir compte d’une dilatation éventuelle de l’échantillon en cas de
variation de température. Si les échantillons doivent être congelés dans le cadre de leur conservation,
les flacons ne doivent pas être complètement remplis afin d’éviter tout bris pouvant survenir en raison
de la dilatation de la glace durant le processus de congélation et décongélation.
Ne pas utiliser de produits chimiques pour stabiliser les échantillons.
Réfrigérer les échantillons à une température comprise entre 2 °C et 8 °C ou les congeler à une
température ≤ –18 °C.
8.5 Transport des échantillons
Livrer les échantillons au laboratoire dès que possible après l’échantillonnage.
Pendant le transport, conserver le conteneur d’échantillons à l’abri du gel, de la casse, de la lumière,
d’une augmentation de température et d’une contamination externe.
Des méthodes de réfrigération ou de congélation doivent être appliquées aux échantillons si une
durée plus importante est requise pour le transport et la conservation. Il convient de commencer la
réfrigération dès que possible après l’échantillonnage, par exemple dans des glacières contenant de la
glace, des blocs réfrigérants ou des éléments réfrigérants. Un dispositif de réfrigération dans le véhicule
de transport est également approprié. Une température de réfrigération pendant le transport comprise
entre 2 °C et 8 °C s’est avérée appropriée. La température de refroidissement suggérée s’applique
à l’environnement de l’échantillon (par exemple à l’intérieur de la boîte froide), et non à l’échantillon
lui-même.
Si l’échantillon est congelé, éviter sa décongélation (en le transportant par exemple sur de la glace
carbonique). Si de la glace carbonique est choisie pour le transport, il convient d’envelopper les flacons
dans du papier ou un film à bulles d’air pour éviter tout contact direct avec la glace carbonique.
8.6 Prétraitement des échantillons
Il est préférable d’analyser les échantillons sous leur forme non filtrée immédiatement après
l’échantillonnage en raison de la perte p
...
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ISO/TC 147/SC 5
0 pt
Style Definition: Heading 2: Font: Bold, Tab stops: Not at
Date: 2022-10-03
18 pt
Style Definition: Heading 3: Font: Bold
Style Definition: Heading 4: Font: Bold
ISO/TC 147/SC 5
Style Definition: Heading 5: Font: Bold
Style Definition: Heading 6: Font: Bold
Secrétariat: DIN
Style Definition: ANNEX
Style Definition: RefNorm
Style Definition: Body Text_Center
Style Definition: Dimension_100
Style Definition: Figure Graphic
Style Definition: Figure subtitle
Style Definition: List Continue 1
Qualité de l’eau l'eau — Détermination du potentiel œstrogéniqueoestrogène de
Style Definition: List Number 1
l’eaul'eau et des eaux résiduaires en fonction des agonistes et des antagonistes du
Style Definition: AMEND Terms Heading: Font: Bold
récepteur des œstrogènes — Partie 2: Essai d’œstrogénicité sur levuresTest
Style Definition: AMEND Heading 1 Unnumbered: Font:
d'oestrogénicité (A-YES, Arxula adeninivorans)
Bold
Water quality — Determination of the estrogenic potential of water and waste water
related to agonists and antagonists of the estrogen receptor — Part 2: Yeast estrogen
screen (A-YES, Arxula adeninivorans)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
Formatted: Pattern: Clear
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne
peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique
ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur l’internet ou sur un Intranet, sans
autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Ch. de Blandonnet 8 • CP 401
CH-1214 Vernier, Geneva, Switzerland
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
copyright@iso.org
www.iso.org
ii
Sommaire
Page
Avant-propos . Error! Bookmark not defined.
1 Domaine d’application . Error! Bookmark not defined.
2 Références normatives . Error! Bookmark not defined.
3 Termes et définitions . Error! Bookmark not defined.
4 Principe . Error! Bookmark not defined.
5 Interférences . Error! Bookmark not defined.
6 Appareillage et matériel. Error! Bookmark not defined.
7 Réactifs, milieux et souches d’essai . Error! Bookmark not defined.
8 Échantillonnage et échantillons . Error! Bookmark not defined.
8.1 Généralités . Error! Bookmark not defined.
8.2 Flacons et matériel d’échantillonnage . Error! Bookmark not defined.
8.3 Nettoyage préalable des flacons et du matériel . Error! Bookmark not defined.
8.4 Mode opératoire d’échantillonnage . Error! Bookmark not defined.
8.5 Transport des échantillons . Error! Bookmark not defined.
8.6 Prétraitement des échantillons . Error! Bookmark not defined.
8.7 Conservation des échantillons . Error! Bookmark not defined.
9 Mode opératoire . Error! Bookmark not defined.
9.1 Configuration d’essai . Error! Bookmark not defined.
9.1.1 Préparation de la gamme de dilution de référence . Error! Bookmark not defined.
9.1.2 Réactivation de la levure . Error! Bookmark not defined.
9.1.3 Témoin négatif . Error! Bookmark not defined.
9.1.4 Réplicat à blanc . Error! Bookmark not defined.
9.1.5 Dilution de l’échantillon . Error! Bookmark not defined.
9.1.6 Blanc de terrain. Error! Bookmark not defined.
9.1.7 Préparation de la plaque . Error! Bookmark not defined.
9.1.8 Inoculation de la plaque d’essai . Error! Bookmark not defined.
9.2 Mesurage . Error! Bookmark not defined.
9.2.1 Mesurage de l’activité du gène rapporteur . Error! Bookmark not defined.
9.2.2 Mesurage de la densité cellulaire . Error! Bookmark not defined.
9.3 Calculs . Error! Bookmark not defined.
9.3.1 Correction du bruit de fond . Error! Bookmark not defined.
9.3.2 Calcul de la croissance relative . Error! Bookmark not defined.
9.3.3 Calculs pour l’évaluation des blancs d’échantillon . Error! Bookmark not defined.
9.3.4 Calcul de l’induction du gène rapporteur . Error! Bookmark not defined.
10 Critères de validité . Error! Bookmark not defined.
11 Critères d’évaluation . Error! Bookmark not defined.
12 Rapport d’essai . Error! Bookmark not defined.
13 Vérification . Error! Bookmark not defined.
Annexe A (informative) Préparation de la plaque . Error! Bookmark not defined.
Annexe B (informative) Lyophilisation des cellules d’Arxula adeninivorans . Error! Bookmark not
defined.
iii
Annexe C (informative) Schéma de principe de l’essai . Error! Bookmark not defined.
Annexe D (informative) Configuration d’essai pour les produits chimiques et les extraits . Error!
Bookmark not defined.
Annexe E (informative) Préparation d’une gamme de dilution . Error! Bookmark not defined.
Annexe F (informative) Données de performances . Error! Bookmark not defined.
Annexe G (informative) Évaluation statistique . Error! Bookmark not defined.
Annexe H (informative) Calcul des équivalents œstradiol . Error! Bookmark not defined.
Annexe I (informative) Autre conception d’essai pour la détermination de EEQ Error! Bookmark not
defined.
Annexe J (informative) Mesurage de la plus faible dilution sans effet (LID) d’eaux
résiduaires — Évaluation simplifiée pour les essais d’eaux résiduaires . Error! Bookmark
not defined.
Annexe K (informative) Exemple d’évaluation statistique . Error! Bookmark not defined.
Bibliographie . Error! Bookmark not defined.
iv
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en
général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit
de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales
et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la
normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www.iso.org/iso/fr/avant-propos.html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 19040 se trouve sur le site web de l’ISO. Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
v
NORME INTERNATIONALE ISO 19040-2:2018(F)
Qualité de l’eau l'eau — Détermination du potentiel
œstrogéniqueoestrogène de l’eaul'eau et des eaux résiduaires
en fonction des agonistes et des antagonistes du récepteur des
œstrogènes — Partie 2: Essai d’œstrogénicité sur levuresTest
d'oestrogénicité (A-YES, Arxula adeninivorans)
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les pratiques
courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter tous les problèmes de sécurité
qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il relève de la responsabilité de l’utilisateur d’établir des
pratiques de santé et de sécurité appropriées.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément au présent document
soient effectués par du personnel dûment formé.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode permettant de déterminer le potentiel œstrogénique de l’eau
et des eaux résiduaires au moyen d’un essai avec un gène rapporteur à l’aide d’une souche de levure
génétiquement modifiée Arxula adeninivorans. Cet essai avec gène rapporteur se fonde sur l’activation du
récepteur des œstrogènes humains alpha. L’essai détecte la fraction du potentiel œstrogénique ou de
l’œstrogénicité d’un échantillon qui est induite par les molécules interagissant avec le récepteur; il ne
répond pas aux molécules ayant des modes d’action qui ne passent pas directement par le récepteur
comme les modulateurs de la stéroïdogenèse, du transport ou de la clairance des stéroïdes sexuels.
L’essai A-YES (essai d’œstrogénicité sur levure Arxula) est un essai avec gène rapporteur qui peut être
utilisé pour mesurer l'activation du récepteur alpha des œstrogènes humains (ERα) en présence d'un
échantillon contenant des composés qui provoquent des effets œstrogéniques en interagissant avec le
récepteur. Ainsi, le dosage détecte l’activité œstrogénique de l’ensemble de l’échantillon dans son état
réel comme une mesure intégrale incluant les effets additifs, synergique et antagoniste possibles du
mélange sur le récepteur des œstrogènes humains.
Arxula adeninivorans est un organisme d’essai très robuste, résistant au sel et à la température qui est
particulièrement adapté à l’analyse d’échantillons ayant une salinité élevée (conductivité
jusqu’à 70 mS/cm). L’organisme d’essai peut être cultivé dans un milieu contenant jusqu’à 20 % de
chlorure de sodium.
Cette méthode est applicable:
— aux eaux douces;
— aux eaux résiduaires;
— à l’eau de mer;
— à l’eau saumâtre;
— aux extraits aqueux et lixiviats;
— aux éluats de sédiments (eau douce);
— aux eaux interstitielles;
— aux solutions aqueuses contenant des substances uniques ou des mélanges chimiques;
— à l’eau potable.
La limite de quantification (LDQ) de cette méthode pour l’analyse directe d’échantillons d’eau est
comprise entre 1,5 ng/l et 3 ng/l d’équivalents 17β-œstradiol (EEQ). Le seuil supérieur de la gamme
dynamique pour cet essai est compris entre 25 ng/l et 40 ng/l d’équivalent 17β-œstradiol (EEQ).
Les échantillons présentant un potentiel œstrogénique supérieur à ce seuil doivent être dilués pour une
quantification valable. L’extraction et la préconcentration des échantillons d’eau peuvent s’avérer
nécessaires, si leur potentiel œstrogénique est inférieur à la LDQ donnée.
Un essai interlaboratoires international a été réalisé pour la validation du présent document. L’Annexe F Formatted: Pattern: Clear
fournit un récapitulatif des résultats.
NOTE L’extraction et la préconcentration des échantillons d’eau peuvent s’avérer nécessaires.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des exigences
du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non
datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
Commented [eXtyles2]: The match came back with a
different title. The original title was: Eau pour laboratoire à
usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
Commented [eXtyles3]: The text ";" is marked with
"Hyperlink" character style but does not appear to be a
hyperlink. Please check the text.
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse
https://www.iso.org/obp;https://www.iso.org/obp; Commented [eXtyles4]: The text "." is marked with
"Hyperlink" character style but does not appear to be a
hyperlink. Please check the text.
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse
https://www.electropedia.org/https://www.electropedia.org/. Commented [eXtyles5]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
3.1
ISO 10872:2020, Qualité de l'eau et du sol — Détermination
réplicat à blanc
de l'effet toxique d'échantillons de sédiment et de sol sur la
réplicat supplémentaire ne contenant pas d’organisme d’essai mais traité de la même façon que les autres croissance, la fertilité et la reproduction de Caenorhabditis
elegans (Nematodes)
réplicats d’un échantillon
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 10872:2010, 3.5]
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.2
Formatted: Pattern: Clear
milieu de culture
substances nutritives se présentant sous une forme et une phase (liquide ou solidifiée) favorisant la
croissance microbiologique
3.3
niveau de dilution
D
dénominateur du coefficient de dilution (le numérateur étant 1) d’un mélange d’eau ou d’eaux résiduaires
et d’eau de dilution en tant que nombre entier
Note 1 à l’article: Pour de l’eau ou pour des eaux résiduaires non diluées, ce coefficient est par définition de 1→1.
La valeur D correspondante la plus petite possible est 1. Dans le présent document, la flèche indique la transition
entre le volume total initial et le volume total final.
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 28] Commented [eXtyles6]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
3.4
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
eau de dilution
Formatted: Pattern: Clear
eau ajoutée à l’échantillon soumis à essai afin de préparer une série définie de dilutions
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.7]
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.5
Formatted: Pattern: Clear
concentration efficace 50 %
CE Formatted: Pattern: Clear
concentration d’un composé produisant 50 % d’un effet
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Note 1 à l’article: Au sens du présent document, la CE est la concentration d’un composé qui induit 50 % de
l’activité maximale du gène rapporteur qui peut être atteinte par ce composé.
3.6
blanc de terrain
récipient préparé dans le laboratoire, utilisant comme réactif de l’eau ou toute autre matrice de blanc, et
destiné à être emporté par le personnel d’échantillonnage pour être exposé à l’environnement dans
lequel l’échantillonnage est effectué afin de vérifier l’absence de contamination au cours de
l’échantillonnage
[SOURCE: ISO 11074:2015, 4.5.3]
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.7
Formatted: Pattern: Clear
taux de croissance
Formatted: Pattern: Clear
taux proportionnel d’augmentation de la densité cellulaire
[SOURCE: ISO 10253:2006, 3.2] Commented [eXtyles7]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
3.8
ISO 10253:2016, Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de la
taux d’induction
croissance des algues marines avec Skeletonema sp. et
rapport de la valeur moyenne de puits ayant une activité accrue du gène rapporteur mesurée sur les
Phaeodactylum tricornutum
plaques traitées avec une dose de l’échantillon pour essai, à la valeur moyenne des puits correspondants
Formatted: Pattern: Clear
traités avec le témoin négatif à l’aide de la même souche, dans des conditions identiques
Formatted: Pattern: Clear
Note 1 à l’article: Au lieu du témoin négatif, il est possible d’utiliser le paramètre estimé A du modèle à quatre Formatted: Pattern: Clear
paramètres, qui décrit la relation dose-effet entre un composé de référence et le taux d’induction.
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 43, modifiée — «puits ayant une activité accrue du gène rapporteur Formatted: Pattern: Clear
mesurée» remplace «colonies mutantes dénombrées»; «puits correspondants» remplace «plaques
Formatted: Pattern: Clear
correspondantes»; «rapport» remplace «différence».]
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.9
inoculum
Commented [eXtyles8]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
fraction d’une culture de micro-organismes utilisée pour démarrer une nouvelle culture ou une
préculture à croissance exponentielle dans un nouveau milieu de culture
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 44] Commented [eXtyles9]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
3.10
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
plus faible dilution sans effet
Formatted: Pattern: Clear
LID
plus faible dilution dans un lot d’essai qui ne présente aucun effet, c’est-à-dire aucune augmentation Formatted: Pattern: Clear
statistiquement significative de l’activité du gène rapporteur par rapport au témoin négatif
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 11350:2012, 3.4, modifiée — «augmentation de l’activité du gène rapporteur» remplace
Formatted: Pattern: Clear
«augmentation du nombre de puits de révertants».]
Formatted: Pattern: Clear
3.11
Formatted: Pattern: Clear
témoin négatif
Formatted: Pattern: Clear
eau de dilution sans l’échantillon pour essai
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 51] Commented [eXtyles10]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
3.12
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
composé de référence
Formatted: Pattern: Clear
composé avec une ou plusieurs valeurs de propriété suffisamment reproductibles et bien établies pour
permettre l’étalonnage de la méthode de mesure Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 7405:2008, 3.6, modifiée —« composé » remplace «produit»; «l’étalonnage de la méthode
Formatted: Pattern: Clear
de mesure» remplace «l’utilisation du produit ou de la substance pour l’étalonnage d’un appareil,
Formatted: Pattern: Clear
l’évaluation d’une méthode de mesure, ou pour l’attribution de valeurs à des produits».]
Formatted: Pattern: Clear
3.13
Formatted: Pattern: Clear
activité du gène rapporteur
Formatted: Pattern: Clear
activité quantitative d’un gène fixé au promoteur d’un autre gène
Commented [eXtyles11]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
3.14
échantillon pour essai
ISO 7405:2018, Médecine bucco-dentaire — Évaluation de
portion non diluée, diluée ou préparée autrement d’un échantillon soumis à l’essai, après exécution de la biocompatibilité des dispositifs médicaux utilisés en
médecine bucco-dentaire
toutes les étapes de préparation, telles que la centrifugation, la filtration, l’homogénéisation, l’ajustement
du pH et la détermination de la force ionique
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 92]
Commented [eXtyles12]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
4 Principe
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
Formatted: Pattern: Clear
L’essai A-YES (essai d’œstrogénicité sur levure Arxula) est un essai avec gène rapporteur qui peut être
Formatted: Pattern: Clear
utilisé pour mesurer l’activation du récepteur alpha des œstrogènes humains (ERa) en présence d’un
échantillon contenant des composés qui provoquent des effets œstrogéniques. Ainsi, le dosage détecte
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
l’activité œstrogénique de l’ensemble de l’échantillon dans son état réel comme une mesure intégrale
incluant les effets additifs, synergique et antagoniste possibles du mélange.
Le récepteur α des œstrogènes humains est exprimé de façon constitutive dans la cellule de levure sous
le contrôle du promoteur TEF1. Le récepteur des œstrogènes appartient à la famille des récepteurs
nucléaires d’hormones. Lorsque des agonistes du récepteur des œstrogènes pénètrent dans la cellule de
levure, ils se lient à la protéine réceptrice des œstrogènes et induisent ainsi son changement
conformationnel. En conséquence, deux protéines réceptrices forment un dimère récepteur. Cette
activation du récepteur des œstrogènes est mesurée par l’induction du gène rapporteur phyK qui code
l’enzyme phytase. Le gène phyK fusionne avec un promoteur œstrogéno-dépendant qui contient des
éléments de réponse aux œstrogènes (ERE). L’ER dimère se lie au promoteur et active ainsi l’expression
et la sécrétion de la phytase. Enfin, l’activité de la phytase en tant que mesure du potentiel œstrogénique
de l’échantillon est déterminée en utilisant un substrat approprié dont le clivage génère un produit de
réaction coloré. Le produit de réaction peut être mesuré par photométrie. Voir l’Annexe C pour un schéma Formatted: Pattern: Clear
du principe de l’essai.
5 Interférences
Les échantillons colorés ou troubles peuvent interférer avec la détection photométrique de la densité
cellulaire et/ou la détection du substrat clivé de l’enzyme rapportrice phytase (voir l’Article 10 pour de Formatted: Pattern: Clear
plus amples informations).
Les effets de la matrice de l’échantillon peuvent entraîner une réduction ou une augmentation des cellules
viables et une réduction ou une augmentation du signal mesurable. Les effets œstrogéniques d’un
échantillon peuvent être masqués par les effets de matrice, conduisant ainsi à des résultats d’essai faux
négatifs ou faux positifs.
Une salinité élevée peut provoquer des effets toxiques dus à la pression osmotique résultante. La
conductivité d’un échantillon est une mesure de sa salinité. La levure Arxula adeninivorans tolère une
conductivité de l’échantillon jusqu’à 20 % de chlorure de sodium, ce qui correspond à une conductivité
de 180 mS/cm.
La croissance bactérienne dans les puits d’essai est évaluée par le réplicat à blanc (3.1). Voir l’Article 10 Formatted: Pattern: Clear
pour de plus amples informations.
Formatted: Pattern: Clear
Lorsque des échantillons filtrés sont soumis à essai afin d’éliminer les bactéries de l’échantillon, des
particules solides sont également séparées de l’échantillon. Ainsi, les substances ayant une activité
œstrogénique qui sont adsorbées sur les particules peuvent ne pas être détectées.
Pour des informations détaillées sur un matériel d’échantillonnage approprié qui n’influence pas le
résultat d’essai, voir l’Article 8.
Formatted: Pattern: Clear
6 Appareillage et matériel
Pour des dispositifs d’échantillonnage appropriés, voir l’Article 8. Utiliser le matériel et la verrerie de Formatted: Pattern: Clear
laboratoire courants si nécessaire. En particulier, le matériel suivant est nécessaire:
6.1 Incubateur agitateur avec minuteur et régulation de température, agitateur décrivant une
orbite d’au moins 3 mm, 30 °C à 37 °C avec une précision de ±1 °C.
Si l’agitateur n’a pas de fonction d’incubation, utiliser un agitateur de laboratoire décrivant une orbite
d’au moins 3 mm en combinaison avec un incubateur (6.17). Formatted: Pattern: Clear
6.2 Mini-agitateur de laboratoire.
6.3 Dispositif de mesurage multiparamètres pour pH et conductivité ou dispositifs séparés pour
chaque paramètre.
6.4 Stérilisateur à vapeur.
6.5 Centrifugeuse, avec un rotor pour plaques à 96 puits jusqu’à 1 000 g et un rotor pour tubes de
réaction de 2 ml.
6.6 Filtres stériles, en acétate de cellulose, diamètre des pores 0,2 µm.
6.7 Pipettes à canal unique, volume nominal de 10 µl à 10 000 µl.
6.8 Pipettes à canaux multiples, volume nominal de 100 µl et 300 µl.
6.9 Plaques à 96 puits en polystyrène transparent à fond plat (profil F, 300 µl) et couvercle.
6.10 Plaques à 96 puits profonds d’un volume d’au moins 1 ml, avec puits carrés à fond rond.
6.11 Photomètre pour microplaques à 96 puits, pour mesurage de l’absorbance à une longueur
d’onde de 405 nm ± 20 nm et de 630 nm ± 5 nm, ou de 600 nm ± 20 nm.
6.12 Film adhésif perméable à l’air pour plaques à puits profonds.
6.13 Tubes de réaction, 2 ml.
6.14 Tubes à essai, 15 ml et 50 ml.
6.15 Réservoir pour pipettes à canaux multiples.
6.16 Balance, charge minimale 1 mg, d = 0,1 mg.
6.17 Incubateur, 30 °C à 37 °C avec une précision de ±1 °C. Pour utiliser l’incubateur en combinaison
avec un agitateur, un incubateur réfrigéré est nécessaire.
7 Réactifs, milieux et souches d’essai
7.1 Réactifs
Dans la mesure du possible, utiliser des produits chimiques de «qualité réactif».
7.1.1 Solution d’acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l, masse moléculaire 36,46 g/mol, CAS: 7647-
01-0.
7.1.2 Solution d’hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 1 mol/l, masse moléculaire 40,00 g/mol,
CAS: 1310-73-2.
7.1.3 Éthanol, ≥ 99,8 %, C H OH, masse moléculaire 46,07 g/mol, CAS: 64-17-5.
2 5
7.1.4 17β-œstradiol, ≥ 98 %, C H O , masse moléculaire 272,38 g/mol, CAS: 50-28-2.
18 24 2
7.1.5 Maltose monohydraté, > 95 %, C H O , H O, masse moléculaire 360,32 g/mol, CAS: 6363-
12 22 11 2
53-7.
7.1.6 Nitrate de sodium, > 99 %, NaNO3, masse moléculaire 84,98 g/mol, CAS: 7631-99-4.
7.1.7 Dihydrogénophosphate de potassium, ≥ 99 %, KH2PO4, masse moléculaire 136,09 g/mol,
CAS: 7778-77-0.
7.1.8 Sulfate de magnésium pur, MgSO , masse moléculaire 120,37 g/mol (anhydre), CAS: 7487-88-
9.
7.1.9 Chlorure de fer(III) hexahydraté, > 97 %, FeCl ·6H O, masse moléculaire 270,29 g/mol,
3 2
CAS: 10025-77-1.
7.1.10 Nitrate de calcium, > 99 %, Ca(NO ) , masse moléculaire 164,09 g/mol, CAS: 10124-37-5.
3 2
7.1.11 D-pantothénate de calcium, > 98 %, C H CaN O masse moléculaire 238,27 g/mol,
18 32 2 10
CAS: 137-08-6.
7.1.12 Chlorhydrate de thiamine, > 98,5 %, C12H18Cl2N4OS, masse moléculaire 337,27 g/mol, CAS: 67-
03-8.
7.1.13 Niacine, > 99,5 %, C H NO , masse moléculaire 123,11 g/mol, CAS: 59-67-6.
6 5 2
7.1.14 Chlorhydrate de pyridoxine, > 99 %, C H NO ·HCl, masse moléculaire 205,64 g/mol, CAS: 58-
8 11 3
56-0.
7.1.15 D-(+)-biotine, ≥ 98,5 %, C H N O S, masse moléculaire 244,31 g/mol, CAS: 58-85-5.
10 16 2 3
7.1.16 Inositol, ≥ 99 %, C H O , masse moléculaire 180,16 g/mol, CAS: 87-89-8.
6 12 6
7.1.17 Acide borique, > 99,8 %, H BO , masse moléculaire 61,83 g/mol, CAS: 10043-35-3.
3 3
7.1.18 Sulfate de cuivre(II) pentahydraté, > 99,5 %, CuSO ·5H O, masse moléculaire 249,68 g/mol,
4 2
CAS: 7758-99-8.
7.1.19 Iodure de potassium, > 99 %, masse moléculaire KI 166,00 g/mol, CAS: 7681-11-0.
7.1.20 Sulfate de manganèse monohydraté, > 99 %, MnSO , H O, masse moléculaire 169,02 g/mol,
4 2
CAS: 10034-96-5.
7.1.21 Sulfate de zinc heptahydraté, > 99,5 %, ZnSO4·7H2O, masse moléculaire 287,56 g/mol,
CAS: 7446-20-0.
7.1.22 Molybdate de sodium dihydraté, > 99,5 %, Na MoO ·2H O, masse moléculaire 241,95 g/mol,
2 4 2
CAS: 10102-40-6.
7.1.23 Chlorure de cobalt(II) pour synthèse, CoCl , masse moléculaire 129,84 g/mol, CAS: 7646-79-
9.
7.1.24 Citrate trisodique dihydraté, > 99 %, C H Na O ·2H O, masse moléculaire 294,10 g/mol,
6 5 3 7 2
CAS: 6132-04-3.
7.1.25 Acide citrique, > 99,5 %, C6H8O7, masse moléculaire 192,12 g/mol, CAS: 77-92-9.
7.1.26 4-nitrophénylphosphate, sel disodique hexahydraté (pNPP), C H NNa O P·6H O, masse
6 4 2 6 2
moléculaire 371,14 g/mol, CAS: 333338-18-4.
7.1.27 Hydroxyde de sodium, ≥ 99 %, NaOH, masse moléculaire 40,00 g/mol, CAS: 1310-73-2.
7.1.28 Eau de mer répondant aux spécifications suivantes: chlorure (Cl) 19 290 mg/l, sodium
10 780 mg/l, sulfate 2 660 mg/l, potassium 420 mg/l, calcium 400 mg/l, carbonate (bicarbonate)
200 mg/l, strontium 8,8 mg/l, bore 5,6 mg/l, bromure 56 mg/l, iodure 0,24 mg/l, lithium 0,3 mg/l,
fluorure 1,0 mg/l, magnésium (Mg) 1 320 mg/l.
7.1.29 Chlorure de sodium, ≥ 99 %, NaCl, masse moléculaire 58,44 g/mol, CAS: 7647-14-5.
7.1.30 Acétone (pureté «pour analyses »), C H O, masse moléculaire 58,08 g/mol, CAS: 67-64-1.
3 6
7.2 Eau, qualité 3, telle que définie dans l’ISO 3696; une eau dont la conductivité est inférieure ou égale
Formatted: Pattern: Clear
à 5 µS/cm est acceptable, ou de l’eau ultrapure.
Formatted: Pattern: Clear
Lorsqu’une eau stérile est nécessaire, la stériliser à l’autoclave ou par filtration (acétate de cellulose,
0,2 µm).
L’eau telle que spécifiée ici est également utilisée pour la préparation de l’eau de dilution employée pour
la dilution progressive de l’échantillon pour essai.
7.3 Souche d’essai
Cette souche d’essai est dérivée de Blastobotrys adeninivorans G1214 Syn.: Arxula adeninivorans G1214
(aleu2 aura3::ALEU2), Référence [1]. Cette souche est auxotrophe pour l’uracile. Pour empêcher Formatted: Pattern: Clear
l’apparition de résistances aux antibiotiques dans l’environnement et pour accroître l’acceptation en ce
qui concerne les exigences légales, l’organisme d’essai ne contient aucun marqueur de résistance aux
antibiotiques.
Modifications génétiques: intégration du marqueur de sélection AURA3mm dans le plasmide Xplor2-102-
hERα-GAA2(ERE107)-phyK après échange du promoteur ATRP1m du marqueur ALEU2. Le marqueur de
sélection AURA3mm a été isolé du plasmide pCR4-AURA3mm-13. Les séquences de E. coli et de marqueur
résistant à la kanamycine ont été éliminées par une digestion par enzymes de restriction. L’intégration
stable de Xplor2-102-hERα-GAA2(ERE107)-phyK dans le génome de Arxula adeninivorans a été obtenue
par transformation de la cassette en un mutant auxotrophe pour l’uracile de A. adeninivorans G1214
(aleu2 aura3::ALEU2) par recombinaison avec l’ADNr 25S.
Pour la détermination du potentiel œstrogénique des échantillons aqueux, une suspension de cellules de
levure est préparée à l’aide de cellules de levure lyophilisées. Étant donné que les cellules de Arxula
adeninivorans sont lyophilisées, l’essai peut être réalisé dans des conditions hautement normalisées et
aucun matériel de laboratoire spécifique n’est requis pour la culture de cellules à long terme.
Les cellules de levure sont disponibles dans le commerce. Conserver les cellules de levure lyophilisées
à une température comprise entre 4 °C et 8 °C et suivre les recommandations du fabricant. Après
réactivation, les cellules de levure peuvent être utilisées directement pour l’essai; une préculture n’est
pas nécessaire pour les essais.
Une alternative aux cellules de levure lyophilisées disponibles dans le commerce consiste à préparer soi-
même des cellules de levure lyophilisées. Le mode opératoire de préparation est décrit à l’Annexe B. La Formatted: Pattern: Clear
souche de levure peut être isolée à partir d’un lyophilisat disponible dans le commerce.
7.4 Milieu.
Lorsqu’un passage en autoclave est nécessaire, le réaliser pendant 20 min à 121 °C ± 2 °C. Couvrir
légèrement les récipients (par exemple avec une feuille d’aluminium). Ne jamais fermer hermétiquement.
7.4.1 Solution mère de 17β-œstradiol (E2).
Dissoudre 10 mg de 17b-œstradiol (E2) (7.1.4) dans 10 ml d’éthanol (7.1.3). Conserver la solution mère Formatted: Pattern: Clear
de 17β-œstradiol (E2) à ≤ −18 °C. Ne pas conserver la solution mère plus de 18 mois.
Formatted: Pattern: Clear
S’il est disponible, un étalon de référence certifié de 17β-œstradiol de même concentration peut être
utilisé comme solution mère.
7.4.2 Solution de travail de 17β-œstradiol (E2).
Diluer la solution mère de 17β-œstradiol (E2) (7.4.1) à 1→100 en ajoutant 10 µl de la solution mère Formatted: Pattern: Clear
de 17β-œstradiol (E2) (7.4.1) à 990 µl d’éthanol (7.1.3) et bien mélanger. Effectuer une dilution
Formatted: Pattern: Clear
supplémentaire à 1→10 en ajoutant 100 µl de la première dilution à 900 µl d’éthanol (7.1.3) et bien
Formatted: Pattern: Clear
mélanger. La concentration finale est de 1 mg/l. La solution de travail doit être préparée sous forme
Formatted: Pattern: Clear
d’aliquote pour éviter toute congélation et décongélation de la solution de travail. Conserver la solution
de travail de 17β-œstradiol (E2) à ≤ −18 °C. Ne pas conserver la solution de travail plus de 6 mois.
NOTE Le pipetage de solvants organiques nécessite l’utilisation de pipettes calibrées adéquates ou d’un autre
matériel adapté à la manipulation de liquides.
7.4.3 Solution de maltose.
Dissoudre 20 g de maltose monohydraté (7.1.5) dans 70 ml d’eau ultrapure (7.2). Compléter la solution Formatted: Pattern: Clear
de maltose à 100 ml avec de l’eau ultrapure (7.2). Passer la solution à l’autoclave. Conserver la solution
Formatted: Pattern: Clear
de maltose à une température comprise entre 2 °C et 8 °C. Ne pas conserver la solution de maltose plus
Formatted: Pattern: Clear
de six mois.
7.4.4 Solution saline pour milieu minimal pour levures.
Formatted: Pattern: Clear
Dissoudre 3,7 g de NaNO (7.1.6), 8,4 g de KH PO (7.1.7) et 1 g de MgSO (7.1.8) dans 70 ml d’eau
3 2 4 4
ultrapure (7.2). Compléter à 100 ml avec de l’eau ultrapure (7.2). Passer la solution à l’autoclave.
Formatted: Pattern: Clear
Conserver la solution saline pour milieu minimal pour levures à une température comprise entre 2 °C
Formatted: Pattern: Clear
et 8 °C. Ne pas conserver la solution saline plus de six mois.
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
7.4.5 Solution saline pour milieu salin minimal pour levures.
Formatted: Pattern: Clear
Dissoudre 28 g de NaCl (7.1.29), 3,7 g de NaNO3 (7.1.6), 8,4 g de KH2PO4 (7.1.7) et 1 g de MgSO4 (7.1.8)
Formatted: Pattern: Clear
dans 70 ml d’eau ultrapure (7.2). Compléter à 100 ml avec de l’eau ultrapure (7.2). Pour l’analyse
Formatted: Pattern: Clear
d’échantillons d’eau de mer et d’échantillons d’eau saumâtre, les 28 g de NaCl peuvent être remplacés
Formatted: Pattern: Clear
par 28 g d’une composition saline similaire à celle de l’eau de mer. Passer la solution à l’autoclave.
Conserver la solution saline pour milieu salin minimal pour levures à une température comprise
Formatted: Pattern: Clear
entre 2 °C et 8 °C pendant six mois au maximum.
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
7.4.6 Solution de micronutriments.
Formatted: Pattern: Clear
Peser séparément les produits chimiques suivants:
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
0,05 g de H BO (7.1.17), 0,01 g de CuSO ·5H O (7.1.18), 0,01 g de KI (7.1.19), 0,04 g de
3 3 4 2
Formatted: Pattern: Clear
MnSO , H O (7.1.20), 0,04 g de ZnSO ·7H O (7.1.21), 0,02 g de Na MoO ·2H O (7.1.22), 0,01 g de
4 2 4 2 2 4 2
Formatted: Pattern: Clear
CoCl2 (7.1.23).
Formatted: Pattern: Clear
Mélanger les produits chimiques et les dissoudre dans 100 ml d’eau ultrapure (7.2). Passer la solution Formatted: Pattern: Clear
à l’autoclave. La précipitation qui suit le passage à l’autoclave n’a pas d’influence sur la qualité. Agiter la
solution avant de l’utiliser. Conserver la solution de micronutriments à une température comprise
entre 2 °C et 8 °C. Ne pas conserver la solution de micronutriments plus de 12 mois.
7.4.7 Solution de FeCl3.
Peser 0,2 g de Fe(III)Cl hexahydraté (7.1.9) et le dissoudre dans 20 ml d’eau ultrapure (7.2). Stériliser la
3 Formatted: Pattern: Clear
solution de FeCl par filtration (0,2 µm). Conserver la solution de FeCl à une température comprise
3 3
Formatted: Pattern: Clear
entre 2 °C et 8 °C. Ne pas conserver la solution de FeCl plus de six mois.
7.4.8 Solution de Ca(NO ) .
3 2
Peser 10 g de Ca(NO ) (7.1.10) et les dissoudre dans 10 ml d’eau ultrapure (7.2). Stériliser la solution Formatted: Pattern: Clear
3 2
de Ca(NO ) par filtration (0,2 µm). Conserver la solution de Ca(NO ) à une température comprise
3 2 3 2
Formatted: Pattern: Clear
entre 2 °C et 8 °C. Ne pas conserver la solution de Ca(NO3)2 plus de six mois.
7.4.9 Mélange de vitamines.
Peser séparément les produits chimiques suivants:
0,2 g de D-pantothénate de calcium (7.1.11), 0,2 g de chlorhydrate de thiamine (7.1.12), 0,05 g de niacine Formatted: Pattern: Clear
(7.1.13), 0,02 g de biotine (7.1.15), 0,2 g de chlorhydrate de pyridoxine (7.1.14), 2 g d’inositol (7.1.16).
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Mélanger et dissoudre les vitamines dans 50 ml d’eau ultrapure (7.2). Stériliser le mélange de vitamines
Formatted: Pattern: Clear
par filtration (0,2 µm). Conserver le mélange de vitamines à une température comprise entre 2 °C et 8 °C.
Ne pas conserver le mélange de vitamines plus de six mois.
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
7.4.10 Milieu minimal maltosé pour levures.
Formatted: Pattern: Clear
Ajouter à la pipette 1 ml de solution de FeCl (7.4.7), 1 ml de solution de Ca(NO ) (7.4.8), 1 ml de solution
3 3 2 Formatted: Pattern: Clear
de micronutriments (7.4.6) et 0,5 ml de mélange de vitamines (7.4.9) à 96,5 ml de la solution saline
Formatted: Pattern: Clear
(7.4.4). Ajouter 100 ml de solution de maltose (7.4.3).
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Le milieu minimal maltosé pour levures est concentré cinq fois. Conserver le milieu minimal pour levures
à une température comprise entre 2 °C et 8 °C. Ne pas conserver le milieu minimal pour levures plus
Formatted: Pattern: Clear
de six mois.
Formatted: Pattern: Clear
7.4.11 Milieu salin minimal maltosé pour levures.
Ajouter à la pipette 1 ml de solution de FeCl (7.4.7), 1 ml de solution de Ca(NO ) (7.4.8), 1 ml de solution
3 3 2 Formatted: Pattern: Clear
de micronutriments (7.4.6) et 0,5 ml de mélange de vitamines (7.4.9) à 96,5 ml de solution saline pour
Formatted: Pattern: Clear
milieu salin minimal pour levures (7.4.5). Ajouter 100 ml de solution de maltose (7.4.3).
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Le milieu salin minimal maltosé pour levures est concentré cinq fois. Conserver le milieu salin minimal
pour levures à une température comprise entre 2 °C et 8 °C. Ne pas conserver le milieu salin minimal
Formatted: Pattern: Clear
pour levures plus de six mois.
Formatted: Pattern: Clear
7.4.12 Tampon de substrat.
Formatted: Pattern: Clear
Peser séparément 10,35 g de citrate trisodique dihydraté (7.1.24) et 12,45 g d’acide citrique (7.1.25).
Formatted: Pattern: Clear
Dissoudre chaque réactif dans 60 ml d’eau ultrapure (7.2). Mélanger les deux solutions et compléter
Formatted: Pattern: Clear
à 200 ml avec de l’eau ultrapure (7.2). Passer le tampon de substrat à l’autoclave et le laisser refroidir
Formatted: Pattern: Clear
avant de l’utiliser. Conserver le tampon de substrat à une température comprise entre 2 °C et 8 °C. Ne pas
conserver le tampon de substrat plus de six mois.
7.4.13 Solution de substrat pour phytase.
Peser au moins 15 mg de 4-nitrophénylphosphate, sel disodique hexahydraté (7.1.26) et les dissoudre Formatted: Pattern: Clear
dans un volume équivalent de tampon de substrat. Un volume de 15 ml de solution de substrat pour
phytase suffit pour deux plaques d’essai. Préparer toujours une solution fraîche de substrat pour phytase
et l’utiliser dans les 2 h qui suivent.
7.4.14 Révélateur.
Dissoudre 24 g d’hydroxyde de sodium solide (7.1.27) dans 200 ml d’eau ultrapure (7.2). Passer la Formatted: Pattern: Clear
solution d’hydroxyde de sodium à l’autoclave et la laisser refroidir avant de l’utiliser. Conserver le
Formatted: Pattern: Clear
révélateur à température ambiante. Ne pas conserver la solution de révélateur plus de six mois.
8 Échantillonnage et échantillons
8.1 Généralités
Le présent document décrit les exigences spécifiques relatives à l’échantillonnage en vue de la
détermination de l’activité œstrogénique dans des échantillons d’eau. Pour des informations générales
sur l’échanti
...
Questions, Comments and Discussion
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