ISO 5667-16:2017
(Main)Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
ISO 5667-16:2017 gives practical guidance on sampling, pre-treatment, performance and evaluation of environmental samples in the context of performing biological tests. Information is given on how to cope with the problems of biotesting arising from the sample and the suitability of the test design. It is intended to convey practical experience concerning precautions to be taken by describing methods successfully proven to solve or to circumvent some of the experimental problems of biotesting of, for example, waters. Primarily dealt with are substance-related problems concerning sampling and pre-treatment of environmental samples (e.g. waste water samples) for the performance of biotests. This guidance is on ecotoxicological testing with organisms (single-species biotests; in vivo and in vitro). Some features addressed in this document also apply to biotests using single-cell systems (in vitro bioassays) and biodegradation studies as far as sampling and sample preparations are concerned. Testing of substances in the water solubility range is also addressed. Reference has been made as far as possible to existing International Standards and guidelines. Information taken from published papers or oral communication has been utilized as well. ISO 5667-16:2017 is applicable to biological tests for determining the effect of environmental samples like treated communal and industrial waste water, groundwater, fresh water, aqueous extracts (e.g. leachates, eluates), pore water of sediments and whole sediments. This document is also applicable to chemical substances. ISO 5667-16:2017 is not applicable to bacteriological examination of water. Appropriate methods for bacteriological examination are described in other documents (see ISO 19458[17]).
Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques des échantillons
ISO 5667-16:2017 fournit des lignes directrices pour l'échantillonnage, le prétraitement, la mise en ?uvre et l'évaluation des échantillons environnementaux dans le cadre de la réalisation d'essais biologiques. Des informations sont données sur la manière de traiter les problèmes, pour les essais biologiques, liés à l'échantillon et à l'adaptation du dispositif expérimental. Elles sont destinées à diffuser une expérience pratique concernant les précautions à prendre en décrivant des méthodes qui se sont révélées satisfaisantes pour résoudre ou éliminer certains problèmes expérimentaux au cours des essais biologiques des eaux, par exemple. ISO 5667-16:2017 traite en premier lieu des problèmes liés aux substances en ce qui concerne l'échantillonnage et le prétraitement des échantillons environnementaux (par exemple échantillons d'eaux résiduaires) pour la réalisation d'essais biologiques. Ces lignes directrices portent sur les essais écotoxicologiques réalisés avec des organismes (essais biologiques monospécifiques; in vivo et in vitro). Certaines caractéristiques traitées dans le présent document s'appliquent également à l'échantillonnage et la préparation d'échantillons pour les essais biologiques utilisant des systèmes unicellulaires (essais biologiques in vitro) et les études de biodégradation. Les essais sur substances dans la gamme de solubilité dans l'eau sont également traités. Il a été fait référence aux Normes internationales et aux directives existantes dans toute la mesure du possible. Des informations provenant de publications ou de communications orales ont également été utilisées. ISO 5667-16:2017 s'applique aux essais biologiques destinés à déterminer l'effet des échantillons environnementaux tels que les eaux résiduaires communales et industrielles traitées, les eaux souterraines, les eaux douces, les extraits aqueux (par exemple lixiviats et éluats), l'eau interstitielle des sédiments et les sédiments entiers. Il s'applique également aux substances chimiques. ISO 5667-16:2017 n'est pas applicable à l'examen bactériologique des eaux. Des méthodes appropriées pour l'examen bactériologique sont décrites dans d'autres documents (voir l'ISO 19458[17]).
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 5667-16
Second edition
2017-04
Water quality — Sampling —
Part 16:
Guidance on biotesting of samples
Qualité de l’eau — Échantillonnage —
Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques des
échantillons
Reference number
©
ISO 2017
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or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
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Fax +41 22 749 09 47
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www.iso.org
ii © ISO 2017 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .v
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 General guidance regarding test design . 5
4.1 General . 5
4.2 Replicates . 5
4.2.1 General. 5
4.2.2 Lowest ineffective dilution (LID) . 5
4.2.3 Hypothesis testing — two-sample comparisons . 6
4.2.4 Concentration and dilution response relationship . 6
5 Evaluation . 7
5.1 General . 7
5.2 Statistical analysis . 7
6 Sampling and transportation . 7
6.1 General . 7
6.2 Sampling equipment . 8
6.2.1 General. 8
6.2.2 Sample container . 8
6.3 Filling status of sample containers . 9
6.4 Sample identification and records . 9
6.5 Sub-sampling . 9
6.6 Transportation .10
6.7 Contamination during sampling .10
6.8 Sampling quality control techniques .10
7 Pre-treatment .11
7.1 General .11
7.2 Preservation and storage .11
7.3 Thawing .12
7.4 Homogenization .12
7.5 Separation of soluble and particulate matter .12
7.6 Preconcentration .13
7.6.1 General.13
7.6.2 Extraction methods .14
7.7 pH adjustment .14
8 Apparatus and equipment .14
8.1 Selection of apparatus .14
8.2 Cleaning of apparatus and equipment .15
9 Impairment of test performance .15
9.1 Problems and preventive measures for samples containing removable ingredients .15
9.1.1 General.15
9.1.2 Volatilization . .16
9.1.3 Foaming .16
9.1.4 Adsorption . . .16
9.1.5 Precipitation/flocculation .16
9.1.6 Degradation .16
9.2 Problems and preventive measures concerning coloured and/or turbid samples .17
10 Preparation of stock solutions and test batches .17
10.1 Water-soluble substances .17
10.2 Poorly soluble substances .17
10.2.1 General.17
10.2.2 Testing in the water solubility range .17
10.2.3 Dispersions and emulsions .18
10.2.4 Special problems with mixtures of substances or technical products .18
10.2.5 Limit test .19
11 Quality assurance for biotesting .19
11.1 General .19
11.2 Quality assurance in the context of the investigation of environmental samples .19
12 Reporting .20
Bibliography .23
iv © ISO 2017 – All rights reserved
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: w w w . i s o .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 6, Sampling (general
methods).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 5667-16:1998), which has been technically
revised.
A list of all parts in the ISO 5667 series can be found on the ISO website.
Introduction
Biological tests are suitable for determining the effect of environmental samples or chemical substances
on the respective test organism under the specific standardized test conditions. Environmental samples
are e.g. treated communal and industrial waste water, fresh water, aqueous extracts of solid material
(e.g. leachates, eluates), pore water of sediments. The effect can be stimulative or inhibiting, and can be
determined by the reaction of the test organism (e.g. death, growth, morphological and physiological
changes or generally, changes in molecular mechanisms of action). Inhibiting effects can be triggered
by toxic water constituents or by other noxious influences.
The toxicity measurable in the biological test is the result of the interaction between a single toxic
substance, a mixture of substances or the constituents of an environmental sample and the test
organism. The protective potential of the biological system, i.e. the test organism, for instance by
metabolic detoxification and excretion, is an integral part of the biological test.
Apart from the direct toxic effect of one or more sample constituents, biological effects can be exerted
by the combined action of all constituents of a sample. Such a combined effect includes the impact of, for
example, substances which are not toxic per se but affect the chemical or physical properties of the test
batches by interfering with the test specific additives (e.g. nutrients, salts) and, consequently, the living
conditions for the test organisms. This applies for instance to oxygen-depleting substances, coloured
substances or turbid matter which reduce light exposure.
Biological tests also include those tests which examine the effect of organisms on substances (e.g.
microbial degradation studies).
The results of the biological test refer primarily to the organism used in the test and the defined
conditions stipulated for the test procedure. A harmful effect stated by means of standardized biological
tests can justify concern that aquatic organisms and biocoenosis might be endangered. The results,
however, do not permit direct or extrapolative conclusions as to the occurrence of similar effects in
the aquatic environment. This applies in particular to suborganismic tests, as important properties
and physiological functions of intact organisms (e.g. protective integuments, repair mechanisms) are
removed or deactivated.
In principle there is no test organism which can be used to test all the effects on the biocoenosis or
the ecosystem possible under the various combinations of abiotic and biotic conditions. Only a few
(“model”) species representing relevant ecological functions can be tested in practice.
Besides these fundamental and practical limitations in the selection of test organisms some issues
should be taken into account during sampling and sample treatment in order to avoid a change in the
sample properties. This applies to the method of sampling, including the sampling equipment and
sample container as well as the transport to the laboratory. The method of sample pre-treatment and
storage, as well as the preparation of, for example, stock solutions, may have an influence on the test
result as well.
Furthermore, the sample to be tested can pose experimental problems on biotesting. Environmental
samples (e.g. waste water, eluates) are complex mixtures and may contain, for example, sparingly
soluble, volatile, unstable, coloured substances or suspended, sometimes colloidal, particles. The
complexity and heterogeneity of materials give rise to a variety of experimental problems when
performing biotests.
Special problems are related to the instability of the test material due to reactions and processes such as
— physical (e.g. phase separation, sedimentation, volatilization),
— chemical (e.g. hydrolysis, photodegradation, precipitation), and/or
— biological (e.g. biodegradation, biotransformation, biological uptake in organisms).
Other problems, especially if spectrometric measurements are applied, relate to turbidity and colour of
the test batch.
vi © ISO 2017 – All rights reserved
The statistical analysis of the data from biological testing of environmental samples should be
conducted according to the current state of the art if not stipulated by the specific biotest standard.
Finally, it is recommended to implement and maintain a quality management system regardless if a
laboratory is involved in testing of substances or environmental samples.
This document is one of a group of International Standards dealing with the sampling of waters and
sediments and is intended to be read in conjunction with the other parts of the ISO 5667 series, in
particular with ISO 5667-1, ISO 5667-3 and ISO 5667-15.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 5667-16:2017(E)
Water quality — Sampling —
Part 16:
Guidance on biotesting of samples
1 Scope
This document gives practical guidance on sampling, pre-treatment, performance and evaluation of
environmental samples in the context of performing biological tests. Information is given on how to
cope with the problems of biotesting arising from the sample and the suitability of the test design.
It is intended to convey practical experience concerning precautions to be taken by describing methods
successfully proven to solve or to circumvent some of the experimental problems of biotesting of, for
example, waters.
Primarily dealt with are substance-related problems concerning sampling and pre-treatment of
environmental samples (e.g. waste water samples) for the performance of biotests.
This guidance is on ecotoxicological testing with organisms (single-species biotests; in vivo and in
vitro). Some features addressed in this document also apply to biotests using single-cell systems (in
vitro bioassays) and biodegradation studies as far as sampling and sample preparations are concerned.
Testing of substances in the water solubility range is also addressed.
Reference has been made as far as possible to existing International Standards and guidelines.
Information taken from published papers or oral communication has been utilized as well.
This document is applicable to biological tests for determining the effect of environmental samples
like treated communal and industrial waste water, groundwater, fresh water, aqueous extracts (e.g.
leachates, eluates), pore water of sediments and whole sediments. This document is also applicable to
chemical substances.
This document is not applicable to bacteriological examination of water. Appropriate methods for
[17]
bacteriological examination are described in other documents (see ISO 19458 ).
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org/ obp
3.1
blank
mixture of water and nutrients without test organism
3.2
cell density
x
number of cells per unit volume of medium
Note 1 to entry: Cell density is expressed in cells per millilitre.
[6]
[SOURCE: ISO 10253:2016, 3.1]
3.3
control
control medium (3.4), or control sediment (3.5), including organisms used in the test, without test sample
3.4
control medium
combination of dilution water and/or nutrient medium used in the test
[18]
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.6]
3.5
control sediment
defined artificial or natural sediment used in the test
3.6
dilution level
D
reciprocal value of the volume fraction of test sample in dilution water (3.7) in which the test is
conducted
EXAMPLE 250 ml of waste water in a total volume of 1 000 ml (volume fraction of 25 %) represents dilution
level D = 4.
[13]
[SOURCE: ISO 15088:2007, 3.2, modified — “waste water” replaced by “test sample”]
3.7
dilution water
water added to the test sample to prepare a series of defined dilutions
Note 1 to entry: The composition of the water is specified in the respective standard.
[18]
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.7, modified — “Note 1 to entry” has been added]
3.8
effective concentration
EC
x
concentration of the test material in water or sediment that causes x % change in response during a
specified time interval
[SOURCE: ISO/TS 20281:2006, 3.8.1, modified — “quantal” has been removed from the term and
abbreviated term; “soil” and “(e.g. immobility)” have been removed from the definition; the EXAMPLE
[20]
and Notes 1 and 2 to entry are not included]
3.9
field blank
container prepared in the laboratory using reagent water or other blank matrix and sent with the
sampling personnel for exposure to the sampling environment to verify possible contamination during
sampling
[9]
[SOURCE: ISO 11074:2015, 4.5.3]
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3.10
growth rate
proportional rate of increase in biomass per unit of time: (1/day)
[SOURCE: ISO 10253:2016, 3.2, modified — “specific grow rate” replaced by “growth rate”; formula and
[6]
Note 1 to entry not included]
3.11
lowest ineffective dilution
dilution factor
LID
lowest ineffective dilution tested, expressed as dilution level D (3.6), at which no inhibition, or only
effects not exceeding the test-specific variability, are observed
[13]
[SOURCE: ISO 15088:2007, 3.5]
3.12
nutrient medium
solution of nutrients and micronutrients in water which are essential for the growth of the test organism
[18]
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.17, modified — “duckweed” replaced by “the test organism”]
3.13
positive control
well-characterized reference substance (3.14) that, when evaluated by a specific test method,
demonstrates the suitability of the test system to yield a reproducible, appropriately positive or reactive
response in the test system
[SOURCE: ISO 10993-12:2010, 3.14, modified — “any” removed before “well-characterized”; “material
[8]
and/or substance, which” replaced by “reference substance that”
3.14
reference substance
known substance to verify the sensitivity of the method
3.15
reference batch
mixture of dilution water, test specific additives and reference substance, including test organisms
3.16
replicate
one of a selected number of identical test batches (3.24) or identical reference batches (3.15)
3.17
sample
portion of material selected from a large quantity of material
Note 1 to entry: The method of sample selection can be described in the sampling plan.
Note 2 to entry: The material is from the environment (e.g. waste water, sediment or an eluate), a chemical
substance or preparation or related material.
[15]
[SOURCE: ISO 16133:2004, 2.11, modified — Notes 1 and 2 to entry have been added]
3.18
sample pre-treatment
collective noun for all procedures used for conditioning a sample to a defined state which allows
subsequent examination
Note 1 to entry: Depending on the requirements of the method sample, pre-treatment includes for example
preservation and storage, centrifugation, filtration, homogenization, preconcentration and pH adjustment.
3.19
sample storage
process, and the result, of keeping a sample available under predefined conditions for a (usually)
specified time interval between collection and further treatment of a sample
Note 1 to entry: Specified time is the maximum time interval.
[2]
[SOURCE: ISO 5667-3:2012, 3.3]
3.20
stock culture
culture of a single species to conserve the original defined species in the laboratory
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.21, modified — deleted “duckweed”, “Lemna” “and to provide inoculum for
[18]
the pre-culture”]
3.21
stock solution
solution with accurately known analyte concentration(s), prepared from chemicals with an
appropriate purity
[10]
[SOURCE: ISO 11885:2007, 3.23]
3.22
storage time
period of time between filling of the sample container and further treatment of the sample in the
laboratory, if stored under predefined conditions
Note 1 to entry: Sampling finishes as soon as the sample container has been filled with the sample. Storage time
ends when the sample is taken by the analyst to start sample preparation prior to analysis.
[2]
[SOURCE: ISO 5667-3:2012, 3.4, modified — Note 2 to entry not included]
3.23
sub-sample
representative portion removed from a sample
[5]
[SOURCE: ISO 5667-19:2004, 3.7]
3.24
test batch
test medium including organisms used for testing
[18]
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.22]
3.25
test medium
mixture of test sample or test substance, dilution water and nutrients (without test organisms)
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.23, modified “combination” replaced by “mixture”, after test sample added
“or test substance”, deleted “/or”, “nutrient medium used in the test” replaced by “nutrients (without
[18]
test organisms)”]
3.26
test sample
sample to be tested, after finishing all preparations
EXAMPLE Preparations include centrifugation, filtration, homogenization, pH adjustment and measurement
of conductivity.
[11]
[SOURCE: ISO 13829:2000, 3.7]
4 © ISO 2017 – All rights reserved
3.27
test substance
chemical substance under investigation added to the test system
[14]
[SOURCE: ISO 15473:2002, 3.10]
3.28
test material
material to be tested
[16]
[SOURCE: ISO 17126:2005, 3.3, modified — EXAMPLES removed]
4 General guidance regarding test design
4.1 General
For each test, several replicates of the control and the treatment groups should be examined. The
minimum number of replicates is usually prescribed in the respective standard. An example of how the
required number of observations (replicates) can be calculated is given in 4.2.3.
It is recommended to minimize the influence of differences in testing conditions (e.g. light, temperature)
for example by randomizing the design for location of the test vessels in the test chamber.
To assure that the laboratory test conditions (including the condition and sensitivity of the test
organisms) are adequate and have not changed significantly, a reference substance should be tested as
a positive control.
4.2 Replicates
4.2.1 General
Mainly three statistical approaches are performed in statistical analysis of the results from ecotoxicity
tests with environmental samples.
a) determining the lowest ineffective dilution (LID) in testing of, for example, waste water;
b) two sample comparisons between the control (or reference batch) and either test or positive control
batches (toxic standard);
c) computing point estimates [e.g. EC , LC (Lethal concentration)] from modelled concentration or
20 50
dilution response relationships.
In ecotoxicity testing of environmental samples, the determination of a NOEC (no observed effect
concentration) and LOEC (lowest observed effect concentration) is normally not intended and thus is
not considered in this document. If the assessment of the NOEC should be exceptionally performed,
[20]
consider ISO/TS 20281 .
The number of replicates is mainly critical in hypothesis testing (e.g. two-sample comparisons) and is
dependent on the variability of the respective endpoint to be evaluated, the minimum effect size which
has to be detected by a statistical test and the statistical power. The estimation of an EC puts different
x
[20]
demands on the study design than on the two-sample comparison (see ISO/TS 20281 ).
4.2.2 Lowest ineffective dilution (LID)
In toxicity testing of, for example, waste water or eluates, the sample is diluted according to a defined
scheme of dilutions (D). The lowest ineffective dilution (LID) denotes the most concentrated test batch
at which no inhibition or mortality, or only effects not exceeding the test-specific limit occur (e.g.
[18]
ISO 20079 : 10 % inhibition of the growth rate of Lemna spec.). D is expressed as the reciprocal value
of the volume fraction of e.g. waste water in the test batch.
This approach does not require further statistical analysis (e.g. hypothesis testing).
4.2.3 Hypothesis testing — two-sample comparisons
Statistical two-sample comparisons play an important role in testing of environmental samples. They
are performed in order to compare samples from various sample sites with a reference site (e.g. samples
from a polluted area of running waters with a sample from an unpolluted reference site upstream) or to
compare samples taken at different periods.
Under some circumstances, for example when it is only desired to ascertain whether a given dilution
level exhibits an effect, a two-sample comparison involving a comparison of responses in a control and
one test concentration or a positive control may be undertaken (see 10.2.5).
When performing two-sample comparisons, the type of endpoint data, i.e. whether quantal (qualitative)
or metric (quantitative), variables under investigation is of decisive importance for the selection of the
test procedure and calculation of the necessary sample sizes (replicates). In addition, a statistical test
based on an analysis of variance (ANOVA) requires normal distribution and variance homogeneity of data.
The mortality (or immobility) of test organisms determined in the acute test is a typical quantal
variable.
In contrast, metric variables show continuous increments, i.e. a response gradient. Typical metric
variables are for example, body length or biomass, metabolic rates, oxygen production, consumption
rates or enzymatic transformation rates. The number of young animals produced may also be regarded
as an approximate metric variable.
Formulae to calculate the required number of observations (replicates) are provided by statistical
textbooks and papers (e.g. Reference [24]). As an example, to compare a metric variable (e.g. biomass)
measured in a water or sediment sample from a polluted site and a reference site, a two-sample t-test
is performed. The calculation of the required sample size is given in Formula (1) (see Reference [24]):
σ
nt≥ 2 + t (1)
()
αβ,,df 2 df
δ
where
n is the number of replicates;
σ is the true standard deviation of the end point;
δ is the smallest true difference;
df are the degrees of freedom (here: df = n + n – 2);
1 2
α is the desired significance level (e.g. 0,05);
β is the desired type II error [1 – β is called “power” of the statistical test and denotes the
desired probability that a difference will be found to be significant (if it as small as δ)];
t | t are the values from a two-tailed t table with df degrees of freedom.
α 2β
It is necessary to know only the ratio of σ to δ, not their actual values (e.g. given the coefficient of
variation is 20 % and the desired detectable difference 10 % the ratio is two). Consider statistical
[20]
textbooks or ISO/TS 20281 for formulae of other test procedures.
4.2.4 Concentration and dilution response relationship
Concentration and dilution response modelling can be used to determine definite effect sizes (e.g. EC ,
EC , LC ) evoked by the volume fractions of the test sample. It should be used to analyse the effects of
50 50
[18]
reference substances in order to demonstrate the performance of the test system (e.g. ISO 20079 ).
6 © ISO 2017 – All rights reserved
The test is seen as valid if the obtained EC for the reference substance is bracketed by a lower and
upper limit EC , determined in previous ring tests.
The primary demand on the design is to have a sufficient number of concentration (dilution) groups.
This might be at the expense of the number of replicates per group (e.g. keeping the total size of the
experiment the same), since the precision of the estimated EC depends more on the total size of the
x
experiment rather than on the sample size per concentration or dilution group.
Again, the type of endpoint data, i.e. whether quantal (qualitative) or metric (quantitative) variables are
determined, is of decisive importance for the test design and statistical method. For more information,
[20]
see ISO/TS 20281 .
5 Evaluation
5.1 General
Evaluation of the test results first involves the critical inspection of data and a presentation and
description of the test results using graphs, tables and suitable statistical parameters, e.g. mean values
and measures of dispersion (descriptive statistics).
In many cases, this is followed by more extensive statistical processing which aims to determine
concentration or dilution response relationships, to calculate suitable statistical parameters for the
quantum of action and to examine the statistical significance (estimating and testing statistics). This
more extensive statistical evaluation is useful only if the data are sufficient for this purpose. This
requires critical examination of the data.
5.2 Statistical analysis
The statistical analysis of the data from ecotoxicity testing of environmental samples should be
[20]
conducted according to the current state of the art as stated in ISO/TS 20281 or the respective
standard of the ecotoxicity test. In particular, the following should be considered.
— The data should be completely documented in tabular or graphical form.
— An appropriate statistical method should be chosen based on the type of data scale.
— With hypothesis testing, a measure of statistical power of the conducted statistical test procedure
should be provided, e.g. the minimum detectable (= significant) difference (see References [24]
and [25]).
— With concentration or dilution response modelling, confidence limits (e.g. 95 % confidence limits)
should be provided for the reported EC or LC ).
x x
— It is highly recommended to perform all statistical calculations using validated statistical software.
6 Sampling and transportation
6.1 General
Sampling is the first step in carrying out biological, chemical and physical examinations. The goal of
sampling should be to obtain a representative sample for the research question assessed and to supply
it to the laboratory in the correct manner.
Environmental samples are susceptible to change as a result of physical, chemical or biological reactions
which can take place between the time of sampling and the analysis. If the necessary precautions are
not taken during sampling, transportation and storage, the nature and rate of these reactions are often
such that the sample can be changed substantially and will no longer be representative of the original
sample. The extent of these changes is dependent on the chemical and biological nature of the sample,
the material of the sampling equipment (sampling vessel and sample container), the transportation
and pre-treatment (e.g. storage, preservation). Errors caused by improper sampling and sample pre-
treatment cannot be corrected.
[1]
This document is intended to be used in conjunction with ISO 5667-1 which sets out the general
principles and provides guidance on the design of sampling programmes and sampling techniques for
all aspects of sampling of water (including waste water, sludge, effluents and bottom deposits), e.g. the
choice of representative sampling points, time and frequency of sampling, sampling techniques, sample
equipment for physical or chemical characteristics, avoidance of contamination, transportation to and
storage of samples at the laboratory, sample identification and records.
[2]
For the determination of physico-chemical parameters ISO 5667-3 gives guidance when spot or
composite samples cannot be analysed on site and have to be transported to a laboratory for analysis.
It establishes general requirements for handling and preservation of samples, sample transportation,
sample reception and identification as well as sample storage. For the preservation and handling of
[4]
sludge and sediment, see ISO 5667-15 .
In general, the sampling approach for performing biotests is compatible with the one for chemical
analysis. In any case, consultation with the laboratory conducting the biotest is strongly recommended.
6.2 Sampling equipment
6.2.1 General
The provisions on sampling equipment, especially on the material used, apply to both the sampling
vessel as well as to sample containers. The type of container and sample equipment should be chosen
in agreement with the testing laboratory since for some biotests only certain materials are suitable for
sampling, transportation and storage. Specific requirements for the sampling material described in a
given national or international biotest standard are mandatory.
6.2.2 Sample container
[1] [2]
The choice of sample container is of major importance and ISO 5667-1 and ISO 5667-3 provide
guidance on this subject.
[1]
The majority of the following instructions and recommendations are cited from ISO 5667-1 .
The sample container should be designed to preserve the composition of the sample from losses due
to adsorption and volatilization, or from contamination by foreign substances. The most frequently
encountered problems consist of adsorption of chemical substances onto the walls of the sampling
vessel or sample container, contamination prior to sampling caused by improper cleaning of the
sampling vessel or sample container, and contamination of the sample by the material constituting the
sampling vessel or sample container.
The sample container used to collect and store the sample should be chosen after considering, for
example, resistance to temperature extremes, resistance to breakage, ease of good sealing and
reopening, size, shape, mass, availability, cost, potential for cleaning and re-use.
For light-sensitive materials, light-absorbent glass should be used. Stainless steel should be used
for taking samples of water under high temperature and/or pressure, or when sampling for trace
concentrations of organic material.
In addition to the desired physical characteristics described above, the sample containers used to
collect and store the samples should be selected by taking into account the following predominant
criteria (especially when the constituents to be analysed are present in trace quantities):
a) minimization of contamination of the sample by the material of which the container or its stopper is
made, for example, leaching of inorganic constituents from glass (especially soft glass) and organic
compounds and metals from plastics and elastomers (plasticized vinyl cap liners, polychloroprene
jackets);
8 © ISO 2017 – All rights reserved
b) ability to clean and treat the walls of the containers, to reduce surface contamination by trace
constituents such as heavy metals;
c) chemical and biological inertness of the material of which the container is made, in order to prevent
or minimize reaction between constituents of the sample and the container;
d) sample containers which can also cause errors by adsorption of chemical determinants. Trace
metals are particularly liable to this effect, but other determinants (e.g. detergents, pesticides and
phosphate) can also be subject to error.
The sample container should be resistant to heating and freezing and it should be autoclavable and
easy to clean. Polypropylene (PP), polytetrafluoroethylene (PTFE) or polyethylene (PE) containers are
appropriate, but polyethylene is not autoclavable. Glass bottles are generally (but not always) suitable
for organic chemical compounds and biological species.
The volume, shape and material of the sample containers are dependent on the nature of the sample, the
number of replicates, the volume required for the biotests and the necessity of preserving and storing
the samples prior to further processing.
The volume of sample collected should be sufficient for the required analyses and for any repeat
analyses. The use of very small sample volumes can cause the samples collected to be unrepresentative.
In addition, small samples can also increase problems of adsorption because of the relatively high area
to volume ratio.
6.3 Filling status of sample containers
To minimize possible impacts on the sample during transportation it is recommended to fill the
containers completely.
When freezing is envisaged for preservation, sample containers should be filled only up to an extent
which allows expansion of volume (prevention of breakage).
Problems related to partial filling can include:
— enhanced agitation during transport, leading to breakdown of aggregated particles,
— interaction with gas phase, leading to stripping, and
— oxidation of substances, leading e.g. to precipitation of heavy metals.
If completely filled sample containers are transported as recommended, the volume reduction for
freezing takes place in the laboratory after homogenization.
6.4 Sample identification and records
Sample containers should be clearly and unambiguously marked, so that subsequent analytical results
can be properly related.
A unique identifier, with at least sample number, sample date and location should be on the label of the
sample containe
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 5667-16
Deuxième édition
2017-04
Qualité de l’eau — Échantillonnage —
Partie 16:
Lignes directrices pour les essais
biologiques des échantillons
Water quality — Sampling —
Part 16: Guidance on biotesting of samples
Numéro de référence
©
ISO 2017
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ii © ISO 2017 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Lignes directrices relatives au dispositif expérimental . 5
4.1 Généralités . 5
4.2 Réplicats . 5
4.2.1 Généralités . 5
4.2.2 Plus faible dilution sans effet (DMSE) . 6
4.2.3 Tests d’hypothèses — comparaisons de deux échantillons . 6
4.2.4 Relation concentration/effet et dilution/effet . 7
5 Évaluation . 7
5.1 Généralités . 7
5.2 Analyse statistique . 8
6 Échantillonnage et transport . 8
6.1 Généralités . 8
6.2 Matériel d’échantillonnage . 9
6.2.1 Généralités . 9
6.2.2 Récipient pour échantillons . 9
6.3 Condition de remplissage des récipients pour échantillons.10
6.4 Identification et enregistrement des échantillons .10
6.5 Sous-échantillonnage .10
6.6 Transport .11
6.7 Contamination en cours d’échantillonnage .11
6.8 Techniques de contrôle qualité de l’échantillonnage.11
7 Prétraitement .12
7.1 Généralités .12
7.2 Préservation et conservation .12
7.3 Décongélation .13
7.4 Homogénéisation .13
7.5 Séparation des matières solubles et particulaires .13
7.6 Préconcentration .14
7.6.1 Généralités .14
7.6.2 Méthodes d’extraction .15
7.7 Ajustement du pH .15
8 Matériel et équipements .16
8.1 Choix du matériel .16
8.2 Nettoyage du matériel et des équipements .16
9 Détérioration des performances lors de la réalisation de l’essai.17
9.1 Problèmes et mesures préventives concernant les échantillons contenant des
ingrédients susceptibles d’être éliminés .17
9.1.1 Généralités .17
9.1.2 Volatilisation .17
9.1.3 Moussage .18
9.1.4 Adsorption . . .18
9.1.5 Précipitation/floculation .18
9.1.6 Dégradation .18
9.2 Problèmes et mesures préventives concernant les échantillons colorés et/ou turbides .18
10 Préparation de solutions mères et de lots d’essai .19
10.1 Substances solubles dans l’eau .19
10.2 Substances faiblement solubles .19
10.2.1 Généralités .19
10.2.2 Essai dans la gamme de solubilité dans l’eau .19
10.2.3 Dispersions et émulsions .20
10.2.4 Problèmes spécifiques aux mélanges de substances ou de produits techniques .20
10.2.5 Essai limite .21
11 Assurance qualité pour les essais biologiques .21
11.1 Généralités .21
11.2 Assurance qualité dans le contexte de l’analyse des échantillons environnementaux . .22
12 Rapport.22
Bibliographie .26
iv © ISO 2017 – Tous droits réservés
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ avant -propos .html
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité
SC 6, Échantillonnage (méthodes générales).
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 5667-16:1998), qui a fait l’objet
d’une révision technique.
Une liste de toutes les parties de la série de normes ISO 5667 est disponible sur le site Internet de l’ISO.
Introduction
Les essais biologiques sont appropriés pour la détermination des effets d’échantillons environnementaux
ou les substances chimiques sur l’organisme d’essai dans des conditions d’essai normalisées spécifiées.
Les échantillons environnementaux sont, par exemple, les eaux résiduaires communales et industrielles
traitées, les eaux douces, les extraits aqueux (par exemple lixiviats et éluats) de matières solides,
l’eau interstitielle des sédiments. Les effets peuvent être la stimulation ou l’inhibition et peuvent
être déterminés par la réaction de l’organisme d’essai (par exemple mort, croissance, modifications
morphologiques et physiologiques ou, de manière générale, modifications dans les mécanismes d’action
moléculaires). Les effets d’inhibition peuvent être déclenchés par des constituants toxiques de l’eau ou
par d’autres influences nocives.
La toxicité mesurable au cours de l’essai biologique est le résultat de l’interaction entre une substance
toxique unique, un mélange de substances ou les constituants d’un échantillon environnemental et
l’organisme d’essai. Le potentiel de protection du système biologique, à savoir l’organisme d’essai, par
exemple par détoxication métabolique et excrétion, fait partie intégrante de l’essai biologique.
Hormis les effets toxiques directs d’un ou plusieurs constituants de l’échantillon, des effets biologiques
peuvent se produire par l’action combinée de tous les constituants d’un échantillon. Ces effets combinés
incluent l’impact, par exemple, de substances non toxiques en elles-mêmes, mais qui affectent les
propriétés chimiques ou physiques des lots d’essai en interférant avec les additifs spécifiques de l’essai
(par exemple nutriments, sels) et, par conséquent, les conditions de vie des organismes d’essai. Ceci
s’applique par exemple aux substances consommant l’oxygène, aux substances colorées ou aux matières
turbides qui réduisent l’exposition à la lumière.
Les essais biologiques comprennent également les essais qui étudient l’effet des organismes sur les
substances (par exemple les études de dégradation microbienne).
Les résultats de l’essai biologique font principalement référence à l’organisme utilisé pour l’essai et aux
conditions définies stipulées pour le mode opératoire. Un effet nocif établi au moyen d’essais biologiques
normalisés peut renseigner sur un danger potentiel pour les organismes et les biocénoses aquatiques.
Cependant, les résultats ne permettent pas de tirer des conclusions directes ou d’extrapolation en ce
qui concerne la présence d’effets similaires dans le milieu aquatique. Ceci s’applique en particulier
aux essais suborganismiques, dans la mesure où des propriétés et des fonctions physiologiques
importantes des organismes entiers (par exemple téguments protecteurs, mécanismes de réparation)
sont supprimées ou désactivées.
En principe, aucun organisme d’essai ne peut être utilisé pour évaluer tous les effets possibles sur
la biocénose ou l’écosystème dans les diverses combinaisons de conditions abiotiques et biotiques
possibles. Seules quelques espèces («modèles») représentant les fonctions écologiques majeures
peuvent en pratique être soumises à essai.
Outre ces limitations fondamentales et pratiques dans la sélection des organismes d’essai, il convient
de tenir compte de certains problèmes au cours de l’échantillonnage et du traitement des échantillons,
afin d’éviter toute modification des propriétés de l’échantillon. Cela s’applique à la méthode
d’échantillonnage, y compris le matériel d’échantillonnage et le récipient, ainsi que le transport vers le
laboratoire. La méthode de prétraitement et de conservation de l’échantillon, ainsi que la préparation,
par exemple, de solutions mères, peuvent également avoir une influence sur le résultat de l’essai.
En outre, l’échantillon à soumettre à essai peut poser des problèmes d’expérimentation en matière
d’essai biologique. Les échantillons environnementaux (par exemple eaux résiduaires, éluats) sont des
mélanges complexes et peuvent contenir, par exemple, des substances difficilement solubles, volatiles,
instables, colorées ou des particules en suspension, parfois colloïdales. La complexité et l’hétérogénéité
des matériaux entraînent toute une variété de problèmes expérimentaux lors de la réalisation des
essais biologiques.
vi © ISO 2017 – Tous droits réservés
Des problèmes spécifiques sont liés à l’instabilité du matériau soumis à essai en raison des réactions et
des procédés, tels que ceux de nature:
— physique (par exemple séparation de phases, sédimentation, volatilisation);
— chimique (par exemple hydrolyse, photodégradation, précipitation); et/ou
— biologique (par exemple biodégradation, biotransformation, capacité d’absorption biologique dans
les organismes).
D’autres problèmes, particulièrement en cas d’application de mesures spectrométriques, sont liés à la
turbidité et à la couleur du lot d’essai.
Il convient de procéder à l’analyse statistique des données issues des essais biologiques concernant les
échantillons environnementaux en fonction de l’état actuel de la technique, sauf indication contraire
dans la norme spécifique relative aux essais biologiques.
Pour finir, il est recommandé de mettre en œuvre et de maintenir un système de management de
la qualité, qu’un laboratoire prenne part ou non à des essais sur des substances ou des échantillons
environnementaux.
Le présent document fait partie d’un groupe de Normes internationales relatives à l’échantillonnage des
eaux et sédiments et est destiné à être lu conjointement avec les autres parties de la série de normes
ISO 5667, en particulier avec l’ISO 5667-1, l’ISO 5667-3 et l’ISO 5667-15.
NORME INTERNATIONALE ISO 5667-16:2017(F)
Qualité de l’eau — Échantillonnage —
Partie 16:
Lignes directrices pour les essais biologiques des
échantillons
1 Domaine d’application
Le présent document fournit des lignes directrices pour l’échantillonnage, le prétraitement, la mise
en œuvre et l’évaluation des échantillons environnementaux dans le cadre de la réalisation d’essais
biologiques. Des informations sont données sur la manière de traiter les problèmes, pour les essais
biologiques, liés à l’échantillon et à l’adaptation du dispositif expérimental.
Elles sont destinées à diffuser une expérience pratique concernant les précautions à prendre en
décrivant des méthodes qui se sont révélées satisfaisantes pour résoudre ou éliminer certains
problèmes expérimentaux au cours des essais biologiques des eaux, par exemple.
Le présent document traite en premier lieu des problèmes liés aux substances en ce qui concerne
l’échantillonnage et le prétraitement des échantillons environnementaux (par exemple échantillons
d’eaux résiduaires) pour la réalisation d’essais biologiques.
Ces lignes directrices portent sur les essais écotoxicologiques réalisés avec des organismes (essais
biologiques monospécifiques; in vivo et in vitro). Certaines caractéristiques traitées dans le présent
document s’appliquent également à l’échantillonnage et la préparation d’échantillons pour les
essais biologiques utilisant des systèmes unicellulaires (essais biologiques in vitro) et les études de
biodégradation. Les essais sur substances dans la gamme de solubilité dans l’eau sont également traités.
Il a été fait référence aux Normes internationales et aux directives existantes dans toute la mesure du
possible. Des informations provenant de publications ou de communications orales ont également été
utilisées.
Le présent document s’applique aux essais biologiques destinés à déterminer l’effet des échantillons
environnementaux tels que les eaux résiduaires communales et industrielles traitées, les eaux
souterraines, les eaux douces, les extraits aqueux (par exemple lixiviats et éluats), l’eau interstitielle
des sédiments et les sédiments entiers. Il s’applique également aux substances chimiques.
Le présent document n’est pas applicable à l’examen bactériologique des eaux. Des méthodes appropriées
[17]
pour l’examen bactériologique sont décrites dans d’autres documents (voir l’ISO 19458 ).
2 Références normatives
Il n’y a aucune référence normative dans le présent document.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques, destinées à être utilisées pour la
normalisation, aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/ .
— Plateforme de consultation en ligne de l’ISO: disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp.
3.1
blanc
mélange d’eau et de nutriments ne contenant pas d’organisme d’essai
3.2
densité cellulaire
x
nombre de cellules par unité de volume de milieu
Note 1 à l’article: La densité cellulaire est exprimée en cellules par millilitre.
[6]
[SOURCE: ISO 10253:2016, 3.1]
3.3
témoin
milieu témoin (3.4) ou sédiment témoin (3.5), incluant les organismes utilisés dans le cadre de l’essai,
sans échantillon d’essai
3.4
milieu témoin
combinaison de l’eau de dilution et/ou du milieu nutritif utilisée pour l’essai
[18]
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.6]
3.5
sédiment témoin
sédiment artificiel ou naturel défini utilisé au cours de l’essai
3.6
niveau de dilution
D
inverse de la valeur de la fraction volumique de l’échantillon soumis à essai dans l’eau de dilution (3.7)
dans laquelle l’essai est réalisé
EXEMPLE 250 ml d’eaux résiduaires dans un volume total de 1 000 ml (fraction volumique de 25 %)
représentent un niveau de dilution D = 4.
[SOURCE: ISO 15088:2007, 3.2, modifié — la phrase « des eaux résiduaires dans l’eau de dilution dans
laquelle l’essai est réalisé » a été remplacée par la phrase « de l’échantillon soumis à essai dans l’eau de
[13]
dilution dans laquelle l’essai est réalisé »]
3.7
eau de dilution
eau ajoutée à l’échantillon soumis à essai afin de préparer une série définie de dilutions
Note 1 à l’article: La composition de l’eau est spécifiée dans la norme correspondante.
[18]
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.7, modifié —Note 1 à l’article a été ajoutée]
3.8
concentration efficace
CE
x
concentration du matériau soumis à essai dans l’eau ou le sédiment qui entraîne x % de variation de la
réponse sur un intervalle de temps spécifié
[SOURCE: ISO/TS 20281:2006, 3.8.1, modifié — le mot « quantique » a été supprimé du terme et du
terme abrégé ; « sol » et « (par exemple immobilité) » ont été supprimés de la définition ; l’EXEMPLE et
[20]
les Notes 1 et 2 à l’article ne sont pas incluses]
2 © ISO 2017 – Tous droits réservés
3.9
blanc de terrain
récipient préparé dans le laboratoire utilisant de l’eau pure ou toute autre matrice de blanc et destiné
à être emporté par le personnel d’échantillonnage sur le terrain, pour être exposé à l’environnement
dans lequel l’échantillonnage est effectué afin de vérifier l’absence de contamination au cours de
l’échantillonnage
[9]
[SOURCE: ISO 11074:2015, 4.5.3]
3.10
taux de croissance
taux proportionnel de l’augmentation de la biomasse par unité de temps: (1/jour)
[SOURCE: ISO 10253:2016, 3.2, modifié — le mot « spécifique » a été supprimé du terme et du terme
abrégé ; la phrase « de la densité cellulaire » a été remplacée par la phrase « de la biomasse » dans la
[6]
définition ; la formule et la Note 1 à l’article ne sont pas incluses]
3.11
plus faible dilution sans effet
facteur de dilution
DMSE
niveau de dilution D (3.6) pour lequel aucune inhibition n’est observée ou bien uniquement des effets ne
dépassant pas la variabilité spécifique à l’essai
[13]
[SOURCE: ISO 15088:2007, 3.5]
3.12
milieu nutritif
solution aqueuse contenant les nutriments et les micronutriments essentiels pour la croissance de
l’organisme d’essai
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.17, modifié — la phrase « des lentilles d’eau » a été remplacée par la phrase
[18]
« « de l’organisme d’essai »]
3.13
témoin positif
substance de référence (3.14) bien caractérisée, qui, soumise à essai conformément à une méthode
d’essai spécifique, démontre l’aptitude du système d’essai à conduire à une réponse reproductible,
judicieusement positive ou réactive vis-à-vis du système d’essai particulier
[SOURCE: ISO 10993-12:2012, 3.14, modifié — « matériau ou substance » a été remplacé par « substance
[8]
de référence »]
3.14
substance de référence
substance connue utilisée pour vérifier la sensibilité de la méthode
3.15
lot de référence
mélange d’eau de dilution, d’additifs spécifiques à l’essai et de substance de référence, incluant les
organismes d’essai
3.16
réplicat
un parmi un nombre sélectionné de lots d’essai (3.24) identiques ou de lots de référence (3.15) identiques
3.17
échantillon
quantité de matériau prélevée dans un volume plus important de matériau
Note 1 à l’article: La méthode de sélection des échantillons peut être décrite dans le plan d’échantillonnage.
Note 2 à l’article: Le matériau provient de l’environnement (par exemple eaux résiduaires, sédiment ou éluat),
d’une substance ou préparation chimique ou d’un matériau associé.
[15]
[SOURCE: ISO 16133:2004, 2.11, modifié — les Notes 1 et 2 à l’article ont été ajoutées]
3.18
prétraitement des échantillons
nom générique regroupant tous les modes opératoires utilisés pour le conditionnement d’un échantillon
afin de l’amener à un état défini permettant de le soumettre à un examen
Note 1 à l’article: Selon les exigences de la méthode, le prétraitement des échantillons inclut par exemple la
préservation et la conservation, la centrifugation, la filtration, l’homogénéisation, la préconcentration et
l’ajustement du pH.
3.19
conservation d’un échantillon
processus, et son résultat, consistant à garder un échantillon disponible dans des conditions prédéfinies,
pour un laps de temps (en général) déterminé entre le prélèvement et le traitement de cet échantillon
Note 1 à l’article: Le temps déterminé est le laps de temps maximal.
[2]
[SOURCE: ISO 5667-3:2012, 3.3]
3.20
culture mère
culture monospécifique destinée à conserver en laboratoire l’espèce définie d’origine
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.21, modifié — la définition « culture monospécifique de lentille d’eau,
dans le but de conserver en laboratoire l’espèce définie Lemna d’origine et de fournir l’inoculum pour la
[18]
préculture » a été remplacée ; Note 1 à l’article a été supprimée]
3.21
solution mère
solution dont la (les) concentration(s) d’analyte est (sont) précisément connue(s), préparée à partir de
produits chimiques de pureté appropriée
[10]
[SOURCE: ISO 11885:2007, 3.23]
3.22
durée de conservation
période entre le remplissage du récipient et le traitement ultérieur de l’échantillon au laboratoire, si
l’échantillon est conservé dans des conditions prédéfinies
Note 1 à l’article: L’échantillonnage prend fin dès que le récipient a été rempli avec l’échantillon. La durée de
conservation prend fin lorsque l’échantillon est prélevé par l’analyste pour commencer la préparation de
l’échantillon avant l’analyse.
[SOURCE: ISO 5667-3:2012, 3.4 — « de stockage » a été change à « de conservation » dans le terme ; Note
[2]
2 à l’article a été supprimé]
3.23
sous-échantillon
partie d’un échantillon, idéalement représentative de l’échantillon dans lequel elle est prélevée
[5]
[SOURCE: ISO 5667-19:2004, 3.7]
3.24
lot d’essai
milieu d’essai incluant les organismes utilisés pour l’essai
[18]
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.22]
4 © ISO 2017 – Tous droits réservés
3.25
milieu d’essai
mélange de l’échantillon ou de la substance d’essai, de l’eau de dilution et des nutriments (sans les
organismes d’essai)
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.23, modifié — la définition « combinaison de l’échantillon soumis à essai,
[18]
de l’eau de dilution et/ou du milieu nutritif, utilisée pour l’essai » a été remplacée]
3.26
échantillon d’essai
échantillon à expérimenter à l’issue de toutes les étapes de préparation
EXEMPLE La préparation peut inclure une centrifugation, une filtration, une homogénéisation, un
ajustement de la valeur du pH et une mesure de la conductivité.
[11]
[SOURCE: ISO 13829:2000, 3.7]
3.27
substance d’essai
substance d’essai à expérimenter ajoutée au système d’essai
[14]
[SOURCE: ISO 15473:2002, 3.10]
3.28
matériau soumis à essai
matériau à soumettre à essai
[SOURCE: ISO 17126:2005, 3.3, modifié — le mot « matériau » a été ajouté à la définition ; l’EXEMPLE
[16]
n’est pas inclus]
4 Lignes directrices relatives au dispositif expérimental
4.1 Généralités
Pour chaque essai, il convient d’examiner plusieurs réplicats du témoin et des groupes traités. Le nombre
minimal de réplicats est généralement prescrit dans la norme respective. Un exemple de méthode de
calcul du nombre d’observations (réplicats) exigé est donné en 4.2.3.
Il est recommandé de réduire le plus possible l’influence des différences de conditions d’essai (par
exemple lumière, température), par exemple en disposant les récipients d’essai dans l’enceinte d’essai
de façon aléatoire.
Pour s’assurer que les conditions d’essai en laboratoire (y compris l’état et la sensibilité des organismes
d’essai) sont adaptées et n’ont pas varié de manière significative, il convient de soumettre une substance
de référence à essai en tant que témoin positif.
4.2 Réplicats
4.2.1 Généralités
Trois approches statistiques sont généralement adoptées pour l’analyse statistique des résultats
d’essais d’écotoxicité réalisés avec des échantillons environnementaux:
a) la détermination de la plus faible dilution sans effet (DMSE) lors d’essais sur des eaux résiduaires;
b) les comparaisons de deux échantillons entre le témoin (ou le lot de référence) et soit les lots d’essai,
soit les lots témoins positifs (substance de référence);
c) le calcul des estimations ponctuelles [par exemple CE , CL (concentration létale)] à partir des
20 50
relations concentration/effet ou dilution/effet modélisées.
Dans les essais d’écotoxicité appliqués aux échantillons environnementaux, la détermination d’une
CSEO (concentration sans effet observé) et d’une CMEO (plus faible concentration d’effet observée)
n’est normalement pas prévue et n’est donc pas davantage développée dans le présent document. S’il
[20]
convient que la CSEO fasse exceptionnellement l’objet d’une évaluation, se reporter à l’ISO/TS 20281 .
Le nombre de réplicats est particulièrement critique dans les tests d’hypothèses (par exemple
comparaisons de deux échantillons) et dépend de la variabilité du critère d’effet respectif à évaluer,
de l’ampleur minimale des effets à détecter par un essai statistique et de la puissance statistique.
Les exigences relatives à la méthodologie d’estimation d’une CE sont différentes de celles d’une
x
[20]
comparaison de deux échantillons (voir l’ISO/TS 20281 ).
4.2.2 Plus faible dilution sans effet (DMSE)
Dans les essais de toxicité, appliqués par exemple aux eaux résiduaires ou aux éluats, l’échantillon d’eau
est dilué suivant un schéma de dilution (D) défini. La plus faible dilution sans effet (DMSE) désigne le
lot d’essai le plus concentré pour lequel il n’a été observé aucune inhibition ou mortalité, ou uniquement
[18]
des effets ne dépassant pas la limite spécifique à l’essai (par exemple l’ISO 20079 : 10 % d’inhibition
du taux de croissance de l’espèce Lemna). D est exprimée comme l’inverse de la valeur de la fraction
volumique, par exemple des eaux résiduaires, dans le lot d’essai.
Cette approche ne nécessite pas d’analyse statistique complémentaire (par exemple test d’hypothèse).
4.2.3 Tests d’hypothèses — comparaisons de deux échantillons
Les comparaisons statistiques de deux échantillons jouent un rôle important dans les essais appliqués
aux échantillons environnementaux. Elles sont réalisées afin de comparer des échantillons prélevés
sur différents sites à un site de référence (par exemple des échantillons provenant d’une zone d’eaux
courantes polluée avec un échantillon issu d’un site de référence non pollué en amont), ou de comparer
des échantillons prélevés à différents moments.
Dans certains cas, par exemple lorsque l’on désire uniquement évaluer si un niveau de dilution donné
produit un effet, une comparaison de deux échantillons impliquant une comparaison d’effets dans un
témoin et d’une concentration d’essai ou d’un témoin positif peut être effectuée (voir 10.2.5).
Lors de la réalisation de comparaisons de deux échantillons, le type de critère d’effet, c’est-à-dire si
l’analyse porte sur des variables quantales (qualitatives) ou métriques (quantitatives), est primordial
pour le choix du mode opératoire et le calcul des tailles d’échantillon exigées (réplicats). De plus, un
essai statistique basé sur une analyse de variance (ANOVA) nécessite une distribution normale et
l’homogénéité des variances des données.
La mortalité (ou l’immobilité) des organismes d’essai déterminée dans l’essai de toxicité aiguë est une
variable quantale type.
Par opposition, les variables métriques présentent des incréments continus, c’est-à-dire une graduation
de l’effet. Les variables métriques types sont par exemple la longueur du corps ou la biomasse, l’activité
métabolique, la production d’oxygène, les taux de consommation ou les vitesses de transformation
enzymatique. Le nombre de jeunes animaux produits peut également être considéré en première
approche comme une variable métrique.
Les formules de calcul du nombre d’observations (réplicats) exigé sont données dans la littérature
statistique (par exemple Référence [24]). À titre d’exemple, pour comparer une variable métrique (par
exemple biomasse) mesurée dans un échantillon d’eau ou de sédiment prélevé sur un site pollué et un
site de référence, un test t est réalisé sur deux échantillons. La taille d’échantillon exigée est calculée
d’après la Formule (1) (voir Référence [24]):
σ
nt≥2 +t (1)
()
αβ,,df 2 df
δ
où
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n est le nombre de réplicats;
σ est l’écart-type du critère d’effet;
δ est la plus petite différence vraie;
df est le nombre de degrés de liberté (ici: df = n + n – 2);
1 2
α est le niveau de signification souhaité (par exemple 0,05);
β est l’erreur de type II souhaitée [1 – β est appelé «puissance» de l’essai statistique et
exprime la probabilité désirée pour qu’une différence déterminée soit significative (si
elle est aussi petite que δ)];
t | t sont les valeurs d’une table t bilatérale avec df degrés de liberté.
α 2β
Il n’est nécessaire de connaître que le rapport σ sur δ, et non leurs valeurs réelles (par exemple si le
coefficient de variation est de 20 % et que la différence détectable désirée est de 10 %, ce rapport est
[20]
égal à deux). Se reporter à la littérature statistique ou à l’ISO/TS 20281 pour obtenir les formules
des autres modes opératoires d’essai.
4.2.4 Relation concentration/effet et dilution/effet
La modélisation de la concentration/effet et de la dilution/effet peut être utilisée pour déterminer les
ampleurs précises des effets (par exemple CE , CE , CL ) provoquées par les fractions volumiques
10 50 50
de l’échantillon d’essai. Il convient de l’utiliser pour analyser les effets des substances de référence afin
[18]
de démontrer les performances du système d’essai (par exemple l’ISO 20079 ). L’essai est considéré
comme valide si la valeur de CE obtenue pour la substance de référence se situe dans l’intervalle des
valeurs inférieures et supérieures de CE , déterminées au cours d’essais circulaires antérieurs.
La principale exigence en matière de conception est de disposer d’un nombre suffisant de groupes de
concentration (dilution). Cette exigence peut être satisfaite au détriment du nombre de réplicats par
groupe (par exemple en conservant la même taille totale pour l’expérience), car la fidélité de la CE
x
estimée dépend plus de l’étendue totale de l’expérience que de la taille d’échantillon par groupe de
concentration ou de dilution.
De nouveau, le type de critère d’effet, c’est-à-dire le fait de déterminer des variables quantales
(qualitatives) ou métriques (quantitatives)variable quantita est primordial pour le dispositif
[20]
expérimental et la méthode statistique. Pour plus d’informations, voir l’ISO/TS 20281 .
5 Évaluation
5.1 Généralités
L’évaluation des résultats d’essai implique tout d’abord l’inspection critique des données ainsi qu’une
présentation et une description des résultats d’essai à l’aide de graphiques, de tableaux et de paramètres
statistiques appropriés, par exemple des moyennes et des mesures de dispersion (statistiques
descriptives).
Dans bon nombre de cas, cette évaluation est suivie d’un traitement statistique plus étendu qui a pour
but de déterminer la relation concentration/effet ou dilution/effet, afin de calculer les paramètres
statistiques appropriés au quantum d’action, et d’examiner la signification statistique (statistique
d’estimation et d’hypothèse). Cette évaluation statistique plus étendue n’est utile que si l’on dispose de
suffisamment de données, ce qui nécessite un examen critique des données.
5.2 Analyse statistique
Il convient de procéder à l’analyse statistique des données issues des essais d’écotoxicité des échantillons
[20]
environnementaux en fonction de l’état actuel des connaissances, tel qu’exposé dans l’ISO/TS 20281
ou dans la norme respective de l’essai d’écotoxicité. Il convient en particulier de tenir compte des
recommandations suivantes:
— il convient de consigner la totalité des données sous forme graphique ou tabulaire;
— il convient de choisir une méthode statistique adaptée au type d’échelle de données;
— pour les tests d’hypothèses, il convient de prévoir une mesure de la puissance statistique du mode
opératoire statistique mis en œuvre, par exemple la différence détectable (= significative) minimale
(voir Références [24] et [25]);
— pour la modélisation de la relation de concentration/effet ou dilution/effet, il convient de préciser
les limites de confiance (par exemple 95 %) pour la valeur CE ou CL rapportée (concentration
x x
létale);
— il est fortement recommandé d’effectuer tous les calculs statistiques en utilisant un logiciel
statistique validé.
6 Échantillonnage et transport
6.1 Généralités
L’échantillonnage est la première étape dans la mise en œuvre des analyses biologiques, chimiques et
physiques. Il convient que l’objectif de cet échantillonnage soit d’obtenir un échantillon représentatif de
la question de recherche évaluée et de le transmettre au laboratoire de manière appropriée.
Les échantillons environnementaux sont susceptibles de se modifier suite à des réactions physiques,
chimiques ou biologiques pouvant survenir entre le moment de l’échantillonnage et l’analyse. Si
les précautions nécessaires ne sont pas prises au cours de l’échantillonnage, du transport et de la
conservation, la nature et la vitesse de ces réactions sont souvent telles que l’échantillon peut subir
des changements significatifs et ne sera plus représentatif de l’échantillon initial. L’ampleur de ces
changements dépend de la nature chimique et biologique de l’échantillon, du matériau du matériel
d’échantillonnage (récipient d’échantillonnage et récipient pour échantillons), du transport et du
prétraitement (par exemple conservation, préservation). Les erreurs dues à un échantillonnage et un
prétraitement incorrects des échantillons ne peuvent pas être corrigées.
[1]
Le présent document est destiné à être utilisé conjointement avec l’ISO 5667-1 , qui définit les principes
généraux et donne des lignes directrices pour la conception des programmes d’échantillonnage et les
techniques d’échantillonnage pour tous les aspects de l’échantillonnage de l’eau (y compris les eaux
résiduaires, les boues, les effluents et les dépôts sédimentaires): par exemple le choix de points de
prélèvement représentatifs, la durée et la fréquence d’échantillonnage, les techniques d’échantillonnage,
le matériel d’échantillonnage pour les caractéristiques physiques ou chimiques, la prévention de la
contamination, le transport et la conservation des échantillons en laboratoire, l’identification et les
enregistrements des échantillons.
[2]
Pour la détermination des paramètres physico-chimiques, l’ISO 5667-3 donne des lignes directrices
concernant le cas où les échantillons ponctuels ou composites ne peuvent pas être analysés sur site
et doivent être transportés jusqu’à un laboratoire en vue d’une analyse. Elle établit des exigences
générales relatives au traitement, à la préservation, au transport, à la réception et à l’identification
des échantillons, ainsi qu’à leur conservation. Pour la conservation et le traitement des boues et des
[4]
sédiments, voir l’ISO 5667-15 .
En général, l’appr
...
Questions, Comments and Discussion
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