ISO 9167-1:1992
(Main)Rapeseed — Determination of glucosinolates content — Part 1: Method using high-performance liquid chromatography
Rapeseed — Determination of glucosinolates content — Part 1: Method using high-performance liquid chromatography
The method specified is based on extraction by methanol, purification and enzymatic desulfatation, determination using reversed-phase chromatography. Does not determine glucosinolates which are substituted on the glucose molecule. A rapid method for the determination of glucosinolates content using X-ray fluorescence spectrometry is the subject of ISO 9167-2.
Graines de colza — Dosage des glucosinolates — Partie 1: Méthode par chromatographie liquide à haute performance
La présente partie de l'ISO 9167 prescrit une méthode de dosage par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) des différents glucosinolates dans les graines de colza. NOTES 1 Cette méthode ne dose pas les glucosinolates ayant des substituants sur la partie glucose, mais ces composés sont peu importants dans les graines de colza commercialisées. 2 Une méthode rapide de dosage global des glucosinolates des graines de colza, par spectrométrie de fluorescence aux rayons X (XRF) fait l'objet de l'ISO 9167-2.
General Information
Relations
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL
91674
STANDARD
First edition
1992-07-0 1
- ----
Rapeseed - Determination of glucosinolates
content -
Part 1:
Method using high-performance liquid
chromatography
Graines de colza - Dosage des qlucosinolates -
L
Partie 1: Methode par chromatographie liquide 3 haute perforrnance
~---- ---
--
Reference number
ISO 9167-1:1992(E)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 91674:1992(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national Standards bodies (ISO member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Esch member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the
work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an Inter-
national Standard requires approval by at least 75 % of the member
bodies casting a vote.
International Standard ISO 9167-1 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 34, Agricultural food products, Sub-Committee SC 2, Oleaginous
seeds and fruits.
ISO 9167 consists of the following Parts, under the general title
Rapeseed - Determination of glucosinolates content:
-
Part 1: Method using high-performance liquid chromatography
-
Part 2: Method using X-ray fluorescence spectrometry
Annex A of this part of ISO 9167 is for information only.
0 ISO 1992
All rights reserved. No part of this publication may be reproduced or utilized in any form
or by any means, electronie or mechanical, including photocopylng and microfilm, without
Permission in writing from the publisher.
Intern ational Organizati on for Standardiz ation
211 Gen&e 20 * Switz erland
Case Postale 56 l CH-l
Printed in Switzerland
ii
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ISO 91674:1992(E)
INTERNATIONAL STANDARD
- Determination of glucosinolates content -
Rapeseed
Part 1:
Method using high-performance liquid chromatography
1 Scope 3 Principle
Extraction of glucosinolates by methanol, then puri-
This part of ISO 9167 specifies a method for the
fication and enzymatic desulfatation on ion-
determination of the content of the different gluco-
exchange resins. Determination using
sinolates in rapeseeds (colza) using high-
reversed-Phase
high-performance liquid chro-
Performance liquid chromatography.
matography (HPLC) with elution gradient and ultra-
NOTES
violet detection.
1 This method does not determine gfucosinolates which
are substituted on the glucose molecule, but these com-
4 Reagents
pounds are of little importante in commercial rapeseed.
2 A rapid method for the determination of giucosinolates
Use only reagents of recognized analytical grade,
content using X-ray fluorescence spectrometry is the
unless otherwise specified, and water complying
subject of ISO 9167-2.
with grade 2 of ISO 3696.
4.1 Methanol, HPLC grade, 70 % (I/!I/) Solution.
4.2 Sodium acetate, 0,02 mol/1 at pH 4,0.
2 Normative references
4.3 Sodium acetate, 0,2 mol/1 solution.
The following Standards contain provisions which,
through reference in this text, constitute provisions
of this part of ISO 9167. At the time of publication,
4.4 Imidazofe formate, 6 mol/1 Solution.
the editions indicated were valid. All Standards are
subject to revision, and Parties to agreements based
Dissolve 204 g of imidazole in 113 ml of formic acid
on this part of ISO 9167 are encouraged to investi-
in a 500 ml one-mark volumetric flask. Make up to
gate the possibility of applying the most recent edi-
the mark with water.
tions of the Standards indicated below. Members of
IEC and ISO maintain registers of currently valid In-
ternational Standards.
4.5 lnternal Standard, use either sinigrin mono-
hydrate (potassium allylglucosinolate monohydrate,
ISO 664:1990, Oilseeds -- Reduction of laboratory
M, = 415,49) (see 4.5.1) or, for rapeseed (cultivated
Sample to fest Sample.
or self-propagated) in which sinigrin is present na-
turally, glucotropaeolin (benzylglucosinolate, pot-
Determination of moisture
ISO 665:1977, Oilseeds - assium salt, M, = 447,52) (see 4.5.2).
and volati/e matter content.
For rapeseed with a low glucosinolate content
(< 20 pm/g), reduce the internal Standard concen-
ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use -
tration (1 mmol/l to 3 mmol/l) in 4.5.1 and 4.5.2.1 .
Specification and test methods.
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ISO 91674:1992(E)
4.5.1 Sinigrin monohydrate 4.5.2 Glucotropaeolin
NOTE 3 Glucotropaeolin is sometimes difficult to sep-
arate from other natura/ minor glucosinolates.
4.5.1.1 Sinigrin monohydrate, 5 mol/1 Solution.
4.5.2.1 Glucotropaeolin, 5 mmol/l Solution.
Dissolve 207,7 mg of potassium allylglucosinolate
monohydrate in water in a 100 ml one-mark
Dissolve 233,8 mg of glucotropaeolin in water in a
volumetric flask. Make \JP, to the mark with water.
100 mf volumetric flask. Make up to the mark with
water.
The Solution thus prepared may be stored in a
refrigerator at approximately 4 “C for up to a week
4.5.2.2 Glucotropaeolin, 20 mmol/t Solution.
or in a freezer at -
18 “C for a langer period.
Dissolve 895,0 mg of glucotropaeolin in water in a
100 ml volumetric flask. Make up to the mark with
water.
451.2 Sinigrin monohydrate, 20 mmol/l Solution.
4.5.2.3 Purity check
Dissolve 831 ,O mg of potassium allylglucosinolate
monohydrate in water in a 100 ml one-mark
Check the purity in accordance with the procedure
volumetric flask. Make up to the mark with water.
described in 4.5.1.3.
The Solution thus prepared may be stored in a
4.5.2.4 Response factor
refrigerator at approximately 4 “C for up to a week
or in a freezer at - 18 “C for a longer period.
Verify that the response factors of glucotropaeolin,
in comparison with sinigrin, correspond to those in-
dicated in 9.2.
4.5.1.3 Purity check
4.6 Mobile phases
Use one or more of the following three tests:
4.6.1 Eluant A: water, purified by passing it through
-
HPLC analysis using the method specified in this
an activated charcoal cartridge (e.g. Norganic
part of ISO 9167;
Millipore’) System) or water of equivalent purity.
-
analysis of the intact sinigrin by HPLC (ion-pair
HPLC
4.6.2 Eluant B: acetonitrile, grade,
technique);
20 % (1/‘/1/) Solution in purified water. The concen-
tration may be modified in relation to the column
-
analysis of the desulfated and silylated sinigrin
used.
by gas chromatography.
4.7 Ion-exchange resin, use either 4.7.1 or 4.7.2.
For each test, the chromatogram shall show only
one major peak representing at least 98 % of the
total peak area. 4.7.1 DEAE Sepharose CL-6B2) Suspension, avail-
able commercially ready for use, or an equivalent
Confirm the purity by determining the quantity of
product.
glucose released after hydrolysis with myrosinase
(thioglucoside glucohydrolase, EC 3.2.3.1). Measure
4.7.2 DEAE Sephadex A2!j2) Suspension, prepared
the glucose by enzymatic means. The use of a
as follows.
commercially available test kit facilitates the deter-
Mix 10 g of DEAE Sephadex A25 resin (or an equiv-
mination. Take into account any free glucose pres-
alent resin) in excess 2 mol/1 acetic acid solution.
ent; this is determined in the Same way but without
Leave to settle. Add 2 mol/1 acetic acid until the
addition of myrosinase. The molar concentration of
volume of the liquid is equal to twice the volume of
glucose measured should be at least 98 % of the
the Sediment.
molar concentration of the sinigrin Solution tested.
1) Norganic Millipore System is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this part of ISO 9167 and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
products avai lable commercially. This information is given for
2) DEA Sepharo se and S ephadex are exam ples of su itable
of this part of ISO 9167 and not consti tute an endorsement by ISO of these products.
the conv ,enience of users does
2
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ISO 91674:1992(E)
4.8 Sulfatase, Helix pomafia type Hl (EC 3.1.6.1), Pour 3 ml of the 5 mmol/l sinigrin Solution (4.5.1.1)
having an activity of greater than 0,5 units of activity into a 100 ml one-mark volumetric flask and make
per millilitre of purified sulfatase solution. up to the mark with Solution c).
Purify, test and dilute the sulfatase in accordance
4.8.3.2 Test of activity
with the method described in 4.8.1 to 4.8.4.
Using a pipette, transfer 2 ml of the buffered sinigrin
solution (4.8.3.1) into the reference and measuring
4.8.1 Preparation of ion-exchange columns
cells of the spectrometer (5.3) adjusted to a wave-
Cut five Pasteur pipettes (5.9) 7 cm above the neck length of 229 nm with a cell temperature of 30 “C.
and place a glass wool plug (5.8) in the neck. Place At time t = 0, add 50 pl of purified sulfatase (4.8.2) to
the pipettes vertically on a stand and add to each a the measuring cell and immediately switch on the
sufficient quantity of ion-exchange resin (4.7) such recorder. Stop the recorder when the absorbance
that, once the water has drained Off, a volume of no longer varies (ii,), plot the tangent to the Point
500 pl of resin is obtained. I = 0 and measure its gradient An/Al.
The activity of the sulfatase (i.e. the production of
Pour 1 ml of the imidazole formate Solution (4.4) into
each pipette and rinse twice with 1 ml portions of 1 micromole of desulfated sinigrin per minute at
water. 30 “C and pH 5,8), expressed in units of activity per
millilitre of sulfatase solution, is equal to
4.8.2 Purification
AA
V 1000 x 106
AZ xxi-x 50
Weigh, to the nearest 0,l mg, 25 mg of Helix poniatia
type Hl (4.8), dissolve it in 2,5 ml of water and
transfer 500 pl of this Solution to each of the columns
AA/AI is the gradient of the tangent to the
prepared in 4.8.1. Wash each column with 1,5 ml of
Point t = 0, in absorbance units per
water and discard the effluent. Then add 1,5 ml of
minute;
the sodium acetate Solution (4.3) and collect the
eluates from the five columns in a test tube.
V is the volume, in litres, of the reacting
medium (i.e. 2,05 x 10we3 1);
Concentrate the eluates by filtration using a
Millipore PTGC 11K253) immersion filter until ap-
AF (approximately 1 500 I.mol- ‘vcm- ‘) is
proximately 100 ~1 of liquid remains (sulfatase with
the differente between the molar ex-
a molar mass in excess of 5 000 is not removed).
tinction coefficients of sinigrin and of
Add 2,5 ml of water and concentrate once more by
desulfosinigrin at 228 nm, i.e.
filtration until approximately 100 pl of liquid remains.
n
Dilute to 2,5 ml with water and store the purified
AF, = .-!f!-
sulfatase in a freezer at - 18 OC in small amounts in *
k /
Order to allow defrosting of the amount necessary
where
for immediate use.
,& is the differente between the
4.8.3 Test of the sulfatase activity
absorbance at equilibrium of
the desulfated sinigrin and the
4.8.3.1 Preparation of a 0,15 mmol/l sinigrin sol- absorbance at time t = 0;
ution, buffered to pH 58.
I is the path length of the cell, in
centimetres (i.e. 1 cm);
Prepare three solutions in succession as follows:
is the concentration of desul-
c
a) transfer- 1 ml of acetic acid to a 500 ml one-mark
fated sinigrin at equilibrium, in
volumetric flask and make up to the mark with
moles per litre, i.e.
water;
0,15 x 1o--3 x 0,95 x 2
b) transfer 1 ml of ethylene diamine to a 500 ml c=-
2,05 -
one-mark volumetric flask and make up to the
mark with water;
= 1,39 x 10 mol/1
c) mix 73 ml of Solution a) with 40 ml of Solution b) 0,95 is the yield at equilibrium
and adjust the mixture to pH 5,8 using Solution of the desulfatation of the
sinigrin.
a) or Solution b) as appropriate.
3) Millipore PTGC 11K25 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience sf users of this part of ISO 9167 and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
3
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ISO 91674:1992(E)
Alternatively, the activity of the sulfatase may be 5.3 Double-beam spectrometer, capable of operat-
calculated using the following simplified formula, ing in the ultraviolet region of the spectrum, and at
where the activity is given by the expression a controlled temperature of 30 OC, equipped with
quartz cells of path length 1 em and a recording
AA x 5,7
System.
Atn,
5.4 Microgrinder, for example a coffee mill.
4.8.4 Diktion
5.5 Centrifuge, suitable for use with the tubes
Using a pipette, transfer 1 ml of purified sulfatase
(5.6), capable of obtaining a centrifugal acceleration
(4.82) to a 10 ml one-mark volumetric flask. Make
of 5 ooog.
up to the mark with water and mix.
Divide the Solution into small quantities an
...
IS0
NORME
91 67-1
I NTE R NAT1 O NALE
Première édition
1992-07-01
Graines de colza - Dosage des
glucosinolates -
Partie 1:
e liquide à ha ite
Méthode par chromatograph
performance
Rapeseed - Determinafion of glucosinolates content -
Part 1: Method using high-performance liquid clJromatography
Numéro de référence
IS0 91 67-1: 1992(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
IS0 91 67-1 :1992(F)
Avant-propos
L‘ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres
de I‘ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
conMe aux comités techniques de l’lS0. Chaque comite membre inté-
ressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique créé
à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I‘ISO participent également aux tra-
vaux. L‘ISO collabore élroitement avec la Commission électrotechnique
internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotech-
nique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techni-
ques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l‘approbation de 75 % au moins
des comités membres votants.
La Norme internationale IS0 9167-1 a été élaborée par le comite tech-
nique ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 2,
Graines et fruits oléagineux.
L’ISO 9167 comprend les parties suivantes, présentees sous le titre gé-
néral Graines de colza - Dosage des glucosinolates:
- Partie 1: Méthode par chromatographie liquide à haute perfor-
mance
-- Partie 2: - MBthode par spectrométrie de fluorescence aux rayom
X
L’annexe A de la présente partie de I’ISO 9167 est donnée uniquement
à titre d’information.
8 IS0 1992
Oroits de reproduction reserves. Aucune partie de cette publication ne peul êIre repro-
duite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, electronique ou
mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l‘accord ecrit de I’editeur.
Organisation Internationale de normalisation
Case Postale 56 CH-1211 Geneve 20 Suisse
imorimé en Suisse
ii
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NORME INTERNATIONALE IS0 9167-1:1992(F)
Graines de colza - Dosage des glucosinolates -
Partie 1:
Méthode par chromatographie liquide à haute performance
IS0 3696:1987, Eau pour laboratoire à usage analyti-
1 Domaine d’application
que - Spécification et méthodes d‘essai.
La présente partie de I’ISO 9167 prescrit une mé-
thode de dosage par chromatographie liquide à
3 Principe
haute performance (CLHP) des différents
glucosinolates dans les graines de colza.
Extraction des glucosinolates par le méthanol, puis
purification et désulfatation enzymatique sur résines
NOTES
échangeuses d’ions. Détermination par chromato-
1 Cette méthode ne dose pas les glucosinolates ayant
graphie liquide à haute performance en phases in-
des substituants sur la partie glucose, mais ces compos&
verses avec gradient d’élution et détection aux
sont peu importants dans les graines de colza commer-
ultraviolets.
ci ali Sées.
2 Une methode rapide de dosage global des
4 Réactifs
graines de colza, par spectrométrie de
glucosinolates des
fluorescence aux rayons X (XRF) fait l’objet de
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des
l’lS0 9167-2.
réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau
de grade 2, conformément à I’ISO 3696.
4.1 Méthanol, qualité CLHP, solution a 70 Oh (V/V).
2 Références normatives
4.2 Acétate de sodium, solution à 0,02 mol/l de
Les normes suivantes contiennent des dispositions
pH 4,O.
qui, par suite de la référence qui en est faite,
constituent des dispositions valables pour la pré-
sente partie de I‘ISO 9167. Au moment de la publi-
4.3 Acétate de sodium, solution à 0,2 mol/l
cation, les éditions indiquées étaient en vigueur.
Toute norme est sujette à révision et les parties
4.4 Formate d‘imidazole, solution à 6 mol/l
prenantes des accords fondés sur la présente partie
de I’ISO 9167 sont invitées à rechercher la possi-
Dissoudre 204 g d’imidazole dans 113 ml d’acide
bilité d’appliquer les éditions les plus récentes des
formique dans une fiole jaugée de 500 ml. Ajuster
normes indiquées ci-après. Les membres de la CE1
au trait repère avec de l’eau.
et de I’ISO possèdent le registre des Normes inter-
nationales en vigueur à un moment donné.
4.5 Étalon interne, utiliser soit la sinigrine
IS0 664:1990, Graines oléagineuses .- Réduction de monohydrate (allylglucosinolate, sel de potassium
I‘échantillon pour laboratoire en échantillon pour monohydraté, M, = 415,49) (voir 4.5.1) soit, pour le
essai. colza (cultivé ou adventice) dans lequel la sinigrine
est prés ente na t u re1 lemen t , I a glucotropaéoline
IS0 665: 1977, Graines oléagineuses - Détermination (benzylglucosinolate, sel de potassium,
de la teneur en eau et matières volatiles M, = 447.52) (voir 4.5.2).
1
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IS0 9167-1:1992(F)
Pour le colza A faible teneur en glucosinolates
mesurée devrait être égale au moins à 98 de la
(< 20 pm/g). réduire la concentration de l’étalon
concentration molaire de la solution de sinigrine
interne (1 mmol/l à 3 mmol/l) en 4.5.1 et 4.5.2.1
testée.
4.5.1 Sinigrine monohydratée 4.5.2 Glucotropaéoline
NOTE 3 La glucotropaeoline est quelquefois difficile à
4.5.1.1 Sinigrine monohydratée, solution à
séparer d’autres glucosinolates naturels mineurs.
5 mmol/l.
4.5.2.1 Glucotropaéoline, solution à 5 mmol/l. Dis-
Dissoudre 207,7 mg d’allylglucosinolate de potas-
soudre 233,8 rng de glucotropaéoline dans de l‘eau,
sium monohydraté dans de l’eau, dans une fiole
dans une fiole jaugée de 100 ml. Ajuster au trait re-
jaugée de 100 ml. Ajuster au trait repère avec de
père avec de l’eau.
l‘eau.
La solution ainsi prkparée peut être conservée au
4.5.2.2 Glucotropaéoline, solution à 20 mmol/l. Dis-
réfrigérateur à 4 “C pour une conservation d’une
soudre 895,O mg de glucotropaéoline dans de l’eau,
semaine ou au congélateur (- 18 “C) pour une
dans une fiole jaugée de 100 ml. Ajuster au trait re-
conservation plus longue.
pere avec de l’eau.
4.5.1.2 Sinigrine monohydratée, solution à
4.5.2.3 Contrôle de pureté
20 mmol/l.
Contrôler la pureté conformément au mode opé-
Dissoudre 831,O mg d‘allylglucosinolate de potas-
ratoire indiqué en 4.5.1.3.
sium monohydraté dans de l‘eau, dans une fiole
jaugée de 100 ml. Ajuster au trait repère avec de
4.5.2.4 Coefficients de réponse
l’eau.
Vérifier que les coefficients de réponse de la
La solution ainsi préparée peut être conservée au
glucotropaéoline, comparés à la sinigrine, corres-
réfrigérateur à 4 “C environ pour une conservation
pondent à ceux indiqués en 9.2.
d’une semaine ou au congélateur (- 18 “C) pour
une conservation plus longue.
4.6 Phases mobiles
4.5.1.3 Contrôle de pureté
4.6.1 Eluant A: eau, purifiée par passage sur car-
touche de charbon actif (par exemple système
Utiliser un ou plusieurs des trois tests suivants:
Norganic Millipore’) ou eau de qualité équivalente.
- l’analyse par CLHP réalisée par la méthode
prescrite dans la présente partie de I‘ISO 9167;
4.6.2 Eluant B: acétonitrile, qualité CLHP, solution
à 20 YO (V/V) dans l’eau purifiée. La concentration
- l‘analyse de la sinigrine intacte par CLHP (tech-
peut être modifiée en fonction de la colonne utilisee
nique par appariement d’ions);
4.7 Resine echangeuse d’ions, utiliser 4.7 1 ou
- l‘analyse par chromalographie en phase ga-
4.7 2.
zeuse de la sinigrine désulfatée et silylée.
4.7.1 Suspension DEAE Sepharose CL-6B7), prête à
Dans ces tests, le pic majeur doit représenter au
l’emploi ou produit équivalent.
moins 98 de la surface totale des pics.
Confirmer la pureté par une détermination de la
4.7.2 Suspension DEAE Sephadex A29), préparée
quantité de glucose libéré après hydrolyse avec la
comme suit.
myrosinase (t hiog I ucoside g lucoh yd rol ase EC
3.2.3.1). Mesurer le glucose par voie enzymatique. Mélanger log de résine DEAE Sephadex A25 (ou
L’utilisation d‘un coffret du commerce facilite la dé- d’une résine équivalente) dans un excès d‘acide
termination. Tenir compte du glucose libre éven- acétique à 2 mol/l. Laisser décanter. Ajouter de
tuellement présent qui sera mesure sans addition l’acide acétique à 2 mol/l jusqu‘à ce que le volume
de myrosinase. La concentration molaire de glucose du surnageant soit égal au volume du gel décanté.
1) Norganic Millipore est un exemple de produit approprié disponible sur le marcl>é. Cette information est donnée à I’in-
tention des utilisateurs de la présente partie de I’ISO 9167 et ne signifie nullement que I’ISO approuve ou recommande
l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
2) DEA Sepharose et Sephadex sont des exemples de produits appropriés disponibles sur le marché. Cette information
est donnée à l’intention des utilisateurs de la présente partie de I’ISO 9167 et ne signifie nullement que l’lS0 approuve
ou recommande l’emploi exclusif de ces produits ainsi désignés.
---------------------- Page: 4 ----------------------
IS0 91 67-1 :1992(F)
4.8 Sulfatase, type Hi (EC 3.1.6.1) d‘Hélix pornatia c) mélanger 73 ml de solution a) et 40 ml de solu-
ayant une activité supérieure à 0,5 unité d’activité tion b) et ajuster à pH 5,8 avec les solutions a)
par millilitre de solution de sulfatase purifiée. ou b).
Purifier, tester et diluer la sulfatase conformément Verser 3 ml de la solution de sinigrine à 5 mmol/l
à la méthode décrite de 4.8.1 à 4.8.4. (4.5.1) dans une fiole jaugée de 100 ml et ajuster au
trait repère avec la solution c).
4.8.1 Préparation des colonnes échangeuses d‘ions
Couper cinq pipettes Pasteur (5.9) à 7 cm au-dessus 4.8.3.2 Contrôle de l’activité
de I’étranglement et placer une mèche de laine de
Verser, à la pipette, 2 ml de la solution de sinigrine
verre (5.8) au niveau de I‘étranglement. Installer les
tamponnée (4.8.3.1) dans les cuves de référence et
pipettes verticalement sur un support et déposer
de mesure du spectromètre (5.3) réglé à une lon-
dans chacune d’elles une quantité suffisante de ré-
gueur d‘onde de 229 nm avec une température des
sine échangeuse d’ions (4.7) de manière à obtenir,
cuves de 30 “C. Au temps t = O, verser dans la cuve
après Ccoulement de l’eau, un volume de 500 pl de
de mesure 50 pl de la sulfatase purifiée (4.8.2) et
résine.
mettre en marche l‘enregistreur. Arrêter I’enregis-
Verser dans chaque pipette 1 ml de la solution de
treur quand I’absorbance ne varie plus (Ae), tracer
formate d’imidazole (4.4) puis les rincer deux fois
la tangente au point t=O et mesurer sa pente
avec 1 ml d’eau.
AA/At.
L’activiti! de la sulfatase (c’est-à-dire la production
4.8.2 Purification
de 1 micromole de sinigrine désulfatée par minute
à 30 “C et pH 5,8), exprimée en unites d’activité par
Peser, à 0,l mg près, 25 mg de sulfatase type H1
d’Hélix pornatia (4.8), les dissoudre dans 2,5 ml millilitre de solution de sulfatase, est égale à
d’eau et faire passer 500 pI de cette solution dans
AA V 1000 106
----X---X-
chacune des colonnes préparées en 4.8.1. Laver
At AC 50
chaque colonne avec 1,5 ml d’eau et éliminer
l’effluent. Ajouter ensuite 1,5 ml de la solution OU
d’acétate de sodium (4.3). puis récupérer et réunir
AA/At est la pente de la tangente au point
les éluats des cinq colonnes dans un tube à essais.
[=O, en unités d’absorbance par mi-
Concentrer les éluats par filtration à l‘aide d‘un filtre nute;
immersible Millipore PTGC 1 1K253’ jusqu‘à obtention
V est le volume, en litres, du milieu
d‘un résidu d‘environ 100 pl (la sulfatase ayant une
réactionnel (soit 2,05 x IOp3 I);
masse moléculaire supérieure à 5 O00 n’est pas éli-
minée). Ajouter 2.5 ml d’eau et concentrer à nou-
AC est la différence (de l‘ordre de
veau par filtration jusqu’A obtention d‘un résidu
1 500 I.mol-- ‘) des coefficients
d’environ 100 pl. Diluer jusqu’â 2,5 ml avec de l’eau
d’extinction molaire de la sinigrine et
et conserver la sulfatase ainsi purifiée au congéla-
de la désulfosinigrine à 228 nrn, c’est-
teur à - 18 “C en plusieurs fractions pour ne dé-
à-dire
congeler que le volume nécessaire à l’utilisation.
4
AS=--
4.8.3 Contrôle de l’activité de la sulfatase
IC
OU
4.8.3.1 Préparation d’une solution de sinigrine à
0,15 mmol/l, tamponnée à pH 5,8.
A, est la différence entre I’absor-
bance à I‘équilibre de la
Préparer successivement les trois solutions sui-
sinigrine désulfatée et I’absor-
vantes,
bance au temps t = O;
a) verser 1 mi d’acide acétique dans une fiole jau-
I est le parcours optique de la
gée de 500 ml et ajuster au trait repère avec de
cuve, en centimètres (soit
l‘eau:
1 cm);
b) verser 1 ml d’éthylène diamine dans une fiole c est la concentration de la
jaugée de 500 ml et ajuster au trait repère avec sinigrine désulfatée à l’équili-
bre, en moles par litre, soit
de l’eau;
3) Millipore PTGC 11K25 est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à
l’intention des utilisateurs de la présente partie de I’ISO 9167 et ne signifie nullement que l’lS0 approuve ou recommande
l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
3
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IS0 91 67-1 :1992(F)
Colonne Novapak C18, 4 pm (150 mm x 4 mm)
0,15 x x 0,95 x 2
c=
2.05
Colonne Lichrospher RP8, Q 5 pm (125 mm x
= 1,39 x 10 mol/l
4 mm)
0,95 correspond au rendement
Colonne Nucléosil C18, Q 5 pm (200 mm x
à I’équilibre de la désulfatation
4 mm)
de la sinigrine
Les performances de la colonne choisie doivent être
On peut également calculer l’activité de la sulfatase
régulièrement contrôlees à l’aide, de préférence,
à l‘aide de la formule simplifiée suivante:
d‘un echantillon de référence de colza
désulfoglucosinolatesl. En particulier, la colonne ne
AA x 5,7
doit pas dégrader I‘hydroxy-4 glucobrassicine. un
AfA,
glucosinolate important, mais relativement instable
Les nouvelles colonnes doivent faire l’objet d‘une
4.8.4 Dilution
mise en condition préliminaire, selon les instruc-
tions du fabricant, avant de pouvoir obtenir des
...
IS0
NORME
91 67-1
I NTER NATIONALE
Première 6dition
1992-07-0 1
Graines de colza - Dosage des
glucosinolates -
Partie 1:
Méthode par chromatographie liquide à haute
performance
Rapeseed - Determination of glucosinolates content -
Part I: Method using high-performance liquid chromatography
___
__-
Numéro de référence
~~ ~___. ~ IS0 9167-1.1992(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
IS0 9167-1:1992(F)
Avant-propos
L‘ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres
de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comites techniques de l’lS0. Chaque comité membre inté-
ressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique créé
à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I’ISO participent également aux tra-
vaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique
internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotech-
nique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techni-
ques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 au moins
des comitCts membres votants.
La Norme internationale IS0 9167-1 a été élaborée par le comité tech-
nique ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 2,
Graines et fruits oléagineux.
L’ISO 9167 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre ge-
neral Graines de colza - Dosage des glucosinolates:
- Partie 1; Méthode par chromatographie liquide à haute perfor-
niance
-- Partie 2; - Méthode par spectrométrie de fluorescence aux rayons
X
L‘annexe A de la présente partie de I’ISO 9167 est donnée uniquement
à tit re d ’inform at ion .
0 IS0 1992
Droits de reproduction reserves. Aucune partie de cette publication ne peut être repro-
sous quelque forme que ce soit et par aucun procede, electronique ou
duite ni utilisée
mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord ecrit de i‘editeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 CH-1211 Genève 20 Suisse
imprimé en Suisse
ii
---------------------- Page: 2 ----------------------
~~
~
NORME INTERNATIONALE IS0 9167-1:1992(F)
Graines de colza - Dosage des glucosinolates -
Partie 1:
Méthode par chromatographie liquide à haute performance
IS0 3696:1987, Eau pour laboratoire à usage analyti-
1 Domaine d’application
que - Spécification et méthodes d‘essai.
La présente partie de I’ISO 9167 prescrit une mé-
thode de dosage par chromatographie liquide à
3 Principe
haute performance (CLHP) des différents
glucosinolates dans les graines de colza.
Extraction des glucosinolates par le méthanol, puis
purification et désulfatation enzymatique sur résines
NOTES
éch a n g e u s e s d ’ions. Dé termination par chroma to-
1 Cette méthode ne dose pas les glucosinolates ayant
graphie liquide à haute performance en phases in-
des substituants sur la partie glucose, mais ces compos6s
verses avec gradient d‘élution et détection aux
sont peu importants dans les graines de colza commer-
ultraviolets.
cialisées.
2 Une méthode rapide de dosage global des
4 Réactifs
glucosinolates des graines de colza, par spectrométrie de
X (XRF) fait l’objet de
fluorescence aux rayons
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des
I’ISO 9167-2.
réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau
de grade 2, conformément à I’ISO 3696.
4.1 Méthanol, qualité CLHP, solution à 70 O/O (V/V).
2 Références normatives
4.2 Acétate de sodium, solution à 0,02 mol/l de
Les normes suivantes contiennent des dispositions
pH 4,O.
qui, par suite de la référence qui en est faite,
constituent des dispositions valables pour la pré-
sente partie de I’ISO 9167. Au moment de la publi-
4.3 Acétate de sodium, solution a 0,2 mol/l
cation, les éditions indiquées étaient en vigueur.
Toute norme est sujette à révision et les parties
4.4 Formate d’imidazole, solution à 6 mol/l.
prenantes des accords fondés sur la présente partie
de I’ISO 9167 sont invitées à rechercher la possi-
Dissoudre 204 g d’imidazole dans 113 ml d’acide
bilité d’appliquer les éditions les plus récentes des
formique dans une fiole jaugée de 500 ml. Ajuster
normes indiquées ci-après. Les membres de la CE1
au trait repère avec de l’eau.
et de I’ISO possèdent le registre des Normes inter-
nationales en vigueur à un moment donné.
4.5 Étalon interne, utiliser soit la sinigrine
IS0 664:1990, Graines oléagineuses .- Réduction de (allylglucosinolate, sel de potassium
monohydrate
l’échantillon pour laboratoire en échantillon pour monohydrate, M, = 415,49) (voir 4.5.1) soit, pour le
essai. colza (cultivé ou adventice) dans lequel la sinigrine
est présente nature I le ment, I a glucotropaéoline
IS0 665: 1977, Graines oléagineuses - Détermination (be nzylg I ucos i no1 a te, sel de pot as si um ,
de la teneur en eau et matières volatiles. M, = 447,52) (voir 4.5.2).
1
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IS0 91 67-1 :1992(F)
Pour le colza A faible teneur en glucosinolates
mesurée devrait être égale au moins à 98 O/O de la
(< 20 prn/g), réduire la concentration de l’étalon
concentration molaire de la solution de sinigrine
interne (1 mmol/l à 3 mmol/l) en 4.5.1 et 4.5.2.1 , testée.
4.5.1 Sin igri n e mono h yd ratée 4.5.2 Glucotropaeoline
NOTE 3 La glucotropaéoline est quelquefois difficile à
solution à
4.5.1.1 Sinigrine monohydratée,
séparer d’autres glucosinolates naturels mineurs.
5 mmol/l.
4.5.2.1 Glucotropaéoline, solution à 5 mmol/l. Dis-
Dissoudre 207,7 mg d’allylglucosinolate de potas-
soudre 233,8 mg de glucotropaéoline dans de l’eau,
sium monohydraté dans de l’eau, dans une fiole
dans une fiole jaugée de 100 ml. Ajuster au trait re-
jaugée de 100 ml. Ajuster au trait repère avec de
pere avec de l‘eau.
l’eau.
La solution ainsi préparée peut être conservée au
4.5.2.2 Glucotropaéoline, solution à 20 mmol/l. Dis-
réfrigérateur Q 4 “C pour une conservation d’une
soudre 895,O mg de glucotropaéoline dans de l’eau,
semaine ou au congélateur (- 18 “C) pour une
dans une fiole jaugée de 100 ml. Ajuster au trait re-
conservation plus longue.
père avec de l’eau.
4.5.1.2 Sinigrine monohydratée, solution à
4.5.2.3 Contrôle de pureté
20 mrnol/l.
Contrôler la pureté conformément au mode opé-
Dissoudre 831,O mg d‘allylglucosinolate de potas-
ratoire indiqué en 4.5.1.3.
sium monohydraté dans de l‘eau, dans une fiole
jaugée de 100 ml. Ajuster au trait repère avec de
4.5.2.4 Coefficients de réponse
l‘eau.
Vérifier que les coefficients de réponse de la
La solution ainsi préparée peut être conservée au
glucotropaéoline, comparés à la sinigrine, corres-
réfrigérateur à 4 “C environ pour une conservation
pondent à ceux indiqués en 9.2.
d’une semaine ou au congélateur (- 18 OC) pour
une conservation plus longue.
4.6 Phases mobiles
4.5.1.3 ContrGle de pureté
4.6.1 Eluant A: eau, purifiée par passage sur car-
touche de charbon actif (par exemple système
Utiliser un ou plusieurs des trois tests suivants:
Norganic MiIlipore” ou eau de qualité équivalente.
- l’analyse par CLHP réalisée par la méthode
prescrite dans la présente partie de I’ISO 9167;
4.6.2 Eluant B: acétonitrile, qualité CLHP, solution
à 20 O/O (Vir3 dans l’eau purifiée. La concentration
- l’analyse de la sinigrine intacte par CLHP (tech-
peut être modifiée en fonction de la colonne utilisCe.
nique par appariement d’ions);
4.7 Resine échangeuse d’ions, utiliser 4 7.1 ou
- l‘analyse par chromatographie en phase ga-
472
zeuse de la sinigrine désulfatée et silylée.
Suspension DEAE Sepharose CL-6B7), prête a
4.7.1
Dans ces tests, le pic majeur doit représenter au
l’emploi ou produit équivalent.
de la surface totale des pics.
moins 98
Confirmer la pureté par une détermination de la
4.7.2 Suspension DEAE Sephadex A251), préparée
quantité de glucose libéré après hydrolyse avec la
comme suit.
myrosinase (thioglucoside glucohydrolase EC
3.2.3.1). Mesurer le glucose par voie enzymatique. Mélanger log de résine DEAE Sephadex A25 (ou
L’utilisation d‘un coffret du commerce facilite la dé- d’une résine &quivalente) dans un excès d’acide
termination. Tenir compte du glucose libre éven- acétique à 2 mol/l. Laisser décanter. Ajouter de
tuellement présent qui sera mesuré sans addition l‘acide acétique à 2 mol/l jusqu’à ce que le volume
de myrosinase. La concentration molaire de glucose du surnageant soit égal au volume du gel décanté.
1) Norganic Millipore est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à I’in-
tention des utilisateurs de la présente partie de I’ISO 9167 et ne signifie nullement que I’ISO approuve ou recommande
l‘emploi exclusif du produit ainsi désigne.
2) DEA Sepharose et Sephadex sont des exemples de produits appropriés disponibles sur le marché. Cette information
est donnée à l’intention des utilisateurs de la présente partie de I’ISO 9167 et ne signifie nullement que I’ISO approuve
ou recommande l’emploi exclusif de ces produits ainsi désignés.
2
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IS0 9167-1:1992(F)
4.8 Sulfatase, type HI (EC 3.1.6.1) d’Hélix pornatia c) mélanger 73 ml de solution a) et 40 ml de solu-
tion b) et ajuster à pH 5,8 avec les solutions a)
ayant une activité supérieure à 0,5 unité d’activité
ou b).
par millilitre de solution de sulfatase purifiée.
Purifier, tester et diluer la sulfatase conformément Verser 3 ml de la solution de sinigrine à 5 mmol/l
à la méthode décrite de 4.8.1 à 4.8.4. (4.5.1) dans une fiole jaugée de I00 ml et ajuster au
trait repère avec la solution c).
4.8.1 Préparation des colonnes echangeuses d’ions
Couper cinq pipettes Pasteur (5.9) à 7 cm au-dessus 4.8.3.2 Contrôle de l’activité
de I’étranglement et placer une mèche de laine de
Verser, à la pipette, 2 ml de la solution de sinigrine
verre (5.8) au niveau de I‘étranglement. Installer les
tamponnée (4.8.3.1) dans les cuves de référence et
pipettes verticalement sur un support et déposer
de mesure du spectromètre (5.3) réglé à une lon-
dans chacune d’elles une quantité suffisante de ré-
gueur d’onde de 229 nm avec une température des
sine échangeuse d’ions (4.7) de manière à obtenir,
cuves de 30 “C. Au temps t = O, verser dans la cuve
après écoulement de l’eau, un volume de 500 pl de
de mesure 50 pl de la sulfatase purifiée (4.8.2) et
résine.
mettre en marche l’enregistreur. Arrêter I‘enregis-
Verser dans chaque pipette 1 ml de la solution de
treur quand I’absorbance ne varie plus (A,,), tracer
formate d’imidazole (4.4) puis les rincer deux fois
la tangente au point t =O et mesurer sa pente
avec 1 ml d’eau.
AAIAi.
L’activitk de la sulfatase (c’est-à-dire la production
4.8.2 Purification
de 1 micromole de sinigrine désulfatée par minute
à 30 “C et pH 5,8), exprimée en unités d’activité par
Peser, à 0,l mg près, 25 mg de sulfatase type HI
millilitre de solution de sulfatase, est égale à
d’Helix pomatia (4.8), les dissoudre dans 2,5 ml
d’eau et faire passer 500 pl de cette solution dans
AA V 1000 106
----x-x-
chacune des colonnes préparées en 4.8.1. Laver
At AC 50
chaque colonne avec 1,5 ml d’eau et éliminer
l’effluent. Ajouter ensuite 1,5 ml de la solution où
d’acétate de sodium (4.3), puis récupérer et réunir
AA/At est la pente de la tangente au point
les éluats des cinq colonnes dans un tube à essais.
(=O, en unités d’absorbance par mi-
Concentrer les éluats par filtration à l‘aide d’un filtre nute:
immersible Millipore PTGC I 1K253’ jusqu’à obtention
V est le volume, en litres, du milieu
d’un résidu d’environ 100 pI (la sulfatase ayant une
réactionnel (soit 2,05 x I);
masse moléculaire supérieure à 5 O00 n’est pas éli-
nou-
minée). Ajouter 2,5 ml d’eau et concentrer à
Ar: est la différency (de l‘ordre de
veau par filtration jusqu’à obtention d‘un résidu
1 500 I,mol-’ ,cm- ) des coefficients
d’environ 100 pl. Diluer jusqu’â 2,5 ml avec de l’eau
d’extinction molaire de la sinigrine et
et conserver la sulfatase ainsi purifiée au congéla-
de la désulfosinigrine à 228 nm, c’est-
teur à - 18 “C en plusieurs fractions pour ne dé-
à-dire
congeler que le volume nécessaire à l’utilisation.
A,
AC =-
4.8.3 Contrôle de l’activité de la sulfatase
ic
OU
4.8.3.1 Préparation d’une solution de sinigrine à
0,15 mmol/l, tamponnée A pH 5,8.
A, est la différence entre I’absor-
bance à I’équilibre de la
Préparer successivement les trois solutions sui-
sinigrine désulfatée et I’absor-
vantes,
bance au temps 1 = O;
a) verser 1 ml d’acide acétique dans une fiole jau-
I est le parcours optique de la
gée de 500 ml et ajuster au trait repère avec de
cuve, en centimètres (soit
l‘eau;
1 cm);
b) verser 1 ml d’éthylène diamine dans une fiole c est la concentration de la
sinigrine désulfatée à I’équili-
jaugée de 500 ml et ajuster au trait repère avec
bre, en moles par litre, soit
de l’eau;
3) MiIlipore PTGC llK25 est un exemple de produit approprié disponible sur IF! marché. Cette information est donnée à
l’intention des utilisateurs de la présente partie de I‘ISO 9167 et ne signifie nullement que l’lS0 approuve ou recommande
l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
3
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IS0 9167-1:1992(F)
Colonne Novapak C18, 4 pm (150 mm x 4 mm)
0,15 x x 0,95 x 2
c=
2,05
Colonne Lichrospher RP8, < 5 irm (125 nirn x
= 1,39 x 10 mol/l
4 mm)
0,95 correspond au rendement
Colonne Nucléosil C18, g 5 pm (200 mm x
à I’équilibre de la désulfatation
4 mm)
de la sinigrine.
Les performances de la colonne choisie doivent être
On peut également calculer l’activité de la sulfatase
régulièrement contrôlées à l’aide, de préférence,
à l’aide de la formule simplifiée suivante:
d‘un échantillon de référence de colza
désulfoglucosinolates~. En particulier, la colonne ne
AA x 5,7
doit pas dégrader I’hydroxy-4 glucobrassicine, un
AtA,
glucosinolate important, mais relativement instable.
Les nouvelles colonnes doivent faire l‘objet d’une
4.8.4 Dilution
mise en condition préliminaire, selon les
...
Questions, Comments and Discussion
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