ISO 20638:2015

NORME ISO
INTERNATIONALE 20638
Première édition
2015-11-01
Formules infantiles — Détermination
de la teneur en nucléotides par
chromatographie liquide
Infant formula — Determination of nucleotides by liquid
chromatography
Numéro de référence
ISO 20638:2015(F)
©
ISO 2015

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Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Termes et definitions . 1
3 Principe . 1
4 Réactifs et matériaux . 1
5 Appareillage . 3
6 Préparation des échantillons . 4
7 Mode opératoire. 5
7.1 Extraction . 5
7.2 Chromatographie . 5
8 Calculs . 6
9 Résultats . 8
Annexe A (informative) Exemples de chromatogrammes . 9
Annexe B (informative) Données de fidélité .10
Bibliographie .14
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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer
un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, en
collaboration avec l’AOAC INTERNATIONAL. Le document est publié par l’ISO et séparément par l’AOAC
INTERNATIONAL. La méthode décrite dans la présente Norme internationale est équivalente à la
Méthode officielle de l’AOAC 2011.20: Nucléotides dans les formules infantiles.
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NORME INTERNATIONALE ISO 20638:2015(F)
Formules infantiles — Détermination de la teneur en
nucléotides par chromatographie liquide
AVERTISSEMENT — L’utilisation de la présente Norme internationale peut impliquer des
matériaux, des opérations et des équipements dangereux. La présente Norme internationale
n’a pas pour but d’aborder tous les problèmes de sécurité liés à son utilisation. Avant d’utiliser
la présente Norme internationale, il incombe à l’utilisateur d’établir des pratiques appropriées
de sécurité et de protection de la santé et de déterminer l’applicabilité des restrictions
réglementaires.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de dosage des 5′‑mononucléotides dans les
formules infantiles sous forme solide (c’est-à-dire les poudres) ou liquide (c’est-à-dire les liquides prêts
à servir et les liquides concentrés) par chromatographie liquide.
2 Termes et definitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
2.1
formule infantile
substitut du lait maternel spécialement fabriqué pour satisfaire, par lui-même, les besoins nutritionnels
des nourrissons pendant les premiers mois de la vie jusqu’à l’introduction d’une alimentation
complémentaire appropriée
[SOURCE: Norme Codex 72-1981]
3 Principe
Dissolution de l’échantillon dans une solution à forte teneur en sels afin d’inhiber les interactions entre
protéines et matières grasses. Séparation des 5’‑mononucléotides — uridine 5’‑monophosphate (UMP),
inosine 5’‑monophosphate (IMP), adénosine 5’‑monophosphate (AMP), guanosine 5’‑monophosphate
(GMP) et cytidine 5’-monophosphate (CMP) — de la matrice d’échantillon par extraction en phase
solide (SPE) par échange d’anions fort, suivie d’une analyse chromatographique utilisant une phase
stationnaire C18 avec élution à gradient, détection UV et quantification par étalonnage interne utilisant
[1]
de la thymidine 5’-monophosphate (TMP) .
4 Réactifs et matériaux
Au cours de l’analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique
reconnus et de l’eau distillée ou déminéralisée ou de l’eau de pureté équivalente.
1)
4.1 Étalons, purs à ≥ 99 % (Sigma ou l’équivalent). Les sels sodiques ou sels sodiques hydratés de
nucléotides peuvent être substitués aux formes acides libres si celles-ci ne sont pas facilement disponibles.
4.1.1 TMP, thymidine 5’-monophosphate, n° CAS 365-07-1.
1) Ceci est un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée par souci
de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à
l’égard de ces produits. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes
résultats.
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4.1.2 AMP, adénosine 5’-monophosphate, n° CAS 61-19-8.
4.1.3 CMP, cytidine 5’-monophosphate, n° CAS 63-37-6.
4.1.4 GMP, guanosine 5’‑monophosphate, n° CAS 85‑32‑5.
4.1.5 IMP, inosine 5’-monophosphate, n° CAS 131-99-7.
4.1.6 UMP, uridine 5’-monophosphate, n° CAS 58-97-9.
4.2 Bromure de potassium (KBr).
4.3 Dihydrogénophosphate de potassium (KH PO ).
2 4
4.4 Acide orthophosphorique (H PO ).
3 4
4.5 Hydroxyde de potassium (KOH).
4.6 Acide éthylènediaminetétraacétique, sel disodique dihydraté (EDTA).
4.7 Chlorure de sodium (NaCl).
4.8 Méthanol (CH OH).
3
4.9 Préparation du réactif
4.9.1 Tampon de normalisation (KH PO , c = 0,25 mol/l, pH = 3,5). Dissoudre 34,0 g de KH PO (4.3)
2 4 2 4
dans 900 ml d’eau et ajuster le pH à 3,5 à l’aide d’acide orthophosphorique (4.4). Compléter à 1 l.
4.9.2 Solution d’extraction (NaCl, c = 1 mol/l, EDTA c = 4 mmol/l). Dissoudre 58,5 g de NaCl (4.7) et
1,5 g d’EDTA (4.6). Diluer dans 1 l d’eau.
4.9.3 Solution de lavage (KBr, c = 0,3 mol/l). Dissoudre 3,6 g de KBr (4.2) dans 100 ml d’eau.
4.9.4 Solution d’élution (KH PO , c = 0,5 mol/l, pH = 3,0). Dissoudre 6,8 g de KH PO (4.3) dans 90 ml
2 4 2 4
d’eau et ajuster le pH à 3,0 à l’aide d’acide orthophosphorique (4.4). Compléter à 100 ml.
4.9.5 Phase mobile A (KH PO , c = 10 mmol/l, pH = 5,6). Dissoudre 1,4 g de KH PO (4.3) dans 900 ml
2 4 2 4
d’eau et ajuster le pH à 5,6 ± 0,1 à l’aide d’une solution de KOH (10 % m/v). Compléter à 1 l avec de l’eau.
Fabriquer la solution quotidiennement, car une croissance microbienne survient souvent à température
ambiante dans les tampons phosphate contenant peu ou pas de solvant organique.
4.9.6 Phase mobile B, méthanol à 100 % (4.8).
4.10 Préparation de l’étalon
4.10.1 Solutions étalons mères, ρ environ 1 mg/ml. Peser avec précision environ 50 mg de chaque
nucléotide 5’‑monophosphate dans des fioles jaugées de 50 ml séparées. Ajouter 40 ml d’eau, mélanger
jusqu’à dissolution et compléter au volume avec de l’eau.
4.10.2 Solutions étalons de pureté. Transférer à l’aide d’une pipette 1,0 ml de chaque solution
étalon mère (4.10.1) dans des fioles jaugées de 50 ml séparées, compléter au volume avec le tampon de
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normalisation (4.9.1) et mesurer l’absorbance à la λ appropriée afin de déterminer la concentration
max
de chaque solution étalon mère de nucléotide. Voir Tableau 1 et Références [1] et [2].
Tableau 1 — Maxima d’absorbance dans l’UV et coefficients d’extinction des nucléotides
5’-monophosphates
λ
max
1%
Nucléotide 5’-monophosphate E
1cm
nm
Adénosine 5’-monophosphate 257 428,6
Cytidine 5’-monophosphate 280 390,9
Guanosine 5’-monophosphate 254 392,0
Inosine 5’-monophosphate 249 356,5
Uridine 5’-monophosphate 262 312,7
Thymidine 5’-monophosphate 267 288,5
4.10.3 Solution étalon interne, ρ environ 80 µg/ml. Diluer 4 ml de solution étalon mère de TMP
(4.10.1) dans 50 ml d’eau.
4.10.4 Solution étalon de travail, ρ environ 40 µg/ml. Transférer 2 ml de chaque solution étalon mère
(4.10.1) (AMP, CMP, GMP, IMP et UMP) à l’aide d’une pipette dans une seule fiole jaugée de 50 ml et
compléter au volume avec de l’eau.
4.10.5 Solutions d’étalonnage. Se reporter au Tableau 2 pour connaître les concentrations nominales
de nucléotide des solutions d’étalonnage.
4.10.5.1 Solution d’étalonnage 1. Transférer 0,25 ml d’étalon de travail (4.10.4) et 1 ml d’étalon interne
(4.10.3) à l’aide d’une pipette dans une fiole jaugée de 25 ml et compléter au volume avec de l’eau.
4.10.5.2 Solution d’étalonnage 2. Transférer 0,5 ml d’étalon de travail (4.10.4) et 1 ml d’étalon interne
(4.10.3) à l’aide d’une pipette dans une fiole jaugée de 25 ml et compléter au volume avec de l’eau.
4.10.5.3 Solution d’étalonnage 3. Transférer 2 ml d’étalon de travail (4.10.4) et 1 ml d’étalon interne
(4.10.3) à l’aide d’une pipette dans une fiole jaugée de 25 ml et compléter au volume avec de l’eau.
4.10.5.4 Solution d’étalonnage 4. Transférer 5 ml d’étalon de travail (4.10.4) et 1 ml d’étalon interne
(4.10.3) à l’aide d’une pipette dans une fiole jaugée de 25 ml et compléter au volume avec de l’eau.
Tableau 2 — Concentration nominale des solutions d’étalonnage
Concentration de chaque nucléotide:
Concentration de TMP
Solution
AMP, CMP, GMP, IMP, UMP
d’étalonnage
μg/ml
μg/ml
1 0,4 3,2
2 0,8 3,2
3 3,2 3,2
4 8,0 3,2
5 Appareillage
Verrerie et équipement de laboratoire habituels et, en particulier, les éléments suivants.
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5.1 Système de CLHP, composé d’une pompe, d’une unité d’injection d’échantillons avec boucle
d’injection de 50 μl, d’une unité de dégazage, d’un four pour colonne et d’un détecteur à réseau de
photodiodes.
2)
2)
5.2 Colonne C18, Gemini C18, 5 μm, 4,6 mm× 250 mm (Phenomenex ).
5.3 Spectrophotomètre, capable d’une lecture numérique à 3 décimales.
5.4 pH-mètre.
5.5 Centrifugeuse.
2)
5.6 Tubes de centrifugation, Amicon Ultra MWCO 3k, 4 ml (Millipore) .
5.7 Tubes de centrifugation en polypropylène, capacité 50 ml.
5.8 Seringues jetables, capacité 3 ml.
5.9 Filtres seringue, 0,2 μm avec membranes en acétate de cellulose.
5.10 Extracteur sous vide pour SPE.
5.11 Cartouches de SPE par échange d’anions fort en polypropylène, 6 ml × 1 000 mg,
2)
Chromabond SB .
5.12 Membranes filtres, 0,45 μm nylon.
6 Préparation des échantillons
a) Agiter ou mélanger le récipient d’échantillon avant ouverture.
b) Peser avec précision environ 1 g de poudre ou 10 ml de formule infantile, à base de lait, prête à
servir/liquide, dans un tube de centrifugation de 50 ml.
c) Ajouter 30 ml de solution d’extraction (4.9.2).
d) Ajouter 1,0 ml d’étalon interne de TMP (4.10.3).
e) Boucher le tube et le mélanger au vortex jusqu’à ce que la poudre soit dissoute.
f) Laisser l’échantillon reposer 10 min pour garantir son hydratation complète.
g) Compléter à un volume final d’environ 50 ml avec de l’eau.
h) Boucher le tube et mélanger au vortex.
i) Pour les produits à base d’amidon, transférer 2 × 4 ml d’échantillon préparé dans deux tubes
d’ultracentrifugation séparés et centrifuger à 3 500 g pendant 60 min, puis regrouper le filtrat
des deu
...