ISO 20631:2024
(Main)Infant formula and adult nutritionals - Determination of total folate content by trienzyme extraction and ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS)
Infant formula and adult nutritionals - Determination of total folate content by trienzyme extraction and ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS)
This document specifies a method for the analysis of total folate in infant formula and adult nutritionals using trienzyme extraction and ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS).
Préparations pour nourrissons et produits nutritionnels pour adultes — Détermination de la teneur en folates totaux par extraction trienzymatique et chromatographie liquide à ultra performance (CLUHP) couplée à une spectrométrie de masse en tandem (SM/SM)
General Information
Overview
ISO 20631:2024 specifies a validated analytical method for determining total folate in infant formula and adult nutritionals. The method combines trienzyme extraction (protease, α‑amylase and rat plasma conjugase) to release folate monoglutamates with ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UHPLC‑MS/MS) for selective quantitation. The standard is intended for laboratories performing folate analysis for labeling, quality control, formulation and regulatory compliance.
Key topics and technical requirements
- Scope: Total folate in powdered and ready‑to‑feed infant formulas and adult nutritional products.
- Extraction principle: Trienzyme digestion in buffered conditions (deconjugation of polyglutamate folates to monoglutamates), followed by purification.
- Cleanup: Weak anion exchange (WAX) solid‑phase extraction (SPE) to concentrate and purify folate analytes prior to analysis.
- Instrumental analysis: UHPLC‑MS/MS with specific MS/MS transitions for folic acid, 5‑methyl‑tetrahydrofolate (5‑CH3‑THF) and 5‑formyl‑tetrahydrofolate (5‑CHO‑THF).
- Internal standards: Isotopically labelled 13C internal standards for folic acid, 5‑CH3‑THF and 5‑CHO‑THF are required for accurate quantitation.
- Reagents and handling: LC‑MS grade reagents; folate standards and extracts are light‑sensitive and must be handled under UV‑filtered or yellow light and stored appropriately (e.g., −20 °C).
- Calculations & reporting: Calibration curves, peak area ratios to internal standards, and reporting of folate as folic acid equivalents (µg/100 g). The standard includes precision (repeatability and reproducibility) performance data.
- Sample preparation: Procedures for homogenizing products and reconstituting powders to ready‑to‑feed form are specified.
Applications and users
ISO 20631:2024 is targeted at:
- Food testing and analytical laboratories performing folate analysis by UHPLC‑MS/MS.
- Infant formula and adult nutritional product manufacturers for quality control, formulation verification and stability studies.
- Regulatory agencies and compliance laboratories for nutritional labeling verification and surveillance.
- Research groups studying folate bioavailability and fortification effects in complex food matrices.
Practical uses include verifying declared folate content, optimizing fortification processes, monitoring production consistency, and supporting product registration or market authorization.
Related standards
- The method in ISO 20631:2024 is equivalent to AOAC Official Method 2011.06 (Total Folate in Infant Formula and Adult Nutritionals by Trienzyme Extraction and LC‑MS/MS).
- Developed under ISO/TC 34 (Food products) guidance for analytical method standardization.
Keywords: ISO 20631:2024, trienzyme extraction, UHPLC‑MS/MS, total folate, infant formula, adult nutritionals, folic acid, 5‑CH3‑THF, WAX SPE, isotopically labelled internal standards, folate analysis, food testing.
Frequently Asked Questions
ISO 20631:2024 is a standard published by the International Organization for Standardization (ISO). Its full title is "Infant formula and adult nutritionals - Determination of total folate content by trienzyme extraction and ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS)". This standard covers: This document specifies a method for the analysis of total folate in infant formula and adult nutritionals using trienzyme extraction and ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS).
This document specifies a method for the analysis of total folate in infant formula and adult nutritionals using trienzyme extraction and ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS).
ISO 20631:2024 is classified under the following ICS (International Classification for Standards) categories: 67.050 - General methods of tests and analysis for food products. The ICS classification helps identify the subject area and facilitates finding related standards.
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Standards Content (Sample)
International
Standard
ISO 20631
First edition
Infant formula and adult
2024-07
nutritionals — Determination
of total folate content by
trienzyme extraction and
ultra high performance liquid
chromatography tandem mass
spectrometry (UHPLC-MS/MS)
Préparations pour nourrissons et produits nutritionnels pour
adultes — Détermination de la teneur en folates totaux par
extraction trienzymatique et chromatographie liquide à ultra
performance (CLUHP) couplée à une spectrométrie de masse en
tandem (SM/SM)
Reference number
© ISO 2024
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on
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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents and materials . 2
5.1 List of reagents .2
5.2 Preparation of solvent for standard solutions .3
5.3 Preparation of folate standard solutions .4
5.4 Preparation of folate internal standard stock solutions .5
5.5 Preparation of calibration standard solutions .6
5.6 Preparation of substrate solution to test plasma conjugase activity .7
5.7 Reagent for folate analysis .8
6 Apparatus . 9
7 Procedure .10
7.1 Sample preparation .10
7.1.1 Sample processing to make them homogenous .10
7.1.2 Reconstitution of powder sample into liquid .11
7.2 Extraction .11
7.3 Extract purification .11
7.4 Instrumental analysis . 12
7.4.1 Analysis of instrument blank, calibration standards, method blank and samples . 12
7.4.2 UHPLC conditions and MS parameters for different systems . 12
8 Calculations .13
8.1 Calculation of ratios of peak areas of the folate compounds to the respective internal
standard peak areas . 13
8.2 Calibration curve . 13
8.3 Calculation of concentration of folate compounds in the method blank . 13
8.4 Calculation of concentration of folate compounds in the sample extracts . 13
8.5 Calculation of folate compounds and total folate in reconstituted or RTF samples
(μg/100 g) .14
8.6 Calculation of total folate in powder samples (μg/100 g) as-is basis . 15
8.7 Calculation of folic acid nanograms released in the conjugase test . 15
8.8 Calculation of per cent conversion of Pte-Glu3 to folic acid in the conjugase assay . 15
9 Precision .15
9.1 General . 15
9.2 Repeatability . 15
9.3 Reproducibility .16
Annex A (informative) Precision data . 17
Bibliography .18
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, in collaboration with
AOAC INTERNATIONAL. It is being published by ISO and separately by AOAC INTERNATIONAL. The method
described in this document is equivalent to the AOAC Official Method 2011.06 Total Folate in Infant Formula
and Adult Nutritionals by Trienzyme Extraction and LC-MS/MS Quantitation.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
International Standard ISO 20631:2024(en)
Infant formula and adult nutritionals — Determination
of total folate content by trienzyme extraction and ultra
high performance liquid chromatography tandem mass
spectrometry (UHPLC-MS/MS)
1 Scope
This document specifies a method for the analysis of total folate in infant formula and adult nutritionals
using trienzyme extraction and ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry
(UHPLC-MS/MS).
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
adult nutritional
nutritionally complete, specially formulated food, consumed in liquid form, which may constitute the sole
source of nourishment, made from any combination of milk, soy, rice, whey, hydrolysed protein, starch and
amino acids, with and without intact protein
3.2
infant formula
breast-milk substitute specially manufactured to satisfy, by itself, the nutritional requirements of infants
during the first month of life up to the introduction of appropriate complementary feeding
[SOURCE: Codex Standard 72-1981]
4 Principle
Folates in a sample are extracted in a buffer (pH = 6,0) containing internal standards by treatments with
protease, amylase and rat plasma conjugase (trienzyme digestion). The extract is purified and concentrated
using a weak anion exchange (WAX) solid phase extraction (SPE). Polyglutamate forms of folates in the
sample are deconjugated to monoglutamates during the extraction and are analysed by UHPLC-MS/MS. Folic
acid, 5-methyl-tetrahydrofolate (5-CH -THF) and, 5-formyl-tetrahydrofolate (5-CHO-THF) are quantified,
and total folate is estimated and expressed as folic acid. Isotopically labelled folic acid ( C-folic acid), 5-CH -
13 13
THF ( C-5-CH -THF) and 5-CHO-THF ( C-5-CHO-THF) are used as the internal standards (IS).
5 Reagents and materials
During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and distilled
or demineralized water or water of equivalent purity.
Most of the chemicals used are LC-MS grade unless specified. Product numbers and suppliers, when listed,
reflect those used in validation. Equivalent chemicals can be used.
All chemicals used in preparation of standards were stored at a minimum at −20 °C or as directed by the
manufacturer. Because folate compounds are light sensitive, all samples and standards shall be prepared,
handled and stored in the dark or under yellow-shielded lighting or UV-filtered lighting. If standards and
samples shall be transported through or into an area without UV-filtered lighting, they shall be tightly
wrapped in foil.
Store chemicals per manufacturer guidelines or set conventions.
5.1 List of reagents
1)
5.1.1 Folic acid (standard) (FA), Schircks Laboratories, Cat. No. 16.203 .
5.1.2 (6R,S)-5-Methyl-5,6,7,8-Tetrahydrofolic acid (5-CH -THF), calcium salt, Schircks Laboratories,
1)
Cat. No. 16.235 .
5.1.3 (6S)-5-Formyl-5,6,7,8-Tetrahydrofolic acid (5-CHO-THF), calcium salt, Schircks Laboratories,
1)
Cat. No. 16.221 .
5.1.4 Pteroyltri-γ-L-glutamic acid (Folic acid triglutamate) (Pte-Glu3), Schircks Laboratories, Cat.
No. 16.253
1)
An alternate source for this reagent is Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada, Cat No P840220 .
13 13 1)
5.1.5 C -Folic Acid (internal standard) ( C -FA), IsoSciences, PA, Cat# 14139 .
5 5
13 13
5.1.6 C -labelled (6S)-5-methyltetrahydrofolic acid ( C -CH -THF), calcium salt (internal standard),
5 5 3
1)
IsoSciences, PA, Cat# 14168Ca .
13 13
5.1.7 C-labelled (6S)-5-formyltetrahydrofolic acid ( C -CHO-THF), calcium salt, (internal
5 5
1)
standard), Merck Cie .
An alternate source is asi chemicals, 1837 University Circle, Sci. Bldg, Rm. 308, Cheyney, PA 19319, USA.
1)
Web: www .asichemicals .com; email: info@ asichemicals .com, Phone: 609-440-0020 . Available in 1 mg size.
A kit of all the three internal standards each in 1 mg size is also available from this source.
5.1.8 α-Amylase from Aspergillus oryzae, powder, ≥ 150 units/mg protein, Sigma-Aldrich, Cat. No.
1)
A9857 .
5.1.9 Protease from Bacillus licheniformis, Subtilisin A, lyophilized powder, Sigma-Aldrich Cat. No.
1)
P3910 .
1) Listed chemicals were used in the validation study. They are examples of suitable products available commercially.
This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of
these products. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
5.1.10 Conjugase (Male Sprague Dawley Rat Plasma) with lithium and heparin (not filtered), BIOIVT
1)
Cat. No. RAT00PLLHMNN .
1)
An alternate source for the rat plasma reagent is Odin Bioscience , 1621 Central Ave., Cheyenne, WY 82001,
1)
info@ odinbioscience .com or Lampire Biological Laboratories, Pippersville, 18947. PA, USA .
5.1.11 Ammonium hydroxide solution, (certified ACS Plus) 28 % to 30 % (mass fraction), (aqueous
1)
ammonia), Fisher, Cat. No. A669-500 .
5.1.12 Sodium phosphate, dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS, ≥ 99 %), Fisher Cat. No.
1)
S-374-500 .
1)
5.1.13 Methanol, Optima LC/MS grade, 99,9 % minimum, Fisher Cat. No. A456-4 .
1)
5.1.14 Glacial acetic acid, (certified ACS), Fisher, Cat. No. A38S-212 .
1)
5.1.15 Sodium hydroxide, (pellets/ACS Certified), ≥ 97 %, Fisher Cat. No. S318-1 .
1)
5.1.16 Ammonium acetate, (crystalline/certified ACS), ≥ 97 %, Fisher Cat. No. A637-500 .
1)
5.1.17 2-Mercaptoethanol, (electrophoresis grade), ≥ 98 %, Fisher Cat. No. BP176-100; Sigma M6250 .
1)
5.1.18 Ascorbic acid, (white crystalline powder), ≥ 99 %, Fisher Cat. No. BP351-500 .
1)
5.1.19 Tris-(2-carboxyethyl)phosphine, hydrochloride (TCEP-HCl), Fisher, Cat. No. AC 363830100 .
1)
5.1.20 Charcoal, (Darco G-60 activated carbon), Fisher Cat. No. D127-500 .
1)
5.1.21 Formic acid, (reagent grade), ≥ 95 %, water ≤ 2,5 %, acetic acid < 1 %, Sigma F0507 .
1)
5.1.22 Water, (high purity, suitable for HPLC mobile phase), resistivity up to 18 MΩ·cm .
5.2 Preparation of solvent for standard solutions
−3
5.2.1 Stock solvent, substance concentration c = 15,6 × 10 mol/l ammonium acetate buffer with 25 %
ascorbic acid and 1 % mercaptoethanol, pH = 5,5.
Accurately weigh 0,6 g ± 0,01 g of ammonium acetate and transfer into a 500 ml beaker. In a fume hood,
slowly add approximately 300 ml of HPLC water and 2,4 ml of glacial acetic acid. Add 125 g of ascorbic acid
and 5 ml of 2-mercaptoethanol. Stir to dissolve completely. Adjust pH to = 5,5 using concentrated ammonium
hydroxide (28 % to 30 %). Transfer the solution into a 500 ml volumetric flask and bring to volume (500 ml)
with HPLC water. Mix thoroughly.
−3
5.2.2 Intermediate solvent, c = 1,6 × 10 mol/l ammonium acetate buffer with 1 % ascorbic acid,
pH = 5,5.
Accurately weigh 0,12 g ± 0,001 g ammonium acetate and transfer into a 1 l beaker. In a fume hood, slowly
add approximately 700 ml of HPLC water and 480 μl of glacial acetic acid. Add 10 g of ascorbic acid and stir
until completely dissolved. Adjust pH to pH = 5,5, if necessary, with concentrated ammonium hydroxide.
Transfer the solution to a 1 l volumetric flask and bring to volume with HPLC water. Mix thoroughly.
5.2.3 Solvent for SPE elution and folates standards, methanol with 10 % formic acid and 1 % ascorbic acid.
Take 1 g of ascorbic acid and 10 ml of concentrated formic acid into a 100 ml volumetric flask. Add
approximately 50 ml methanol. Sonicate in a water bath (at room temperature) for complete dissolution
(usually takes about 2 min). Bring to 100 ml volume with methanol. Mix thoroughly.
Use this solution to elute folates from SPE sorbent after clean up, to make analytical standards and as a
blank in the LC-MS/MS analysis. Prepare fresh on the day of use.
5.3 Preparation of folate standard solutions
5.3.1 Folate stock standards, mass concentration ρ = 500 µg/ml.
Accurately weigh approximately 25 mg of each of folic acid, 5-CH -THF, 5-CHO-THF and Pte-Glu3 into
separate 50 ml low-actinic volumetric flasks. Add approximately 35 ml of the stock solvent to each flask and
sonicate in a water bath for about 1 min for complete dissolution of the folate chemical. Add the least amount
of ammonium hydroxide solution (28 % to 30 %) to aid in dissolution of folic acid; it can take approximately
30 drops to 48 drops (1,5 ml to 2,4 ml). Make up to 50 ml with folate stock solvent in each of the flask and
mix the contents.
Transfer solutions to glass vials of capable of maintaining integrity at the targeted low temperature. The
use of plastic vials has no demonstrable issues in storage. Store at −20 °C or lower temperatures (i.e. −70 °C
for better stability). Folate stock standard solutions (folic acid, 5-CHO-THF and Pte-Glu3) stored at –70 °C
are stable for six months, and 5-CH -THF is stable for three months. Solutions stored at –20 °C are stable for
30 days.
Calculate the correct concentration of each of the folate compound’s respective stock solution after adjusting
for the moisture content in the folate chemical and their respective purity (HPLC) based on the certificate
provided by the supplier. Folic acid may have moisture content as high as 7,9 % and 5-formyl-THF as high as
14,9 %. Typical purity (HPLC based) of the folate compounds is usually 98 % to 99 %. 5-CH -THF and 5-CHO-
THF chemicals used are often calcium salts.
Calculate the concentration of the stock standard solutions, ρ , in micrograms per millilitre, as salt free
ss
form based on the differences in their respective molecular weights, using Formula (1):
()mP××()10 M
srsff
ρ = × (1)
ss
V M
rf
where
m is the mass of the standard, in grams, e.g. m = 0,025 g;
s s
P is the purity of analyte and moisture contents, e.g. P = 90 % or P = 0,9 g/g;
V is the final volume, in millilitre, e.g. V = 50 ml;
M is the molecular weight of free base or salt free folate;
rsff
M is the molecular weight of folate salt used.
rf
For example, with the values above and a molecular weight of free base or salt free 5-CHO-THF of 473,4 and
a molecular weight of 5-CHO-THF calcium salt of 511,5, the calculation using Formula (1) for ρ (salt free) is:
ss
(,0 025××09,) ()10 473,4
ρ ==× 416,5
ss
50 511,5
5.3.2 Folate intermediate standards, ρ = 20 µg/ml.
Add about 5 ml of the intermediate solvent to a 10 ml low-actinic volumetric flask. Accurately add 0,4 ml
of each of the stock standard solutions (5.3.1) of FA, 5-CH -THF and 5-CHO-THF to the same flask. Make up
volume to 10 ml with the folate intermediate solvent and mix contents.
Calculate the concentration of each folate vitamer in the intermediate standard solution, ρ , in micrograms
is
per millilitre, using Formula (2):
()ρ ×V
ss 1
ρ = (2)
is
V
where
V is 0,4 ml;
V is 10 ml.
The folate intermediate standard solution can be stored at −20 °C for 30 days and can be stable up to
three months at −70 °C.
5.4 Preparation of folate internal standard stock solutions
5.4.1 C -Folic acid internal standard stock solution, ρ = 1 mg/ml.
The chemical is often supplied in a 1 mg amount. Dissolve the entire 1 mg amount of labelled folic acid in
1 ml of the stock solvent. Folic acid is difficult to dissolve. The addition of 10 μl of ammonium hydroxide
solution (28 % to 30 %) aids in dissolution. A higher amount of the chemical, if available, can be used to
make a stock solution of a final concentration of around 1 mg/ml. Sonication and vortex for 1 min to 2 min
can help to complete dissolution.
5.4.2 C -(6S)-5-Methyl-5,6,7,8-Tetrahydrofolate internal standard stock solution, ρ = 1 mg/ml.
The labelled methyl-THF may be supplied in a 1 mg amount. Dissolve the entire 1 mg amount of labelled
methyl-THF in 1 ml of the stock solvent. A higher amount of the chemical, if available, can be used to make a
stock solution of a final concentration of around 1 mg/ml. Dissolve the chemical completely with the aid of
vortex and brief (30 s) sonication.
5.4.3 C -(6S)-5-formyl-5,6,7,8-Tetrahydrofolate internal standard stock solution, ρ = 1 mg/ml.
Weigh about 10 mg of labelled formyl-THF in a 10 ml volumetric flask. Add about 7 ml of the stock solvent.
Dissolve the chemical completely with the aid of vortex and brief (30 s) sonication. Make up volume to 10 ml
with the stock solvent and mix the solution.
Folate internal standard stock solutions in 5.4.1, 5.4.2 and 5.4.3 if stored at −70 °C, folic acid and 5-CHO-
THF can be stable for six months and 5-CH -THF for three months. Solutions can be stable for shorter time
periods if stored at −20 °C.
Concentration of each of internal standard stock solution should be calculated after adjustment for their
respective purity (based on the manufacturer’s certificate).
5.4.4 Internal standard intermediate solution cocktail, ρ = 20 μg/ml of each folate.
Take about 5 ml of the intermediate solvent into a 10 ml low-actinic volumetric flask. Transfer accurately
13 13 13
0,2 ml of each of the internal standard stock solutions, i.e. C -FA (5.4.1), C -CH -THF (5.4.2) and C -
5 5 3 5
CHO-THF (5.4.3) into the same 10 ml volumetric flask. Make up 10 ml with folate intermediate solvent.
Thoroughly mix the solution.
Calculate the actual concentrations of each internal standard ρ , in micrograms per millilitre, using
iis
Formula (3):
()ρ ×V
ss 1
ρ = (3)
iis
V
where
ρ is concentration of the internal standard intermediate solution after adjusting for purity;
iis
V is 0,2 ml;
V is 10 ml.
The folate standard intermediate solution can be stored at −20 °C for 30 days and can be stable up to three
months at −70 °C.
5.4.5 Internal standard solution for calibration standards 1, ρ = 2 µg/ml of each internal standard folate.
Take 20 ml of solvent for SPE elution (5.2.3) in a 50 ml centrifuge tube. Add 1 ml of ammonium hydroxide
(28 % to 30 %) and mix (neutralized solvent for SPE elution). Prepare fresh before use.
Accurately pipette 100 µl of the folate internal standard intermediate solution (ρ is approximately 20 µg/
ml) (5.4.4) into a microcentrifuge tube. Accurately add 900 µl of the freshly prepared neutralized solvent for
SPE elution.
Mix thoroughly by a brief vortex for about 30 s. Prepare solution fresh before use. Store at 4 °C if necessary
but not for more than 6 h. Calculate the concentration of each folate vitamer, ρ in micrograms per millilitre
is1
using Formula (4):
V
ρρ= (4)
is1 is
V
where
V is 0,1 ml;
V is 1 ml.
5.4.6 Internal standard solution for calibration standards 2, ρ = 40,0 ng/ml each folate.
Take 12 ml of solvent for SPE elution in a scintillation vial or a 50 ml plastic centrifuge tube. Add 600 µl of
ammonium hydroxide (28 % to 30 %) (neutralized solvent for SPE elution). Mix. Prepare fresh before use.
To prepare an internal standard solution for calibration standards 2, pipette about 5 ml of neutralized
solvent for SPE elution into a 10 ml low actinic volumetric flask. Pipette 20,0 µl (ρ is approximately 20 µg/
ml of each folate) of the internal standard intermediate solution into the same 10 ml volumetric flask. Make
up volume to 10 ml with the neutralized solvent for SPE elution. Mix thoroughly. Prepare solution fresh
before use. If the next step has to be delayed, the solution can be stored at the lower temperature up to 6 h.
Alternatively, the solution can be prepared in advance and stored up to 6 h at 4 °C.
The concentration, in μg/ml, of each folate vitamer in the 40,0 ng/ml internal standard solution equals the
concentration, in μg/ml, of the 20 µg/ml internal standard solution times 0,020 0 ml, divided by 10 ml.
5.5 Preparation of calibration standard solutions
Prepare fresh before the analysis. Store at 4 °C if necessary but not for more than 6 h.
Take 12 ml of solvent for SPE elution in a scintillation vial or a 50 ml plastic centrifuge tube. Add 600 µl of
ammonium hydroxide (neutralized solvent for SPE elution). Mix. Prepare fresh before use. This solution is
also used as an instrument blank in analysis.
The calibration standard solutions are prepared as detailed in Table 1. Set up microfuge tubes labelled
calibration standard A through G separately. Standards A and B are prepared using folate
...
Norme
internationale
ISO 20631
Première édition
Préparations pour nourrissons
2023-12
et produits nutritionnels pour
adultes — Détermination de
la teneur en folates totaux par
extraction trienzymatique et
chromatographie liquide à ultra
performance (CLUHP) couplée à une
spectrométrie de masse en tandem
(SM/SM)
Infant formula and adult nutritionals — Determination of
total folate content by trienzyme extraction and ultra high
performance liquid chromatography tandem mass spectrometry
(UHPLC-MS/MS)
Numéro de référence
ISO 20631:2023(fr) © ISO 2023
PROJET FINAL
ISO 20631:2023(fr)
Norme
internationale
ISO/FDIS 20631.2
ISO/TC 34
Préparations pour nourrissons
Secrétariat: AFNOR
et produits nutritionnels pour
Début de vote:
adultes — Détermination de la teneur
2024-04-04
en folates totaux par extraction
Vote clos le:
trienzymatique et chromatographie
2024-05-30
liquide à ultra performance (CLUHP)
couplée à une spectrométrie de
masse en tandem (SM/SM)
Infant formula and adult nutritionals — Determination of
total folate content by trienzyme extraction and ultra high
performance liquid chromatography tandem mass spectrometry
(UHPLC-MS/MS)
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT
INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSERVATIONS,
NOTIFICATION DES DROITS DE PROPRIÉTÉ DONT ILS
AURAIENT ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À
FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE.
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS
© ISO 2023 INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET COM-MERCIALES,
AINSI QUE DU POINT DE VUE DES UTILISATEURS, LES
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PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE CONSIDÉRÉS
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
NORMES POUVANT
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Publié en Suisse Numéro de référence
ISO/FDIS 20631.2:2024(fr) © ISO 2024
ii
ISO/FDIS 20631.2:2024(fr)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d'application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 1
5 Réactifs et matériaux . 2
5.1 Liste de réactifs.2
5.2 Préparation du solvant pour solutions étalons .3
5.3 Préparation des solutions étalons de folates .4
5.4 Préparation des solutions mères d’étalons internes de folates .5
5.5 Préparation des solutions d’étalonnage .7
5.6 Préparation de la solution de substrat pour évaluer l’activité conjugase de plasma .8
5.7 Réactif pour l’analyse des folates .8
6 Appareillage . 10
7 Mode opératoire .11
7.1 Préparation des échantillons .11
7.1.1 Traitement des échantillons pour les rendre homogènes.11
7.1.2 Reconstitution de l'échantillon en poudre en liquide .11
7.2 Extraction .11
7.3 Purification des échantillons . 12
7.4 Analyse instrumentale . 12
7.4.1 Analyse du blanc d’instrument, des solutions d’étalonnage, du blanc de méthode
et des échantillons . 12
7.4.2 Conditions de CLUHP et paramètres de SM pour différents systèmes . 12
8 Calculs . 14
8.1 Calcul des rapports des aires de pics des vitamères de folates aux aires de pics des
étalons internes .14
8.2 Courbe d’étalonnage .14
8.3 Calcul de la concentration des vitamères de folates dans le blanc de méthode .14
8.4 Calcul de la concentration des vitamères de folates dans les échantillons .14
8.5 Calcul de la concentration des vitamères de folates et des folates totaux dans des
échantillons reconstitués ou RTF (µg/100 g) . 15
8.6 Calcul de la concentration de folates totaux dans les échantillons en poudre (μg/100 g)
en l'état .16
8.7 Calcul de la concentration d’acide folique (en nanogrammes) libéré lors du test de la
conjugase .16
8.8 Calcul du pourcentage de conversion du Pte-Glu3 en acide folique lors du test de la
conjugase .16
9 Fidélité . 17
9.1 Généralités .17
9.2 Répétabilité .17
9.3 Reproductibilité .17
Annexe A (informative) Données de fidélité . 19
Bibliographie .20
iii
ISO/FDIS 20631.2:2024(fr)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de propriété revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n'avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l'adresse
www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou partie de
tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion de
l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, en collaboration
avec l’AOAC INTERNATIONAL. Il est publié par l’ISO, et séparément par l’AOAC INTERNATIONAL. La méthode
décrite dans le présent document est l’équivalent de la méthode officielle de l’AOAC 2011.06, Total Folate in
Infant Formula and Adult Nutritionals by Trienzyme Extraction and LC-MS/MS Quantitation.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
PROJET FINAL Norme internationale ISO/FDIS 20631.2:2024(fr)
Préparations pour nourrissons et produits nutritionnels pour
adultes — Détermination de la teneur en folates totaux par
extraction trienzymatique et chromatographie liquide à ultra
performance (CLUHP) couplée à une spectrométrie de masse
en tandem (SM/SM)
1 Domaine d'application
Le présent document spécifie une méthode de détermination de la teneur en folates totaux dans les
préparations pour nourrissons et produits nutritionnels pour adultes par extraction trienzymatique et
chromatographie liquide à ultra haute performance (CLUHP) couplée à une spectrométrie de masse en
tandem (SM/SM).
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
produit nutritionnel pour adultes
aliment spécialement formulé, complet sur le plan nutritionnel, consommé sous forme liquide, qui peut
constituer la seule source d’alimentation, fabriqué à partir d’un mélange de lait, de soja, de riz, de lactosérum,
de protéine hydrolysée, d’amidon et d’acides aminés, avec et sans protéine intacte
3.2
préparation pour nourrissons
substitut du lait maternel spécialement fabriqué pour satisfaire à lui seul les besoins nutritionnels des
nourrissons pendant les premiers mois de leur vie, jusqu’à l’introduction d’une alimentation complémentaire
appropriée
[SOURCE: Codex Standard 72-1981]
4 Principe
Les folates présents dans un échantillon sont extraits dans un tampon (pH = 6,0) contenant des étalons
internes, par des traitements à la protéase, à l’amylase et à la conjugase de plasma de rat (digestion
trienzymatique). L’extrait est purifié et concentré par extraction en phase solide (SPE) avec échangeur
d’anions faibles (WAX). Les formes polyglutamates des folates présents dans l’échantillon sont déconjuguées
en monoglutamates pendant l’extraction, puis analysées par CLUHP-SM/SM. L’acide folique, le 5-méthyl-
tétrahydrofolate (5-CH -THF) et le 5-formyl-tétrahydrofolate (5-CHO-THF) sont quantifiés, et la teneur en
ISO/FDIS 20631.2:2024(fr)
folates totaux est estimée et exprimée sous forme d’acide folique. L’acide folique ( C-acide folique), le 5-CH -
13 13
THF ( C-5-CH THF) et le 5-CHO-THF ( C-5-CHO-THF) marqué aux isotopes sont utilisés comme étalons
3-
internes (IS).
5 Réactifs et matériaux
Pendant l’analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue,
et de l'eau distillée ou déminéralisée ou de l'eau d'une pureté équivalente.
Sauf spécification contraire, la plupart des produits chimiques utilisés sont de qualité CL-SM. Les références
et les fournisseurs des produits, lorsqu’ils sont énumérés, reflètent ceux utilisés lors de la validation. Des
produits chimiques équivalents peuvent être utilisés.
Tous les produits chimiques utilisés pendant la préparation des étalons ont été stockés à une température
minimale de –20 °C ou conformément aux instructions du fabricant. Étant donné que les vitamères de folates
sont photosensibles, tous les échantillons et étalons doivent être préparés, manipulés et stockés à l’abri
de la lumière ou sous un éclairage anti-lumière jaune ou sous filtre protégeant des UV. Si les étalons et les
échantillons doivent être transportés dans une zone, ou en passant par une zone, sans protection contre les
UV, ils doivent être totalement emballés dans une feuille d’aluminium.
Stocker les produits chimiques conformément aux lignes directrices du fabricant ou aux conventions
établies.
5.1 Liste de réactifs
1)
5.1.1 Acide folique (étalon) (FA), Schircks Laboratories, réf. 16.203 .
5.1.2 Acide (6R,S)-5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique (5-CH -THF), sel de calcium, Schircks
1)
Laboratories, réf. 16.235 .
5.1.3 Acide (6S)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique (5-CHO-THF), sel de calcium, Schircks
1)
Laboratories, réf. 16.221 .
5.1.4 Acide ptéroyltri-γ-L-glutamique (Triglutamate d’acide folique) (Pte-Glu3), Schircks
1)
Laboratories, réf. 16.253 .
1)
Ce réactif peut également provenir de Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada, réf. P840220 .
13 13 1)
5.1.5 Acide folique marqué au C (étalon interne) ( C -FA), IsoSciences, PA, réf. 14139 .
5 5
13 13
5.1.6 Acide (6S)-5-méthyltétrahydrofolique marqué au C ( C -CH -THF), sel de calcium (étalon
5 5 3
1)
interne), IsoSciences, PA, réf. 14168Ca .
13 13
5.1.7 Acide (6S)-5-formyltétrahydrofolique marqué au C ( C -CHO-THF), sel de calcium (étalon
5 5
1)
interne), Merck Cie .
Ce réactif peut également provenir d’asi chemicals, 1837 University Circle, Sci. Bldg, Rm. 308, Cheyney,
PA 19319, États-Unis. Web: www .asichemicals .com; e-mail: info@ asichemicals .com, Téléphone: 609-440-
1)
0020 . Disponible en conditionnement de 1 mg. Ce fournisseur propose également un kit regroupant les
trois étalons internes, en conditionnement de 1 mg chacun.
1)
5.1.8 α-Amylase d’Aspergillus oryzae, poudre, ≥ 150 unités/mg protéine, Sigma-Aldrich, réf. A9857 .
1) Les produits chimiques répertoriés ont été utilisés lors de l’étude de validation. Ces produits sont des exemples de
produits appropriés disponibles sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent
document et ne signifie nullement que l’ISO recommande l'emploi des produits ainsi désignés. Des produits équivalents
peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils aboutissent aux mêmes résultats.
ISO/FDIS 20631.2:2024(fr)
1)
5.1.9 Protéase de Bacillus licheniformis, Subtilisine A, poudre lyophilisée, Sigma-Aldrich, réf. P3910 .
5.1.10 Conjugase (plasma de rats Sprague Dawley mâles) avec lithium et héparine (non filtrée),
1)
BIOIVT, réf. RAT00PLLHMNN .
1)
Le réactif à base de plasma de rats peut également provenir d’Odin Bioscience , 1621 Central Ave., Cheyenne,
WY 82001, usainfo@ odinbioscience .com ou de Lampire Biological Laboratories, Pippersville, 18947. PA,
1)
États-Unis .
5.1.11 Solution d’hydroxyde d’ammonium, (certifiée ACS Plus) 28 % à 30 % (fraction massique),
1)
(ammoniaque), Fisher, réf. A669-500 .
5.1.12 Phosphate de sodium, dibasique anhydre (grains ou poudre/certifiée ACS, ≥ 99 %), Fisher,
1)
réf. S-374-500 .
1)
5.1.13 Méthanol, qualité Optima CL/SM, 99,9 % minimum, Fisher, réf. A456-4 .
1)
5.1.14 Acide acétique glacial, (certifié ACS), Fisher, réf. A38S-212 .
1)
5.1.15 Hydroxyde de sodium, (granulés/certifié ACS), ≥ 97 %, Fisher, réf. S318-1 .
1)
5.1.16 Acétate d’ammonium, (cristallin/certifié ACS), ≥ 97 %, Fisher, réf. A637-500 .
1)
5.1.17 2-Mercaptoéthanol, (qualité électrophorèse), ≥ 98 %, Fisher, réf. BP176-100; Sigma M6250 .
1)
5.1.18 Acide ascorbique, (poudre cristalline blanche), ≥ 99 %, Fisher, réf. BP351-500 .
1)
5.1.19 Tris-(2-carboxyéthyl)phosphine, chlorhydrate (TCEP-HCl), Fisher, réf. AC 363830100 .
1)
5.1.20 Charbon, (charbon actif Darco G-60), Fisher, réf. D127-500 .
1)
5.1.21 Acide formique, (qualité réactif), ≥ 95 %, eau ≤ 2,5 %, acide acétique < 1 %, Sigma F0507 .
1)
5.1.22 Eau, (haute pureté, appropriée pour la phase mobile pour CLHP), résistivité jusqu’à 18 MΩ·cm .
5.2 Préparation du solvant pour solutions étalons
−3
5.2.1 Solution stock de solvant, concentration c = 15,6 × 10 mol/l de tampon acétate d’ammonium avec
25 % d’acide ascorbique et 1 % de mercaptoéthanol, pH = 5,5.
Peser exactement 0,6 g ± 0,01 g d’acétate d’ammonium et transférer dans un bécher de 500 ml. Sous une
hotte aspirante, ajouter lentement environ 300 ml d’eau pour CLHP et 2,4 ml d’acide acétique glacial. Ajouter
125 g d’acide ascorbique et 5 ml de 2-mercaptoéthanol. Agiter pour dissoudre complètement. Ajuster le pH à
5,5 à l’aide d’hydroxyde d’ammonium concentré (28 % à 30 %). Transférer la solution dans une fiole jaugée
de 500 ml et compléter au volume (500 ml) avec de l’eau pour CLHP. Mélanger soigneusement.
−3
5.2.2 Solution de solvant intermédiaire, c = 1,6 × 10 mol/l de tampon acétate d’ammonium avec 1 %
d’acide ascorbique, pH = 5,5.
Peser exactement 0,12 g ± 0,001 g d’acétate d’ammonium et transférer dans un bécher de 1 l. Sous une hotte
aspirante, ajouter lentement environ 700 ml d’eau pour CLHP et 480 μl d’acide acétique glacial. Ajouter
10 g d’acide ascorbique et agiter jusqu’à dissolution complète. Ajuster le pH à 5,5, si nécessaire, à l’aide
d’hydroxyde d’ammonium concentré. Transférer la solution dans une fiole jaugée de 1 l et compléter au
volume avec de l’eau pour CLHP. Mélanger soigneusement.
ISO/FDIS 20631.2:2024(fr)
5.2.3 Solvant pour élution SPE et étalons de folates, méthanol avec 10 % d’acide formique et 1 % d’acide
ascorbique.
Transférer 1 g d’acide ascorbique et 10 ml d’acide formique concentré dans une fiole jaugée de 100 ml.
Ajouter environ 50 ml de méthanol. Passer aux ultrasons, dans un bain-marie (à température ambiante),
jusqu’à dissolution complète (nécessite généralement 2 min environ). Porter à un volume de 100 ml avec du
méthanol. Mélanger soigneusement.
Utiliser cette solution pour éluer les folates de la cartouche SPE après purification, ainsi que pour réaliser les
étalons analytiques et également le blanc lors de l’analyse par CL-SM/SM. Préparer une nouvelle solution le
jour de l’utilisation.
5.3 Préparation des solutions étalons de folates
5.3.1 Solutions étalons mères de folates, concentration massique ρ = 500 µg/ml.
Peser exactement, pour chacune des molécules suivantes, environ 25 mg d’acide folique, de 5-CH -THF, de
5-CHO-THF et de Pte-Glu3 dans des fioles jaugées inactiniques de 50 ml, spécifiques à chaque molécule.
Ajouter environ 35 ml de la solution stock de solvant dans chaque fiole et passer aux ultrasons, dans un
bain-marie, pendant environ 1 min jusqu'à dissolution complète des folates. Ajouter la quantité minimale de
solution d’hydroxyde d'ammonium (28 % à 30 %) afin de faciliter la dissolution de l’acide folique. Cela peut
représenter environ 30 gouttes à 48 gouttes (1,5 ml à 2,4 ml). Compléter à 50 ml avec la solution stock de
solvant dans chacune des fioles et mélanger le contenu.
Transférer les solutions dans des flacons en verre capables de préserver leur intégrité à la faible température
fixée. L’utilisation de flacons en plastique ne présente pas d’avantages concrets lors du stockage. Stocker à
–20 °C ou moins (c’est-à-dire –70 °C pour une meilleure stabilité). Les solutions étalons mères de folates
(acide folique, 5-CHO-THF et Pte-Glu3) stockées à –70 °C sont stables pendant six mois, et la solution de
5-CH -THF pendant trois mois. Les solutions stockées à –20 °C sont stables pendant 30 jours.
Calculer la concentration exacte de chaque solution mère des molécules de folates après ajustement de la
teneur en humidité de la molécule et de la pureté (par CLHP) présente sur le certificat correspondant du
fournisseur. L’acide folique peut avoir une teneur en humidité capable d’atteindre 7,9 %, tandis que celle
du 5-formyl-THF peut atteindre 14,9 %. La pureté (par CLHP) des molécules de folates est habituellement
comprise entre 98 % et 99 %. Les molécules 5-CH -THF et 5-CHO-THF utilisées sont souvent sous forme de
sels de calcium.
Calculer la concentration des solutions étalons mères, ρ , en microgrammes par millilitre, sous forme non
ss
saline, d’après les différences de leurs masses moléculaires respectives, à l’aide de la Formule (1):
()mP× × 10
()
s M
rsff
ρ = × (1)
ss
V M
rf
où
m est la masse de l’étalon, en grammes, par exemple m = 0,025 g;
s s
P est la pureté de l’analyte et la teneur en humidité, par exemple P = 90 % ou P = 0,9 g/g;
V est le volume final, en millilitres, par exemple V = 50 ml;
M est la masse moléculaire du folate sous forme non saline;
rsff
M est la masse moléculaire du sel de folate utilisé.
rf
ISO/FDIS 20631.2:2024(fr)
Par exemple, avec les valeurs ci-dessus et une masse moléculaire du 5-CHO-THF, sous forme non saline,
de 473,4 et une masse moléculaire de 5-CHO-THF, sous forme de sel de calcium, de 511,5, le calcul selon la
Formule (1) pour ρ (sous forme non saline) est:
ss
()0,,025×09 × 10
()
473,4
ρ = ×=416,5
ss
50 511 5
,
5.3.2 Solution étalon intermédiaire de folates, ρ = 20 µg/ml.
Ajouter environ 5 ml de solution de solvant intermédiaire dans une fiole jaugée inactinique de 10 ml. Ajouter
exactement 0,4 ml de chacune des solutions étalons mères (5.3.1) de FA, de 5-CH -THF et de 5-CHO-THF
dans cette même fiole. Compléter jusqu’à un volume de 10 ml avec la solution de solvant intermédiaire et
mélanger le contenu.
Calculer la concentration de chaque vitamère de folates dans la solution étalon intermédiaire, ρ , en
is
microgrammes par millilitre, à l’aide de la Formule (2):
ρ ×V
()
ss 1
ρ = (2)
is
V
où
V est égal à 0,4 ml;
V est égal à 10 ml.
La solution étalon intermédiaire de folates peut être stockée à –20 °C pendant 30 jours et peut être stable
pendant trois mois à –70 °C.
5.4 Préparation des solutions mères d’étalons internes de folates
5.4.1 Solution mère d’étalon interne d’acide folique marqué au C , ρ = 1 mg/ml.
La molécule est souvent fournie dans une quantité de 1 mg. Dissoudre la totalité (1 mg) d’acide folique
marqué dans 1 ml de solution stock de solvant. L’acide folique est difficile à dissoudre. L’ajout de 10 µl
de solution d’hydroxyde d'ammonium (28 % à 30 %) facilite la dissolution. Le cas échéant, une quantité
supérieure peut être utilisée pour produire une solution mère d’une concentration finale d’environ 1 mg/ml.
Le passage aux ultrasons et au vortex pendant 1 min à 2 min peut faciliter la dissolution complète.
5.4.2 Solution mère d’étalon interne de (6S)-5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofolate marqué au C ,
ρ = 1 mg/ml.
Le méthyl-THF marqué peut être fourni dans une quantité de 1 mg. Dissoudre la totalité (1 mg) de méthyl-
THF marqué dans 1 ml de solution stock de solvant. Le cas échéant, une quantité supérieure peut être utilisée
pour produire une solution mère d’une concentration finale d’environ 1 mg/ml. Dissoudre entièrement le
produit chimique avec l’aide du vortex et d’un bref passage aux ultrasons (30 s).
5.4.3 Solution mère d’étalon interne de (6S)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofolate marqué au C ,
ρ = 1 mg/ml.
Peser environ 10 mg de formyl-THF marqué dans une fiole jaugée de 10 ml. Ajouter environ 7 ml de solution
stock de solvant. Dissoudre entièrement le produit chimique avec l’aide du vortex et d’un bref passage aux
ultrasons (30 s). Compléter jusqu’au volume de 10 ml avec la solution stock de solvant et mélanger la solution.
Les solutions mères d’étalons internes de folates mentionnées en 5.4.1, 5.4.2 et 5.4.3 si elles sont stockées à
−70 °C, l’acide folique et le 5-CHO-THF peuvent être stables pendant six mois et le 5-CH -THF pendant trois
mois. Les solutions peuvent être stables moins longtemps si elles sont stockées à –20 °C.
ISO/FDIS 20631.2:2024(fr)
Il convient de calculer la concentration de chaque solution mère d'étalons internes après ajustement de leur
pureté respective (d’après le certificat du fabricant).
5.4.4 Solution intermédiaire d’étalons internes en mélange, ρ = 20 μg/ml de chaque folate.
Transférer environ 5 ml de solution de solvant intermédiaire dans une fiole jaugée inactinique de 10 ml.
13 13
Transférer exactement 0,2 ml de chaque solution mère d’étalons internes, c’est-à-dire C -FA (5.4.1), C -
5 5
CH -THF (5.4.2) et C -CHO-THF (5.4.3) dans cette même fiole jaugée de 10 ml. Compléter à 10 ml avec la
3 5
solution de solvant intermédiaire. Mélanger soigneusement la solution.
Calculer les concentrations réelles de chaque étalon interne ρ , en microgrammes par millilitre, à l’aide de
iis
la Formule (3):
()ρ ×V
ss 1
ρ = (3)
iis
V
où
ρ est la concentration de la solution intermédiaire d’étalons internes après ajustement de la pureté;
iis
V est égal à 0,2 ml;
V est égal à 10 ml.
La solution intermédiaire d'étalons de folates peut être stockée à –20 °C pendant 30 jours et peut être stable
pendant trois mois à –70 °C.
5.4.5 Solution d'étalons internes pour l’étalonnage 1, ρ = 2 µg/ml de chaque étalon interne de folate.
Transférer 20 ml de solvant pour élution SPE (5.2.3) dans un tube à centrifuger de 50 ml. Ajouter 1 ml
d’hydroxyde d’ammonium (28 % à 30 %) et mélanger (solvant neutralisé pour élution SPE). À préparer
immédiatement avant utilisation.
À l’aide d'une pipette, transférer 100 µl de la solution intermédiaire d'étalons internes en mélange
(ρ d’environ 20 µg/ml) (5.4.4) dans un tube de microcentrifugation. Ajouter exactement 900 µl du solvant
neutralisé fraîchement préparé pour élution SPE.
Mélanger soigneusement en créant un bref vortex pendant environ 30 s. Préparer la solution immédiatement
avant utilisation. Stocker à 4 °C, si nécessaire mais pendant pas plus de 6 h. Calculer la concentration de
chaque vitamère de folates, ρ en microgrammes par millilitre, à l’aide de la Formule (4):
is1
V
ρρ= (4)
is1 is
V
où
V est égal à 0,1 ml;
V est égal à 1 ml.
5.4.6 Solution d'étalons internes pour l’étalonnage 2, ρ = 40,0 ng/ml de chaque folate.
Transférer 12 ml de solvant pour élution SPE dans un flacon à scintillation ou dans un tube à centrifuger en
plastique de 50 ml. Ajouter 600 µl d’hydroxyde d’ammonium (28 % à 30 %) (solvant neutralisé pour élution
SPE). Mélanger. À préparer immédiatement avant utilisation.
Pour préparer une solution d'étalons internes pour l’étalonnage 2, à l’aide d'une pipette, transférer environ
5 ml de solvant neutralisé pour élution SPE dans une fiole jaugée inactinique de 10 ml. À l’aide d'une pipette,
transférer 20,0 µl (ρ d’environ 20 µg/ml de chaque folate) de la solution intermédiaire d'étalons internes,
dans cette même fiole jaugée de 10 ml. Compléter jusqu’au volume de 10 ml avec le solvant neutralisé pour
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élution SPE. Mélanger soigneusement. Préparer la solution immédiatement avant utilisation. Si l’étape
suivante doit être différée, la solution peut être stockée à une température moins élevée pendant 6 h. La
solution peut également être préparée à l’avance et stockée pendant 6 h à 4 °C.
La concentration, en μg/ml, de chaque vitamère de folates dans la solution d'étalons internes à 40,0 ng/ml
équivaut à la concentration, en μg/ml, de la solution d'étalons internes à 20 µg/ml multipliée par 0,020 0 ml,
divisée par 10 ml.
5.5 Préparation des solutions d’étalonnage
À préparer immédiatement avant analyse. Stocker à 4 °C, si nécessaire mais pendant pas plus de 6 h.
Transférer 12 ml de solvant pour élution SPE dans un flacon à scintillation ou dans un tube à centrifuger
en plastique de 50 ml. Ajouter 600 µl d’hydroxyde d’ammonium (solvant neutralisé pour élution SPE).
Mélanger. À préparer immédiatement avant utilisation. Cette solution est également utilisée comme blanc
d'instrument lors de l’analyse.
Les solutions d'étalonnage sont préparées comme décrit dans le Tableau 1. Installer des tubes à centrifuger
référencés de A à G comme solutions d'étalonnage. Les solutions d'étalonnage A et B sont préparées en
utilisant la solution étalon intermédiaire de folates tandis que les solutions d'étalonnage C à G sont préparées
en diluant des solutions étalons plus concentrées.
Ajouter le volume de solution étalon intermédiaire de folates comme indiqué dans le Tableau 1 dans les tubes
d'étalonnage correspondants A et B. Ajouter 20 µl de la solution d'étalons internes à 2 µg/ml (5.4.5) dans les
tubes A et B. Ajouter le solvant d’élution neutralisé dans les tubes A et B comme indiqué dans le Tableau 1.
Fermer les tubes et mélanger soigneusement en créant un bref vortex pendant environ 20 s.
Préparer les solutions d’étalonnage C à G en effectuant les dilutions indiquées dans le Tableau 1 qui répertorie
les solutions d'étalonnage. À l’aide d'une pipette, transférer le volume indiqué de la solution d'étalonnage
spécifiée. Compléter jusqu’au volume de 1 ml avec la solution d'étalons internes à 40,0 ng/ml (5.4.6) comme
indiqué dans le Tableau 1. Fermer les tubes et mélanger soigneusement en créant un bref vortex pendant
environ 20 s.
Calculer la concentration exacte de chaque vitamère de folates, y compris l’étalon interne, dans chaque
solution d'étalonnage, en suivant la dilution de la solution étalon intermédiaire ou de l’étalon correspondant
dans la solution, et de la solution d'étalons internes utilisée.
Tableau 1 — Préparation des solutions d’étalonnage à base de folates
Volume de Volume de Concentration
Volume
Volume de solution éta- solution solution de chaque vita-
de solvant Volume
Solution d'éta- lon intermédiaire/solu- d'étalons d'étalons mère de folates
d’élution final
lonnage tion d'étalonnage internes 1 internes 2 dans la solution
neutralisé ml
μl (5.4.5) (5.4.6) d’étalonnage
μl
μl μl ng/ml
a
A 25 20 0 955 1,0 500
a
B 10 20 0 970 1,0 200
b f
C 100 0 900 0 1,0 50
c f
D 100 0 900 0 1,0 20
d f
E 100 0 900 0 1,0 5
NOTE La concentration d’étalons internes dans chaque solution d'étalonnage (A à G) est de 40 ng/ml de chaque folate.
a
Quantité de solution étalon intermédiaire.
b
Quantité de solution d'étalonnage A.
c
Quantité de solution d’étalonnage B.
d
Quantité de solution d’étalonnage C.
e
Quantité de solution d’étalonnage D.
f
Quantité de solution d'étalons internes pour l’étalonnage 2.
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TTabableleaauu 1 1 ((ssuuiitte)e)
Volume de Volume de Concentration
Volume
Volume de solution éta- solution solution de chaque vita-
de solvant Volume
Solution d'éta- lon intermédiaire/solu- d'étalons d'étalons mère de folates
d’élution final
lonnage tion d'étalonnage internes 1 internes 2 dans la solution
neutralisé ml
μl (5.4.5) (5.4.6) d’étalonnage
μl
μl μl ng/ml
e f
F 100 0 900 0 1,0 2
e f
G 50 0 950 0 1,0 1
NOTE La concentration d’étalons internes dans chaque solution d'étalonnage (A à G) est de 40 ng/ml de chaque folate.
a
Quantité de solution étalon intermédiaire.
b
Quantité de solution d'étalonnage A.
c
Quantité de solution d’étalonnage B.
d
Quantité de solution d’étalonnage C.
e
Quantité de solution d’étalonnage D.
f
Quantité de solution d'étalons internes pour l’étalonnage 2.
5.6 Préparation de la solution de substrat pour évaluer l’activité conjugase de plasma
5.6.1 Solution de substrat pour évaluer l’activité conjugase, ρ = 20 μg/ml de Pte-Glu3.
Ajouter environ 5 ml de solution de solvant intermédiaire dans une fiole jaugée inactinique de 10 ml. À l’aide
d’une pipette, transférer 0,4 ml de solution mère de Pte-Glu3 (500 μg/ml). Compléter jusqu’au volume de
10 ml avec la solution de solvant intermédiaire. Mélanger soigneusement. Stocker à –20 °C pendant un mois;
peut être stable plus longtemps en cas de stockage à –70 °C.
5.7 Réactif pour l’analyse des folates
5.7.1 Solution de protéase, ρ = 2 mg/ml.
À préparer immédiatement avant utilisation. Stocker entre 4 °C et 8 °C, si nécessaire mais pendant pas plus
de 4 h. Dissoudre 0,05 g de protéase dans 25 ml d’eau dans un bécher ou une fiole conique de 100 ml en
effectuant un mélange adéquat. Chaque échantillon nécessite 1 ml.
5.7.2 Solution d’α-amylase, ρ = 20 mg/ml; environ 300 unités/ml.
À préparer immédiatement avant utilisation. Stocker entre 4 °C et 8 °C, si nécessaire mais pendant pas plus
de 4 h. Dissoudre 0,5 g dans environ 20 ml d’eau dans une fiole jaugée ou un tube à centrifuger de 25 ml.
Compléter jusqu’au volume de 25 ml. Mélanger doucement pour que le mélange soit complet. S’assurer
qu’aucune mousse ne se développe.
Transférer la solution d’amylase dans un tube à centrifuger de 50 ml si elle n’y est pas encore. Traiter la
solution d’amylase avec du charbon. Ajouter 20 mg de charbon par millilitre de solution (0,5 g dans 25 ml).
Mélanger doucement avec un mélangeur vortex pendant environ 45 s. Laisser reposer pendant 5 min entre
4 °C et 8 °C. Filtrer à travers un filtre-seringue en PVDF de 0,45 µm. Chaque échantillon nécessite 1 ml.
5.7.3 Conjugase de plasma de rats mâles
Le plasma est conservé congelé à –20 °C ou moins jusqu’à ce qu’il soit utilisé. Contrôler la viabilité du plasma
stocké pendant plus de trois mois. Éviter de congeler-décongeler plusieurs fois le plasma pour ne pas qu’il
perde son activité conjugase. Un plasma non soumis à des opérations répétées de congélation-décongélation
conservera généralement la majeure partie de son activité conjugase même après 6 mois de stockage à
–20 °C. Décongeler le plasma conformément aux exigences. Traiter le plasma avec 20 mg de charbon par
millilitre. Transférer 5 ml de plasma dans un tube. Ajouter 100 mg de charbon. Mélanger doucement avec un
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mélangeur vortex pendant environ 30 s. Laisser reposer pendant 5 min entre 4 °C et 8 °C. Filtrer à travers
un filtre-seringue en PVDF. Environ 4,2 ml de plasma sont généralement obtenus à partir des 5 ml après
traitement au charbon. À préparer extemporanément. Stocker entre 4 °C et 8 °C, si nécessaire mais pendant
pas plus de 4 h. Chaque échantillon nécessite 0,3 ml de plasma traité au charbon. L’efficacité de la conjugase
doit être déterminée avant utilisation mais une seule fois pour chaque nouveau lot de plasma.
Pour contrôler l’efficacité de la conjugase de plasma de rats:
— ajouter 30 μl de solution de conjugase dans un tube à centrifuger de 50 ml avec 10 ml de tampon
d’extraction (contenant uniquement l’étalon interne d’acide folique marqué au C , 4 ng/ml) et 50 μl
de solution TCEP. Mélanger avec un mélangeur vortex (tube de réaction). Pour le test de la conjugase,
ajouter 30 µl de solution de solvant intermédiaire dans un autre tube à centrifuger de 50 ml avec 10 ml
de tampon d’extraction et 50 µl de solution TCEP. Mélanger avec un mélangeur vortex. Ajouter 300 μl
de conjugase traitée au charbon dans les deux tubes, remplir l’espace de tête avec de l’azote, couvrir et
incuber pendant 16 h dans un bain-marie vibrant à 37 °C et à une vitesse d’agitation de 60 r/min. Suivre
les étapes 7 à 15 du mode opératoire d’analyse des folates. La quantité d’acide folique libérée sous l’action
de la conjugase dans le tube de réaction et qui est présente dans la solution d’essai est déterminée en
suivant la méthode d’analyse en commençant par 7.3 (purification de l’extrait) et en poursuivant avec
l’analyse instrumentale (7.4) et les calculs expliqués à l’Article 8;
— à l’aide du résultat obtenu et de la concentration du Pte-Glu3 dans la solution d’essai préparée, déterminer
la conversion du Pte-Glu3 en acide folique. La conjugase est jugée apte à l’utilisation si la conversion du
Pte-Glu3 en acide folique est ≥ 90 %. Le protocole de calcul de la conversion du Pte-Glu3 en acide folique
est indiqué à l’Article 8.
5.7.4 Solution de TCEP, c = 1 mol/l.
Dissoudre 1 g de TCEP-HCl dans 3,5 ml d’eau dans un tube à essai ou un flacon.
−3
5.7.5 Tampon d’extraction, c = 10 × 10 mol/l de tampon phosphate, 1 % d’acide ascorbique, pH = 6,0.
Peser 0,355 g de phosphate de sodium dibasique anhydre, Na HPO , dans un bécher de 250 ml. Ajouter
2 4
2,5 g d’acide ascorbique et environ 200 ml d’eau pour CLHP. Agiter jusqu’à dissolution complète. À l’aide de
la solution d’acide phosphorique et/ou d’hydroxyde de sodium (c = 10 mol/l de NaOH), ajuster le pH à 6,0.
Transférer dans une fiole jaugée de 250 ml et diluer au volume avec de l’eau pour CLHP. Mélanger. Cette
solution peut être stockée à 4 °C pendant 5 jours.
−3
5.7.6 Tampon d’extraction avec les étalons internes, c = 10 × 10 mol/l de tampon phosphate, 1 %
d’acide ascorbique, pH = 6,0, étalons internes = 4 ng/ml de chaque folate.
Ajouter exactement 0,05 ml de la solution intermédiaire d'étalons internes à 20 µg/ml à 250 ml de tampon.
Mélanger soigneusement. La concentration des étalons internes est de 4 ng/ml de chaque folate. Préparer
une nouvelle solution chaque jour avant utilisation. Stocker à 4 °C, si nécessaire mais pendant pas plus de
6 h, après l’ajout d’étalons internes. Chaque échantillon nécessite 10 ml de tampon d’extraction.
5.7.7 Tampon d’extraction avec uniquement l’étalon interne d’acide folique pour contrôler
−3
l’efficacité de la conjugase de plasma de rats, c = 10 × 10 mol/l de tampon phosphate, 1 % d’acide
ascorbique, pH = 6,0, étalon interne d’acide folique = 4 ng/ml.
Cela nécessite d’abord une préparation d’une solution intermédiaire d'étalon interne d’acide folique
(uniquement), ρ = 20 μg/ml d’acide folique. Transférer environ 5 ml de solution de solvant intermédiaire
dans une fiole jaugée inactinique de 10 ml. Transférer exactement 0,2 ml de la solution mère d'étalon interne
d’acide folique, c’est-à-dire C -FA (5.4.1) dans une fiole jaugée de 10 ml. Compléter jusqu’au volume de 10 ml
avec la solution de solvant intermédiaire. Mélanger soigneusement la solution. Calculer la concentration
réelle d’étalon interne d’acide folique, ρ , en microgrammes par millilitre, d’après la Formule (3) en
iisf
effectuant le changement suivant pour limiter le calcul à l’acide folique (remplacer ρ , ρ ). Où ρ est la
iis iisf iisf
concentration de la solution intermédiaire d'étalon interne d’acide folique après ajustement de la pureté.
ISO/FDIS 20631.2:2024(fr)
Ajouter exactement 0,05 ml de la solution intermédiaire d'étalon interne d’acide folique à 20 µg/ml, préparée
comme décrit ci-dessus, à 250 ml de tampon d’extraction (5.7.5). Mélanger soigneusement. Concentration
de l’étalon interne d’acide folique = 4 ng/ml. Préparer une nouvelle solution chaque jour avant utilisation.
Stocker à 4 °C, si nécessaire mais pendant pas plus de 6 h, après l’ajout de l’étalon interne d’acide folique.
Chaque analyse visant à contrôler l’efficacité de la conjugase du plasma de rats nécessite 10 ml de tampon
d’extraction contenant l’étalon interne d’acide folique.
5.7.8 Phase mobi
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
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