ISO 20046:2019
(Main)Radiological protection — Performance criteria for laboratories using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) translocation assay for assessment of exposure to ionizing radiation
Radiological protection — Performance criteria for laboratories using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) translocation assay for assessment of exposure to ionizing radiation
The purpose of this document is to provide criteria for quality assurance (QA), quality control (QC) and evaluation of the performance of biological dosimetry by cytogenetic service laboratories. This document addresses: a) the responsibilities of both the customer and the laboratory; b) the confidentiality of personal information, for the customer and the laboratory; c) the laboratory safety requirements; d) sample processing; culturing, staining and scoring, including the criteria for scoring for translocation analysis by FISH; e) the calibration sources and calibration dose ranges useful for establishing the reference dose‑response curves that contribute to the dose estimation from chromosome aberration frequency and the detection limit; f) the scoring procedure for translocations stained by FISH used for evaluation of exposure; g) the criteria for converting a measured aberration frequency into an estimate of absorbed dose (also appears as "dose"); h) the reporting of results; i) the QA and QC; j) Annexes A to F containing sample instructions for the customer, sample questionnaire, sample datasheet for recording aberrations, sample of report and fitting of the low dose-response curve by the method of maximum likelihood and calculating the uncertainty of dose estimate.
Radioprotection — Critères de performance pour les laboratoires utilisant l'analyse des translocations visualisées par hybridation in situ fluorescente (FISH) pour évaluer l'exposition aux rayonnements ionisants
L'objectif du présent document est de fournir des critères pour l'assurance de la qualité (AQ), le contrôle de la qualité (CQ) et l'évaluation des performances des laboratoires de service pratiquant la dosimétrie biologique par cytogénétique. Le présent document aborde: a) les responsabilités du demandeur et du laboratoire; b) la confidentialité des informations personnelles pour le demandeur et le laboratoire; c) les exigences de sécurité du laboratoire; d) le traitement des échantillons, la culture, la coloration et le dénombrement, y compris les critères de dénombrement pour l'analyse des translocations par FISH; e) les sources de calibration et les gammes de doses de calibration utiles pour établir les courbes dose-effet de référence qui contribuent à l'estimation dosimétrique à partir de la fréquence des aberrations chromosomiques et la limite de détection; f) la procédure de dénombrement des translocations colorées par FISH utilisée pour l'évaluation de l'exposition; g) les critères pour convertir une fréquence mesurée d'aberrations en une estimation de dose absorbée (également dénommée «estimation dosimétrique»); h) la présentation des résultats; i) l'AQ et le CQ; j) les Annexes A à F contenant des exemples d'instructions pour le traitement du prélèvement par le demandeur, de questionnaire, de tableau type pour le dénombrement des aberrations chromosomiques, de rapport et d'ajustement de la courbe dose-effet par la méthode du maximum de vraisemblance et de calcul de l'incertitude sur l'estimation de la dose absorbée.
General Information
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20046
First edition
2019-03
Radiological protection —
Performance criteria for laboratories
using Fluorescence In Situ
Hybridization (FISH) translocation
assay for assessment of exposure to
ionizing radiation
Radioprotection — Critères de performance pour les laboratoires
utilisant l'analyse des translocations visualisées par hybridation in
situ fluorescente (FISH) pour évaluer l'exposition aux rayonnements
ionisants
Reference number
©
ISO 2019
© ISO 2019
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address
below or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: +41 22 749 01 11
Fax: +41 22 749 09 47
Email: copyright@iso.org
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2019 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .v
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Translocation assay by FISH . 5
4.1 General . 5
4.2 Culturing and fixation . 5
4.3 Types of staining. 5
4.4 Scoring . . 6
4.5 General requirement of the laboratory . 6
5 Responsibility of the customer . 6
6 Responsibility of the laboratory . 7
6.1 Setup and sustainment of the QA program . 7
6.2 Responsibility during service . 7
7 Confidentiality of personal information . 8
7.1 Overview . 8
7.2 Applications of the principle of confidentiality . 8
7.2.1 Delegation of responsibilities within the laboratory. 8
7.2.2 Requests for analysis . 9
7.2.3 Transmission of confidential information . 9
7.2.4 Anonymity of samples . 9
7.2.5 Reporting of results . 9
7.2.6 Storage of data and results . 9
8 Laboratory safety requirements . 9
8.1 Overview . 9
8.2 Microbiological safety requirements .10
8.3 Chemical safety requirements .10
8.4 Optical safety requirements .11
8.5 Safety plan .11
9 Sample processing .11
9.1 Culturing and staining .11
9.2 Scoring . .12
9.2.1 Criteria for scoring .12
9.2.2 Conversion of translocation frequencies to genome equivalence .12
10 Background levels of translocations .13
11 Calibration curves .14
11.1 Calibration source(s) .14
11.2 Establishment of calibration curve(s) .14
12 Criteria for converting a measured aberration frequency into an estimate of
absorbed dose .16
12.1 Determination of estimated whole-body absorbed dose and confidence limits .16
12.1.1 General.16
12.1.2 Comparison with the background level: Characterisation of the minimum
detectable dose.16
12.1.3 Confidence limits on the number of translocations .19
12.1.4 Adjustment for background yield .20
12.1.5 Calculation of absorbed dose .21
12.1.6 Calculation of uncertainty on absorbed dose .22
12.1.7 Acute and non-acute exposure cases.22
12.1.8 Other exposure scenarios .23
13 Reporting of results .23
13.1 General .23
13.2 Content of the report (see Annex C for an example of a standard form) .23
13.3 Interpretation of the results .24
14 Quality assurance and quality control .24
14.1 Overview .24
14.2 Specific requirements .24
14.2.1 General.24
14.2.2 Performance checks by inter-laboratory comparisons .24
14.2.3 Performance check of scorer qualification .25
14.2.4 Performance checks of sample transport integrity .25
14.2.5 Performance checks of sample integrity by service laboratory .26
14.2.6 Performance checks of instrumentation .26
14.2.7 Performance checks of sample protocol .26
14.2.8 Performance checks of sample scoring .26
14.2.9 Performance checks of result report generation .26
Annex A (informative) Sample instructions for customer .27
Annex B (informative) Sample questionnaire .29
Annex C (informative) Sample of report .31
Annex D (informative) Sample data sheets for recording painted aberrations .32
Annex E (informative) Fitting of the dose response-curve by the method of maximum
likelihood and calculating the uncertainty of the absorbed dose estimate .34
Annex F (informative) Process for dose estimation.35
Bibliography .40
iv © ISO 2019 – All rights reserved
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: www .iso .org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 85, Nuclear energy, nuclear technologies
and radiological protection, Subcommittee SC 2, Radiological protection.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
Introduction
The purpose of this document is to define the use of fluorescent in situ hybridization (FISH) for
chromosome translocation analysis on human peripheral blood lymphocytes for biological dosimetry
of exposure to ionizing radiation. Biological dosimetry, based on the study of chromosomal aberrations,
mainly the dicentric assay, has become a routine component of accidental dose assessment. Dicentric
aberrations, however, disappear with time after exposure, making this assay useful only in the short
term after exposure. Translocations, however, are more stable, allowing dose estimates to be made long
times after exposure or after protracted exposures.
This document provides a guideline for performing the translocation assay by FISH for dose assessment
using documented and validated procedures. The minimum requirements for testing translocation
yield in peripheral blood lymphocytes, by precisely defining the technical aspects of staining
chromosomes (number of chromosomes and types of painting), selecting types of aberrations and
cells, scoring aberrations, converting aberration yield to dose, statistical considerations, problems
related to heterogeneous, chronic or delayed exposures and extrapolation to full genome are described.
Dose assessment using the FISH assay has relevance in medical management, radiation-protection
management, record keeping, and medical/legal requirements.
A part of the information in this document is contained in other international guidelines and scientific
publications, primarily in the International Atomic Energy Agency’s (IAEA) technical reports series
on biological dosimetry. However, this document expands and standardizes the quality assurance and
quality control and the evaluation of performance.
vi © ISO 2019 – All rights reserved
INTERNATIONAL STANDARD ISO 20046:2019(E)
Radiological protection — Performance criteria for
laboratories using Fluorescence In Situ Hybridization
(FISH) translocation assay for assessment of exposure to
ionizing radiation
1 Scope
The purpose of this document is to provide criteria for quality assurance (QA), quality control (QC) and
evaluation of the performance of biological dosimetry by cytogenetic service laboratories.
This document addresses:
a) the responsibilities of both the customer and the laboratory;
b) the confidentiality of personal information, for the customer and the laboratory;
c) the laboratory safety requirements;
d) sample processing; culturing, staining and scoring, including the criteria for scoring for
translocation analysis by FISH;
e) the calibration sources and calibration dose ranges useful for establishing the reference
dose-response curves that contribute to the dose estimation from chromosome aberration
frequency and the detection limit;
f) the scoring procedure for translocations stained by FISH used for evaluation of exposure;
g) the criteria for converting a measured aberration frequency into an estimate of absorbed dose
(also appears as “dose”);
h) the reporting of results;
i) the QA and QC;
j) Annexes A to F containing sample instructions for the customer, sample questionnaire, sample
datasheet for recording aberrations, sample of report and fitting of the low dose-response curve by
the method of maximum likelihood and calculating the uncertainty of dose estimate.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at https: //www .electropedia .org/
3.1
absorbed dose
D
quantity of ionizing radiation energy imparted per unit mass of a specified material
3.2
acentric
terminal or interstitial chromosome fragment of varying size lacking a centromere, referred to as an
excess acentric fragment when it is formed independently of a dicentric or centric ring chromosome
aberration
3.3
anticoagulant
drug which prevents blood from clotting
3.4
background frequency/level
spontaneous frequency (or number) of chromosome aberrations recorded in a general population
3.5
buffy coat
layer of an anticoagulated blood sample after centrifugation that contains most of the white blood cells
3.6
calibration curve
graphical or mathematical description of the dose effect relation derived by the in vitro irradiation of
blood samples to known absorbed doses
Note 1 to entry: The curve is used to determine, by interpolation, the absorbed radiation dose to a potentially
exposed individual.
3.7
centromere
specialized constricted region of a chromosome that appears during mitosis and joins together the
chromatid pair
3.8
chromatid
either of the two strands of a duplicated chromosome that are joined by a single centromere and
separate during cell division to become individual chromosomes
3.9
chromosome
structure comprised of discrete packages of DNA and proteins that carries genetic information, which
condense to form characteristically shaped bodies during nuclear division
3.10
chromosome aberration
change in the normal structure of a chromosome involving both chromatids of a single chromosome at
the same locus as observed in metaphase
3.11
colcemid
alkaloid compound that inhibits spindle formation during cell division
Note 1 to entry: It is used to collect a large number of metaphase cells by preventing them from progressing to
anaphase.
2 © ISO 2019 – All rights reserved
3.12
complex aberration
aberration involving three or more breaks in two or more chromosomes and is characteristically
induced after exposure to densely ionizing radiation or high doses of sparsely ionizing radiation
3.13
confidence interval
range within which the true value of a statistical quantity lies with a specified probability
3.14
covariance
measure of the correlation of the variance between two (or more) dependent sets of data or parameters
3.15
decision threshold
value of the estimator of the measurand, which when exceeded by the result of the actual measurement
using a given measurement procedure of a measurand quantifying a physical effect, one decides that
the physical effect is present
Note 1 to entry: The decision threshold is defined such that in cases where the measurement result, y, exceeds
the decision threshold, y*, the probability that the true value of the measurand is zero is less or equal to a chosen
probability, α.
Note 2 to entry: If the result, y, is below the decision threshold, y*, the result cannot be attributed to the physical
effect; nevertheless it cannot be concluded that it is absent.
3.16
detection limit
smallest true value of the measurand which ensures a specified probability of being detectable by the
measurement procedure
Note 1 to entry: With the decision threshold (3.15), the detection limit is the smallest true value of the measurand
for which the probability of wrongly deciding that the true value of the measurand is zero is equal to a specified
value, β, when, in fact, the true value of the measurand is not zero
3.17
dicentric
aberrant chromosome bearing two centromeres derived from the joining of parts from two broken
chromosomes, generally accompanied by an acentric fragment
3.18
fluorescence in situ hybridization
FISH
technique that uses specific sequences of DNA as probes to particular parts of the genome, allowing
the chromosomal regions to be highlighted or “painted” in different colours by attachment of various
fluorochromes
3.19
fluorochrome
molecules that are fluorescent when appropriately excited
Note 1 to entry: They are used for FISH cytogenetics to highlight specific chromosomal regions.
3.20
genome equivalent
number of translocations that would be observed with all chromosomes painted, calculated from the
number of translocations detected with a limited number of painted chromosomes
3.21
insertion
chromosome rearrangement in which a piece of one chromosome has been inserted within another
chromosome
3.22
interphase
period of a cell cycle between the mitotic divisions
3.23
linear energy transfer
LET
radiation energy lost per unit length of path through a biological material
3.24
metaphase
stage of mitosis when the nuclear membrane is dissolved, the chromosomes condensed to their minimum
lengths and aligned for division
3.25
protocol for aberration identification and nomenclature terminology
PAINT
terminology used in FISH analysis for describing chromosomal aberrations
3.26
precision
concept employed to describe dispersion of measurements with respect to a measure of location or
central tendency
3.27
proficiency test
evaluation of participant performance against pre-established criteria by means of inter-laboratory
comparisons
3.28
quality assurance
QA
planned and systematic actions necessary to provide adequate confidence that a process, measurement
or service satisfies given requirements for quality
3.29
quality control
QC
part of quality assurance intended to verify that systems and components conform with predetermined
requirements
3.30
radiation-induced translocation
among the observed translocations, the ones that can be attributed to a radiation exposure i.e. not
translocations induced by other sources (e.g. age, lifestyle factors)
3.31
ring
aberrant circular chromosome resulting from the joining of two breaks within one chromosome
Note 1 to entry: Rings can be centric or acentric.
3.32
service laboratory
laboratory performing biological dosimetry measurements
3.33
stable aberration
aberration which is not lethal to the cell and can be passed on to daughter cells (e.g. simple translocation)
4 © ISO 2019 – All rights reserved
3.34
stable cell
cell without unstable aberrations, that may be entirely undamaged or contain stable type aberrations
only, and are likely to survive division
3.35
translocation
stable chromosome aberration in which parts of two or more chromosomes are exchanged
3.36
unstable aberration
aberration which is lethal to the cell (e.g. dicentrics/centric rings/acentric fragments)
4 Translocation assay by FISH
4.1 General
The frequency of chromosomal aberrations seen at metaphase in cultured human peripheral blood
lymphocytes is used for absorbed dose estimation after suspected exposure to ionizing radiation. This
document focuses on retrospective evaluation of exposures which occurred in the past or protracted
exposures where the dicentric assay (see ISO 19238) and the cytokinesis block micronucleus assay
(see ISO 17099) are not applicable due to the decrease in this type of damage over time. The aberrations
to be used are translocations and insertions in stable cells. For the application of this document, the
service laboratory shall choose which type of aberrations to score for the purpose of assessing absorbed
dose estimates and shall be consistent throughout.
It has been well established that the background translocation frequency in individuals varies with
age due to various confounding factors (i.e. nutritional status, genotoxic exposures, lifestyle factors,
malsegregation of sex chromosomes). This is an important consideration to take into account for
absorbed dose estimations using translocation analysis.
Hereafter, chromosome aberrations are referred to as translocations but may include insertions if
determined by the service laboratory.
4.2 Culturing and fixation
Similarly to ISO 19238, lymphocytes are cultured by a method that maximizes first-division
metaphases. This requires whole blood, or lymphocytes separated from the other blood components, to
be incubated in a culture medium containing a mitogen that stimulates lymphocyte cycling into mitosis.
For translocation analysis, cell cycle control is recommended. A mitotic blocking agent, colcemid, is
added to arrest and collect dividing lymphocytes in metaphase. The duration of the cell culture and the
timing of the addition of the arresting agent are optimized to ensure an adequate mitotic index.
Metaphases are recovered from the cultures, using a hypotonic salt solution and fixing in a mixture of
methanol and acetic acid. Fixed cells are dropped on microscope slides and stained. The exact protocol
for cell culture, harvesting metaphases, and staining employed by a service laboratory shall be formally
documented (See Clause 9).
4.3 Types of staining
Whole chromosome FISH staining shall be conducted and can involve one colour painting for all selected
chromosome pairs or two or three different colours, one for each pair of chromosomes selected. Painting
of three of the larger chromosomes covers about 20 % to 24 % of the total human DNA content, however
there are many choices of the number of fluorochromes and which chromosomes could be selected for
painting. It is recommended that chromosomes selected cover a large amount of DNA.
Some examples are described below:
a) one colour painting of three chromosome pairs [e.g. chromosome pairs 1, 4 and 8 all painted with
FITC (green)];
b) three colour painting of three chromosome pairs [e.g. chromosome pair 1 painted with Texas Red
(red), chromosome pair 2 painted with FITC (green) and chromosome pair 4 painted with FITC and
Texas Red (yellow)].
It is possible to increase the number of painted chromosome pairs to analyse a higher proportion of the
genome, but the staining of a few chromosome pairs is an efficient method in most cases.
All chromosomes should be counterstained with a fluorescent DNA dye such as DAPI
(4',6-diamidino-2-phenylindole). The use of a pan-centromeric probe may also be added but is not
necessary for translocation analysis, when the centromeres can be clearly identified.
4.4 Scoring
Microscope slides containing stained cells are methodically scanned to identify suitable metaphase
cells. The frequency of translocations observed in an appropriate number of scored metaphase cells is
converted to an estimate of radiation dose by reference to calibration data.
There are many types of chromosomal aberrations visible with whole chromosome FISH including
stable and unstable, which should all be recorded during the scoring procedure. For the application
of this document, the focus is on the scoring of translocations in stable cells so that this method can
be applied to retrospective analysis of exposures that have occurred in the past. Therefore, it is
recommended that unstable aberrations detected in counterstained chromosomes should also be
recorded to determine whether the translocation occurs in a stable or unstable cell. To avoid slowing
down the scoring, the analysis of all the counterstained chromosomes can be performed only in cells
with stable aberrations visible in the painted chromosomes.
The service laboratory shall choose which chromosome pairs and type of aberrations to score for the
purpose of assessing absorbed dose estimates and shall be consistent throughout.
Metaphases selected for scoring should be well-spread and appear to be complete.
[3]
There are several aberration classification systems currently in use (e.g. PAINT) . For the application
of this document, the service laboratory shall choose which type of scoring system to be used and shall
be consistent throughout. It is recommended that all visible damage be recorded but only translocations
in stable cells are to be counted for generating the calibration curve and providing absorbed dose
estimates. The information about the frequencies of all observed aberrations allows an opportunity for
further interpretation of the exposure conditions.
4.5 General requirement of the laboratory
The laboratory shall be well-equipped with the required standard laboratory equipment for lymphocyte
culture, cell processing, slide preparation, and fluorescence microscopy scoring of cells. The laboratory
should maintain QA documents, including those describing periodic calibration and maintenance of the
equipment used for cell culture as required.
5 Responsibility of the customer
This clause includes items that are not controlled by the laboratory. Prior to blood sampling,
coordination between the customer and the service laboratory should occur. Essential requirements
should be explained to the customer and this should be by a standardised instruction sheet as illustrated
in Annex A. The essential features are:
a) blood sampling shall use a collection system, containing lithium or sodium heparin as the
anticoagulant, which has been sent or specified by the service laboratory;
6 © ISO 2019 – All rights reserved
b) blood shall be collected (ideally about 10 ml), labelled accurately and unambiguously, maintained
between 6 °C and 30 °C and sent to the laboratory as soon as possible (ideally within 48 h);
c) precautions to ensure the integrity of the container and to prevent leakage during shipment shall
be observed. Blood samples should be kept between 6 °C and 30 °C during shipping. A temperature
recorder should be included to monitor the temperature during shipment. Packaging and labelling
shall conform to national and international regulations. If air transportation is involved, a physical
dosimeter shall be included to monitor whether the sample was irradiated in transit;
d) a questionnaire provided by the laboratory shall be completed accurately and returned promptly;
particularly listing previous medical or occupational radiation exposures (see Annex B). Accurate
biological dosimetry is limited for patients who have received a previous unknown medical
exposure;
e) the laboratory shall be alerted of biologically contaminated and/or infectious samples.
6 Responsibility of the laboratory
6.1 Setup and sustainment of the QA program
The laboratory shall establish and maintain a QA program (see Clause 14), which covers all aspects of
the service. The QA program should address the following issues:
a) the laboratory’s QA program shall include periodic internal checks of equipment operations,
reagent suitability, and various performance checks (i.e., intra-laboratory comparisons, operator
qualifications, sample protocol, scoring, absorbed dose estimations, report generation, etc.);
b) the laboratory’s QA program shall include periodic external checks of the laboratory’s operations.
The external audits shall include a review of the service laboratory’s documentation of equipment
operations, reagent suitability, and various performance checks (i.e., inter-laboratory comparisons,
operator qualifications, sample transport integrity, etc.).
The laboratory shall establish the frequency of these QA checks.
6.2 Responsibility during service
The service laboratory shall provide necessary guidance, procedures, and reporting to provide
absorbed dose assessment by cytogenetic analysis in response to a request for service. The service
activities shall address the following issues:
a) the laboratory shall have documentation, reviewed and endorsed by a designated, competent
person including the following:
1) an instruction sheet to be sent to the customer describing shipping procedures (see Annex A);
2) a questionnaire that shall elicit patient consent and information on whole or partial body
exposure, source and quality of the radiation, circumstances of the exposure, exposure location
(country, city, company, etc.), date and time of exposure, previous occupational or medical
exposures to radiation, intake of pharmaceuticals, infection, smoking habit, and significant
exposures to any other DNA damaging agents (such as organic solvents or heavy metals)
(see Annex B);
3) step by step procedures for processing the blood sample from receipt of the sample to reporting
of the absorbed dose;
b) if required, a blood collection system (10 ml) containing lithium or sodium heparin as the
anticoagulant shall be sent to the customer, also including the appropriately labelled and addressed
packaging material for the return of the sample to the service laboratory. The packaging shall
conform to national and/or international regulations for the transit of potentially infectious
pathological specimens (see 14.2.4);
c) after receipt of the blood sample, the following steps shall be performed:
1) document the receipt of the blood sample (date, time, consignee);
2) blind code the blood sample;
3) document the place of storage until the setting up of cultures;
4) set up cultures in parallel as soon as possible and document date, time and operator;
5) document, with lot numbers as appropriate, all reagents used for culturing;
6) document addition of reagents and end of culture (date, time, operator);
7) document short- and long-term storage of sample until slide making;
8) document slide codes, number of slides and location of storage;
9) document the results from scoring;
10) store slides and case documents in an appropriate place for a time period defined by the
laboratory for possible medico-legal re-evaluation of the case;
d) the service laboratory shall interpret results and prepare reports (see Annex C);
e) the service laboratory shall sustain a dialogue with the requestor, reprioritizing cases as required,
and providing results to the requestor.
7 Confidentiality of personal information
7.1 Overview
Biological dosimetry investigations made by the laboratory shall be undertaken in accordance with
national regulations regarding confidentiality. This would normally include the maintenance of
confidentiality of the patient's identity, medical data and social status. In addition, the commercial
confidentiality of the patient's employer and any other organizations involved in a radiological accident/
incident should be observed.
This requirement extends to
a) written, electronic or verbal communications between the laboratory and the person/organization
requesting the analysis and receiving the report, and
b) the secure protection of confidential information held within the organization where the service
laboratory is located.
7.2 Applications of the principle of confidentiality
7.2.1 Delegation of responsibilities within the laboratory
The head of the laboratory may authorise a limited number of laboratory staff to deal with documents
related to the analysis. Persons with this authority shall have signed a commitment to confidentiality
regarding their duties within the laboratory.
The laboratory shall maintain the signed confidentiality agreements and ensure the security and safety
of all confidential documents.
8 © ISO 2019 – All rights reserved
7.2.2 Requests for analysis
Depending on national regulations, the request for an analysis should normally be made by a doctor
representing the patient, by the patient him/herself or could be requested due to legal claims. In most
cases the blood sampling for chromosome analysis shall be made with the patient’s informed consent.
The laboratory, depending on the national regulations, may be required to maintain the record of the
patient's informed consent.
7.2.3 Transmission of confidential information
Whatever the chosen means of communication, confidentiality shall be ensured during the exchange of
information and reports between the service laboratory and the requestor of the analysis.
The laboratory needs to define all processes for information transmission and assurance of
confidentiality.
7.2.4 Anonymity of samples
The laboratory needs to have established protocols for maintaining the anonymity of samples. To avoid
the identification of the patient while guaranteeing the traceability of the analysis, the blood samples
should be coded upon arrival in the service laboratory. The coding is performed in an unambiguous
way according to a standard procedure. The same code is to be used for all stages of the analysis. The
code is assigned by an authorized person as defined in 7.2.1. Decoding, interpretation of results and
compiling the report are also to be performed by an authorized person.
7.2.5 Reporting of results
The final report containing the results and their interpretation (when needed) is communicated to the
requestor of the analysis and those so specified in the signed informed consent form. Depending on
national regulations, further copies may, with appropriate approvals, be passed to other responsible
persons.
7.2.6 Storage of data and results
The laboratory shall define how data and results are stored. All laboratory documents relating to a
case and which could permit the patient and/or employer to be identified shall be stored in a place
only accessible to the authorized persons. Documents shall be retained in an appropriate place for a
time defined by the laboratory for possible medico-legal re-evaluation of the case. Final disposal of
documents shall be by secure means such as shredding.
8 Laboratory safety requirements
8.1 Overview
Staff shall conform to their national legislation and institutional regulations regarding safety in the
laboratories. There are some particular features concerning safety in service laboratories that are
worth highlighting. These include microbiological, chemical, and optical considerations.
WARNING — The use of this document can involve hazardous materials, operations and
equipment. It does not purport to address all of the safety or environmental problems associated
with its use. It is the responsibility of users of this document to take appropriate measures
to ensure the safety and health of personnel and the environment prior to application of the
document and fulfil statutory and regulatory requirements for this purpose.
8.2 Microbiological safety requirements
Handling human blood poses some risk of blood-borne pathogens being transmitted to laboratory staff.
All specimens shall be regarded as being potentially infectious even if they are known to be derived
from apparently healthy persons. Staff should be offered available vaccinations against appropriate
blood-borne diseases.
8.3 Chemical safety requirements
Certain chemicals and pharmaceuticals are routinely used in the procedures covered in this document.
When present in cultures or used in staining procedures they are mostly used in small volumes
and in dilutions that generally present no health hazard. They are however prepared and stored in
concentrated stock solutions. The main reagents of concern and their internationally agreed upon
hazard statements (H-Statements) according to the GHS classification system are listed in Table 1 with
the key to the H-statements in Table 2. Note that commercially available products may vary depending
on the physical form/quantity/composition — always check the hazard and precautionary statements
on safety data sheets available from suppliers for your own reagents.
Table 1 — List of reagents and corresponding hazard statement
Reagent Hazard Statement
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) H315, H317, H335
Acetic Acid H226, H3
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 20046
Première édition
2019-03
Radioprotection — Critères de
performance pour les laboratoires
utilisant l'analyse des translocations
visualisées par hybridation in situ
fluorescente (FISH) pour évaluer
l'exposition aux rayonnements
ionisants
Radiological protection — Performance criteria for laboratories
using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) translocation assay
for assessment of exposure to ionizing radiation
Numéro de référence
©
ISO 2019
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2019
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Analyse des translocations par FISH. 5
4.1 Généralités . 5
4.2 Culture et fixation . 5
4.3 Types de coloration . 6
4.4 Dénombrement . 6
4.5 Exigences générales relatives au laboratoire. 7
5 Responsabilité du demandeur . 7
6 Responsabilité du laboratoire . 7
6.1 Mise en place et maintenance d’un programme d’assurance de la qualité (AQ) . 7
6.2 Responsabilité pendant le service . 8
7 Confidentialité des informations personnelles . 9
7.1 Aperçu général . 9
7.2 Applications du principe de confidentialité . 9
7.2.1 Délégation de responsabilités au sein du laboratoire . 9
7.2.2 Demandes d’analyse . 9
7.2.3 Transmission d’informations confidentielles . 9
7.2.4 Anonymat des échantillons . 9
7.2.5 Consignation des résultats .10
7.2.6 Stockage des données et résultats .10
8 Exigences de sécurité relatives aux laboratoires.10
8.1 Aperçu général .10
8.2 Exigences de sécurité microbiologique .10
8.3 Exigences de sécurité chimique .10
8.4 Exigences de sécurité optique .11
8.5 Plan de sécurité .12
9 Traitement des échantillons .12
9.1 Culture et coloration .12
9.2 Dénombrement .13
9.2.1 Critères de dénombrement .13
9.2.2 Conversion des fréquences de translocation en équivalence génomique .13
10 Fréquences de base des translocations .14
11 Courbes de calibration .15
11.1 Sources de calibration .15
11.2 Établissement de la ou des courbes de calibration .15
12 Critères pour convertir une fréquence d’aberration mesurée en une estimation de
dose absorbée.17
12.1 Détermination de l’estimation de dose absorbée au corps entier et des limites de
l’intervalle de confiance .17
12.1.1 Généralités .17
12.1.2 Comparaison avec la fréquence de base: caractérisation de la dose
minimale détectable .17
12.1.3 Limites de l’intervalle de confiance pour le nombre de translocations .21
12.1.4 Ajustement pour la fréquence de base .22
12.1.5 Calcul de la dose absorbée .23
12.1.6 Calcul de l’incertitude sur la dose absorbée .23
12.1.7 Cas d’exposition aiguë et non aiguë .24
12.1.8 Autres scénarios d’exposition .24
13 Consignation des résultats .24
13.1 Généralités .24
13.2 Contenu du rapport (voir Annexe C pour découvrir un format normalisé) .25
13.3 Interprétation des résultats .25
14 Assurance et contrôle de la qualité .26
14.1 Aperçu général .26
14.2 Exigences spécifiques .26
14.2.1 Généralités .26
14.2.2 Contrôles de performance par comparaisons interlaboratoires .26
14.2.3 Contrôle de la qualification des opérateurs .27
14.2.4 Contrôle de performance du transport des échantillons .27
14.2.5 Contrôle de performance de l’intégrité des échantillons par le laboratoire
de service.27
14.2.6 Contrôle de performance de l’appareillage .27
14.2.7 Contrôle de performance des protocoles expérimentaux .28
14.2.8 Contrôle de performance de la qualité de dénombrement .28
14.2.9 Contrôle de performance du rapport d’expertise .28
Annexe A (informative) Exemples d’instructions pour le demandeur .29
Annexe B (informative) Exemple de questionnaire .31
Annexe C (informative) Exemple de rapport .33
Annexe D (informative) Tableau type pour le dénombrement des aberrations
chromosomiques peintes .34
Annexe E (informative) Ajustement de la courbe dose-effet par la méthode du maximum de
vraisemblance et calcul de l’erreur d’estimation de dose absorbée .36
Annexe F (informative) Processus d’estimation dosimétrique .37
Bibliographie .43
iv © ISO 2019 – Tous droits réservés
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 85, Énergie nucléaire, technologies
nucléaires, et radioprotection, sous-comité SC 2, Radioprotection.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
Introduction
L’objectif du présent document est de définir l’utilisation de l’analyse des translocations des
chromosomes visualisées par hybridation in situ fluorescente (FISH) sur les lymphocytes du sang
périphérique humain qui ont été exposés à des rayonnements ionisants. La dosimétrie biologique, fondée
sur l’étude des aberrations chromosomiques, essentiellement le dénombrement des dicentriques, est
devenue un élément de routine pour l’estimation dosimétrique en cas de surexposition accidentelle. Les
dicentriques, cependant, disparaissent avec le temps après l’exposition, ce qui rend ce dénombrement
utile uniquement à court terme après l’exposition. Les translocations sont toutefois plus stables, ce qui
permet de faire des estimations dosimétriques longtemps après l’exposition ou après des expositions
prolongées.
Le présent document fournit des lignes directrices pour effectuer l’analyse des translocations par FISH
pour l’estimation dosimétrique en utilisant des modes opératoires documentés et validés. Il décrit
également les exigences minimales pour évaluer la fréquence de translocation dans les lymphocytes
du sang périphérique, en définissant précisément les aspects techniques de la coloration des
chromosomes (nombre de chromosomes et types de peinture), de la sélection des types d’aberrations
et de cellules, du dénombrement des aberrations, de la conversion de la fréquence d’aberration en dose,
de l’analyse statistique, des problèmes liés aux expositions hétérogènes, chroniques ou anciennes et de
l’extrapolation au génome complet. L’estimation dosimétrique à l’aide de l’analyse FISH est pertinente
pour la prise en charge médicale, la radioprotection, le suivi dosimétrique et les exigences médico-
légales.
Une partie de l’information contenue dans le présent document est incluse dans d’autres lignes
directrices et publications scientifiques internationales et principalement dans la série de rapports
techniques de l’Agence Internationale de l’Énergie Atomique (AIEA) sur la dosimétrie biologique.
Cependant, le présent document développe et normalise l’assurance et le contrôle de la qualité ainsi que
l’évaluation des performances.
vi © ISO 2019 – Tous droits réservés
NORME INTERNATIONALE ISO 20046:2019(F)
Radioprotection — Critères de performance pour les
laboratoires utilisant l'analyse des translocations
visualisées par hybridation in situ fluorescente (FISH)
pour évaluer l'exposition aux rayonnements ionisants
1 Domaine d’application
L’objectif du présent document est de fournir des critères pour l’assurance de la qualité (AQ), le contrôle
de la qualité (CQ) et l’évaluation des performances des laboratoires de service pratiquant la dosimétrie
biologique par cytogénétique.
Le présent document aborde:
a) les responsabilités du demandeur et du laboratoire;
b) la confidentialité des informations personnelles pour le demandeur et le laboratoire;
c) les exigences de sécurité du laboratoire;
d) le traitement des échantillons, la culture, la coloration et le dénombrement, y compris les critères
de dénombrement pour l’analyse des translocations par FISH;
e) les sources de calibration et les gammes de doses de calibration utiles pour établir les courbes
dose-effet de référence qui contribuent à l’estimation dosimétrique à partir de la fréquence des
aberrations chromosomiques et la limite de détection;
f) la procédure de dénombrement des translocations colorées par FISH utilisée pour l’évaluation de
l’exposition;
g) les critères pour convertir une fréquence mesurée d’aberrations en une estimation de dose
absorbée (également dénommée «estimation dosimétrique»);
h) la présentation des résultats;
i) l’AQ et le CQ;
j) les Annexes A à F contenant des exemples d’instructions pour le traitement du prélèvement
par le demandeur, de questionnaire, de tableau type pour le dénombrement des aberrations
chromosomiques, de rapport et d’ajustement de la courbe dose-effet par la méthode du maximum
de vraisemblance et de calcul de l’incertitude sur l’estimation de la dose absorbée.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
dose absorbée
D
quantité d’énergie de rayonnement ionisant impartie par unité de masse d’un matériau spécifié
3.2
acentrique
fragment chromosomique terminal ou interstitiel de taille variable, dépourvu de centromère,
habituellement considéré comme un acentrique en excès lorsqu’il est formé indépendamment d’un
dicentrique ou d’un anneau centrique
3.3
anticoagulant
substance chimique qui empêche le sang de coaguler
3.4
taux/fréquence de base
fréquence spontanée (ou nombre) d’aberrations chromosomiques dénombrées sur une population
générale
3.5
couche leuco-plaquettaire
couche d’un échantillon de sang anticoagulé après centrifugation qui contient la plupart des
globules blancs
3.6
courbe de calibration
description graphique ou mathématique de la relation effet-dose construite à partir de l’irradiation
in vitro d’échantillons de sang à des doses absorbées connues
Note 1 à l'article: La courbe est utilisée pour déterminer, par interpolation, la dose de rayonnement absorbée par
un individu potentiellement exposé.
3.7
centromère
région spécialisée sous forme d’une constriction d’un chromosome, qui apparaît pendant la mitose et
réunit les paires chromatidiennes
3.8
chromatide
un des deux brins d’un chromosome dupliqué qui sont réunis par un seul centromère et se séparent
pendant la division cellulaire pour s’individualiser comme des chromosomes
3.9
chromosome
structure porteuse de l’information génétique, constituée de pelotes d’ADN et de protéines qui se
condensent pendant la division nucléaire pour former des éléments de forme caractéristique
3.10
aberration chromosomique
modification de la structure normale d’un chromosome impliquant le même locus sur les
deux chromatides d’un même chromosome observé en métaphase
3.11
colcémide
composé alcaloïde qui inhibe la formation du fuseau pendant la division cellulaire
Note 1 à l'article: Il est utilisé pour collecter un grand nombre de cellules en métaphase en les empêchant de
progresser en anaphase.
2 © ISO 2019 – Tous droits réservés
3.12
aberration complexe
aberration impliquant trois cassures ou plus dans au moins deux chromosomes et induite de manière
caractéristique après une exposition à un rayonnement ionisant dense ou à des doses élevées de
rayonnement à faible densité d’ionisation
3.13
intervalle de confiance
plage dans laquelle se situe la vraie valeur d’une grandeur statistique avec une probabilité spécifiée
3.14
covariance
mesure de la corrélation de la variance entre (au moins) deux ensembles de données ou paramètres
dépendants
3.15
seuil de décision
valeur de l’estimateur du mesurande telle que, quand le résultat du mesurage réel utilisant une
procédure de mesure donnée d’un mesurande quantifiant le phénomène physique lui est supérieur, on
décide que le phénomène physique est présent
Note 1 à l'article: Le seuil de décision est défini de manière que, dans le cas où le résultat du mesurage, y, dépasse
le seuil de décision, y*, la probabilité que la valeur vraie du mesurande soit nulle est inférieure ou égale à la
probabilité choisie, α.
Note 2 à l'article: Si le résultat, y, est inférieur au seuil de décision, y*, le résultat ne peut pas être attribué à l’effet
physique, mais il ne peut pas être conclu qu’il est absent.
3.16
limite de détection
plus petite valeur vraie du mesurande qui garantit une probabilité spécifiée qui soit détectable par la
procédure de mesure
Note 1 à l'article: Avec le seuil de décision (3.15), la limite de détection est la plus petite valeur vraie du mesurande
pour laquelle la probabilité de décider de façon erronée que la valeur vraie du mesurande est nulle est égale à une
valeur spécifiée, β, quand, en réalité, la valeur vraie du mesurande n’est pas nulle.
3.17
dicentrique
chromosome aberrant portant deux centromères résultant de la jonction des morceaux de
deux chromosomes coupés (généralement accompagné d’un fragment acentrique)
3.18
hybridation in situ fluorescente
FISH
technique utilisant des séquences spécifiques d’ADN comme sondes de régions particulières du génome,
permettant de surligner ou «peindre» des régions chromosomiques en différentes couleurs par la
fixation de divers fluorochromes
3.19
fluorochrome
molécules fluorescentes lorsqu’elles sont excitées de manière appropriée
Note 1 à l'article: Les fluorochromes sont utilisés pour la cytogénétique FISH pour mettre en évidence des régions
chromosomiques spécifiques.
3.20
équivalent génome
fréquence de translocations qui seraient observées si tous les chromosomes étaient peints, calculé à
partir du nombre de translocations détectées sur un nombre limité de chromosomes peints
3.21
insertion
réarrangement de chromosomes dans lequel un morceau de chromosome a été inséré dans un autre
chromosome
3.22
interphase
période d’un cycle cellulaire entre deux divisions mitotiques
3.23
transfert linéique d’énergie
TLE
énergie de rayonnement déposée par unité de longueur de trajectoire parcourue à travers un matériau
biologique
3.24
métaphase
étape de la mitose au cours de laquelle la membrane nucléaire est dissoute, les chromosomes condensés
au maximum et alignés pour la division
3.25
protocole portant sur l’identification des aberrations et sur la terminologie associée à leur
classification
PAINT
terminologie utilisée dans l’analyse FISH pour décrire les aberrations chromosomiques
3.26
fidélité
concept utilisé pour décrire la dispersion des mesures par rapport à une valeur moyenne ou une
tendance centrale
3.27
essai d’aptitude
évaluation de la performance d’un participant par rapport à des critères préétablis au moyen de
comparaisons interlaboratoires
3.28
assurance de la qualité
AQ
actions planifiées et systématiques nécessaires pour attester qu’un processus, un mesurage ou un
service satisfait aux exigences de qualité définies
3.29
contrôle de la qualité
CQ
partie de l’assurance de la qualité qui a pour objectif de vérifier que les systèmes et les composants sont
en conformité avec les exigences prédéfinies
3.30
translocation radio-induite
parmi les translocations observées, celles qui peuvent être attribuées à une irradiation, ce qui exclut
donc les translocations induites par d’autres sources (par exemple l’âge, les facteurs liés au mode de vie)
3.31
anneau
chromosome circulaire aberrant résultant de la jonction de deux points de cassure d’un même
chromosome
Note 1 à l'article: Les anneaux peuvent être centriques ou acentriques.
4 © ISO 2019 – Tous droits réservés
3.32
laboratoire de service
laboratoire pratiquant des expertises par dosimétrie biologique
3.33
aberration stable
aberration qui ne conduit pas à la mort de la cellule et qui peut être transmise aux cellules filles
(par exemple, simple translocation)
3.34
cellule stable
cellule sans aberrations instables, qui peut être entièrement intacte ou contenir uniquement des
aberrations de type stable et qui peut survivre à une division
3.35
translocation
aberration chromosomique stable dans laquelle des parties d’au moins deux chromosomes sont
échangées
3.36
aberration instable
aberration qui peut conduire à la mort de la cellule (par exemple, dicentriques/anneaux centriques/
fragments acentriques)
4 Analyse des translocations par FISH
4.1 Généralités
La fréquence des aberrations chromosomiques observées en métaphase dans les lymphocytes du
sang périphérique humain en culture est utilisée pour estimer la dose absorbée après une suspicion
d’exposition aux rayonnements ionisants. Le présent document se concentre sur l’évaluation
rétrospective des expositions survenues par le passé ou des expositions prolongées pour lesquelles le
dénombrement des dicentriques (voir ISO 19238) et l’essai de micronoyaux avec blocage de la cytodiérèse
(voir ISO 17099) ne sont pas applicables en raison de la diminution de ce type de dommages au fil du
temps. Les aberrations à utiliser sont les translocations et les insertions dans des cellules stables. Pour
l’application du présent document, le laboratoire de service doit choisir le type d’aberrations à analyser
dans l’objectif de fournir des estimations de doses absorbées. Il doit être cohérent tout au long de
l’analyse.
Il est bien établi que les fréquences de translocation de base chez les individus varient en fonction
de l’âge en raison de différents facteurs confondants (à savoir l’état nutritionnel, les expositions
génotoxiques, les facteurs liés au mode de vie, la mauvaise ségrégation des chromosomes sexuels). Il
s’agit d’une information clé à prendre en compte pour les estimations de doses absorbées à l’aide d’une
analyse des translocations.
Les aberrations chromosomiques sont ci-après désignées «translocations», mais peuvent inclure des
insertions si le laboratoire de service le décide.
4.2 Culture et fixation
De la même manière que dans l’ISO 19238, les lymphocytes sont cultivés par une méthode qui maximise
les métaphases de première division. Cette méthode nécessite du sang total ou des lymphocytes isolés
des autres éléments du sang, incubés dans un milieu de culture contenant un mitogène qui stimule le
cycle de mitose des lymphocytes. Pour l’analyse des translocations, un contrôle du cycle cellulaire est
recommandé. Un agent mitotique, la colcémide, est ajouté pour arrêter la division des lymphocytes en
métaphase et ainsi les prélever. La durée de la culture et la période d’incubation avec l’agent bloquant
sont optimisées pour assurer un index mitotique adéquat.
Les métaphases sont isolées à l’aide d’une solution hypotonique et fixées dans un mélange de méthanol et
d’acide acétique. Les cellules fixées sont déposées sur des lames de microscope et colorées. Le protocole
exact de la culture des cellules, du recueil des métaphases et de leur coloration, qui est employé par le
laboratoire de service, doit être clairement formalisé (voir l'Article 9).
4.3 Types de coloration
La coloration FISH de chromosomes entiers doit être effectuée et peut impliquer une peinture d’une
seule couleur pour toutes les paires de chromosomes sélectionnés ou deux ou trois couleurs différentes,
une pour chaque paire de chromosomes sélectionnés. La peinture de trois des plus gros chromosomes
couvre entre 20 % à 24 % environ de la teneur totale en ADN humain, mais il existe de nombreux
choix quant au nombre de fluorochromes et aux chromosomes qui pourraient être sélectionnés pour la
peinture. Il est recommandé de faire en sorte que les chromosomes sélectionnés couvrent une grande
quantité d’ADN.
Certains exemples sont décrits ci-après:
a) peinture d’une seule couleur de trois paires de chromosomes [par exemple, les paires de
chromosomes 1, 4 et 8 toutes peintes avec du FITC (vert)];
b) peinture en trois couleurs différentes de trois paires de chromosomes [par exemple, la paire de
chromosomes 1 peinte avec du Texas Red (rouge), la paire de chromosomes 2 peinte avec du FITC
(vert) et la paire de chromosomes 4 peinte avec du FITC et du Texas Red (jaune)].
Il est possible d’augmenter le nombre de paires de chromosomes peints pour analyser une proportion
plus élevée du génome, mais dans la plupart des cas la coloration de quelques paires de chromosomes
est une méthode efficace.
Il convient de contre-colorer tous les chromosomes avec un colorant d’ADN fluorescent tel que le DAPI
(diamidino-4’,6-phénylindole-2). L’utilisation d’une sonde pan-centromérique peut également être
ajoutée, mais n’est pas nécessaire pour l’analyse des translocations, lorsque les centromères peuvent
être clairement identifiés.
4.4 Dénombrement
Les lames de microscope portant les cellules colorées sont méthodiquement parcourues afin d’identifier
les métaphases adéquates. La fréquence de translocations dénombrées dans un nombre approprié de
métaphases est convertie en une estimation de dose de rayonnement par référence à des données de
calibration.
Il existe de nombreux types d’aberrations chromosomiques visualisables grâce au marquage FISH de
chromosomes entiers, y compris stables et instables, qu’il convient d’enregistrer pendant la procédure
de dénombrement. Pour l’application du présent document, l’accent est mis sur le dénombrement
des translocations dans des cellules stables afin que cette méthode puisse être appliquée à l’analyse
rétrospective des expositions survenues par le passé. Par conséquent, il est recommandé d’enregistrer
les aberrations instables détectées dans les chromosomes contre-colorés afin de déterminer si la
translocation se produit dans une cellule stable ou instable. Pour éviter de ralentir le dénombrement,
l’analyse de tous les chromosomes contre-colorés peut être effectuée uniquement dans des cellules
présentant des aberrations stables visibles dans les chromosomes peints.
Le laboratoire de service doit choisir les paires de chromosomes et le type d’aberrations à analyser dans
l’objectif de fournir des estimations de dose absorbée. Il doit être cohérent tout au long de l’analyse.
Il convient que les métaphases sélectionnées pour le dénombrement soient bien étalées et paraissent
complètes.
Plusieurs systèmes de classification des aberrations sont utilisés actuellement (par exemple PAINT)
[3]
. Pour l’application du présent document, le laboratoire de service doit choisir le type de système de
dénombrement qu’il souhaite utiliser. Il doit être cohérent tout au long de l’analyse. Il est recommandé
d’enregistrer tous les dommages visibles, mais seules les translocations dans les cellules stables
6 © ISO 2019 – Tous droits réservés
doivent être comptabilisées pour générer la courbe de calibration et fournir des estimations de dose
absorbée. Les informations sur les fréquences de toutes les aberrations observées permettent de mieux
interpréter les conditions d’exposition.
4.5 Exigences générales relatives au laboratoire
Le laboratoire doit être pourvu de l’équipement de laboratoire standard requis pour la culture
lymphocytaire, le traitement des cellules, la préparation de la coloration des lames et le dénombrement
des cellules par microscopie à fluorescence. Il convient que le laboratoire conserve les documents d’AQ,
y compris ceux décrivant l’étalonnage périodique et l’entretien de l’équipement utilisé pour la culture
cellulaire, si nécessaire.
5 Responsabilité du demandeur
Le présent article inclut des points qui ne sont pas contrôlés par le laboratoire. Avant le prélèvement
de sang, il convient qu’une coordination soit établie entre le demandeur et le laboratoire de service.
Il convient d’expliquer au demandeur les conditions opératoires, par exemple au moyen d’une feuille
d’instructions normalisée telle que celle présentée en Annexe A. Les points essentiels sont les suivants:
a) le sang doit être prélevé à l’aide d’un dispositif contenant de l’héparine de lithium ou de sodium
comme anticoagulant, et il aura été envoyé ou décrit par le laboratoire d’analyse;
b) le sang doit être récolté (idéalement 10 ml environ), étiqueté de façon fiable et sans ambiguïté,
conservé à température ambiante (entre 6 °C et 30 °C environ) et envoyé au laboratoire dès que
possible (idéalement dans les 48 h);
c) des précautions doivent être prises pour assurer l’intégrité du contenant utilisé pour le transport
et éviter les dommages pendant l’expédition. Il convient de conserver les échantillons de sang
entre 6 °C et 30 °C pendant le transport. Il convient d’inclure un enregistreur de température afin de
surveiller la température pendant l’expédition. L’emballage et l’étiquetage doivent être conformes
aux réglementations nationales et internationales. En cas de transport aérien, un dosimètre
physique doit être inclus pour vérifier si l’échantillon a été irradié pendant le transit;
d) un questionnaire fourni par le laboratoire doit être rempli avec précision et renvoyé rapidement.
Il doit notamment énumérer les expositions antérieures à des rayonnements médicaux ou
professionnels (voir Annexe B). La précision de la dosimétrie biologique est limitée pour les patients
qui ont déjà été exposés à des rayonnements médicaux non déclarés ou dont les caractéristiques ne
sont pas fournies avec précision;
e) le laboratoire doit être alerté en cas d’échantillons biologiquement contaminés et/ou infectieux.
6 Responsabilité du laboratoire
6.1 Mise en place et maintenance d’un programme d’assurance de la qualité (AQ)
Le laboratoire doit établir et tenir à jour un programme d’assurance de la qualité (AQ) (voir l'Article 14)
qui couvre tous les aspects du service. Il convient que le programme AQ porte sur les points suivants:
a) le programme AQ du laboratoire doit inclure des contrôles internes périodiques du fonctionnement
de l’équipement, de l’adéquation des réactifs ainsi que différents contrôles de performance (à
savoir comparaisons intralaboratoires, qualifications du manipulateur, protocole expérimental,
dénombrement, estimations de la dose absorbée, génération de rapports, etc.);
b) le programme AQ du laboratoire doit inclure des contrôles externes périodiques du fonctionnement
du laboratoire. Les audits externes doivent inclure une revue de la documentation décrivant
le fonctionnement de l’équipement, de l’adéquation des réactifs et des différents contrôles de
performance (à savoir comparaisons intralaboratoires, qualifications du manipulateur, intégrité
lors du transport des échantillons, etc.) du laboratoire de service.
Le laboratoire doit établir la fréquence de ces contrôles d’assurance de la qualité.
6.2 Responsabilité pendant le service
Le laboratoire de service doit établir les recommandations, modes opératoires et méthodes de
présentation des résultats nécessaires pour fournir une estimation de la dose absorbée par analyse
cytogénétique en réponse à une demande de service. Les activités de service doivent porter sur les
points suivants:
a) le laboratoire doit disposer d’une documentation, revue et signée par une personne désignée et
compétente, comportant les informations suivantes:
1) une feuille d’instructions à envoyer au demandeur, décrivant les procédures d’expédition
(voir Annexe A);
2) un questionnaire qui doit confirmer le consentement du patient et apporter des informations
sur l’exposition globale ou partielle du corps, la source et la nature du rayonnement, les
circonstances de l’exposition, le lieu de l’exposition (pays, ville, entreprise, etc.), la date et
l’heure de l’exposition, les expositions antérieures aux rayonnements ionisants, qu’il s’agisse
d’expositions professionnelles ou médicales, la prise de médicaments, les infections, la
consommation de tabac et toute exposition significative à d’autres agents génotoxiques (tels
que des solvants organiques ou des métaux lourds) (voir Annexe B);
3) les modes opératoires, étape par étape, pour le traitement de l’échantillon de sang depuis sa
réception jusqu’à la fourniture de la dose absorbée;
b) si nécessaire, un dispositif de prélèvement sanguin (10 ml) contenant de l’héparine de lithium ou
de sodium comme anticoagulant doit être envoyé au demandeur, incluant également un emballage
correctement étiqueté et adressé pour le retour de l’échantillon au laboratoire de service.
L’emballage doit être conforme aux règlements nationaux et/ou internationaux pour le transfert
d’échantillons biologiques potentiellement infectieux (voir 14.2.4);
c) dès sa réception, l’échantillon de sang doit être traité de la manière suivante:
1) renseigner les informations sur la réception de l’échantillon de sang (date, heure, nom de la
personne qui réceptionne le colis);
2) coder l’échantillon de sang pour permettre de garantir l’anonymat;
3) renseigner le lieu de conservation jusqu’à la mise en culture;
4) établir des cultures en double dès que possible et renseigner la date, l’heure et le nom
du manipulateur;
5) renseigner tous les réactifs utilisés pour la culture, en indiquant les numéros de lots le
cas échéant;
6) décrire l’ajout des réactifs et la fin de la culture (date, heure et nom du manipulateur);
7) décrire la conservation à court et long termes de l’échantillon jusqu’à la préparation des lames;
8) décrire les codes des lames, le nombre de lames et le lieu de conservation;
9) décrire les résultats obtenus pour le dénombrement;
10) conserver les lames et les documents concernant l’analyse dans un endroit adapté pendant une
durée définie par le laboratoire pour une possible nouvelle évaluation médico-légale du cas;
d) le laboratoire de service doit interpréter les résultats et préparer des rapports (voir Annexe C);
e) le laboratoire de service doit entretenir un dialogue avec le demandeur, en revoyant l’ordre de
priorité des analyses lorsque cela est nécessaire et en communiquant les résultats au demandeur.
8 © ISO 2019 – Tous droits réservés
7 Confidentialité des informations personnelles
7.1 Aperçu général
Les investigations par la méthode de dosimétrie biologique pratiquées par le laboratoire doivent être
effectuées en accord avec les réglementations nationales en matière de confidentialité. Cette exigence
inclut normalement la confidentialité de l’identité, des données médicales et du statut social du patient.
De plus, il convient de maintenir la confidentialité commerciale de l’employeur du patient et de toutes
les autres organisations impliquées dans un accident/incident radiologique.
Cette exigence s’étend aux éléments suivants:
a) aux communications écrites, électroniques ou orales entre le laboratoire et la personne/
l’organisation demandant l’analyse et recevant le rapport; et
b) la protection sécurisée des informations confidentielles détenues au sein de l’organisation à
laquelle appartient le laboratoire de service.
7.2 Applications du principe de confidentialité
7.2.1 Délégation de responsabilités au sein du laboratoire
Le chef du laboratoire peut autoriser un nombre limité de membres du laboratoire à manipuler des
documents en relation avec l’analyse. Les personnes ayant cette autorisation doivent avoir signé un
engagement de confidentialité concernant leurs activités au sein du laboratoire.
Le laboratoire doit conserver les engagements de confidentialité signés et assurer la sécurité de tous les
documents confidentiels.
7.2.2 Demande
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
Loading comments...