ISO 15163:2012

NORME ISO
INTERNATIONALE 15163
FIL
Première édition
2012-05-15
Version corrigée
2012-08-01
Lait et produits laitiers — Présure de
veau et coagulant issu de bovin adulte —
Détermination des teneurs en chymosine
et en pepsine bovine par
chromatographie
Milk and milk products — Calf rennet and adult bovine rennet —
Determination by chromatography of chymosin and bovine pepsin
contents
Numéros de référence
FIL 110:2012(F)
©
ISO et FIL 2012
FIL 110:2012(F)
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FIL 110:2012(F)
Sommaire Page
Avant-propos . iv
Avant-propos . v
Introduction . vi
1  Domaine d'application . 1
2  Références normatives . 1
3  Principe . 1
4  Réactifs . 2
5  Appareillage . 3
6  Échantillonnage . 4
7  Mode opératoire . 4
7.1  Contrôle . 4
7.2  Préparation d'une nouvelle colonne de Fractogel . 4
7.3  Régénération et équilibrage de la résine Fractogel dans la colonne . 5
7.4  Stockage de la colonne de Fractogel . 5
7.5  Préparation de l'échantillon pour essai . 5
7.6  Analyse du coagulant d'origine bovine dessalé . 6
7.7  Détermination des temps de coagulation . 8
8  Calcul et expression des résultats . 9
8.1  Calcul de l'activité de la chymosine et de la pepsine, exprimée en pourcentage . 9
8.2  Calcul de la concentration en chymosine active et en pepsine bovine active en
milligrammes par litre . 9
8.3  Expression des résultats . 10
9  Fidélité . 10
9.1  Essai interlaboratoires . 10
9.2  Répétabilité . 11
9.3  Reproductibilité . 11
10  Rapport d'essai . 11
Annexe A (informative) Dosage qualitatif des enzymes de coagulation du lait dans des
coagulants commerciaux par immunodiffusion double . 13
Annexe B (informative) Essai interlaboratoires . 18
Bibliographie . 20

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FIL 110:2012(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 15163FIL 110 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération Internationale du Lait (FIL). Elle est publiée conjointement par
l'ISO et la FIL.
Cette première édition de l'ISO 15163FIL 110 annule et remplace la FIL 110B:1997, qui a fait l'objet d'une
révision technique.
La présente version corrigée de l'ISO 15163FIL 110:2012 incorpore les corrections suivantes:
 l’expression «coagulant issu de bovin adulte» a été remplacée par «coagulant d’origine bovine», dans la
dernière phrase de l’Article 1;
 le terme «présure» a été remplacé par «coagulant d’origine bovine» en 4.11, 7.5.3, 7.6 et A.1.
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FIL 110:2012(F)
Avant-propos
La FIL (Fédération Internationale du Lait) est une organisation sans but lucratif représentant le secteur
laitier mondial. Les membres de la FIL se composent des Comités Nationaux dans chaque pays membre et
des associations laitières régionales avec lesquelles la FIL a signé des accords de coopération. Tout membre
de la FIL a le droit de faire partie des Comités permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux
techniques. La FIL collabore avec l'ISO pour l'élaboration de méthodes normalisées d'analyse et
d'échantillonnage pour le lait et les produits laitiers.
La tâche principale des Comités permanents est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de
Normes internationales adoptés par les Comités permanents sont soumis aux Comités Nationaux pour
approbation avant publication en tant que Norme internationale. La publication comme Norme internationale
requiert l'approbation de 50 % au moins des Comités Nationaux de la FIL votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 15163FIL 110 a été élaborée par la Fédération Internationale du Lait (FIL) et le comité technique
ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Elle est publiée conjointement
par la FIL et l'ISO.
L'ensemble des travaux a été effectué par une équipe de projet ISO-FIL sur la Détermination des teneurs en
chymosine et en pepsine bovine, du comité permanent sur les Méthodes d'analyse pour les adjuvants et
indicateurs de traitement, sous la direction de son chef de projet, le professeur A. Andrén (SE).
Cette première édition de l'ISO 15163FIL 110 annule et remplace la FIL 110B:1997, qui a fait l'objet d'une
révision technique.
La présente version corrigée de l'ISO 15163FIL 110:2012 incorpore les corrections suivantes:
 l’expression «coagulant issu de bovin adulte» a été remplacée par «coagulant d’origine bovine», dans la
dernière phrase de l’Article 1;
 le terme «présure» a été remplacé par «coagulant d’origine bovine» en 4.11, 7.5.3, 7.6 et A.1.
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FIL 110:2012(F)
Introduction
Les préparations à base de présure de veau et de coagulant issu de bovin adulte contiennent toutes deux
comme enzymes coagulantes de la chymosine et de la pepsine bovine en quantités variables. La proportion
de chymosine diminue par rapport à la pepsine dans la caillette (quatrième compartiment de l'estomac) en
fonction de l'âge du veau et au moment de son sevrage.
Pour la production de coagulants d’origine bovine, le rapport des volumes de la caillette d'un bovin jeune et
d'un bovin âgé influence ainsi considérablement la composition de la chymosine et de la pepsine du
coagulant final. Plus le volume de la caillette des jeunes veaux nourris au lait est important, plus la proportion
[5][6]
de chymosine est élevée, et inversement .
La chymosine et la pepsine présentent toutes deux des caractéristiques spéciales aussi bien en ce qui
concerne l'activité de coagulation du lait que l'utilisation en fromagerie. Par exemple, l'activité de coagulation
du lait de la pepsine dépend plus du pH que celle de la chymosine. Par ailleurs, la pepsine présente
également une activité protéolytique plus générale que celle de la chymosine.
Par conséquent, il est très important d'analyser la teneur en chymosine et en pepsine en plus de la force
[6][7]
(activité totale de coagulation du lait) du coagulant d'origine bovine .

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NORME INTERNATIONALE
FIL 110:2012(F)
Lait et produits laitiers — Présure de veau et coagulant issu de
bovin adulte — Détermination des teneurs en chymosine et en
pepsine bovine par chromatographie
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de référence pour la détermination des quantités de
chymosine et de pepsine bovines présentes dans un échantillon pour essai de présure de veau et de
coagulant issu de bovin adulte. De plus, elle peut être utilisée pour des mélanges de présure de
veau/coagulant d’origine bovine contenant de la chymosine bovine produite par fermentation (FPC).
2 Références normatives
Le document de référence suivant est indispensable pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 11815FIL 157:2007, Lait — Détermination de l'activité totale de coagulation du lait dans la présure de
bovins
3 Principe
Dans un premier temps, l'échantillon de coagulant d'origine bovine est dessalé puis les enzymes chymosine
[8][9]
et pepsine bovine sont séparées sur une colonne échangeuse d'anions . Dans un deuxième temps,
l'activité de coagulation du lait de chacune des deux enzymes séparées est déterminée selon
l'ISO 11815FIL 157 (lait reconstitué à pH 6,5). La composition enzymatique de l'échantillon de coagulant
d'origine bovine est exprimée soit en pourcentage d'activité de la chymosine et en pourcentage d'activité de la
pepsine de la somme des activités en unités internationales de coagulation du lait (IMCU) des deux
composants, soit en milligrammes par litre de chymosine active et en milligrammes par litre de pepsine active.
L'activité totale coagulante du lait du premier lot de poudre étalon de référence de présure de veau et du
premier lot de poudre étalon de référence de coagulant issu de bovin adulte a été établie une fois pour toutes
à 1 000 IMCU/g. Les préparations ultérieures d'étalons de référence doivent être effectuées d'après les
étalons de référence précédents (voir l'ISO 11815FIL 157).
La présente Norme internationale spécifie une méthode manuelle de chromatographie d'échange d'anions et
une autre méthode automatique.
Il s'agit d'une méthode de référence. Par conséquent, des modifications peuvent être apportées uniquement
s’il a été confirmé qu’elles donnent le même résultat et une répétabilité et une reproductibilité au moins aussi
élevées que celles obtenues avec la méthode normalisée originale. Toute modification apportée à la méthode
décrite dans la présente Norme internationale doit également être mentionnée dans le rapport d'essai (voir
Article 10).
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FIL 110:2012(F)
4 Réactifs
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue ainsi que de l'eau
distillée ou déminéralisée ou de l'eau de pureté équivalente.
® 1) ®
4.1 Résine, Fractogel EMD DEAE (M) (cat. Merck n° 1.16883) ou colonne pré-remplie de 1 ml Mono Q
2)
(HR 5/5 ou 5/50 GL de GE Healthcare) ou résine équivalente.
® ®
NOTE 1 Fractogel EMD DEAE (M) est une résine adaptée à la chromatographie manuelle et Mono Q convient à la
chromatographie automatique.
® ®
NOTE 2 Si les résines Fractogel ou Mono Q sont remplacées par une autre résine, il peut s'avérer nécessaire de
changer les tampons en 4.12 et en conséquence de réévaluer la méthode.
4.2 Pipérazine hexahydratée (C H N , 6H O).
4 10 2 2
4.3 Chlorure de sodium (NaCl).
4.4 Thymol, conservateur facultatif.
4.5 Hydroxyde de sodium (NaOH).
4.6 Solution d'acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l.
4.7 Éthanol (C H OH), à au moins 96 % (fraction volumique).
2 5
4.8 Éthanol (C H OH), à environ 20 % (fraction volumique).
2 5
Ajouter 105 ml d'éthanol à 96 % (4.7) à 400 ml d'eau et mélanger. Si une filtration stérile est souhaitée, filtrer
l'eau avant de la mélanger avec l'éthanol.
4.9 Urée, c(N H CO) = 8 mol/l.
2 4
Dissoudre 48 g d'urée dans de l'eau et compléter à 100 ml.
3)
4.10 Boudin de dialyse, d'un diamètre d'environ 1 cm (Union Carbide) ou équivalent (facultatif).
NOTE La qualité du tube de dialyse n'est pas un paramètre critique.
4)
4.11 Colonnes de dessalement, Bio-Rad – Econopac 10DG (cat. n° 732-2010) ou équivalent (facultatif).
Utiliser soit le boudin de dialyse (4.10), soit les colonnes de dessalement pour dessaler le coagulant d'origine
bovine. ®
1) Fractogel EMD DEAE (M) est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est
donnée à l'intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL approuvent ou
recommandent l'emploi exclusif du produit ainsi désigné. ®
2) La colonne pré-remplie de 1 ml Mono Q est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette
information est donnée à l'intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL
approuvent ou recommandent l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
3) Exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs du
présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL approuvent ou recommandent l'emploi exclusif du produit
ainsi désigné.
4) Bio–RAD - Econopac 10DG est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est
donnée à l'intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL approuvent ou
recommandent l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
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4.12 Solutions tampons
4.12.1 Solution tampon I, pipérazine [(CH ) (NH) ], c[(CH ) (NH) ] = 0,025 mol/l.
2 4 2 2 4 2
Peser 4,85 g de pipérazine (4.2) et 42,8 g de solution d'acide chlorhydrique (4.6) dans un bécher et mélanger.
Transférer quantitativement le contenu du bécher dans une fiole jaugée de 1 000 ml à un trait (5.5).
Compléter à 1 000 ml avec de l'eau et mélanger. Le pH doit être de 5,30  0,05. Si ce n'est pas le cas, ajuster
avec de la pipérazine ou de l'acide chlorhydrique. Avant toute utilisation, dégazer et conserver la solution
tampon comme indiqué en 4.12.5.
4.12.2 Solution tampon II, c(NaCl) = 0,25 mol/l.
Peser 14,6 g de NaCl dans une fiole jaugée de 1 000 ml à un trait (5.5). Compléter à 1 000 ml avec la solution
tampon I (4.12.1) et mélanger. Ne pas ajuster le pH. Utiliser la solution tampon II uniquement pour la méthode
manuelle. Avant toute utilisation, dégazer et conserver la solution tampon comme indiqué en 4.12.5.
4.12.3 Solution tampon III, c(NaCl) = 0,50 mol/l
Peser 29,2 g de NaCl dans une fiole jaugée de 1 000 ml à un trait (5.5). Compléter à 1 000 ml avec la solution
tampon I (4.12.1) et mélanger. Ne pas ajuster le pH. Utiliser la solution tampon III uniquement pour la
méthode manuelle. Avant toute utilisation, dégazer et conserver la solution tampon comme indiqué en 4.12.5.
4.12.4 Solution tampon IV, c(NaCl) = 1,0 mol/l
Peser 58,4 g de NaCl dans une fiole jaugée de 1 000 ml à un trait (5.5). Compléter à 1 000 ml avec la solution
tampon I (4.12.1) et mélanger. Ne pas ajuster le pH. Avant toute utilisation, dégazer et conserver la solution
tampon comme indiqué en 4.12.5.
4.12.5 Dégazage et conservation.
Avant toute utilisation, dégazer les solutions tampons I à IV (4.12.1 à 4.12.4) sous vide ou en utilisant un bain
à ultrasons. Conserver les solutions tampons I à IV en vue de les utiliser dans le cadre de la méthode
manuelle en ajoutant quelques cristaux de thymol. En ce qui concerne la conservation relative à la méthode
automatique, elle s'effectue par filtration stérile à l'aide d'un filtre de 0,2 µm.
Les solutions tampons I à IV peuvent être conservées pendant au moins 5 jours à température ambiante ou
2 mois au réfrigérateur.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
5.1 Pompe péristaltique multicanaux ou toute autre pompe appropriée (pour la méthode manuelle
uniquement).
5.2 pH-mètre, d'une sensibilité de 0,01 unité pH.
5.3 Colonne de chromatographie, d'environ 1,0 cm de diamètre et 10 cm de long, avec régulateur de
débit ou colonne équivalente adaptée à une hauteur de gel d'environ 5 cm (pour la méthode manuelle
uniquement).
5.4 Agitateur magnétique.
[2]
5.5 Fioles jaugées à un trait, de capacités requises, ISO 1042 .
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® 5 ) ® 6 )
5.6 Appareil FPLC ÄKTA ou CLHP, adapté à l'objectif, utilisé uniquement pour la méthode
automatique.
5.7 Matériel de laboratoire, pour la détermination du temps de coagulation (voir l'ISO 11815FIL 157).
6 Échantillonnage
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
[1]
méthode d'échantillonnage recommandée est indiquée dans l'ISO 707FIL 50 .
NOTE 1 L'échantillonnage du coagulant d'origine bovine liquide est décrit dans l'ISO 707FIL 50:2008, Article 9 et celui
du coagulant d'origine bovine en poudre dans l'ISO 707FIL 50:2008, Article 13.
Il convient d'envoyer un échantillon représentatif au laboratoire. Il est recommandé qu'il n'ait pas été
endommagé ou modifié pendant le transport ou le stockage.
NOTE 2 Les produits en poudre peuvent se séparer rapidement.
Conserver les échantillons à l'abri de la lumière, à une température comprise entre 0 °C et 5 °C.
7 Mode opératoire
7.1 Contrôle
Avant la détermination, vérifier que le coagulant d'origine bovine ne contient pas d'enzymes coagulantes
d'origine non bovine en utilisant une méthode appropriée (voir l'Annexe A). Toutefois, ce contrôle peut être
omis si le coagulant d'origine bovine est connu pour contenir uniquement de la chymosine et de la pepsine
d'origine bovine.
7.2 Préparation d'une nouvelle colonne de Fractogel
Après dégazage sous vide, verser une suspension de la résine Fractogel (4.1) prête à l'emploi, directement
depuis le flacon du fabricant, ou en utilisant un bain à ultrasons, dans la colonne (5.3), en position verticale et
orifice ouvert, jusqu'à ce que la couche de résine Fractogel déposée atteigne une hauteur de 4,5 cm à 5,5 cm.
La couche de gel ne doit pas sécher pendant toute la durée de l'opération.
Fermer le tube de sortie. Immerger l'extrémité du tube d'entrée de la pompe péristaltique dans un bécher
contenant la solution tampon I (4.12.1). Raccorder le tube de l'adaptateur au tube de sortie de la pompe.
Ajuster le débit à (1,3  0,1) ml/min. Remplir le tube de l'adaptateur avec la solution tampon I (4.12.1) sans
dépasser le volume interne total du tube de 1,5 ml.
Fermer la colonne avec l'adaptateur, conformément aux instructions du fabricant de la colonne. À l'aide de
l'adaptateur, comprimer la couche de gel de quelques millimètres pour éviter la formation d'espaces libres
au-dessus de la couche de gel. Éviter l'entrée de bulles d'air dans la colonne. Rincer la colonne avec la
solution tampon I (4.12.1) pendant 5 min à un débit de 1,3 ml/min.
®
5) FPLC est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL approuvent ou recommandent l'emploi
exclusif du produit ainsi désigné. ®
6) ÄKTA est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL approuvent ou recommandent l'emploi
exclusif du produit ainsi désigné.
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7.3 Régénération et équilibrage de la résine Fractogel dans la colonne
Après préparation d'une nouvelle colonne et après chaque passage, régénérer et équilibrer la résine
Fractogel (4.1) présente dans la colonne en procédant comme suit.
Régénérer la résine Fractogel présente dans la colonne à un débit de 1,3 ml/min en utilisant au moins 15 ml
de solution tampon IV (4.12.4) (environ 11,5 min). Équilibrer la colonne avec au moins 40 ml de solution
tampon I (4.12.1) (environ 30 min). La colonne est désormais prête à accueillir l'échantillon pour essai.
La même colonne peut être utilisée plus de 20 fois. En cas d'utilisations fréquentes, régénérer la colonne de
façon plus poussée en la rinçant avec du NaOH à 0,1 mol/l pendant 10 min puis avec de l'eau pendant 10 min.
Ensuite, suivre le mode opératoire normal de régénération et d'équilibrage décrit précédemment.
7.4 Stockage de la colonne de Fractogel
Si la colonne doit être stockée pendant plus d'une semaine, la rincer avec au moins 15 ml d'éthanol à
20 % (4.8) à l'aide de la pompe péristaltique (5.1). Stocker la colonne en veillant à ce que les tubes d'entrée et
de sortie soient hermétiquement fermés.
La colonne peut être stockée pendant plusieurs mois à température ambiante et à l'abri de la lumière directe
du soleil.
7.5 Préparation de l'échantillon pour essai
7.5.1 Généralités
Les échantillons liquides peuvent être utilisés tels quels; il suffit de procéder à 7.5.2.
Un échantillon de coagulant d'origine bovine en poudre est préparé de la façon suivante. Avant d'effectuer le
dessalement, dissoudre un échantillon de coagulant d'origine bovine en poudre de façon à obtenir, par
exemple, 200 IMCU/ml, dans une quantité appropriée de solution tampon I (4.12.1) ou en utilisant une
solution tampon à pH 5,5 (voir l'ISO 11815FIL 157).
Avant d'effectuer le dessalement, déterminer le temps de coagulation de l'échantillon de coagulant d'origine
bovine reconstitué conformément à l'ISO 11815FIL 157. Faire une estimation approximative de la force de
l'échantillon, en IMCU/ml, en le mesurant par rapport à l'étalon de référence de présure de veau, cela afin de
déterminer la quantité d'échantillon à appliquer sur la colonne (7.6.1 ou 7.6.2).
Si les résultats sont exprimés en milligrammes par litre, déterminer au moins deux fois le temps de
coagulation de l'échantillon de coagulant d'origine bovine, conformément à l'ISO 11815FIL 157. Dans ce cas,
mesurer les temps de coagulation simultanément ou dans une succession rapide, «avant» et «après» le
dessalement.
Avant d'appliquer l'échantillon pour essai sur la colonne, le dessaler par dialyse (7.5.2) ou par filtration sur gel
(7.5.3).
7.5.2 Dessalement par dialyse
Immerger le boudin de dialyse (4.10) dans de l'eau bouillante pendant environ 5 min et rincer l'intérieur et
l'extérieur du boudin avec de l'eau.
Dialyser 5 ml de l'échantillon pour essai préparé (7.5) (environ 900 IMCU) avec 500 ml de solution tampon I
(4.12.1) à 4 °C pendant au moins 5 h, mais pas au-delà de 20 h. Comprimer fermement le boudin de dialyse à
la main pour le fermer, afin de réduire la dilution qui se produit au cours de la dialyse. Pendant la dialyse,
agiter le tampon avec un agitateur magnétique (5.4).
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Si les résultats sont exprimés en milligrammes par litre, déterminer au moins deux fois le temps de
coagulation de l'échantillon de coagulant d'origine bovine dialysé, conformément à l'ISO 11815FIL 157.
7.5.3 Dessalement par filtration sur gel
Suivre les instructions du fabricant.
Équilibrer la colonne de dessalement (4.11) avec la solution tampon I (4.12.1). Appliquer 3,3 ml d'échantillon
pour essai préparé (7.5) sur la colonne. Éluer l'échantillon avec 4,0 ml de solution tampon I (4.12.1).
Dans le cas d'échantillons pour essai contenant une petite quantité de chymosine ou de pepsine, il est parfois
nécessaire d'effectuer deux fois le mode opératoire susmentionné, afin que l'activité soit suffisante pour
pouvoir déterminer correctement le composant en faible quantité.
Si les résultats sont exprimés en milligrammes par litre, déterminer au moins deux fois le temps de
coagulation de l'échantillon de coagulant d'origine bovine filtré sur gel, conformément à l'ISO 11815FIL 157.
7.5.4 Durée de vie de la colonne
Afin de prolonger la durée de vie des colonnes et pour éviter qu'elles ne s'encrassent, le mode opératoire
suivant est recommandé pour le nettoyage régulier des colonnes de dessalement.
Après chaque jour d'utilisation, rincer toute la colonne dans de l'eau du robinet ou distillée propre. Appliquer
environ 5 ml d'urée à 8 mol/l sur la colonne et purger. Rincer une fois la colonne dans de l'eau du robinet et
l'équilibrer en laissant couler un volume normal de retenue de solution tampon I (4.12.1) dans la colonne.
Stocker les colonnes équilibrées dans un endroit frais et de façon qu'une partie du tampon se trouve au-
dessus de la surface du gel. Pour un stockage de longue durée, il est recommandé de stocker la colonne
dans un tampon ou de l'eau distillée et d'ajouter un conservateur (voir les instructions du fabricant). En suivant
ce mode opératoire, chaque colonne peut être utilisée pendant deux ans ou jusqu'à ce que son débit réduise
considérablement.
7.6 Analyse du coagulant d'origine bovine dessalé
7.6.1 Séparation de la chymosine et de la pepsine avec une colonne ordinaire — Méthode manuelle
Après équilibrage de la colonne en 7.3, y introduire une quantité connue d'échantillon pour essai dessalé
(7.5.2 ou 7.5.3) en utilisant la pompe (5.1), en immergeant l'extrémité du tube d'entrée de la pompe dans le
tube d'échantillon pour essai. Régler le débit à 1,3 ml/min.
Il convient que la quantité d'échantillon pour essai soit suffisante pour obtenir, si possible et après séparation,
un temps de coagulation pour la fraction la plus faible de 350 s à 550 s. Toutefois, cette quantité ne doit pas
être trop importante, de façon à pouvoir détecter l'activité dans la fraction intermédiaire ou dans l'éluat après
la deuxième fraction. Après dessalement, un volume maximal d'échantillon pour essai de 3 ml à 5 ml est
suffisant dans la plupart des cas. Cependant, la quantité totale d'IMCU appliquée sur la colonne ne doit pas
dépasser 900 IMCU. Si les résultats sont exprimés en milligrammes par litre, il est nécessaire de connaître
exactement la quantité ajoutée dans la colonne. Cela n'est pas nécessaire si les résultats sont exprimés
uniquement en pourcentage.
Lorsque l'échantillon est presque entièrement entré dans le tube d'entrée, laver le tube avec 1 ml de solution
tampon II (4.12.2). Éviter l'entrée de bulles d'air dans le tube. Répéter le mode opératoire de lavage dès que
le premier liquide de lavage est entré dans le tube d'entrée.
Immerger l'extrémité du tube d'entrée dans un bécher contenant au moins 50 ml de solution tampon II (4.12.2).
Recueillir la première fraction d'élution dans une fiole jaugée à un trait de 50 ml (5.5). Recueillir exactement
jusqu'au trait de 50 ml ou, par souci de commodité, jusqu'à un volume d'environ 47 ml. Dans le dernier cas,
compléter à 50 ml avec la solution tampon II (4.12.2).
6 © ISO et FIL 2012 – Tous droits réservés

FIL 110:2012(F)
Ensuite, recueillir une quantité de 3 ml dans un petit bécher. Cette quantité est désignée comme étant la
fraction intermédiaire.
Immerger ensuite l'extrémité du tube d'entrée de la pompe péristaltique (5.1) dans un bécher contenant au
moins 50 ml de solution tampon III (4.12.3). Recueillir la deuxième fraction d'élution dans une autre fiole
jaugée de 50 ml à un trait (5.5). Recueillir exactement jusqu'au trait de 50 ml ou, par souci de commodité,
jusqu'à un volume d'environ 47 ml. Dans le dernier cas, compléter à 50 ml avec la solution tampon III (4.12.3).
Ensuite, recueillir encore une quantité de 3 ml dans un petit bécher. Cette quantité est désignée comme étant
la fraction finale.
NOTE La première fraction d'élution contient la chymosine. La fraction intermédiaire est utilisée pour vérifier que la
séparation des deux enzymes s'est déroulée correctement. La deuxième fraction d'élution contient la pepsine bovine. La
fraction finale est utilisée pour vérifier que la totalité de la pepsine a été éluée.
Si l'échantillon est connu pour contenir une très petite quantité de chymosine ou de pepsine, les fractions
d'élution 1 et 2 peuvent être recueillies dans des fioles jaugées plus petites, par exemple de 25 ml.
® ®
7.6.2 Séparation de la chymosine et de la pepsine par FPLC /ÄKTA /CLHP — Méthode automatique
7.6.2.1 Suivre les instructions générales pour l'équipement (5.6) et la colonne Mono Q (4.1) et n'utiliser
que les solutions tampons I (4.12.1) et IV (4.12.4).
Concevoir un programme d'analyse. Vérifier que la séparation est correcte et que les résultats obtenus sont
conformes à la méthode de référence manuelle. Dans la méthode automatique, la chromatographie est
démultipliée par un facteur de 5, ce qui signifie que des fractions de 10 ml sont recueillies au lieu des fractions
de 50 ml collectées dans la méthode manuelle. En outre, il est inutile de recueillir la fraction intermédiaire car
le chromatogramme indique si la chymosine et la pepsine sont entièrement séparées en fractions d'une
enzyme chacune.
Si la colonne n'a pas été utilisée au cours des dernières 24 h, effectuer un passage en aveugle avec le
tampon I (4.12.1) comme échantillon pour essai.
7.6.2.2 Les lignes directrices suivantes relatives à un programme conviennent à l'application de 0,5 ml ou
1,0 ml d'échantillon pour essai.
a) Commencer (à 0,0 ml de tampon) avec 100 % de tampon I (4.12.1) en utilisant un débit de 2 ml/min et
enregistrer à 280 nm. Injecter l'échantillon, qui était préinjecté dans une boucle de 0,500 ml ou 1 000 ml,
dans la colonne.
b) Après élution de 0,60 ml de tampon I (4.12.1), commencer à recueillir la fraction 1 (fraction de
chymosine).
c) Après élution de 1,50 ml de tampon I, remplacer le tampon I par un mélange tampon constitué de 80 %
de tampon I (4.12.1) et 20 % de tampon IV (4.12.4) pour éluer la fraction de chymosine.
d) Après élution d'un total de 10,60 ml de mélange de tampon I et de tampon IV, arrêter de recueillir la
fraction 1 (volume de 10 ml) et remplacer le mélange tampon I et IV par un mélange tampon constitué de
50 % de tampon I (4.12.1) et 50 % de tampon IV (4.12.4) pour éluer la fraction 2 (fraction de pepsine) tout
en commençant à la recueillir.
e) Après élution d'un total de 20,60 ml de mélange tampon, arrêter de recueillir la fraction 2 (volume de
10 ml) et remplacer le mélange constitué de 50 % de tampons I et IV par 100 % de tampon IV (4.12.4)
pour laver la colonne.
f) Après élution d'un total de 25,60 ml de mélange tampon, remplacer une nouvelle fois le tampon IV par
100 % de tampon I (4.12.1) pour équilibrer la colonne.
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FIL 110:2012(F)
g) Après élution d'un total de 32,60 ml de tampon, arrêter le programme.
7.6.2.3 La chromatographie d'un échantillon pour essai est effectuée de la façon suivante.
Préinjecter le coagulant d'origine bovine dessalé dans une boucle de 0,500 ml ou 1 000 ml en appliquant
autant d'IMCU que possible mais sans dépasser 180 IMCU au total. Commencer la chromatographie et
recueillir les deux fractions. Déterminer les temps de coagulation des première et deuxième fractions
conformément à l'ISO 11815FIL 157.
Si l'échantillon est connu pour contenir une très petite quantité de chymosine (coagulant issu de bovin adulte)
ou de pepsine (présure de veau), le volume de la fraction peut être modifié jusqu'à 5 ml puisque l'élution d'une
petite quantité d'une des enzymes dans la première fraction de 5 ml est détectée sur le chromatogramme. Si
la totalité d'une enzyme est éluée dans la première fraction de 5 ml, l'activité est alors mesurée dans cette
fraction uniquement et le calcul est ajusté en conséquence, en divisant les IMCU/ml correspondantes par
deux. Vérifier que le temps de coagulation de l'autre fraction de 5 ml est supérieur à 1 800 s.
En général, il est recommandé d'inclure un échantillon de composition connue à intervalles réguliers, en
particulier en cas d'utilisation de la méthode automatique.
Ajuster le programme si la séparation des fractions de chymosine et de pepsine n'est pas complète.
7.7 Détermination des temps de coagulation
Bien mélanger le contenu de chaque fraction obtenue soit en 7.6.1 soit en 7.6.2 avant de prélever une prise
d'essai. Effectuer les dilutions requises avec la solution tampon II (4.12.2) pour la première fraction et avec la
solution tampon III (4.12.3) pour la deuxième fraction.
Déterminer les temps de coagulation des première et deuxième fractions d'élution conformément à
l'ISO 11815FIL 157, en tenant compte des éléments suivants.
Déterminer la première fraction parallèlement à la solution de travail de référence de présure de veau et la
deuxième fraction parallèlement à la solution de travail de référence de coagulant issu de bovin adulte.
Déterminer deux fois les temps de coagulation, dans un court intervalle de temps, pour chaque couple
«fraction-solution de travail de référence» en utilisant le temps moyen pour les calculs.
Par ailleurs, pour l'essai de coagulation du lait décrit dans l'ISO 11815FIL 157, un volume d'échantillon
jusqu'à cinq fois plus élevé peut être ajouté au lait, si nécessaire, afin d'obtenir un temps de coagulation dans
la gamme de 350 s à 550 s.
Cependant, dans ce cas, diluer la solution de travail de référence de coagulant d'origine bovine
correspondante dans le même tampon que celui utilisé pour éluer la fraction relative à l'échantillon afin de
conserver les mêmes conditions de coagulation pour l'échantillon et pour la solution de travail de référence de
coagulant d'origine bovine. Cela signifie que si un volume d'échantillon pour essai trois fois plus élevé est
nécessaire (1,5 ml au lieu de 0,5 ml), il convient également de diluer trois fois plus la solution de travail de
référence de coagulant d'origine bovine (1,5 ml au lieu de 0,5 ml) pour l'essai de coagulation (voir
l'ISO 11815FIL 157:2007, 9.5.1).
Dans les fractions d'échantillon contenant une très petite quantité de chymosine ou de pepsine, l'utilisation de
temps de coagulation supérieurs à 550 s n'est autorisée que dans le cas où l'on a ajouté un volume
d'échantillon pour essai cinq fois plus élevé que la normale.
Déterminer les temps de coagulation des fractions intermédiaire et finale en ajoutant cinq fois le volume
normal (2,5 ml pour 25 ml de lait). Il convient que ces temps de coagulation dépassent 1 800 s parce qu'un
temps de coagulation inférieur indique que la séparation était insatisfaisante.
Effectuer l'ensemble de l'analyse dès que possible après la séparation de la chymosine et de la pepsine, en
raison de l'éventuelle dénaturation des enzymes dans les solutions diluées.
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FIL 110:2012(F)
8 Calcul et expression des résultats
8.1 Calcul de l'activité de la chymosine et de la pepsine, exprimée en pourcentage
L'activité de la chymosine et l'activité de la pepsine bovine, exprimées en IMCU par millilitre, comme décrit
dans l'ISO 11815FIL 157, peuvent être converties en pourcentage de chymosine, a , et en pourcentage de
c
pepsine bovine, a , à l’aide des Équations (1) et (2), respectivement:
p
n 100
c
a  (1)
c
nn
cp
a = 100  a (2)
p c
où
n est la teneur en chymosine, exprimée en IMCU par millilitre;

c
n est la teneur en pepsine, exprimée en IMCU par millilitre.
p
8.2 Calcul de la concentration en chymosine active et en pepsine bovine active en
milligrammes par litre
Exprimer la concentration en chymosine et en pepsine bovine actives, en milligrammes par litre, si du lait
, K , f et f pour le lait en
en poudre étalon est utilisé pour la préparation du substrat. Les coefficients K
c p c p
7 )
poudre étalon sont fournis par le fabricant (Cecalait) . Déterminer la concentration comme donné dans
l'ISO 11815FIL 157, à l'aide de l'Équation (3):
K V t
x2
 d
x (3)
tf V t
xx p 1
où
 est la concentration, exprimée en milligrammes par litre, en chymosine,  , ou en pepsine bovine,  ,
x c p
dans la préparation enzymatique;
K est le coefficient K ou K utilisé pour le calcul de la concentration, exprimée en milligrammes par
x c p
litre, en chymosine et en pepsine bovine actives, respectivement;
t est le temps de coagulation, exprimé en secondes, obtenu avec 0,5 ml de fraction 1, t , ou fraction 2,
x c
t , diluée ou concentrée F fois (voir 7.7 et ci-après);
p
f est le facteur de correction f ou f , exprimé en secondes, pour le temps de latence de la
x c p
coagulation;
V est le volume, exprimé en millilitres, de la préparation dessalée utilisée pour l'analyse (7.6);
p
V est le volume, exprimé en millilitres, de la fraction recueillie (V = 50 ml);
d est le facteur de dilution ou de concentration de la fraction analysée (par exemple d = 3 lorsque 1 ml
de la fraction a été distillé avec 2 ml de tampon avant l'essai de coagulation et d = 0,25 lorsque 2 ml
au lieu de 0,5 ml ont été utilisés pour 25 ml de lait lors de l'essai de coagulation);

7)
Cecalait, rue de Versailles, B.P. 70129, 39802 Poligny, France (e-mail: secretariat@cecalait.fr). Cette information est
donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL approuvent ou
recommandent le fournisseur ainsi désigné.
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FIL 110:2012(F)
t est le temps de coagulation, exprimé en secondes, obtenu avec la préparation enzymatique
diluée (7.5);
t est le temps de coagulation, exprimé en secondes, obtenu avec la préparation enzymatique
dessalée à la même dilution (7.5.2 ou 7.5.3).
Pour un lait en poudre particulier et une enzyme précise, déterminer f en représentant graphiquement les
temps de coagulation en fonction de 1/ (voir l'exemple). D'après l'équation de Holter, t = f  b/c, où f est la
valeur extrapolée de t pour b/c = 0. Le fabricant de lait en poudre étalon donne également le facteur f.
EXEMPLE Pour déterminer la constante f pour la fraction de chymosine, préparer 100 ml de solution de chymosine
pure concentrée dans la solution tampon II (4.12.2). Cette préparation peut être obtenue à partir d'une ou plusieurs
séparations chromatographiques de présure de veau (première fraction). Ensuite, préparer au moins six solutions
différentes de cette préparation avec la solution tampon II (4.12.2).
Déterminer les temps de coagulation des différentes dilutions selon la méthode donnée dans l'ISO 11815FIL 157. Il
convient que les temps de coagulation soient uniformément répartis entre 240 s et 1 200 s.
La valeur de  pour la dilution minimale (temps de coagulation proche de 300 s) est fixée à 1,00 et les valeurs pour les
autres dilutions sont définies par rapport à celle-ci, par exemple 0,50 (1/2), 0,33 (1/3), 0,25 (1/4), etc. Sur un graphique,
tracer t = d (1/) et calculer le coefficient de corrélation, r. Si r est égal ou supérieur à 0,999, il est possible de déterminer
la constante «f». Si r est inférieur à 0,999, faire de nouvelles dilutions et répéter les mesurages des temps de coagulation.
Pour déterminer la constante f pour la fraction de pepsine bovine, préparer 100 ml de solution de pepsine bovine pure
concentrée dans la solution tampon III (4.12.3). Cette préparation peut être obtenue à partir d'une ou de plusieurs
séparations chromatographiques de coagulant issu de bovin adulte (deuxième fraction). Ensuite, préparer au moins six
solutions différentes de cette préparation avec la solution tampon III (4.12.3).
Déterminer les temps de coagulation dans les mêmes limites de temps que celles décrites pour la fraction de chimosine et
calculer r. Si r est égal ou supérieur à 0,999, il est possible de déterminer la constante f.
8.3 Expression des résultats
Exprimer le résultat d'essai avec des chiffres significatifs entiers.
9 Fidélité
9.1 Essai i
...

МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 15163
IDF
Первое издание
2012-05-15
Молоко и молочные продукты.
Сычужный фермент из желудка телят и
взрослых коров. Определение
содержания химозина и говяжьего
пепсина методом хроматографии
Milk and milk products – Calf rennet and adult bovine rennet.
Determination by chromatography of chymosin and bovine pepsin
contents
Ссылочные номера
IDF 110:2012(R)
©
ISO и IDF 2012
IDF 110:2012(R)
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E-mail copyright@iso.org E-mail info@fil-idf.org
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Напечатан в Швейцарии
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IDF 110:2012(R)
Содержание Страница
Предисловие .iv
Предисловие .v
Введение .vi
1 Область применение .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Принцип.1
4 Реактивы .1
5 Аппаратура.3
6 Отбор проб.4
7 Методика .4
7.1 Проверка .4
7.2 Подготовка чистой колонки со смолой Fractogel .4
7.3 Регенерация и уравновешивание смолы Fractogel в колонке .5
7.4 Хранение колонки со смолой Fractogel.5
7.5 Приготовление пробы для испытания.5
7.6 Анализ обессоленного сычужного фермента .6
7.7 Определение времени свертывания.8
8 Вычисление и представление результатов.8
8.1 Вычисление активности химозина и пепсина, выражаемой в процентах.8
8.2 Вычисление активности химозина и говяжьего пепсина, в миллиграммах на литр.9
8.3 Выражение результатов .10
9 Прецизионность.10
9.1 Межлабораторные испытания.10
9.2 Повторяемость .10
9.3 Воспроизводимость .11
10 Протокол испытания.11
Приложение A (информативное) Количественное определение молокосвертывающих
ферментов в промышленных коагулянтах методом двойной иммунодиффузии .12
Приложение B (информативное) Межлабораторные испытания .17
Библиография.19

© ISO и IDF 2012 – Все права сохраняются iii

IDF 110:2012(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией
национальных организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных
стандартов обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член,
заинтересованный в деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть
представленным в этом комитете. Международные правительственные и неправительственные
организации, имеющие связи с ISO, также принимают участие в этой работе. ISO работает в тесном
сотрудничестве с Международной электротехнической комиссией (IEC) по всем вопросам
стандартизации в области электротехники.
Проекты международных стандартов разрабатываются в соответствии с правилами, приведенными в
Директивах ISO/IEC, Часть 2.
Основная задача технических комитетов заключается в разработке международных стандартов.
Проекты международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-
членам на голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения
не менее 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Следует иметь в виду, что, возможно, некоторые элементы настоящего документа могут быть
объектом патентных прав. ISO не несет ответственности за определение некоторых или всех таких
патентных прав.
Международный стандарт ISO 15163⎪IDF 110 был разработан Техническим комитетом ISO/TC 34,
Пищевые продукты, Подкомитетом SC 5, Молоко и молочные продукты и Международной
федерацией молочной промышленности (IDF). Стандарт опубликован ISO совместно с IDF.
Настоящее первое издание ISO 15163⎪IDF 110 отменяет и заменяет стандарт IDF 110B:1997, который
был технически пересмотрен.
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IDF 110:2012(R)
Предисловие
Международная федерация молочной промышленности (IDF) является некоммерческой
всемирной федерацией предприятий молочной отрасли. Членство в IDF представлено национальными
комитетами стран, а также региональными ассоциациями молочной промышленности, подписавшими
официальное соглашение о сотрудничестве с IDF. Каждый национальный комитет имеет право быть
представленным в постоянных комитетах IDF, осуществляющих техническую работу. IDF сотрудничает
с ISO по вопросам разработки стандартных методов анализа и отбора проб молока и молочных
продуктов.
Основная задача постоянных комитетов заключается в разработке международных стандартов.
Проекты международных стандартов, принятые постоянными комитетами и рабочими группами,
рассылаются национальным комитетам для голосования. Их опубликование в качестве
международных стандартов требует одобрения не менее 50 % национальных комитетов IDF,
принимающих участие в голосовании.
Следует иметь в виду, что, возможно, некоторые элементы настоящего документа могут быть
объектом патентных прав. ISO не несет ответственности за определение некоторых или всех таких
патентных прав.
ISO 15163⎪IDF 110 был разработан Международной федерацией молочной промышленности (IDF)
совместно с Техническим комитетом ISO/TC 34, Пищевые продукты, Подкомитетом SC 5, Молоко и
молочные продукты. Стандарт опубликован ISO совместно с IDF.
Вся работа была выполнена объединенной проектной группой ISO/IDF по Определению содержания
химозина и говяжьего пепсина Постоянного комитета по Аналитическим методам определения
технологических добавок и индикаторов под руководством проф. А.Андрена (Швеция).
Настоящее первое издание ISO 15163⎪IDF 110 отменяет и заменяет IDF 110B:1997, который был
технически пересмотрен.
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IDF 110:2012(R)
Введение
Препараты на основе сычужного фермента из желудка телят и взрослых животных содержат химозин и
говяжий пепсин в разных количествах в качестве основных молокосвертывающих ферментов.
Пропорция химозина по отношению к пепсину в сычуге (четвёртый отдел желудка жвачных) с
возрастом и отлучением теленка от матери уменьшается.
Соотношение сычуга молодняка к сычугу взрослых животных в сырье для производства фермента,
таким образом, сильно влияет на состав химозина и пепсина в конечном сычужном ферменте. Чем
[5][6]
больше сычуг у молодых вскормленных молоком телят, тем выше доля химозина и наоборот .
Как химозин, так и пепсин имеют особые характеристики, касающиеся молокосвертывающей
активности и пригодности для производства сыров. Молокосвертывающая активность пепсина,
например, намного больше зависит от показателя pH, чем активность химозина, кроме того, пепсин
также имеет более общую протеолитическую активность, чем химозин.
Поэтому, важно проанализировать содержание химозина и пепсина в дополнение к концентрации
[6][7]
(общей молокосвертывающей активности) сычужного фермента .

vi © ISO и IDF 2012 – Все права сохраняются

МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ
IDF 110:2012(R)
Молоко и молочные продукты. Сычужный фермент из
желудка телят и взрослых коров. Определение содержания
химозина и говяжьего пепсина методом хроматографии
1 Область применение
Настоящий международный стандарт устанавливает контрольный метод определения количества
химозина и говяжьего пепсина в пробе сычужного фермента телят и взрослых животных. Кроме того,
стандарт может применяться для приготовления смесей сычужного фермента телят/взрослых особей
крупного рогатого скота с полученным в процессе ферментации говяжьим химозином.
2 Нормативные ссылки
Следующие ссылочные нормативные документы являются обязательными при применении данного
документа. Для жестких ссылок применяется только цитированное издание документа. Для плавающих
ссылок необходимо использовать самое последнее издание нормативного ссылочного документа
(включая любые изменения).
ISO 11815⎪IDF 157:2007, Молоко. Определение общей молокосвертывающей активности говяжьего
сычужного фермента
3 Принцип
На первом этапе, пробу сычужного фермента обессоливают, а химозин и говяжий пепсин в ферментах
[8][9]
разделяют на анионообменной колонке . На втором этапе, определяют молочносвертывающую
активность каждого из двух разделенных ферментов в соответствии с ISO 11815⎪IDF 157
(восстановленного молока с рН 6,5). Ферментативный состав пробы сычужного фермента выражают в
процентах активности химозина и пепсина от суммы активностей обоих компонентов в соответствии с
Международными молокосвертывающими единицами (ММЕ), или результаты выражают в
миллиграммах на литр активного химозина и миллиграммах на литр активного пепсина.
Общая молокосвертывающая активность первой партии контрольного сычужного порошка из желудка
телят и первой партии контрольного сычужного порошка от взрослых животных раз и навсегда была
установлена на уровне 1000 ММЕ/г. Будущие препараты стандартных проб должны быть установлены
относительно предыдущих стандартных проб (см. ISO 11815⎪IDF 157).
Данный международный стандарт устанавливает требования как к ручной, так и к альтернативной
автоматизированной упаковке колонок для анионообменной хроматографии.
Это контрольный метод и, поэтому, изменения могут быть сделаны только в случае подтверждения
получения того же результата, а повторяемость и воспроизводимость, по крайней мере, так же высока,
как в исходном контрольном методе. Любые изменения установленного в настоящем стандарте
метода также должны быть указаны в протоколе испытаний (см. Раздел 10).
4 Реактивы
Если не указано иное, используют реактивы только установленной аналитической чистоты и
© ISO и IDF 2012 – Все права сохраняются 1

IDF 110:2012(R)
дистиллированную или деминерализованную воду или воду эквивалентной чистоты.
® 1) ®
4.1 Смола, Fractogel EMD DEAE (M) (Merck cat. no. 1.16883) или Mono Q 1 мл предварительно
2)
упакованной колонки (HR 5/5 или 5/50 GL от GE Healthcare) или эквивалентная смола.

® ®
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Fractogel EMD DEAE (M) подходящая смола для ручного ввода проб, а Mono Q подходит для
автоматического ввода. ®
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Если смолу Fractogel или Mono Q заменить другой смолой, то скорее всего появится
необходимость заменить и буферные растворы в 4.12, что приведет к необходимости повторной оценки метода.
4.2 Пиперазина гексагидрат (C H N ⋅6H O).
4 10 2 2
4.3 Хлорид натрия (NaCl).
4.4 Тимол, необязательный консервант.
4.5 Гидроксид натрия (NaOH).
4.6 Раствор соляной кислоты solution, c(HCl) = 1 моль/л.
4.7 Этанол (C H OH), с объемной долей не менее 96 %.
2 5
4.8 Этанол (C H OH), с приближенной объемной долей не менее 20 %.
2 5
Добавляют 105 мл 96 % этанола (4.7) к 400 мл воды и перемешивают. Если требуется стерильная
фильтрация, фильтруют воду до перемешивания с этанолом.
4.9 Мочевина, c(N H CO) = 8 моль/л.
2 4
Растворяют 48 г мочевины в воде и доводят до общего объема 100 мл.
3)
4.10 Система трубок для диализа, диаметром около 1 см (Union Carbide) или эквивалентного
(необязательно).
ПРИМЕЧАНИЕ Качество системы трубок для диализа не является решающим.
4)
4.11 Колонки для обессоливания, Bio-Rad – Econopac 10DG (cat. no. 732-2010) или эквивалентные
(необязательно).
Используют или систему трубок для диализа (4.10) или колонки для обессоливания для обессоливания
сычужного фермента.
4.12 Буферные растворы
4.12.1 Буферный раствор I, пиперазин [(CH ) (NH) ], c[(CH ) (NH) ] = 0,025 моль/л.
2 4 2 2 4 2 ®
1) Fractogel EMD DEAE (M) – это пример имеющегося в продаже подходящего продукта. Информация дается для
удобства пользователей данного документа и не свидетельствует о поддержке этого продукта со стороны ISO или IDF. ®
2) Mono Q 1 мл предварительно упакованной колонки – это пример имеющегося в продаже подходящего
продукта. Информация дается для удобства пользователей данного документа и не свидетельствует о поддержке
этого продукта со стороны ISO или IDF.
3) Union Carbide – это пример имеющегося в продаже подходящего продукта. Информация дается для удобства
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4) Bio–RAD - Econopac 10DG - это пример имеющегося в продаже подходящего продукта. Информация дается для
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IDF 110:2012(R)
Отвешивают 4,85 г пиперазина (4.2) и 42,8 г раствора соляной кислоты (4.6) в лабораторный стакан и
перемешивают. Переносят по частям содержимое стакана в 1000 мл мерную колбу с одной меткой
(5.5), доводят водой до метки 1000 мл и перемешивают. Показатель pH должен быть равен 5,30 ± 0,05.
Если это не так, регулируют пиперазином или соляной кислотой. Перед использованием дегазируют и
консервируют буферный раствор, как описано в 4.12.5.
4.12.2 Буферный раствор I, c(NaCl) = 0,25 моль/л.
Отвешивают 14,6 г NaCl в 1000 мл мерную колбу с одной меткой (5.5). Добавляют буферный раствор I
(4.12.1) до 1000 мл метки и перемешивают. pH не регулируют. Буферный раствор II используется
только для ручного метода. Перед использованием дегазируют и консервируют буферный раствор, как
описано в 4.12.5.
4.12.3 Буферный раствор III, c(NaCl) = 0,50 моль/л.
Отвешивают 29,2 г NaCl в 1000 мл мерную колбу с одной меткой (5.5). Добавляют буферный раствор I
(4.12.1) до 1000 мл метки и перемешивают. pH не регулируют. Буферный раствор III используется
только для ручного метода. Перед использованием дегазируют и консервируют буферный раствор, как
описано в 4.12.5.
4.12.4 Буферный раствор IV, c(NaCl) = 1,0 моль/л.
Отвешивают 58,4 г NaCl в 1000 мл мерную колбу с одной меткой (5.5). Добавляют буферный раствор I
(4.12.1) до 1000 мл метки и перемешивают. pH не регулируют. Буферный раствор III используется
только для ручного метода. Перед использованием дегазируют и консервируют буферный раствор, как
описано в 4.12.5.
4.12.5 Дегазация и консервация
Перед использованием дегазируют буферные растворы от I до IV (4.12.1 to 4.12.4) в вакууме, или
используя ультразвуковую водяную баню. Консервируют буферные растворы от I до IV для ручного
метода, добавляя несколько кристаллов тимола, а для автоматического метода применяют
стерильную фильтрацию, используя фильтр размером 0,2 мкм.
Буферные растворы от I до IV можно хранить не менее 5 дней при комнатной температуре или в
течение 2 месяцев в холодильнике.
5 Аппаратура
Обычная лабораторная аппаратура и, в частности, следующая.
5.1 Многоканальный перистальтический насос или другой подходящий насос (только для
ручного ввода).
5.2 pH-метр, чувствительностью ±0,01 pH единицы.
5.3 Хроматографическая колонка, диаметром ~1,0 см и длиной 10 см, с адаптером потока в одном
направлении или эквивалентная колонка, подходящая для слоя геля высотой ~5 см (только для
ручного ввода).
5.4 Магнитная мешалка.
[2]
5.5 Мерные колбы с одной меткой, нужной вместимости, ISO 1042 .
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IDF 110:2012(R)
®5) ®6)
5.6 FPLC , ÄKTA или HPLC оборудование, пригодное для поставленной цели, используется
только для автоматического ввода.
5.7 Лабораторное оборудование, для определения времени свертывания (см. ISO 11815⎪IDF 157).
6 Отбор проб
Отбор проб не является частью метода, рассматриваемого в данном международном стандарте.
[1]
Рекомендуемый метод отбора проб приводится в стандарте ISO 707⎪IDF 50 .
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Отбор проб жидкого сычужного фермента установлен в стандарте ISO 707⎪IDF 50:2008,
Раздел 9, а порошкового фермента – в стандарте ISO 707⎪IDF 50:2008, Раздел 13.
Репрезентативную пробу следует направить в лабораторию. Проба не должна быть повреждена или
изменена при транспортировке или хранении.
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Порошковые продукты можно быстро разделить.
Пробы хранят в темном месте при температуре от 0°C до 5°C.
7 Методика
7.1 Проверка
Перед проведением анализа проверяют сычужный фермент на отсутствие основных
молокосвертывающих ферментов не говяжьего происхождения, используя подходящий метод (см.
Приложение A). Однако, проверку можно не проводить, если известно, что фермент содержит химозин
и пепсин только говяжьего происхождения.
7.2 Подготовка чистой колонки со смолой Fractogel
После дегазации в вакууме разливают суспензию готовой к использованию смолы Fractogel (4.1)
непосредственно из бутыли поставщика, или используя ультразвуковую водяную баню, в колонку (5.3),
установленную в вертикальном положении, с открытым выпуском, пока слой осажденной смолы
Fractogel не достигнет высоты от 4,5 см до 5,5 см. Гелевая основа не должна быть сухой во время
проведения процедуры.
Закрывают выпускную трубку. Погружают конец впускного отверстия трубки перистальтического насоса
в лабораторный стакан с буферным раствором I (4.12.1). Подсоединяют трубку адаптера к отводной
трубке насоса. Регулируют скорость потока до (1,3 ± 0,1) мл/мин. Заполняют трубку адаптера
буферным раствором I (4.12.1), не превышая общий внутренний объем трубок 1,5 мл.
Закрывают колонку адаптером, как указано поставщиком колонки. Сжимают адаптером несколько
миллиметров гелевой основы, чтобы ликвидировать свободное пространство над ней. Следует
предупредить попадание пузырьков воздуха в колонку. Промывают колонку буферным раствором I
(4.12.1) в течение 5 мин при скорости потока 1,3 мл/мин.
®
5) FPLC – это пример имеющегося в продаже подходящего продукта. Информация дается для удобства
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6) ÄKTA – это пример имеющегося в продаже подходящего продукта. Информация дается для удобства
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7.3 Регенерация и уравновешивание смолы Fractogel в колонке
После подготовки новой колонки и после каждого цикла проводят регенерацию и приведение в
равновесие смолы Fractogel (4.1) в колонке следующим методом.
Регенерируют смолу Fractogel в колонке со скоростью потока 1,3 мл/мин, используя не менее 15 мл
буферного раствора IV (4.12.4) (∼11,5 мин). Приводят в равновесие колонку, используя не менее 40 мл
буферного раствора I (4.12.1) (∼30 мин). После этого колонка готова для загрузки пробы для анализа.
Одну и ту же колонку можно использовать более 20 раз. Более тщательно очищают колонку после
частого использования, промывая ее 0,1 моль/л NaOH в течение 10 мин, а затем водой в течение 10
мин. Затем проводят обычную процедуру регенерации и приведения в равновесие, как описано выше.
7.4 Хранение колонки со смолой Fractogel
Если колонка должна храниться более 1 недели, ее промывают не менее, чем 15мл 20% этанола (4.8)
с помощью перистальтического насоса (5.1). Хранят колонку с плотно закрытыми впускными и
выпускными каналами.
Колонку можно хранить несколько месяцев при комнатной температуре, стараясь избегать попадания
прямого солнечного света.
7.5 Приготовление пробы для испытания
7.5.1 Общие требования
Жидкие образцы могут быть использованы в том виде, как они есть; необходимо только следовать
процедуре, описанной в 7.5.2.
Порошковую пробу сычужного фермента готовят следующим образом. Растворяют порошковую пробу
фермента так, чтобы получить, например, 200 ММЕ/мл, в подходящем количестве буферного раствора
I (4.12.1), или с использованием буферного раствора с рН 5,5 (см. ISO 11815⎪IDF 157) перед
обессоливанием.
Определяют время свертывания растворенной пробы фермента в соответствии с ISO 11815⎪IDF 157
перед обессоливанием. Проводят приблизительную оценку активности пробы, в ММЕ/мл,
устанавливая ее относительно эталона сычужного фермента, чтобы определить количество пробы на
колонку (7.6.1 or 7.6.2).
Если результаты выражаются в миллиграммах на литр, определяют время свертывания пробы
сычужного фермента, по меньшей мере, дважды в соответствии с ISO 11815⎪IDF 157. В этом случае
измеряют время свертывания одновременно или в быстрой последовательности "до" и "после"
обессоливания.
Перед внесением пробы для анализа в колонку, обессоливают ее путем диализа (7.5.2) или гель-
фильтрации (7.5.3).
7.5.2 Обессоливание путем диализа
Погружают диализную трубку (4.10) в кипящую воду на 5 мин и промывают ее внутри и снаружи водой.
Диализируют 5 мл исследуемой приготовленной пробы (7.5) (около 900 ММЕ) по отношению к 500мл
буферного раствора I (4.12.1) при 4°C в течение не менее 5 ч, но не более 20 ч. Сжимают очень крепко
рукой диализную трубку, чтобы перекрыть ее в целях сокращения разбавления, которое происходит во
время диализа. Во время диализа перемешивают буфер магнитной мешалкой (5.4).
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Если результаты выражаются в миллиграммах на литр, определяют время свертывания диализируемой
пробы сычужного фермента, по меньшей мере, дважды в соответствии с ISO 11815⎪IDF 157.
7.5.3 Обессоливание путем гель-фильтрации
Следуют инструкциям поставщика.
Уравновешивают колонку обессоливания (4.11) буферным раствором I (4.12.1). Используют 3,3 мл
приготовленной пробы (7.5) на колонку. Элюируют пробу буферным раствором I (4.12.1) объемом 4,0 мл.
Для проб с низким содержанием химозина или пепсина иногда необходимо выполнить вышеуказанную
процедуру дважды, чтобы получить достаточную активность фермента и иметь возможность адекватно
определить низкое содержание компонента.
Если результаты выражаются в миллиграммах на литр, определяют время свертывания пробы сычужного
фермента путем гель-фильтрации, по меньшей мере, дважды в соответствии с ISO 11815⎪IDF 157.
7.5.4 Срок службы колонки
Чтобы продлить срок службы колонок и избежать закупоривания, рекомендуется выполнить
следующие процедуры по регулярной очистке обессоливающих колонок.
После каждого дня использования промывают всю колонку чистой водопроводной или
дистиллированной водой. Вводят приблизительно 5 мл мочевины концентрацией 8 моль/л на колонку и
затем сливают. Промывают колонку один раз водопроводной водой и уравновешивают, пропуская
полный объем резервуара с буферным раствором I (4.12.1) через колонку.
Хранят уравновешенные колонки в прохладном месте с небольшим количеством буферного раствора
над поверхностью геля. Для длительного хранения рекомендуется хранить колонку в буферном
растворе или дистиллированной воде с добавлением консервантов (см. инструкцию поставщика). При
соблюдении этой процедуры можно использовать каждую колонку до двух лет или пока значительно не
снизится скорость потока.
7.6 Анализ обессоленного сычужного фермента
7.6.1 Разделение химозина и пепсина в обычной колонке. Ручной ввод
После приведения колонок в равновесие, как указано в 7.3, с помощью насоса (5.1) вводят в колонку
определенное количество обессоленной пробы для анализа (7.5.2 или 7.5.3), погружая конец входной
трубки насоса в трубку с пробой. Устанавливают скорость потока 1,3 мл/мин.
Количество пробы должно быть достаточным, чтобы после разделения, всякий раз, когда это
возможно, время свертывания наиболее слабой фракции составляло от 350 с до 550 с, но не
настолько большим, чтобы можно было обнаружить активность в промежуточной фракции или в
элюате после второй фракции. В большинстве случаев будет достаточным объем от 3 мл до,
максимум, 5 мл пробы после обессоливания. Однако, общее количество ММЕ на колонку не должно
превышать 900 международных молокосвертывающих единиц. Если результаты выражаются в
миллиграммах на литр, необходимо точно знать количество, добавляемое в колонку. Этого не
требуется, если результаты выражаются только в процентах.
Когда проба почти полностью введена во входную трубку, промывают трубку для анализа буферным
раствором II объемом 1 мл (4.12.2). Следует избегать попадания пузырьков воздуха в трубку.
Повторяют промывание после того, как первый промывочный раствор введен во входную трубку.
Погружают конец входной трубки в стакан, содержащий не менее 50 мл буферного раствора II (4.12.2). Собирают
первую фракцию элюата в 50 мл мерную колбу с одной меткой (5.5). Собирают или точно до метки 50 мл или, для
удобства, до объема 47 мл. В последнем случае доводят до метки 50 мл буферным раствором II (4.12.2).
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IDF 110:2012(R)
Затем собирают пробу в количестве 3 мл в небольшой стакан, которую обозначают как промежуточную фракцию.
Далее, погружают конец входной трубки перистальтического насоса (5.1) в стакан, содержащий не
менее 50 мл буферного раствора III (4.12.3). Собирают вторую элюированную фракцию в другую 50 мл
мерную колбу с одной меткой (5.5). Собирают или точно до метки 50 мл или, для удобства, до объема
47 мл. В последнем случае доводят до метки 50 мл буферным раствором III (4.12.2).
Затем собирают пробу в количестве 3 мл в небольшой стакан, которую обозначают как вторичную фракцию.
ПРИМЕЧАНИЕ Первая элюированная фракция содержит химозин. Промежуточная фракция используется для
проверки правильности разделения двух ферментов. Вторая элюированная фракция содержит говяжий пепсин.
Вторичная фракция используется, чтобы проверить полное извлечение пепсина.
Если известно, что проба содержит очень малое количество химозина или пепсина, элюированные
фракции 1 и 2 можно собрать в небольшие мерные колбы, например, объемом 25 мл.
® ®
7.6.2 Разделение химозина и пепсина на оборудовании для FPLC /ÄKTA /HPLC.
Автоматический ввод
7.6.2.1 Следуют общим инструкциям к оборудованию (5.6) и колонке Mono Q (4.1), используя
только буферные растворы I (4.12.1) и IV (4.12.4).
Составляют программу проведения анализа. Проверяют правильность разделения и соответствие
полученных результатов ручному контрольному методу. При автоматическом вводе, хроматограмма
дана с уменьшением на коэффициент 5, то есть 10 мл фракции собирают вместо 50 мл фракций,
собираемых ручным способом. Кроме того, нет необходимости собирать промежуточную фракцию,
потому что хроматограмма показывает, разделены ли химозин и пепсин полностью на фракции с
одним ферментом в каждой.
Если колонка не использовалась в течение последних 24 ч, проводят слепой опыт, используя
буферный раствор I (4.12.1) в качестве пробы для анализа.
7.6.2.2 Следующие рекомендации для программы подходят для использования пробы объемом 0,5 мл или 1,0 мл.
a) Начинают (с буфером 0,0 мл) со 100 % буфера I (4.12.1) при скорости потока 2 мл/мин и
регистрируют на длине волны 280 нм. Вводят пробу, которая была предварительно введена в
петлю 0,500 мл или 1,000 мл, в колонку.
b) После элюирования 0,60 мл буфера I (4.12.1), начинают собирать фракцию
...