ISO/TS 23758:2021
(Main)Guidelines for the validation of qualitative screening methods for the detection of residues of veterinary drugs in milk and milk products
Guidelines for the validation of qualitative screening methods for the detection of residues of veterinary drugs in milk and milk products
This document describes general workflows and protocols for the validation and the verification of qualitative screening tests for the detection of residues of veterinary drugs in liquid milk (raw, pasteurized, UHT and reconstituted milk powders and whey protein extracts) including biological methods. This guideline does not cover the validation of residue analysis by HPLC, UHPLC or LC-MS/MS. This document is intended to be useful for manufacturers of screening test kits, laboratories validating screening methods or tests, competent authorities and dairies or end users of reagents or tests for the detection of veterinary drug residues in milk products. This document facilitates and improves the validation and verification of screening methods. The goals of this document are a harmonization in validation of methods or test kits in order for all stakeholders to have full trust in the result of residue screening and to limit the overlap and multiplication of validation work in different laboratories by sharing the validation results generated by an independent laboratory. Furthermore, a harmonized validation and verification procedure allows for comparison of the performance of different screening methods. This document does not imply that all end users are bound to perform all verification work proposed. The verification of the correct use of reagents/kits for the detection of antimicrobials is not part of the scope of this document.
Lignes directrices pour la validation des méthodes qualitatives de dépistage des résidus de médicaments vétérinaires dans le lait et les produits laitiers
Le présent document spécifie des processus et protocoles généraux pour la validation et la vérification des essais qualitatifs de dépistage des résidus de médicaments vétérinaires dans le lait à l’état liquide (lait cru, lait pasteurisé, lait UHT et lait en poudre reconstitué et concentrés de protéine de lactosérum) incluant des méthodes biologiques. Ces lignes directrices ne couvrent pas la validation de l’analyse des résidus par CLHP, CLUHP ou CL-SM/SM. Le présent document vise à apporter une aide aux fabricants de kits d’essai de dépistage, aux laboratoires validant des méthodes de dépistage ou des essais, aux autorités compétentes et aux laiteries ou aux utilisateurs finaux de réactifs ou d’essais dans le cadre du dépistage de résidus de médicaments vétérinaires dans les produits laitiers. Le présent document facilite et améliore la validation et la vérification de méthodes de dépistage. Le présent document vise d’une part à harmoniser la validation des méthodes ou des kits d’essai afin que l’ensemble des parties prenantes aient une totale confiance dans le résultat d’un dépistage de résidus, et d’autre part à limiter le chevauchement et la multiplication des activités de validation menées par différents laboratoires en partageant les résultats de validation produits par un laboratoire indépendant. Une procédure harmonisée de validation et de vérification permet en outre de comparer les performances de différentes méthodes de dépistage. Le présent document ne sous-entend pas que tous les utilisateurs finaux soient liés pour réaliser l’ensemble des activités de vérification proposées. La vérification de l’usage correct des réactifs/kits de dépistage des antimicrobiens n’est pas couverte par le domaine d’application du présent document.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 23758
IDF/RM 251
First edition
2021-08
Guidelines for the validation of
qualitative screening methods for the
detection of residues of veterinary
drugs in milk and milk products
Lignes directrices pour la validation des méthodes qualitatives de
dépistage des résidus de médicaments vétérinaires dans le lait et les
produits laitiers
Reference numbers
IDF /RM 251:2021(E)
©
ISO and IDF 2021
IDF /RM 251:2021(E)
© ISO and IDF 2021
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IDF /RM 251:2021(E)
Contents Page
Forewords .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 4
5 General requirements for the test/kit . 5
6 Reagents . 5
6.1 Standard blank matrix . 5
6.2 Antibiotics . 6
6.3 Standard stock solution . 6
6.4 Working stock solutions . 6
6.5 Spiked sample . 6
7 Apparatus . 7
8 Sample Preparation. 7
8.1 Stock solution preparation . 7
8.2 Working stock solution preparation . 8
8.3 Blank matrix sample selection . 8
8.4 Spiked sample creation . 8
9 Procedure. 8
9.1 Validation . 8
9.1.1 General. 8
9.1.2 Detection capability (CCβ). 9
9.1.3 Test selectivity/specificity .13
9.1.4 Robustness testing .14
9.1.5 Reader and test repeatability .18
9.1.6 Participation in a(n) (inter)national ring trial .20
9.2 V erification testing of a transferred screening method .20
9.2.1 General.20
9.2.2 Detection capability .21
9.2.3 Test selectivity/specificity .21
9.2.4 Robustness testing .21
9.2.5 Reader and test repeatability .21
9.2.6 Participation in a(n) (inter)national ring trial .23
Annex A (informative) European legislation on veterinary drugs in cow milk .24
Annex B (informative) USA legislation on animal drug residues in milk .28
Annex C (informative) List of problematic compounds in the preparation of stock solutions .29
Annex D (informative) Summary of the stability of antibiotics in solution and in matrix .30
Bibliography .33
IDF /RM 251:2021(E)
Forewords
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national
standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally
carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented on that committee.
International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part
in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
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expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso .org/
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This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with the European
Committee for Standardization (CEN) Technical Committee CEN/TC 302, Milk and milk products —
Methods of sampling and analysis, in accordance with the Agreement on technical cooperation between
ISO and CEN (Vienna Agreement). It is being published jointly by ISO and IDF.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
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IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the
interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National
Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national
interest groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and
governments/food control authorities.
ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis
and sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International
Standards using the logos and reference numbers of both organizations.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
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on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
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constitute an endorsement.
This document was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Additives and
Contaminants and ISO Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and
milk products, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 302, Milk and milk products — Methods of sampling and analysis, in accordance
with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement). It is being
published jointly by ISO and IDF.
This IDF Reviewed method is equal to an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) or an ISO
Technical Specification (ISO/TS) and is therefore published jointly under ISO conditions.
The work was carried out by the IDF-ISO Action Team on A10 of the Standing Committee on Analytical
Methods for Additives and Contaminants under the aegis of its project leader Dr W. Reybroeck (BE).
TECHNICAL SPECIFICATION
IDF /RM 251:2021(E)
Guidelines for the validation of qualitative screening
methods for the detection of residues of veterinary drugs
in milk and milk products
1 Scope
This document describes general workflows and protocols for the validation and the verification
of qualitative screening tests for the detection of residues of veterinary drugs in liquid milk (raw,
pasteurized, UHT and reconstituted milk powders and whey protein extracts) including biological
methods. This guideline does not cover the validation of residue analysis by HPLC, UHPLC or LC-MS/MS.
This document is intended to be useful for manufacturers of screening test kits, laboratories validating
screening methods or tests, competent authorities and dairies or end users of reagents or tests for the
detection of veterinary drug residues in milk products. This document facilitates and improves the
validation and verification of screening methods. The goals of this document are a harmonization in
validation of methods or test kits in order for all stakeholders to have full trust in the result of residue
screening and to limit the overlap and multiplication of validation work in different laboratories by
sharing the validation results generated by an independent laboratory. Furthermore, a harmonized
validation and verification procedure allows for comparison of the performance of different screening
methods.
This document does not imply that all end users are bound to perform all verification work proposed.
The verification of the correct use of reagents/kits for the detection of antimicrobials is not part of the
scope of this document.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
biological method
method that is used to detect cellular responses to analytes
EXAMPLE Inhibition of bacterial growth, immunological test, and receptor test.
3.2
qualitative method
method that gives a yes/no response, with no indication of the concentration of the putative analyte
EXAMPLE 1 Bacterial growth inhibition tests which give a result of either “no zone” or “zone of inhibition”.
EXAMPLE 2 Inhibition tests which give a colour change of growth medium.
IDF /RM 251:2021(E)
EXAMPLE 3 Immunochemical/ligand binding tests, where a response is considered as “above” or “below” a
cut-off level; or where analytes with different cross-reactivities are included within the method scope.
EXAMPLE 4 Biosensors.
3.3
matrix
non-analyte portion of the sample
Note 1 to entry: Matrices are included in the scope.
3.4
detection capability
CCβ
smallest content of the analyte that can be detected, identified and/or quantified in a sample with an
error probability of β
Note 1 to entry: The β error is the probability that the tested sample is truly non-conformant even though a
conformant measurement has been obtained.
3.5
cut-off level
response or signal from a screening test which indicates that a sample contains an analyte at or above
the screening target concentration
3.6
blank matrix sample
negative control sample
sample from animals with known history of treatment which have not been exposed to the substance
in question
Note 1 to entry: If samples from such animals are not available, samples which have been previously confirmed
as conformant and not containing residues of the substance of interest by suitably sensitive physicochemical
tests can also be acceptable.
Note 2 to entry: See Table 1.
3.7
positive control sample
control sample that is spiked with the test analyte at the screening target concentration
Note 1 to entry: This can, however also be an incurred-positive sample (i.e. sample taken from animals which
have been treated with the substance in question) or Certified Reference Material.
3.8
screening target concentration
concentration at which a screening test categorizes the sample as “screen positive” (potentially non-
conformant)
Note 1 to entry: This should always be lower than the regulatory limit.
3.9
validation
confirmation, through the provision of objective evidence, that the requirements for a specific intended
use or application, such as a test or measurement method, have been fulfilled
EXAMPLE Procedure applied in the originator laboratory (manufacturer’s laboratory) or in an independent
laboratory.
Note 1 to entry: Validation often determines the fitness for purpose of a method.
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IDF /RM 251:2021(E)
3.10
verification
procedure applied to a method which has been previously validated in the case of a transfer validation
Note 1 to entry: The verification procedure is applied by a receptor laboratory for the same matrix as initially
validated, to demonstrate that the method will work reliably in that laboratory with locally sourced milk and is
fit for purpose.
3.11
originator laboratory
laboratory that has performed the complete validation of the method
Note 1 to entry: This is by preference an ISO/IEC 17025 accredited independent laboratory and preferably not the
laboratory that developed the method. The laboratory should have experience in residue testing and in validation
of screening tests for the detection of residues of veterinary drugs in milk.
3.12
receptor laboratory
laboratory that will perform the verification of the method
Note 1 to entry: This could be any laboratory interested in using the method.
3.13
spectrum
range of substances that a test can detect
Note 1 to entry: Some tests detect several classes of antibiotics and a large number of substances, whereas others
are more specific.
3.14
regulatory limit
level defined by food legislation for residues in food
Note 1 to entry: Regulatory limits can be MRL (see 3.15), MRPL (see 3.16), RPA (see 3.17).
3.15
maximum residue limit for veterinary drugs
MRL
maximum concentration of residue resulting from the use of veterinary drugs that is recommended by
the Codex Alimentarius Commission to be legally permitted or recognized as acceptable in food
Note 1 to entry: Antibiotics are used to treat and prevent diseases in animal husbandry and as a result, low
residues of antibiotics can be present in food. MRLs are set for pharmacologically active substances used or
intended to be used in veterinary medicinal products placed on the market. In the EU the MRLs are set by EMA
(European Medicines Agency).
3.16
minimum required performance limit
MRPL
minimum content of an analyte in a sample, which at least has to be detected and confirmed
Note 1 to entry: MRPL is intended to harmonize the analytical performance of methods for substances for which
no permitted limit has been established.
3.17
reference point for action
RPA
level of a residue of a pharmacologically active substance established for control reasons in the case
of certain substances for which a maximum residue limit has not been laid down following certain EU
regulations
Note 1 to entry: EU Regulation 470/2009 is applicable for maximum residue limits.
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Note 2 to entry: RPAs are currently based on analytical considerations (i.e. the lowest concentration that can
be quantified using a validated analytical method). The aim is “to define an analytical concentration for a non-
allowed pharmacologically active substance that can be determined by official control laboratories and that is
[19]
low enough to adequately protect the consumers of food commodities which contain that substance” .
3.18
positive / negative result
result of the test after interpretation of the reading of the test taking into account the (pre-set) cut-off
level
Note 1 to entry: Positive result: presence of antimicrobial residues (microbial inhibitor test) or presence of
residues of veterinary drugs.
Note 2 to entry: Negative result: absence of antimicrobial residues (microbial inhibitor test) or absence of
residues of veterinary drugs. Since only screening tests are involved, no judgement about ‘conformant’ or ‘non-
conformant’ can be made.
3.19
repeatability limit
value less than or equal to which the absolute difference between two measurement results obtained
under repeatability conditions is expected with a probability of 95 %
3.20
probability of detection
POD
proportion of positive analytical outcomes for a qualitative method for a given matrix at a given analyte
level or concentration
[7]
Note 1 to entry: POD is concentration dependent (AOAC, 2014 ).
4 Principle
Samples of matrix spiked with known levels of analyte are run on the test under validation or
verification to determine the detection capability, sensitivity and robustness of the test. Evaluation of
the test results determines the tests' suitability for routine use in screening milk for the presence of
veterinary residues.
NOTE Annex B provides information on FDA tolerances and/or safe levels of animal drug residues in milk.
The key requirement for a screening method is its ability to reliably detect the analyte in question at the
chosen screening target concentration. The screening target concentration should be chosen to avoid
false-negative results, i.e. low enough to ensure that if the analyte in question is present in the sample
at the Regulatory Limit, the sample will be classified as 'Screened Positive'.
Both validation and verification should provide the objective evidence that this key requirement is met.
Validation should cover the entire matrix/species/analyte combinations claimed within the scope of
the method standard operating procedure (SOP). Validation should be as broad as possible to cover the
scope of all end users.
Verification should cover the matrix/species/analyte combinations included in the scope of the
implementing (receptor) laboratory. The extent of validation required is variable, depending on whether
it is a validation or a verification of a transferred method.
The verification does not need to cover the entire spectrum if the implementing laboratory is to be
applicable to only a limited scope (e.g. some species and not others, some residues more relevant than
others, raw but not UHT [Ultra-High temperature] milk, etc.).
If a receptor laboratory wants to use the method for screening in a different matrix (IDF 2014) not tested
by the originator laboratory, the receptor laboratory should test all necessary validation parameters to
prove that the method functions for that specific matrix.
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5 General requirements for the test/kit
The developer or the manufacturer should provide information regarding methodology, test reagents,
additional chemicals not necessarily included in the kit, operating requirements (information about
the reading system, cut-off level), test specifications and documentation (extracted from ISO 18330
and ISO 13969). Additionally, the target country(ies) and its/their specific regulatory limits should be
known, in order for the test to be evaluated against the appropriate regulatory limits.
Elements of information to be provided by the manufacturer/distributor/lab manager (in case of an in-
house developed method) before starting the validation are as follows:
— Test principle, principle of reading and interpretation of the test (including cut-off level or calculation
of cut-off level).
— Test formats, if relevant (e.g. ampoules/plates).
— Scope of the test:
— Matrices suitable to be tested: matrices in the scope of the document (see Clause 1).
— Animal species producing the milk.
— Matrices with potential impact (interference) on the result.
— Potential impact of the use of sample preservatives.
— Spectrum of the test: list of veterinary drugs and expected detection capabilities (so far known).
— List with the current regulatory limits (RL) for the detectable veterinary drugs in the matrix(ces) of
concern in the country(ies) of concern.
— Detailed protocol in a language understood by laboratory staff: if minor modifications need to be
made to the method according to the matrix/species, they should be announced in the test protocol
(kit manual).
6 Reagents
6.1 Standard blank matrix
— The raw milk used is commingled milk coming from at least 4 animals not treated with veterinary
drugs within the last 2 months, in mid lactation, and delivering milk with a low to moderate number
−1
of somatic cells (e.g. < 150 000 ml for bovine milk). The raw milk is collected in sterile containers
and kept below 4 °C. The maximum period for the cold storage of the fresh raw milk should be in line
with the definition of fresh raw milk as fixed locally.
— The milk used should be in line with the normal milk produced in the country or area of concern.
This means that the composition and quality of the milk should approach the average composition
of the milk of the country/region.
— Table 1 gives examples of parameters to consider for ‘normal’ milk. Actual figures are likely to vary
depending on country and region.
— Milk of at least 4 animals is commingled and is considered as a sample of standard blank matrix.
At least four such samples should be used for the determination of the detection capability when
testing 20 replicates. If 40 or 60 replicates need to be tested to determine the detection capability,
eight or twelve different blank milk samples should be used, respectively. At least four different
commingled milks should be sourced and used in the verification work (20 replicates).
— The use of thawed or reconstituted lyophilized milk could also be authorized, but strictly on
condition. The pre-requisite condition to work with these alternative solutions, is to demonstrate
IDF /RM 251:2021(E)
previously the equivalence of results between raw milk and thawed or reconstituted lyophilized
milk, after the analysis of negative and positive milk samples.
Table 1 — Examples of reference data for the composition and quality of normal milk of
different animal species
b
TBC pH Antibiotics Lactating period
a d e
SCC FC PC
Species c
cfu per
cells per ml g/l g/l
ml
6,7 to
Target value < 150 000 < 30 000 40 33
Between 60 and
6,8
Cow Absence 200 days after
Acceptable 35 to 6,6 to
calving
< 400 000 < 100 000 30 to 36
range 45 6,9
6,7 to
Target value < 2 000 000 < 60 000 38 34
Between 20 and
6,8
Goat Absence 150 days after
Acceptable 30 to 6,6 to
kidding
28 to 40
range 50 6,9
6,7 to
Target value < 2 000 000 < 60 000 70 55
Between 20 and
6,8
Ewe Absence 150 days after
Acceptable 50 to 6,6 to
lambing
40 to 70
range 90 6,9
a
Somatic cell count.
b
Total bacterial count.
c
Colony forming units.
d
Fat content.
e
Protein content.
6.2 Antibiotics
Only use analytical grade or certified reference material for validation or verification purposes.
6.3 Standard stock solution
— Standard stock solutions of the antibiotic at 100 mg/l are made in water or a suitable solvent and
[14]
kept below 4 °C (refer to 8.1) . The shelf life depends on the stability of the molecule.
— In the preparation of the stock solution, correction for impurity and water content is performed.
— For each substance a single stock solution is prepared, but by preference for certain problematic
compounds (for example solubility problem, stability), at least two stock solutions should be
prepared to determine the detection capability. A list of problematic compounds is given in Annex C.
— If only one stock solution is used it should be either prepared from certified material or verified
with an independent physicochemical method.
— Some compounds like tetracyclines are light sensitive and need to be kept protected from light.
Other compounds can require specific requirements for the glassware used.
6.4 Working stock solutions
Dilutions of 10 mg/l to 0,1 mg/l are freshly prepared on a daily basis.
6.5 Spiked sample
For the preparation of end concentration, the final spiking is performed in the standard blank matrix.
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IDF /RM 251:2021(E)
The blank milk will be spiked with each analyte.
The added volume of working stock solution should be below 5 % of the final volume of the milk sample
to be tested.
7 Apparatus
Any apparatus specified in the test kits procedure that is not provided by the test kit manufacturer.
7.1 Test kit, in which reagents of at least two and by preference three different production lots are
used.
Production lots should be determined randomly and be representative of the production level of the
product.
7.2 Incubator or water-bath, capable of maintaining the appropriate incubation temperature for the
test.
If the manufacturer has an incubator that is designed for the test, this incubator should be supplied by
the manufacturer for use in the validation or verification.
7.3 Automated readers. If the manufacturer provides an apparatus for evaluating the results from the
test, this apparatus should be supplied by the manufacturer for use and evaluation in the validation or
verification.
Calibration procedures for the automated reader shall be made available and all readings shall be taken
from only calibrated equipment.
7.4 Micropipettes, capable of delivering the appropriate amount of sample required for use in the
test.
If the test kit supplies micropipettes or other liquid transfer equipment these should be by preference
evaluated as part of the validation or verification.
8 Sample Preparation
8.1 Stock solution preparation
A 100 mg/l solution of each antibiotic is prepared by first calculating the amount of reference material
needed to give 10 mg ± 0,1 mg of active compound. This calculation is done using Formula (1) and the
information (purity, water content) from the certificate of analysis of the antibiotic.
100 100
mm=× × (1)
ma
PW100−
where
m is the mass of the material required, in mg;
m
m is the mass of the analyte required, in mg;
a
P is the purity, in %;
W is the water content, in %.
Weigh this amount directly in a weight boat and transfer into a 100 ml volumetric flask and make up to
100 ml using the appropriate solvent.
IDF /RM 251:2021(E)
The samples are vortexed or sonicated until dissolved. These can be kept at 4 °C for up to 4 weeks or
at −18 °C or lower for up to 12 months. Stability of different antimicrobials in solution and in matrix at
different storage temperatures are given in Table D.1 and Table D.2.
8.2 Working stock solution preparation
If necessary, intermediate stocks of 100 000 µg/l, 10 000 µg/l, 1 000 µg/l or 100 µg/l, respectively (or
other appropriate concentrations) are made up in distilled water and stored at 4 °C to 6 °C for maximum
one day.
8.3 Blank matrix sample selection
For each antibiotic to be tested, the number of different samples of standard blank matrix from
different sources to be tested depends on the closeness of the predicted detection capability (CCβ) to
the regulatory limit:
— If CCβ is below or equal to half MRL: at least two different batches of milk for 20 replicates.
— If CCβ is between 50 % and 90 % of MRL: at least four different batches of milk for 40 replicates.
— If CCβ is near MRL (≥90 % to 100 % of MRL): at least six different batches of milk for 60 replicates.
— If CCβ is above MRL: at least two different batches of milk for 20 replicates.
The sample should be of sufficient size to provide multiple test portions of the size specified by the test
protocol. When selecting the source of the milk, samples covering the range of “normally” produced
milk should be selected. This could cover factors like breed of animal, feed source, geographic region,
etc.
The samples should be checked to ensure the absence of beta-lactamase or para-aminobenzoic acid
by adding a small but detectable quantity of penicillin or sulfonamide to the milk, respectively and
incubate and test. If a negative result is obtained it indicates the presence of beta-lactamase or para-
aminobenzoic acid (PABA), respectively. This check is only needed if beta-lactams or sulfonamides
are included in the validation, respectively. The pH of the sample should be recorded and a subsample
should be kept and stored at −25 °C ± 5 °C. In case of questionable results during validation or
verification (false-positive results, CCβ lower than the CCβ announced by the manufacturer or obtained
with different milk), the laboratory thaws the sample for screening or confirmatory analyses.
8.4 Spiked sample creation
The appropriate working stock solution should be added to the blank matrix sample to produce a
sample at the required level of antibiotic. The added volume of working stock solution should be below
5 % of the final volume.
Furthermore, the last working solution can be done in milk, except for tetracyclines.
NOTE For tetracyclines, it is recommended that only the added volume of working stock solution be below
1 % or 2 % of the final volume. It is recommended to prepare all the dilutions of working solutions in water and
only the final dilution in milk to avoid binding to milk proteins and to calcium.
9 Procedure
9.1 Validation
9.1.1 General
The validation is a procedure applied to characterize the performances of a test, in the originator
laboratory (manufacturer’s laboratory) or in an independent laboratory. The validation demonstrates
8 © ISO and IDF 2021 – All rights reserved
IDF /RM 251:2021(E)
that the method is fit for purpose. The originator laboratory could be the laboratory (or a group of
laboratories) which developed the new analytical method or the first laboratory (or group of
laboratories) performing a full validation study. The originator laboratory performing the validation
should by preference be an independent laboratory with experience in the field and a quality control
system (e.g. ISO/IEC 17025) in place and accredited for analogue methods for the same matrix.
Laboratory staff should have access to all required equipment (incubator and reader system when
applicable) and should be fully trained to run the test.
The validation of a test covers:
— the detection capability;
— test selectivity/specificity;
— test robustness; and
— reader and test repeatability.
All factors should be present in the final validation report.
During the validation, the detection capabilities are determined as precisely as possible.
9.1.2 Detection capability (CCβ)
9.1.2.1 General
The detection capability should be determined in the specific matrix/species for which the test was
developed, which in most cases will be raw cow milk. If the test is claimed to be appropriate for use
in testing an alternative matrix/species then the validation is required to cover this matrix as well. In
such a case two approaches are possible:
Option 1: The CCβ is determined in the main matrix as such (for example in raw cow milk) then other
matrices/species are studied as part of the applicability and/or robustness testing. In the applicability
and/or robustness testing, the samples may be spiked up to levels of CCβ + 20 %. For as far as positive
results are obtained, the CCβ determined in the main matrix is also valid in the new matrix/species. If
negative results are obtained, the new matrix/species should be fully validated to determine the CCβ,
or the conclusion is that the method is not applicable to the new matrix/species with the same CCβ.
Option 2: The detection capabilities are in the same study determined directly for the different
matrices with an equal number of replicates for each different matrix (e.g. cows’ milk, goats’ milk and
ewes’ milk; UHT milk, sterilized milk and reconstituted milk powder).
Reconstituted milk powder should not be mixed with raw milk when testing microbial inhibitor tests
since they require a different incubation time. Only use similar matrices with equal incubation times in
the same run.
This last procedure can increase the CCβ if the CCβ is different for each matrix. The highest CCβ is the
final value. The same phenomenon can be observed when different lots of test reagents are used in
combination for the determination of CCβ.
9.1.2.2 Compounds involved in the study
All substances relevant for end users in their routine application (whether defined by regulation,
registration or actual use) should be validated.
The compounds to be tested for detection capability are determined by the type of test to be validated.
IDF /RM 251:2021(E)
For bacterial growth inhibition assays that cover a wide range of compounds:
— the marker residues of all pharmacologically active substances of the involved group(s) of veterinary
drugs (e.g. in the EU the pharmacologically active substances mentioned in Table 1 of the Annex of
Council Regulation (EU) N° 37/2010 [see Table A.1]);
or:
— the marker residues of all pharmacologically active substances occurring in brands/trade names
registered for use in dairy cattle in the country of interest and belonging to the involved group(s)
of veterinary drugs (e.g. in the EU as mentioned in Table 1 of the Annex of Council Regulation (EU)
N° 37/2010 [see Table A.1]).
There are many different sulfonamides. The number of sulfonamides to be validated will be at least
three sulfonamides. The choice of which three should be made taking into account the registered
sulfonamides for use in lactating cows, which can vary among countries.
For immunological or receptor assay tests:
— the marker residues of all pharmacologically active substances of the group(s) of veterinary drugs
indicated to be able to be detected (e.g. if the test is designed to detect beta-lactams then detection
ability for all beta-lactams shall be determined);
or:
— the marker residues of all pharmacologically active substances occurring in brands/trade
names registered for use in dairy cattle in the country of interest and belonging to the group(s)
of veterinary drugs indicated to be able to be detected (e.g. if the test is designed to detect beta-
lactams then detection ability for all beta-lactams registered for use in the country of concern shall
be determined).
If a test manufacturer is only claiming the detection of one or a limited number of substances, the other
substances belonging to the same antibiotic group (e.g. within the EU as mentioned in Table 1 of the
Annex of Council Regulation (EU) N° 37/2010) should be tested as part of test selectivity/specificity
testing. If any cross-reactivity is noticed, the substance(s) should be added to list of substances for
detection capability testing.
9.1.2.3 Determination of concentrations of substances to be involved in the study
For each compound at least two concentrations around the initial test concentration should be tested.
For commercial kits, the results obtained by the test manufacturer can be used as a starting point. For
the compounds with missing information, the regulatory limit in milk can be used.
The aim is to find the lowest concentration of compound that returns a positive test in 95 % of the cases.
Two options for the choice of increment between the concentrations are proposed:
1) the increment between the different concentrations is dependent on the concentration level, as
indicated in Table 2.
Table 2 — Increment between the concentrations tested
Concentration Increment
μg/kg μg/kg
1 to 10 1
11 to 20 2
21 to 50 5
51 to 100 10
101 to 250 25
10 © ISO and IDF 2021 – All rights reserved
IDF /RM 251:2021(E)
Table 2 (continued)
Concentration Increment
μg/kg μg/kg
251 to 500 50
501 to 1 000 100
1 001 to 5 000 500
In case of testing of concentrations below 0,5 × RL (regulatory limit) or above RL, the increment can be
doubled. The increments suggested are starting points and can be further modified to identify the true
CCβ;
or
2) the concentrations tested can be based on factors of the RL;
— RL;
— RL;
— RL;
— RL;
— RL.
This approach is most appropriate for broad-spectrum tests with a lot of substances involved.
9.1.2.4 Number of replicates required
The number of replicates tested at each concentration is based on the closeness of the predicted
detection capability (CCβ) to the regulatory limit and is shown in Table 3. Each concentration will be
tested 20, 40, or 60 times, in a time period of at least three days, with at least two operators and by
using at least two and by preference three test kit lots.
Table 3 — Number of replicates based on closeness of the predicted detection capability (CCβ)
to the regulatory limit (RL)
Closeness to Regulatory Limit Number of replicates
≤ 0,5 RL 20
> 0,5 RL and < 0,9 RL 40
≥ 0,9 RL and ≤ RL 60
> RL 20
The detection capability is defined as the lowest concentration tested giving at least 95 % positive
results, for example 19, 38, or 57 positive results, out of 20, 40, or 60 tests, respectively.
The analyses of 20, 40, or 60 samples may be performed sequentially (e.g. 10 samples first, if it is
satisfactory, analyse a further 10 samples, etc.). When two, three or four negative results are obtained
respectively, the assay at this target concentration may be stopped and a higher concentration should
be tested.
IDF /RM 251:2021(E)
9.1.2.5 Testing requirements
Every day the following daily standards are also tested:
— Negative control samples:
— 2 × blank raw milk, free from antimicrobials, with a normal composition, quality and pH;
— Positive control samples:
— 2 × a substance spiked in raw milk close to detection capability, for each group of veterinary
drug agents (e.g. for a beta-lactam test: a penicillin and a cephalosporin).
For multiresidue (non-group specific) tests like antimicrobial inhibitor tests, a minimum of 3
positive controls should be used (e.g. a beta-lactam, a tetracycline and a sulfonamide).
Multiple concentrations for the same compound (e.g. 3 ppb and 4 ppb of benzylpenicillin) can be
tested at the beginning to help determine a suitable po
...
SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 23758
FIL/MR 251
Première édition
2021-08
Lignes directrices pour la validation
des méthodes qualitatives de
dépistage des résidus de médicaments
vétérinaires dans le lait et les produits
laitiers
Guidelines for the validation of qualitative screening methods for the
detection of residues of veterinary drugs in milk and milk products
Numéros de référence
FIL/MR 251:2021(F)
© ISO et FIL 2021
FIL/MR 251:2021(F)
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Fax: +41 22 749 09 47 Fax: + 32 2 325 67 41
E-mail: copyright@iso.org E-mail: info@fil-idf.org
Web: www.iso.org Web: www.fil-idf.org
Publié en Suisse
ii
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 4
5 Exigences générales applicables à l’essai/au kit d’essai . 5
6 Réactifs . 6
6.1 Matrice blanche normalisée . 6
6.2 Antibiotiques . 6
6.3 Solution mère d’étalon . 7
6.4 Solutions mères de travail . 7
6.5 Échantillon dopé . 7
7 Appareillage . 7
8 Préparation des échantillons . 8
8.1 Préparation de la solution mère . 8
8.2 Préparation de la solution mère de travail . 8
8.3 Choix de l’échantillon de matrice blanche . 8
8.4 Préparation de l’échantillon dopé . 9
9 Procédure .9
9.1 Validation . 9
9.1.1 Généralités . 9
9.1.2 Capacité de détection (CCβ). 10
9.1.3 Sélectivité/spécificité de l’essai . 13
9.1.4 Essais de robustesse . 15
9.1.5 Répétabilité du dispositif de lecture et de l’essai . 20
9.1.6 Participation à une étude collaborative (inter)nationale . 21
9.2 Essais de vérification d’une méthode de dépistage ayant été transférée . 21
9.2.1 Généralités . 21
9.2.2 Capacité de détection . 22
9.2.3 Sélectivité/spécificité de l’essai . 23
9.2.4 Essais de robustesse . 23
9.2.5 Répétabilité du dispositif de lecture et de l’essai . 23
9.2.6 Participation à une étude collaborative (inter)nationale . 25
Annexe A (informative) Législation européenne en vigueur concernant les médicaments
vétérinaires présents dans le lait de vache .26
Annexe B (informative) Législation américaine en vigueur concernant les résidus de
médicaments vétérinaires dans le lait .31
Annexe C (informative) Liste de composés problématiques pour la préparation des
solutions mères .33
Annexe D (informative) Récapitulatif de la stabilité des antibiotiques en solution et dans la
matrice.34
Bibliographie .36
iii
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FIL/MR 251:2021(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www.iso.org/iso/fr/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL), en collaboration
avec le Comité européen de normalisation (CEN), comité technique CEN/TC 302, Lait et produits
laitiers — Méthodes d’échantillonnage et d’analyse, conformément à l’accord de coopération technique
entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne). Il est publié conjointement par l’ISO et la FIL.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
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La FIL (Fédération internationale de laiterie) est une organisation privée à but non lucratif qui
représente les intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres
de la FIL sont organisés en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de
représentants de groupes d’intérêt nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des
producteurs laitiers, des acteurs de l’industrie de transformation des produits laitiers, des fournisseurs
de produits laitiers, des universitaires et des représentants des gouvernements/autorités chargées du
contrôle des aliments.
L’ISO et la FIL travaillent en étroite collaboration sur tous les sujets de normalisation relatifs aux
méthodes d’analyse et d’échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL
publient conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et numéros de référence des
deux organisations.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Le présent document a été élaboré par le Comité permanent chargé des Méthodes d’analyse des additifs et
contaminants de la FIL et l’ISO, comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait
et produits laitiers, en collaboration avec le Comité européen de normalisation (CEN), comité technique
CEN/TC 302, Lait et produits laitiers — Méthodes d’échantillonnage et d’analyse, conformément à l’accord
de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne). Il est publié conjointement par l’ISO
et la FIL.
La présente Méthode révisée (RM) de la FIL équivaut à une Spécification accessible au public de
l’ISO (ISO/PAS) ou à une Spécification technique de l’ISO (ISO/TS) et est donc publiée conjointement
sous les conditions de l’ISO.
Le travail a été confié à l’Équipe d’action FIL-ISO A10 du Comité permanent chargé des Méthodes d’analyse
des additifs et contaminants, sous la conduite de son chef de projet, Dr W. Reybroeck (BE).
v
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SPÉCIFICATION TECHNIQUE
FIL/MR 251:2021(F)
Lignes directrices pour la validation des méthodes
qualitatives de dépistage des résidus de médicaments
vétérinaires dans le lait et les produits laitiers
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie des processus et protocoles généraux pour la validation et la vérification
des essais qualitatifs de dépistage des résidus de médicaments vétérinaires dans le lait à l’état liquide
(lait cru, lait pasteurisé, lait UHT et lait en poudre reconstitué et concentrés de protéine de lactosérum)
incluant des méthodes biologiques. Ces lignes directrices ne couvrent pas la validation de l’analyse des
résidus par CLHP, CLUHP ou CL-SM/SM.
Le présent document vise à apporter une aide aux fabricants de kits d’essai de dépistage, aux laboratoires
validant des méthodes de dépistage ou des essais, aux autorités compétentes et aux laiteries ou aux
utilisateurs finaux de réactifs ou d’essais dans le cadre du dépistage de résidus de médicaments
vétérinaires dans les produits laitiers. Le présent document facilite et améliore la validation et la
vérification de méthodes de dépistage. Le présent document vise d’une part à harmoniser la validation
des méthodes ou des kits d’essai afin que l’ensemble des parties prenantes aient une totale confiance
dans le résultat d’un dépistage de résidus, et d’autre part à limiter le chevauchement et la multiplication
des activités de validation menées par différents laboratoires en partageant les résultats de validation
produits par un laboratoire indépendant. Une procédure harmonisée de validation et de vérification
permet en outre de comparer les performances de différentes méthodes de dépistage.
Le présent document ne sous-entend pas que tous les utilisateurs finaux soient liés pour réaliser
l’ensemble des activités de vérification proposées.
La vérification de l’usage correct des réactifs/kits de dépistage des antimicrobiens n’est pas couverte
par le domaine d’application du présent document.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
méthode biologique
méthode qui est utilisée pour détecter des réponses cellulaires aux analytes
EXEMPLE Inhibition d’une croissance bactérienne, essai immunologique et essai récepteur.
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3.2
méthode qualitative
méthode dont le résultat est oui ou non, ne donnant aucune indication sur la concentration de l’analyte
supposé
EXEMPLE 1 Essais d’inhibition de croissance bactérienne dont le résultat est soit «absence de zone
d’inhibition», soit «présence d’une zone d’inhibition».
EXEMPLE 2 Essais d’inhibition aboutissant à un changement de couleur du milieu de culture.
EXEMPLE 3 Essais immunochimiques/de liaison à un ligand, dont le résultat s’exprime par la mention
«supérieur» ou «inférieur» à un seuil de détection; ou pour lesquels des analytes présentant différentes
réactivités croisées sont inclus dans le domaine d’application de la méthode.
EXEMPLE 4 Biocapteurs.
3.3
matrice
partie de l’échantillon autre que l’analyte
Note 1 à l'article: Les matrices sont couvertes par le domaine d’application.
3.4
capacité de détection
CCβ
plus faible teneur en analyte pouvant être détectée, identifiée et/ou quantifiée dans un échantillon avec
une probabilité d’erreur de β
Note 1 à l'article: L’erreur β est la probabilité qu’un échantillon soumis à essai identifié comme conforme soit en
réalité non conforme.
3.5
seuil de détection
réponse ou signal d’un essai de dépistage qui indique qu’un échantillon contient un analyte à une teneur
supérieure ou égale à la concentration cible de dépistage
3.6
échantillon de matrice blanche
échantillon de contrôle négatif
échantillon issu d’animaux ayant fait l’objet d’un suivi sanitaire par rapport aux médicaments
vétérinaires et qui n’ont pas été exposés à la substance en question
Note 1 à l'article: En cas d’indisponibilité d’échantillons d’animaux répondant à ces critères, des échantillons dont
la conformité et l’absence de résidus de la substance étudiée ont été précédemment confirmées par des essais
physicochimiques de sensibilité appropriée peuvent également être acceptés.
Note 2 à l'article: Voir Tableau 1.
3.7
échantillon de contrôle positif
échantillon de contrôle qui est dopé en analyte d’essai de sorte à obtenir la concentration cible de
dépistage
Note 1 à l'article: Il peut toutefois également s’agir d’un échantillon naturellement positif (c’est-à-dire un
échantillon issu d’animaux qui se sont vus administrer la substance en question) ou d’un matériau de référence
certifié.
3.8
concentration cible de dépistage
concentration à laquelle un essai de dépistage identifie l’échantillon comme « positif au dépistage »
(potentiellement non conforme)
Note 1 à l'article: Il convient que cette concentration soit systématiquement inférieure à la limite réglementaire.
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3.9
validation
confirmation par des preuves objectives que les exigences pour une utilisation spécifique ou une
application prévues, par exemple une méthode d’essai ou de mesure, ont été satisfaites
EXEMPLE Procédure appliquée par le laboratoire émetteur (laboratoire du fabricant) ou par un laboratoire
indépendant.
Note 1 à l'article: La validation sert souvent à évaluer l’adéquation de la méthode vis-à-vis de l’objectif.
3.10
vérification
procédure appliquée à une méthode qui a été validée auparavant dans le cas d’une validation de
transfert
Note 1 à l'article: La procédure de vérification est appliquée par un laboratoire receveur pour la même matrice
que celle initialement validée, afin de démontrer que la méthode donnera un résultat fiable dans ce laboratoire
sur du lait obtenu localement et qu’elle est adaptée à l’objectif.
3.11
laboratoire émetteur
laboratoire qui a mené une étude de validation complète de la méthode
Note 1 à l'article: Il s’agit de préférence d’un laboratoire indépendant accrédité ISO/IEC 17025 et de préférence
autre que le laboratoire ayant mis au point la méthode. Il convient que le laboratoire ait de l’expérience en matière
d’essais de résidus et de validation des essais de dépistage des résidus de médicaments vétérinaires dans le lait.
3.12
laboratoire receveur
laboratoire qui réalisera la vérification de la méthode
Note 1 à l'article: Il pourrait s’agir de tout laboratoire intéressé par l’application de la méthode.
3.13
spectre
éventail de substances qu’un essai peut détecter
Note 1 à l'article: Certains essais détectent plusieurs classes d’antibiotiques et un grand nombre de substances,
tandis que d’autres sont plus spécifiques.
3.14
limite réglementaire
seuil défini par la législation alimentaire en ce qui concerne les résidus dans les aliments
Note 1 à l'article: Les limites réglementaires peuvent être une LMR (voir 3.15), une LPMR (voir 3.16), une VR
(voir 3.17).
3.15
limite maximale de résidus de médicaments vétérinaires
LMR
concentration maximale de résidu résultant de l’emploi d’un médicament vétérinaire et recommandée
par la Commission du Codex Alimentarius comme légalement permise ou estimée acceptable dans un
aliment
Note 1 à l'article: Des antibiotiques sont utilisés pour traiter et prévenir des maladies chez les animaux d’élevage
et de faibles teneurs de résidus d’antibiotiques peuvent donc être présentes dans les aliments. Les LMR sont fixées
pour les substances pharmacologiquement actives utilisées ou destinées à être utilisées dans les médicaments
vétérinaires commercialisés. Au sein de l’Union européenne, les LMR sont fixées par l’Agence européenne des
médicaments (EMA).
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3.16
limite de performance minimale requise
LPMR
teneur minimale en analyte dans un échantillon qui doit être au moins détectée et confirmée
Note 1 à l'article: La LPMR vise à harmoniser les performances analytiques des méthodes applicables aux
substances pour lesquelles aucune limite autorisée n’a été fixée.
3.17
valeur de référence
VR
niveau d’un résidu d’une substance pharmacologiquement active, défini à des fins de contrôle, dans le
cas de certaines substances pour lesquelles il n’a pas été fixé de limite maximale de résidus, par certains
Règlements UE
Note 1 à l'article: Le Règlement UE 470/2009 est applicable pour établir des limites maximales de résidus.
Note 2 à l'article: Les VR sont actuellement définies sur la base de considérations analytiques (c’est-à-dire la plus
faible concentration pouvant être quantifiée à l’aide d’une méthode d’analyse validée). L’objectif est de «définir
une concentration analytique pour une substance pharmacologiquement active non autorisée qui peut être
déterminée par des laboratoires officiels de contrôle et qui est suffisamment faible pour protéger convenablement
[19]
les personnes amenées à consommer des denrées alimentaires qui contiennent ladite substance » .
3.18
résultat positif/négatif
résultat de l’essai après interprétation de la mesure de l’essai réalisée par rapport au seuil de détection
(préétabli)
Note 1 à l'article: Résultat positif: présence de résidus antimicrobiens (essai de dépistage d’inhibiteurs
microbiens) ou présence de résidus de médicaments vétérinaires.
Note 2 à l'article: Résultat négatif: absence de résidus antimicrobiens (essai de dépistage d’inhibiteurs
microbiens) ou absence de résidus de médicaments vétérinaires. Dans la mesure où seuls des essais de dépistage
sont impliqués, aucune décision sur la conformité ou la non-conformité ne peut être prise.
3.19
limite de répétabilité
valeur inférieure ou égale à laquelle la différence absolue entre deux résultats de mesurage obtenus
dans des conditions de répétabilité est attendue avec une probabilité de 95 %
3.20
probabilité de détection
POD
proportion de résultats d’analyse positifs obtenus à l’aide d’une méthode qualitative pour une matrice
donnée à une teneur ou concentration donnée en analyte
[7]
Note 1 à l'article: La POD dépend de la concentration (AOAC, 2014 ).
4 Principe
Des échantillons de matrice dopés à des teneurs connues en analyte sont soumis à l’essai faisant l’objet
d’une validation ou d’une vérification afin de déterminer la capacité de détection, la sensibilité et la
robustesse de l’essai. L’évaluation des résultats d’essai établit l’adéquation de l’essai à un usage de
routine pour le dépistage de résidus de médicaments vétérinaires dans le lait.
NOTE L’Annexe B fournit des informations sur les seuils de tolérance et/ou les seuils d’innocuité des résidus
de médicaments vétérinaires dans le lait fixés par la FDA (Administration américaine des denrées alimentaires
et des médicaments).
L’exigence clé applicable à une méthode de dépistage est sa capacité à détecter de manière fiable l’analyte
en question à la concentration cible de dépistage choisie. Il convient de choisir la concentration cible
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de dépistage de sorte à éviter des résultats faux négatifs, c’est-à-dire une concentration suffisamment
faible pour garantir que si l’analyte en question est présent dans l’échantillon à la limite réglementaire,
l’échantillon sera classé comme étant «positif au dépistage».
Il convient que la validation et la vérification apportent des preuves objectives que cette exigence clé
est satisfaite. Il convient que la validation couvre toutes les combinaisons matrice/espèce/analyte
déclarées dans le domaine d’application de la procédure d’utilisation normalisée (SOP) de la méthode. Il
convient que la validation soit la plus large possible de sorte à couvrir le domaine d’application de tous
les utilisateurs finaux.
Il convient que la vérification couvre toutes les combinaisons matrice/espèce/analyte couvertes par le
domaine d’application du laboratoire (receveur) qui utilisera l’essai. La portée exigée de la validation
est variable selon qu’il s’agit d’une validation ou d’une vérification d’une méthode ayant été transférée.
Il n’est pas nécessaire que la vérification couvre l’ensemble du spectre si le laboratoire qui utilisera
l’essai prévoit de n’appliquer la méthode qu’à un domaine limité (par exemple, à certaines espèces et
pas à d’autres, à certains résidus plus pertinents que d’autres, au lait cru mais pas au lait stérilisé à ultra
haute température [UHT], etc.).
Si un laboratoire receveur souhaite utiliser une méthode de dépistage sur différentes matrices
(FIL 2014) qui n’ont pas été soumises à essai par le laboratoire émetteur, il convient que le laboratoire
receveur soumette à essai tous les paramètres de validation nécessaires afin de démontrer que la
méthode est adaptée à la matrice en question.
5 Exigences générales applicables à l’essai/au kit d’essai
Il convient que le développeur ou le fabricant fournisse des informations sur la méthodologie, les réactifs
d’essai, les produits chimiques supplémentaires non nécessairement inclus dans le kit d’essai, les
exigences opératoires (informations sur le système de lecture, le seuil de détection), les spécifications
d’essai et la documentation (tirée de l’ISO 18330 et de l’ISO 13969). Par ailleurs, il convient que le ou les
pays cibles et ses/leurs limites réglementaires spécifiques soient connus, de sorte à évaluer l’essai par
rapport aux limites réglementaires adéquates.
Les éléments d’informations que le fabricant/distributeur/responsable de laboratoire (dans le cas d’une
méthode mise au point en interne) est tenu de fournir avant la validation sont les suivants:
— le principe de l’essai, ainsi que le principe de lecture et d’interprétation de l’essai (notamment le
seuil de détection ou la méthode de calcul du seuil de détection);
— les formats d’essai, le cas échéant (par exemple, ampoules/plaques);
— le domaine d’application de l’essai:
— les matrices adaptées à l’essai: matrices couvertes par le domaine d’application du présent
document (voir Article 1);
— les espèces animales produisant du lait;
— les matrices susceptibles d’avoir un impact (interférence) sur le résultat;
— le possible impact de l’introduction de conservateurs dans les échantillons;
— le spectre de l’essai: la liste des médicaments vétérinaires couverts et les capacités de détection
attendues (si elles sont connues);
— la liste des limites réglementaires en vigueur associées aux médicaments vétérinaires détectables
dans la ou les matrices en question dans le ou les pays concernés;
— le protocole détaillé rédigé dans une langue comprise par le personnel du laboratoire: s’il est
nécessaire d’apporter de légères modifications à la méthode selon la matrice/l’espèce, il convient de
les stipuler dans le protocole d’essai (dans la notice du kit d’essai).
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6 Réactifs
6.1 Matrice blanche normalisée
— Le lait cru utilisé est un mélange de lait provenant d’au moins 4 animaux n’ayant pas reçu de
médicaments vétérinaires dans les 2 derniers mois, en pleine lactation, et dont le lait présente un
−1
nombre de cellules somatiques faible à modéré (par exemple, < 150 000 ml pour le lait de vache).
Le lait cru est recueilli dans des récipients stériles et conservé à une température inférieure à 4 °C.
Il convient que la durée maximale de conservation à froid du lait cru frais respecte la définition du
lait cru frais donnée par la réglementation locale.
— Il convient que le lait utilisé soit représentatif du lait normalement produit dans le pays ou la région
concerné. En d’autres termes, il convient que la composition et la qualité du lait soient proches de la
composition moyenne du lait du pays/de la région.
— Le Tableau 1 donne des exemples de paramètres à prendre en compte par rapport au lait «normal».
Les véritables chiffres sont susceptibles d’être différents selon le pays et la région.
— Le lait d’au moins 4 animaux est regroupé et est considéré comme un échantillon de matrice blanche
normalisée. Il convient d’utiliser au moins quatre échantillons de ce type lorsque la capacité de
détection est déterminée par un essai impliquant l’analyse de 20 réplicats. S’il est nécessaire
d’analyser 40 ou 60 réplicats pour déterminer la capacité de détection, il convient d’utiliser
respectivement huit ou douze échantillons de lait blanc différents. Il convient de préparer et
d’utiliser au moins quatre mélanges de lait différents pour le travail de vérification (20 réplicats).
— Le recours à du lait lyophilisé reconstitué ou du lait décongelé pourrait aussi être admis, mais
strictement sous condition. La condition préalable pour travailler avec ces solutions alternatives
est de démontrer au préalable l’équivalence des résultats obtenus avec du lait cru et de ceux obtenus
avec du lait décongelé ou du lait lyophilisé reconstitué, après analyse d’échantillons de lait négatif et
positif.
Tableau 1 — Exemples de données de référence concernant la composition et la qualité du lait
normal de différentes espèces animales
a b
NCS NTB pH Antibiotiques Période de lac-
d e
TMG TP
tation
Espèce c
cellules par ufc par
g/l g/l
ml ml
Valeur cible < 150 000 < 30 000 40 33 6,7 à 6,8
Entre 60 j et 200 j
Vache Absence
Plage admis-
après vêlage
< 400 000 < 100 000 35 à 45 30 à 36 6,6 à 6,9
sible
Valeur cible < 2 000 000 < 60 000 38 34 6,7 à 6,8
Entre 20 j et 150 j
Chèvre Absence
Plage admis-
après mise-bas
30 à 50 28 à 40 6,6 à 6,9
sible
Valeur cible < 2 000 000 < 60 000 70 55 6,7 à 6,8
Entre 20 j et 150 j
Brebis Absence
Plage admis-
après agnelage
50 à 90 40 à 70 6,6 à 6,9
sible
a
Nombre de cellules somatiques.
b
Nombre total de bactéries.
c
Unités formant colonie.
d
Teneur en matières grasses.
e
Teneur en protéines.
6.2 Antibiotiques
Utiliser uniquement un matériau de référence certifié ou de qualité analytique aux fins d’une validation
ou d’une vérification.
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6.3 Solution mère d’étalon
— Les solutions mères d’étalon de l’antibiotique à 100 mg/l sont préparées dans de l’eau ou dans
[14]
un solvant adéquat et conservées à une température inférieure à 4 °C (voir 8.1). La durée de
conservation dépend de la stabilité de la molécule.
— Lors de la préparation de la solution mère, une correction de teneur en eau et en impuretés est
réalisée.
— Pour chaque substance, une seule solution mère est préparée, mais il convient de préférence, pour
certains composés problématiques (par exemple, problème de solubilité, stabilité), de préparer
au moins deux solutions mères pour déterminer la capacité de détection. Une liste des composés
problématiques est donnée à l’Annexe C.
— Dans le cas où une seule solution mère est utilisée, il convient soit de la préparer à partir d’un
matériau certifié, soit de la vérifier par une méthode physicochimique indépendante.
— Certains composés tels que les tétracyclines sont photosensibles et nécessitent d’être conservés
à l’abri de la lumière. D’autres composés peuvent exiger d’utiliser une verrerie répondant à des
exigences spécifiques.
6.4 Solutions mères de travail
Des solutions diluées de concentration comprise entre 10 mg/l et 0,1 mg/l sont préparées
extemporanément sur une base quotidienne.
6.5 Échantillon dopé
Pour la préparation de la concentration finale, le dopage final est réalisé dans la matrice blanche
normalisée.
Le lait blanc sera dopé avec chaque analyte.
Il convient que le volume ajouté de solution mère de travail soit inférieur à 5 % du volume final de
l’échantillon de lait à soumettre à essai.
7 Appareillage
Tout appareillage spécifié dans le mode opératoire du kit d’essai qui n’est pas fourni par le fabricant du
kit d’essai.
7.1 Kit d’essai, dans lequel des réactifs d’au moins deux et de préférence de trois lots de production
différents sont utilisés.
Il convient que les lots de production soient choisis de manière aléatoire et soient représentatifs du
niveau de production du produit.
7.2 Incubateur ou bain d’eau, permettant de maintenir la température d’incubation appropriée
pour l’essai.
Si le fabricant a un incubateur qui est spécialement conçu pour l’essai, il convient que cet incubateur soit
fourni par le fabricant pour une utilisation dans le cadre de la validation ou de la vérification.
7.3 Dispositifs de lecture automatisés. Si le fabricant prévoit un équipement pour évaluer les
résultats de l’essai, il convient que cet équipement soit fourni par le fabricant pour une utilisation et une
évaluation dans le cadre de la validation ou de la vérification.
Les procédures d’étalonnage du dispositif de lecture automatisé doivent être mises à disposition et
toutes les mesures doivent être obtenues uniquement au moyen de l’équipement étalonné.
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7.4 Micropipettes, permettant de délivrer la quantité appropriée d’échantillon exigée pour l’essai.
Si le kit d’essai comporte des micropipettes ou un autre équipement de transfert de liquide, il convient
de préférence de les évaluer dans le cadre de la validation ou de la vérification.
8 Préparation des échantillons
8.1 Préparation de la solution mère
Une solution de 100 mg/l de chaque antibiotique est préparée en calculant tout d’abord la quantité de
matériau de référence nécessaire pour obtenir 10 mg ± 0,1 mg de composé actif. Ce calcul est réalisé
selon la Formule (1) à partir des informations (pureté, teneur en eau) du certificat d’analyse de
l’antibiotique:
100 100
mm=× × (1)
ma
PW 100−
où
m est la masse du matériau requise, en mg;
m
m est la masse de l’analyte requise, en mg;
a
P est la pureté, en %;
W est la teneur en eau, en%.
Peser cette quantité directement dans un sabot de pesée et la transférer dans une fiole jaugée de 100 ml
puis compléter à 100 ml avec le solvant adéquat.
Les échantillons sont placés dans un vortex ou un bain à ultrasons jusqu’à dissolution. Ils peuvent être
conservés à 4 °C pendant 4 semaines au maximum ou à une température inférieure ou égale à −18 °C
pendant 12 mois au maximum. La durée de stabilité des différents antimicrobiens en solution et dans la
matrice à différentes températures de conservation est indiquée dans le Tableau D.1 et le Tableau D.2.
8.2 Préparation de la solution mère de travail
Si nécessaire, des solutions mères intermédiaires de respectivement 100 000 µg/l, 10 000 µg/l,
1 000 µg/l ou 100 µg/l (ou d’autres concentrations appropriées) sont préparées avec de l’eau distillée et
conservées à une température comprise entre 4 °C et 6 °C pendant un jour au maximum.
8.3 Choix de l’échantillon de matrice blanche
Pour chaque antibiotique à soumettre à essai, le nombre d’échantillons de matrice blanche normalisée
issus de différentes sources à soumettre à essai dépend de l’écart entre la capacité de détection prédite
(CCβ) et la limite réglementaire:
— si la CCβ est inférieure ou égale à la moitié de la LMR: au moins deux lots différents de lait pour
20 réplicats;
— si la CCβ est comprise entre 50 % et 90 % de la LMR: au moins quatre lots différents de lait pour
40 réplicats;
— si la CCβ est proche de la LMR (≥90 % à 100 % de la LMR): au moins six lots différents de lait pour
60 réplicats;
— si la CCβ est supérieure à la LMR: au moins deux lots différents de lait pour 20 réplicats.
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Il convient que le volume d’échantillon soit suffisant pour disposer de plusieurs prises d’essai de la
quantité spécifiée par le protocole d’essai. Lors du choix de la source du lait, il convient de choisir des
échantillons couvrant la gamme de lait «normalement» produit. Cela pourrait couvrir des facteurs tels
que la race de l’animal, la source de l’alimentation donnée aux animaux, la région géographique, etc.
Il convient de veiller à ce que les échantillons soient exempts de bêta-lactamase ou d’acide para-
aminobenzoïque en ajoutant au lait une faible quantité néanmoins détectable respectivement
de pénicilline ou de sulfamide, puis en les incubant avant de les soumettre à essai. L’obtention d’un
résultat négatif indique la présence de bêta-lactamase ou d’acide para-aminobenzoïque (PABA). Cette
vérification n’est nécessaire que si des bêta-lactamines ou des sulfamides sont inclus dans la validation.
Il convient de consigner le pH de l’échantillon et il convient de prélever un sous-échantillon et de le
conserver à −25 °C ± 5 °C. En cas de résultats douteux lors de la validation ou de la vérification (résultats
faux positifs, CCβ inférieure à la CCβ annoncée par le fabricant ou obtenue avec un lait différent), le
laboratoire procédera à des analyses de dépistage ou de confirmation sur l’échantillon décongelé.
8.4 Préparation de l’échantillon dopé
Il convient d’ajouter la solution mère de travail appropriée à l’échantillon de matrice blanche pour
obtenir un échantillon à la teneur exigée d’antibiotique. Il convient que le volume de solution mère de
travail ajouté soit inférieur à 5 % du volume final.
De plus, la dernière solution de travail peut être préparée dans du lait, sauf pour les tétracyclines.
NOTE Pour les tétracyclines, il est recommandé que le volume de solution mère de travail ajouté soit
inférieur à 1 % ou 2 % du volume final seulement. Il est recommandé de préparer toutes les solutions de travail
diluées dans de l’eau sauf la solution finale qui est préparée dans du lait afin d’éviter la liaison des protéines du
lait et du calcium.
9 Procédure
9.1 Validation
9.1.1 Généralités
La validation est une procédure qui vise à caractériser les performances d’un essai et qui est appliquée
par le laboratoire émetteur (laboratoire du fabricant) ou par un laboratoire indépendant. La validation
démontre que la méthode est adaptée à l’utilisation prévue. Le laboratoire émetteur pourrait être le
laboratoire (ou un groupe de laboratoires) qui a mis au point la nouvelle méthode d’analyse ou le premier
laboratoire (ou groupe de laboratoires) qui a mené une étude de validation complète. Il convient de
préférence que le laboratoire émetteur ayant réalisé la validation soit un laboratoire indépendant ayant
de l’expérience dans ce domaine et ayant mis en place un système de contrôle qualité (par exemple,
ISO/IEC 17025) et qui a été accrédité en ce qui concerne des méthodes analogues sur la même matrice.
Il convient que le personnel du laboratoire dispose de tous les équipements exigés (incubateur et
système de lecture le cas échéant) et ait reçu une formation approfondie pour être en mesure de mener
l’essai.
La validation d’un essai couvre:
— la capacité de détection;
— la sélectivité/spécificité de l’essai;
— la robustesse de l’essai; et
— la répétabilité de l’essai et du système de lecture.
Il convient que tous ces facteurs soient examinés et consignés dans le rapport final de validation.
Lors de la validation, les capacités de détection sont déterminées aussi précisément que possible.
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9.1.2 Capacité de détection (CCβ)
9.1.2.1 Généralités
Il convient de déterminer la capacité de détection pour la matrice/espèce spécifique pour laquelle
l’essai a été conçu, qui dans la plupart des cas est du lait cru de vache. S’il est déclaré que l’essai est
approprié pour tester une autre matrice/espèce, il est exigé que la validation couvre également cette
autre matrice. Dans un tel cas, deux approches sont possibles.
Option 1: La CCβ est tout d’abord déterminée dans la matrice principale (par exemple, dans du lait
cru de vache) puis pour les autres matrices/espèces dans le cadre des essais d’applicabilité et/ou de
robustesse. Pour les essais d’applicabilité et/ou de robustesse, les échantillons peuvent être dopés à des
teneurs pouvant aller jusqu’à la CCβ + 20 %. Si des résultats positifs sont obtenus, la CCβ déterminée dans
la matrice principale est également valable dans la nouvelle matrice/espèce. Si des résultats négatifs
sont obtenus, il convient de soumettre la nouvelle matrice/espèce à une étude complète de validation
pour déterminer la CCβ, ou bien de tirer comme conclusion que la méthode n’est pas applicable à la
nouvelle matrice/espèce avec la même CCβ.
Option 2: Les capacités de détection sont déterminées dans la même étude directement pour
les différentes matrices avec un nombre égal de réplicats pour chacune des différentes matrices
(par exemple, lait de vache, lait de chèvre et lait de brebis , lait UHT, lait stérilisé et lait en poudre
reconstitué).
Il convient de ne pas mélanger du lait en poudre reconstitué avec du lait cru lors des essais de dépistage
d’inhibiteurs microbiens dans la mesure où
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
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