ISO 10932:2010
(Main)Milk and milk products — Determination of the minimal inhibitory concentration (MIC) of antibiotics applicable to bifidobacteria and non-enterococcal lactic acid bacteria (LAB)
Milk and milk products — Determination of the minimal inhibitory concentration (MIC) of antibiotics applicable to bifidobacteria and non-enterococcal lactic acid bacteria (LAB)
ISO 10932|IDF 223:2010 specifies a method for determining the minimal inhibitory concentration (MIC) of a series of antibiotics applicable to bifidobacteria and non-enterococcal lactic acid bacteria (LAB). ISO 10932|IDF 223:2010 recommends the broth microdilution method as the standard method.
Lait et produits laitiers - Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) d'antibiotiques applicable aux bifidobacteria et bactéries lactiques non-entérocoques
General Information
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10932
IDF
First edition
2010-06-15
Milk and milk products — Determination
of the minimal inhibitory concentration
(MIC) of antibiotics applicable to
bifidobacteria and non-enterococcal
lactic acid bacteria (LAB)
Lait et produits laitiers — Détermination de la concentration minimale
inhibitrice (CMI) d'antibiotiques applicable aux bifidobacteria et
bactéries lactiques non-entérocoques
Reference numbers
IDF 223:2010(E)
©
ISO and IDF 2010
IDF 223:2010(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. Neither the ISO Central
Secretariat nor the IDF accepts any liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies
and IDF national committees. In the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the ISO Central Secretariat at the
address given below.
© ISO and IDF 2010
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO or IDF at the respective
address below.
ISO copyright office International Dairy Federation
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20 Diamant Building • Boulevard Auguste Reyers 80 • B-1030 Brussels
Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88
Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail copyright@iso.org E-mail info@fil-idf.org
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Published in Switzerland
ii © ISO and IDF 2010 – All rights reserved
IDF 223:2010(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction.vi
1 Scope.1
2 Normative references.1
3 Terms and definitions .2
4 Principle .2
5 Diluents, culture media and reagents .2
5.1 Basic materials .2
5.2 Diluents .2
5.3 Culture media.3
6 Apparatus and glassware.10
7 Sampling .11
8 Procedure.11
8.1 Propagation.11
8.2 Quality control strains and testing.12
8.3 Growth conditions for antibiotic susceptibility test .12
8.4 Preparation of microdilution plate.13
9 Expression of results.18
10 Precision .18
10.1 Interlaboratory test.18
10.2 Repeatability .18
10.3 Reproducibility .18
11 Test report.18
Annex A (informative) Interlaboratory trial.19
Bibliography.30
IDF 223:2010(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has
been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 10932⎪IDF 223 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO and
IDF.
iv © ISO and IDF 2010 – All rights reserved
IDF 223:2010(E)
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit organization representing the dairy sector worldwide.
IDF membership comprises National Committees in every member country as well as regional dairy
associations having signed a formal agreement on cooperation with IDF. All members of IDF have the right to
be represented on the IDF Standing Committees carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO in
the development of standard methods of analysis and sampling for milk and milk products.
The main task of Standing Committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the Standing Committees are circulated to the National Committees for endorsement prior to
publication as an International Standard. Publication as an International Standard requires approval by at least
50 % of IDF National Committees casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 10932⎪IDF 223 was prepared by the International Dairy Federation (IDF) and Technical Committee
ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is being published jointly by IDF
and ISO.
All work was carried out by a Joint ISO-IDF Project Group on Minimal inhibitory concentration (MIC) of
antibiotics of the Standing Committee on Analytical methods for dairy microorganisms under the aegis of its
project leader, Mr. M. Danielsen (DK).
IDF 223:2010(E)
Introduction
There are several reports on minimal inhibitory concentration (MIC) determination of lactic acid bacteria
according to various methods. However, the MIC value obtained depends on the determination used and the
strain cultivation technique. For example, MIC determined by different quantitative methods are not always
equivalent. Also some media components are antagonistic to certain antibiotics.
Consequently, a standardized MIC determination which employs a suitable growth medium having little or no
antagonistic effects towards the antibiotics studied is necessary.
Two EU projects (PROSAFE and ACE-ART) were launched to tackle these issues, and propose appropriate
media and method to measure MIC. This International Standard is based on the SOP (standard operating
procedure) proposed by ACE-ART.
vi © ISO and IDF 2010 – All rights reserved
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 223:2010(E)
Milk and milk products — Determination of the minimal
inhibitory concentration (MIC) of antibiotics applicable to
bifidobacteria and non-enterococcal lactic acid bacteria (LAB)
WARNING — Antibiotics are substances that may be hazardous. Necessary precautions should be
taken to avoid contact with these substances. In particular, kanamycin may cause harm to the unborn
child (risk phrase R61) and chloramphenicol may cause cancer (risk phrase R45).
1 Scope
This International Standard specifies a method for determining the minimal inhibitory concentration (MIC) of a
series of antibiotics applicable to bifidobacteria and non-enterococcal lactic acid bacteria (LAB).
NOTE Unlike the disk diffusion method, which is semi-quantitative, the frequently used broth microdilution method
gives quantitative MICs of the test organism in a dilution series of the antibiotics. The lowest concentration of an antibiotic
that prevents visible growth of a test organism is considered to be the MIC.
This International Standard recommends the broth microdilution method as the standard method.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 6887-5, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination — Part 5: Specific rules for the preparation of milk and
milk products
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production
of culture media — Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the
laboratory
ISO/TS 11133-2, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production
of culture media — Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
IDF 223:2010(E)
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
minimal inhibitory concentration
MIC
lowest concentration that, under defined in vitro conditions, prevents visible growth of bacteria within a defined
period of time
[6]
[ISO 20776-1:2006 , 2.4]
NOTE MIC is expressed in micrograms per millilitre.
4 Principle
Most individual colonies from an agar plate are picked up and suspended in sterile saline. However,
Bifidobacterium spp. are suspended in pre-reduced LSM-Cys medium.
The bacterial suspension is diluted with recommended medium.
The microdilution plate is prepared with a series of twofold dilutions of antibiotic.
The diluted bacterial suspension is distributed into the wells of the plate and incubated under recommended
conditions.
The lowest concentration of an antibiotic that prevents visible growth is considered to be the MIC.
5 Diluents, culture media and reagents
5.1 Basic materials
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and sterile distilled or
demineralized water or water of equivalent purity. See ISO 6887-5.
5.2 Diluents
See ISO 6887-5.
2 © ISO and IDF 2010 – All rights reserved
IDF 223:2010(E)
5.3 Culture media
5.3.1 MRS agar
5.3.1.1 Composition
Peptone 1 (tryptic digest of casein) 10,0 g
Meat extract 10,0 g
Yeast extract (dried) 5,0 g
Glucose 20,0 g
a
Polysorbate 80 (polyethoxylated sorbitan mono-oleate) 1,0 ml
Dipotassium hydrogen phosphate (K HPO) 2,0 g
2 4
Sodium acetate trihydrate (NaCH CO ·3HO) 5,0 g
3 2 2
Diammonium citrate [(NH ) HC H O] 2,0 g
4 2 6 5 7
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO ·7HO) 0,2 g
4 2
Manganese sulfate tetrahydrate (MnSO ·4HO) 0,05 g
4 2
b
Agar 10 g to 15 g
c
Water up to 1 000 ml
a
Tween 80 is an example of a suitable product available commercially. This information is
given for the convenience of users of this International Standard, and does not constitute an
endorsement by ISO or IDF of this product.
b
Depending on the gel strength of the agar.
c
When using hand-made microdilution plates (8.4.5.1), the MRS medium should be
prepared at twice the higher concentration by only adding water up to 500 ml.
5.3.1.2 Preparation
Suspend the ingredients in the water. Heat the suspension to boiling with frequent agitation until complete
dissolution. If needed, adjust the pH (6.7) to 6,35 ± 0,2 with dilute hydrochloric acid or dilute sodium hydroxide
before autoclaving. After autoclaving, the pH range of the MRS agar medium should be 6,2 ± 0,2 at 25 °C.
Distribute the medium in portions of 100 ml ± 1 ml into bottles (6.8) of capacity 150 ml or in portions of
200 ml ± 2 ml into bottles (6.8) of capacity 250 ml.
Sterilize in the autoclave (6.5) maintained at 121 °C for 15 min. If the medium is to be used immediately, cool
it in a water bath (6.6) to between 44 °C and 47 °C. If not used immediately, melt the MRS agar (5.3.1.1) in a
boiling water bath (6.6) and mix carefully to avoid gas bubbles, then cool it in a water bath (6.6) to between
44 °C and 47 °C.
Pour 15 ml to 20 ml of prepared medium into Petri dishes (6.10). Allow the medium to cool. Solidify by placing
the Petri dishes with the lids in place on a cool horizontal surface.
Before use, dry the agar surface in accordance with ISO/TS 11133-1.
The prepared MRS agar plates may be stored in an airtight plastic bag in the dark and held between 2 °C and
8 °C for up to 2 weeks.
Test agar plates for microbial contamination in accordance with ISO/TS 11133-2.
The complete MRS agar is commercially available, but the results obtained may differ significantly from one
supplier to another. If used, therefore, check the commercial MRS agar against the same medium prepared in
accordance with this International Standard.
IDF 223:2010(E)
5.3.2 MRS-cysteine agar (MRS-Cys agar)
MRS-Cys agar consists of MRS agar (5.3.1) with addition of 0,3 g of L-cysteine per litre of medium.
5.3.2.1 Basic medium — MRS agar
See 5.3.1.
5.3.2.2 L-Cysteine stock solution
5.3.2.2.1 Composition
L-Cysteine hydrochloride 0,3 g
Water up to 10,0 ml
5.3.2.2.2 Preparation
Dissolve the L-cysteine hydrochloride in the water. Sterilize through a 0,2 µm filter (6.12) into a sterile test tube
(6.13).
The L-cysteine stock solution may be stored in the dark and held between 2 °C and 8 °C for up to 1 week.
Do not expose the solution to direct sunlight.
5.3.2.3 Complete medium
5.3.2.3.1 Composition
Basic medium (5.3.1) 100 ml
L-Cysteine stock solution (5.3.2.2) 1,0 ml
5.3.2.3.2 Preparation
Immediately before use, melt the MRS agar (5.3.1) in a boiling water bath (6.6). Cool it in a water bath (6.6)
maintained at a temperature between 44 °C and 47 °C.
Aseptically add 1,0 ml of L-cysteine stock solution (5.3.2.2) to 100 ml of MRS agar (5.3.1). Mix very carefully
while avoiding gas bubbles.
Pour 15 ml to 20 ml of prepared medium into Petri dishes (6.10). Allow the medium to cool. Solidify by placing
the Petri dishes with the lids in place on a cool horizontal surface. Before use, dry the agar surface in
accordance with ISO/TS 11133-1.
The prepared MRS-Cys agar plates may be stored in an airtight plastic bag in the dark and held between 2 °C
and 8 °C for up to 1 week.
Test agar plates for microbial contamination in accordance with ISO/TS 11133-2.
The complete MRS-Cys agar is commercially available, but the results obtained may differ significantly from
one supplier to another. If used, therefore, check the commercial MRS-Cys agar against the same medium
prepared in accordance with this International Standard.
5.3.3 M17-sucrose agar
M17-sucrose agar consists of M17 agar (5.3.3.1) with addition of 5,0 g sucrose per litre of medium.
4 © ISO and IDF 2010 – All rights reserved
IDF 223:2010(E)
5.3.3.1 Basic medium — M17 agar
5.3.3.1.1 Composition
Tryptone (pancreatic digest of casein) 5,0 g
Soy peptone 5,0 g
Beef extract 5,0 g
Yeast extract (dried) 2,5 g
Ascorbic acid (C H O) 0,5 g
6 8 6
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO ·7HO) 0,25 g
4 2
Disodium glycerophosphate (C H PO Na ·5HO) 19,0 g
3 7 6 2 2
a
Agar 10 g to 15 g
Water up to 950 ml
a
Depending on the gel strength of the agar.
5.3.3.1.2 Preparation
Suspend the ingredients in the water. Heat to boiling with frequent agitation until complete dissolution. If
needed, adjust the pH (6.7) to 7,35 ± 0,2 with dilute hydrochloric acid or dilute sodium hydroxide before
autoclaving. After autoclaving, the pH range of the M17 agar medium should be 7,2 ± 0,2 at 25 °C. Distribute
the medium in portions of 95 ml ± 1 ml into bottles (6.8) of capacity 150 ml or in portions of 190 ml ± 2 ml into
bottles (6.8) of capacity 250 ml.
Sterilize in the autoclave (6.5) maintained at 121 °C for 15 min. If the medium is to be used immediately, cool
it in a water bath (6.6) to between 44 °C and 47 °C. If not used immediately, melt the M17 agar (5.3.3.1) in a
boiling water bath (6.6) and mix carefully to avoid gas bubbles, then cool it in a water bath (6.6) to between
44 °C and 47 °C.
5.3.3.2 Sucrose stock solution
5.3.3.2.1 Composition
Sucrose 5,0 g
Water up to 50 ml
5.3.3.2.2 Preparation
Dissolve the sucrose in the water. Sterilize through a 0,2 µm filter (6.12) into a sterile test tube (6.13).
5.3.3.3 Complete medium
5.3.3.3.1 Composition
Basic medium (5.3.3.1) 95,0 ml
Sucrose stock solution (5.3.3.2) 5,0 ml
IDF 223:2010(E)
5.3.3.3.2 Preparation
Immediately before use, melt the M17 agar (5.3.3.1) in a boiling water bath (6.6). Cool it in a water bath (6.6)
to between 44 °C and 47 °C. Aseptically add 5,0 ml of sucrose stock solution (5.3.3.2) to 95,0 ml of M17 agar
(5.3.3.1). Mix very carefully while avoiding gas bubbles.
Pour 15 ml to 20 ml of prepared medium into Petri dishes (6.10). Allow the medium to cool and solidify by
placing the Petri dishes with the lids in place on a cool horizontal surface.
Before use, dry the agar surface in accordance with ISO/TS 11133-1.
The prepared M17-sucrose agar plates may be stored in an airtight plastic bag in the dark and held between
2 °C and 8 °C for up to 2 weeks.
Test agar plates for microbial contamination in accordance with ISO/TS 11133-2.
5.3.4 M17-lactose agar
M17-lactose agar consists of M17 agar (5.3.3.1) with addition of 5,0 g lactose per litre of medium.
5.3.4.1 Basic medium — M17 agar
See 5.3.3.1.
5.3.4.2 Lactose stock solution
5.3.4.2.1 Composition
Lactose 5,0 g
Water up to 50 ml
5.3.4.2.2 Preparation
Dissolve the lactose in the water. Sterilize through a 0,2 µm filter (6.12) into a sterile test tube (6.13).
5.3.4.3 Complete medium
5.3.4.3.1 Composition
Basic medium (5.3.3.1) 95,0 ml
Lactose stock solution (5.3.4.2) 5,0 ml
5.3.4.3.2 Preparation
Immediately before use, melt the M17 agar (5.3.3.1) in a boiling water bath (6.6). Cool it in a water bath (6.6)
to between 44 °C and 47 °C. Aseptically add 5,0 ml of lactose stock solution (5.3.4.2) to 95,0 ml of M17 agar
(5.3.3.1). Mix very carefully while avoiding gas bubbles.
Pour 15 ml to 20 ml of prepared medium into Petri dishes (6.10). Allow the medium to cool. Solidify by placing
the Petri dishes with the lids in place on a cool horizontal surface.
Before use, dry the agar surface in accordance with ISO/TS 11133-1.
The prepared M17-lactose agar plates may be stored in an airtight plastic bag in the dark and held between
2 °C and 8 °C for up to 2 weeks.
Test agar plates for microbial contamination in accordance with ISO/TS 11133-2.
6 © ISO and IDF 2010 – All rights reserved
IDF 223:2010(E)
5.3.5 Elliker agar
5.3.5.1 Composition
Pancreatic digest of casein 20,0 g
Yeast extract (dried) 5,0 g
Gelatin 2,5 g
Dextrose 5,0 g
Lactose 5,0 g
Sucrose 5,0 g
Sodium chloride (NaCl) 4,0 g
Sodium acetate trihydrate (Na CH CO ·3HO) 1,5 g
3 2 2
Ascorbic acid (C H O) 0,5 g
6 8 6
a
Agar 10 g to 15 g
Water up to 1 000 ml
a
Depending on the gel strength of the agar.
5.3.5.2 Preparation
Suspend the ingredients in the water. Heat the suspension to boiling with frequent agitation until complete
dissolution. If needed, adjust the pH (6.7) to 6,95 ± 0,2 with dilute hydrochloric acid or dilute sodium hydroxide
before autoclaving. After autoclaving, the pH range of the MRS agar medium should be 6,8 ± 0,2 at 25 °C.
Distribute the medium in portions of 100 ml ± 1 ml into bottles (6.8) of 150 ml capacity or in portions of
200 ml ± 2 ml into bottles (6.8) of 250 ml capacity.
Sterilize in the autoclave (6.5) maintained at 121 °C for 15 min. If the medium is to be used immediately, cool
it in a water bath (6.6) to between 44 °C and 47 °C. If not used immediately, melt the Elliker agar (5.3.5.1) in a
boiling water bath (6.6) while mixing carefully to avoid gas bubbles, then cool it in a water bath (6.6) to
between 44 °C and 47 °C.
Pour 15 ml to 20 ml of prepared medium into Petri dishes (6.10). Allow the medium to cool. Solidify by placing
the Petri dishes with the lids in place on a cool horizontal surface.
Before use, dry the agar surface in accordance with ISO/TS 11133-1.
The prepared Elliker agar plates may be stored in an airtight plastic bag in the dark and held between 2 °C
and 8 °C for up to 2 weeks.
Test agar plates for microbial contamination in accordance with ISO/TS 11133-2.
IDF 223:2010(E)
5.3.6 IST medium
5.3.6.1 Composition
Hydrolysed casein 11,0 g
Peptone 3,0 g
Glucose 2,0 g
Sodium chloride 3,0 g
Soluble starch 1,0 g
Disodium hydrogenphosphate 2,0 g
Sodium acetate 1,0 g
Magnesium glycerophosphate 0,2 g
Calcium gluconate 0,1 g
Cobalt(II) sulfate 0,001 g
Copper(II) sulfate 0,001 g
Zinc sulfate 0,001 g
Iron(II) sulfate 0,001 g
Manganese(II) chloride 0,002 g
Menadione 0,001 g
Cyanocobalamin 0,001 g
L-Cysteine hydrochloride 0,02 g
L-Tryptophan 0,02 g
Pyrodoxine 0,003 g
Pantothenate 0,003 g
Nicotinamide 0,003 g
Biotin 0,000 3 g
Thiamine 0,000 04 g
Adenine 0,01 g
Guanine 0,01 g
Xanthine 0,01 g
Uracil 0,01 g
a
Water up to 1 000 ml
a
When using hand-made microdilution plates (8.4.5.1), the IST medium should be
prepared at twice the concentration by only adding water up to 500 ml.
5.3.6.2 Preparation
Suspend the ingredients in the water. Mix the suspension well until complete dissolution. Distribute the
medium in portions of 100 ml ± 1 ml into bottles (6.8) of 150 ml capacity or in portions of 200 ml ± 2 ml into
bottles (6.8) of 250 ml capacity.
Sterilize in the autoclave (6.5) at 121 °C for 15 min. If needed, adjust the pH (6.7) so that, after sterilization, it
is 7,4 ± 0,2. If the medium is to be used immediately, cool it in a water bath (6.6) to 32 °C.
8 © ISO and IDF 2010 – All rights reserved
IDF 223:2010(E)
The prepared IST medium (5.3.6.1) may be stored in the dark and held between 2 °C and 8 °C for up to
2 weeks with the cap tightened.
Test the medium for microbial contamination in accordance with ISO/TS 11133-2.
5.3.7 IST lactose medium
IST lactose medium consists of IST medium and 10,0 g lactose per litre of medium.
5.3.7.1 Composition
IST medium (5.3.6) 90,0 ml
Lactose stock solution (5.3.4.2) 10,0 ml
5.3.7.2 Preparation
Prepare the IST medium (5.3.6) and the lactose stock solution (5.3.4.2). Aseptically mix the prepared medium
and stock solution in the proportions specified in 5.3.7.1 in a sterilized bottle (6.8) of 150 ml capacity. If using
hand-made microdilution plates (8.4.5.1), prepare the IST with the mass fraction of 1 % lactose medium at an
IST concentration twice higher (see footnote to the composition table in 5.3.6.1).
The prepared IST lactose medium may be stored with the cap tightened in the dark and held between 2 °C
and 8 °C for up to 2 weeks. Test the medium for microbial contamination in accordance with ISO/TS 11133-2.
5.3.8 LSM medium
LSM medium consists of 90 % IST medium and 10 % MRS medium.
5.3.8.1 Composition
IST medium (5.3.6) 90,0 ml
MRS medium (5.3.1) without agar 10,0 ml
5.3.8.2 Preparation
Separately prepare the IST medium (5.3.6) and MRS medium (5.3.1) without agar. Mix both before
autoclaving in the proportions specified in 5.3.8.1. Adjust the pH (6.7) to 6,85 ± 0,1 with dilute hydrochloric
acid or dilute sodium hydroxide before autoclaving. After autoclaving, the pH range of the LSM medium should
be 6,7 ± 0,1.
If using hand-made microdilution plates (8.4.5.1), prepare the LSM medium by using a twice higher
concentration of IST medium (see footnote to the composition table in 5.3.6.1) and MRS medium (see
footnote to the composition table in 5.3.1.1).
Distribute the pH-adjusted medium (5.3.8.1) into bottles (6.8) of 150 ml capacity. Sterilize in the autoclave
(6.5) maintained at 121 °C for 15 min. If the medium is to be used immediately, cool it in a water bath (6.6) to
28 °C or 37 °C.
The prepared LSM medium may be stored with the cap tightened in the dark and held between 2 °C and 8 °C
for up to 2 weeks.
Test the medium for microbial contamination in accordance with ISO/TS 11133-2.
IDF 223:2010(E)
5.3.9 LSM-cysteine medium (LSM-Cys medium)
LSM-Cys medium consists of LSM medium (5.3.8) with addition of 0,3 g L-cysteine per litre of medium.
5.3.9.1 Composition
LSM medium (5.3.8) 100,0 ml
L-Cysteine hydrochloride 0,03 g
5.3.9.2 Preparation
Add 0,03 g of L-cysteine hydrochloride into 100 ml of LSM medium that has not been autoclaved (5.3.8). Mix
well until complete dissolution. Adjust the pH (6.7) to 6,85 ± 0,1 with dilute hydrochloric acid or dilute sodium
hydroxide before autoclaving. After autoclaving, the pH of the LSM-Cys medium should be 6,7 ± 0,1.
If using hand-made microdilution plates (8.4.5.1), prepare the LSM-Cys medium at a concentration twice
higher (see 5.3.8.2).
Distribute the pH-adjusted medium (5.3.9) into bottles (6.8) of 150 ml capacity.
Sterilize in the autoclave (6.5) maintained at 121 °C for 15 min. If the medium is to be used immediately, cool
it in a water bath (6.6) to 37 °C.
The prepared LSM-Cys medium may be stored with the cap tightened in the dark and held between 2 °C and
8 °C for up to 1 week.
Test the medium for microbial contamination in accordance with ISO/TS 11133-2.
5.3.10 Saline
Saline consists of a 0,85 % mass fraction of sodium chloride in water.
5.3.10.1 Composition
Sodium chloride 0,85 g
Water up to 100 ml
5.3.10.2 Preparation
Dissolve the sodium chloride in the water. Sterilize through a 0,2 µm filter (6.12) into a sterile test tube (6.13).
6 Apparatus and glassware
6.1 General. Sterilize as specified in ISO 7218 all equipment that comes into contact with the test sample,
the diluent, the dilutions or the culture medium. The glassware shall be resistant to repeated sterilization.
Usual microbiological laboratory equipment required for the preparation of test samples and dilutions as
specified in ISO 7218 and in particular the following.
6.2 Incubators, capable of maintaining temperatures of 28 °C ± 1 °C, 32 °C ± 1 °C, and 37 °C ± 1 °C,
respectively.
10 © ISO and IDF 2010 – All rights reserved
IDF 223:2010(E)
6.3 Anaerobic incubators, capable of maintaining temperatures of 28 °C ± 1 °C, 32 °C ± 1 °C, and
37 °C ± 1 °C, respectively or anaerobic culture jars, providing an atmosphere of an approximate volume
fraction of 9 % to 13 % of carbon dioxide.
6.4 Colony-counting equipment, see ISO 7218.
6.5 Autoclave, capable of maintaining a temperature of 121 °C ± 1 °C.
6.6 Water baths, capable of maintaining all temperatures between 28 °C and 55 °C and at boiling point.
6.7 pH meter, temperature compensated, accurate to ±0,1 pH unit at 25 °C.
6.8 Bottles or flasks, of capacity 150 ml or 250 ml and with suitable caps or stoppers (to hold the culture
medium).
6.9 Pipettes, sterile, calibrated for bacteriological use, capable of delivering 0,05 ml ± 0,002 ml,
[5] [1]
0,1 ml ± 0,02 ml, ISO 7550 , 1,0 ml ± 0,02 ml and 10 ml ± 0,2 ml, ISO 648 class A.
6.10 Petri dishes, sterile, made of clear colourless glass or plastic, of diameter 90 mm, of minimal internal
depth 10 mm. The bottoms shall have no irregularities that may interfere with counting colonies.
6.11 Spatula, sterile, made of glass or metal.
6.12 Filtration equipment, sterile, with cellulose acetate membrane filters of nominal size of openings
0,2 µm.
6.13 Test tubes, sterile, of capacity 5 ml, 20 ml or 50 ml with suitable sealing caps.
6.14 Spreader, sterile, made of glass, metal or plastic.
6.15 Drying cabinet, oven or incubator (e.g. a laminar airflow cabinet), ventilated (for drying the surface of
agar plates).
6.16 Cryotubes, sterile, of capacity 2 ml.
6.17 Spectrophotometer, capable of measuring optical density at 625 nm.
6.18 Microdilution plates, 96 well standard plates.
7 Sampling
A representative sample should be sent to the laboratory. It should not have been damaged or changed
during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method
[2]
is given in ISO 707⎪IDF 50 .
8 Procedure
8.1 Propagation
8.1.1 Prior to the susceptibility assay, propagate a strain to be tested on the agar medium under the
recommended incubation conditions (see Table 1). If a strain does not grow well in the recommended medium
or conditions, another carbon source may be added or the growth condition changed to facilitate growth.
IDF 223:2010(E)
Table 1 — Growth conditions for propagation
Medium Temperature Incubation time
Species Atmosphere
(agar) °C h
Bifidobacterium spp. MRS-Cys 37 Anaerobic 24 to 48
Lactobacillus brevis MRS 28 Anaerobic or ambient 16 to 24
Lactobacillus plantarum/pentosus MRS 28 Anaerobic or ambient 16 to 24
Lactobacillus sakei MRS 28 Anaerobic or ambient 16 to 24
Lactobacillus delbrueckii group MRS 37 Anaerobic 16 to 24
Other lactobacilli MRS 37 Anaerobic or ambient 16 to 24
Lactococcus lactis M17-lactose or Elliker 32 Anaerobic or ambient 16 to 24
Streptococcus thermophilus M17-sucrose or Elliker 37 Anaerobic or ambient 16 to 24
8.1.2 A strain stored as frozen can first be recovered in the liquid medium of the growth condition in Table 1
prior to its propagation on the agar medium.
8.2 Quality control strains and testing
® TM 1)
a) Lactobacillus plantarum ATCC 14917 (at 28 °C).
® TM 1)
b) Lactobacillus paracasei ATCC 334 (at 37 °C).
® TM 1)
c) Lactococcus lactis ATCC 19435 (at 32 °C).
1)
d) Streptococcus thermophilus LMG 18311 (at 37 °C).
® TM 1)
e) Bifidobacterium longum ATCC 15707 (at 37 °C).
The following quality control testing procedures are possibilities for testing strains.
When testing a strain of interest, examine a quality control strain which belongs to the same species of the
test strain each time:
® TM 1)
a) for lactobacilli to be cultivated at 28 °C, use Lactobacillus plantarum ATCC 14917 ;
® TM 1)
b) for lactobacilli to be cultivated at 37 °C, use Lactobacillus paracasei ATCC 334 ;
® TM 1)
c) for Bifidobacterium spp., use Bifidobacterium longum ATCC 15707 .
8.3 Growth conditions for antibiotic susceptibility test
See Table 2.
1) Example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of users of this
International Standard, and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of this product.
12 © ISO and IDF 2010 – All rights reserved
IDF 223:2010(E)
Table 2 — Growth conditions for antibiotic susceptibility test
Temperature Incubation time
Organism Medium Atmosphere
°C h
Bifidobacterium spp. LSM-Cys 37 Anaerobic 48
Lactobacillus brevis LSM 28 Anaerobic 48
Lactobacillus plantarum/pentosus LSM 28 Anaerobic 48
Lactobacillus sakei LSM 28 Anaerobic 48
Other lactobacilli LSM 37 Anaerobic 48
Lactococcus lactis IST 32 Anaerobic 48
Streptococcus thermophilus IST-lactose 37 Anaerobic 48
For testing Bifidobacterium spp., it is recommended to pre-reduce the medium under anaerobic conditions one
day prior to testing.
8.4 Preparation of microdilution plate
8.4.1 Concentration range of antibiotics
The concentration range of antibiotics is listed in Table 3.
Table 3 — Concentration range of antibiotics
Concentration range
Antibiotic Class
µg/ml
Gentamicin Aminoglycoside 0,5 to 256
Kanamycin Aminoglycoside 2 to 1 024
Streptomycin Aminoglycoside 0,5 to 256
Neomycin Aminoglycoside 0,5 to 256
Tetracycline Tetracycline 0,125 to 64
Erythromycin Macrolide 0,016 to 8
Clindamycin Lincosamide 0,032 to 16
Chloramphenicol Chloramphenicol 0,125 to 64
Ampicillin β-Lactam 0,032 to 16
Vancomycin Glycopeptide 0,25 to 128
Quinupristin and dalfopristin combination Streptogramin 0,016 to 8
Linezolid Oxazolidinone 0,032 to 16
Trimethoprim Dihydrofolate reductase inhibitor 0,125 to 64
Ciprofloxacin Fluoroquinolone 0,25 to 128
Rifampicin Rifamycin 0,125 to 64
IDF 223:2010(E)
8.4.2 Layout of microdilution plate
8.4.2.1 General
The layout of the microdilution plate is shown in Table 4 and Table 5.
Table 4 — Layout of microdilution plate — Panel 1
a b
Antibiotic 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Gentamicin P 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 N
Kanamycin P 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 N
Streptomycin P 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 N
Tetracycline P 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 N
Erythromycin P 0,016 0,032 0,0630,1250,25 0,5 1 2 4 8 N
Clindamycin P 0,032 0,063 0,1250,25 0,5 1 2 4 8 16 N
Chloramphenicol P 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 N
Ampicillin P 0,032 0,063 0,1250,25 0,5 1 2 4 8 16 N
a
Positive control well without the antibiotic, but with the test strain and the medium containing solvent which is used to dissolve the
antibiotic at the highest concentration.
b
Negative control well without the test strain and the antibiotic, but with the medium.
Table 5 — Layout of microdilution plate — Panel 2
b c
Antibiotic 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Neomycin P 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 N
Vancomycin P 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 N
Quinupristin and dalfopristin
P 0,016 0,0320,0640,1250,25 0,5 1 2 4 8 N
a
combination or virginiamycin
Linezolid P 0,032 0,0640,1250,25 0,5 1 2 4 8 16 N
Trimethoprim P 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 N
Ciprofloxacin P 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 N
Rifampicin P 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 N
a
The microdilution plate combined with a quinupristin and dalfopristin combination is difficult to acquire. Instead, pre-made
microdilution plates with virginiamycin can be used, which is a similar antibiotic used, for example, in veterinary practice. Virginiamycin
was also used in the interlaboratory trial (Annex A).
b
Positive control well without the antibiotic, but with the test strain and the medium containing solvent which is used to dissolve the
antibiotic at the highest concentration.
c
Negative control well without the test strain and the antibiotic, but with the medium.
14 © ISO and IDF 2010 – All rights reserved
IDF 223:2010(E)
8.4.2.2 Dilution of antibiotic
For the microdilution plate assay, first prepare a stock solution at the recommended concentration of an
antibiotic. When preparing the stock solution, adjust the mass of the antibiotic for the potency.
Calculate the potency, w , by using the equation:
p
ww=−w 1w
()
pas ac HO
where
w is the assay purity;
as
w is the active fraction, which is the free acid or base and not the salt — use a minimum amount of
ac
solvent to solubilize to antibiotic powder;
w is the water content due to any hydrate present.
H O
Use one of the following equations to calculate the amount, as mass, m, or volume, V, of powder or diluent
needed for a stock solution:
V ρ
m =
w
p
mw
p
V =
ρ
An example using gentamicin is shown in Table 6.
Table 6 — Stepwise preparation of antibiotic working solution
Double
Solution Source
Step Concentration Water (5.1) strength
source volume
solution
µg/ml ml ml µg/ml
1 Stock solution 5 120 1 9 512
2 Step 1 512 1 1 256
3 Step 1 512 1 3 128
4 Step 1 512 1 7 64
5 Step 4 64 1 1 32
6 Step 4 64 1 3 16
7 Step 4 64 1 7 8
8 Step 7 8 1 1 4
9 Step 7 8 1 3 2
10 Step 7 8 1 7 1
IDF 223:2010(E)
8.4.2.3 Preparation of final solution
Dilute 1 ml of each solution source mentioned in Table 6, steps 1 to 10 with water (5.1).
8.4.2.4 Distribution of the final solution
Dispense, for step 1 to step 10 (8.4.2.3), 50 µl of the double strength solution obtained into a well of the
microdilution plates (6.18) listed in Table 4 or Table 5.
8.4.2.5 Storage of microdilution plates
If the microdilution plates are not used immediately, they may be sealed and stored below −20 °C until
needed.
The antibiotic in frozen microdilution plates usually remains stable for several months. Check the performance
of the microdilution plates with a control strain.
8.4.3 Preparation of microdilution plates
TM 2)
VetMIC antibiotic pre-coated microdilution plates can be used. Applying a 100 µl solution (8.4.5.2) gives
the defined antibiotic concentration indicated in the instruction.
The plates can be kept for 2 years at room temperature.
8.4.4 Preparation of inoculum
8.4.4.1 Pick up individual colonies from an agar plate (8.1). Suspend the colonies obtained in a sterile
glass or plastic culture tube containing 2 ml to 5 ml of sterile saline.
In the case of Bifidobacterium spp., suspend the obtained colonies in pre-reduced LSM-Cys medium.
8.4.4.2 Suspend colonies until the solution turbidity reaches McFarland standard 1 or an optical density
at 625 nm of 0,16 to 0,2 by spectrophotometer (6.17). The suspended solution corresponds to approximately
3 × 10 cfu/ml.
For S. thermophilus and Lactob. delbrueckii, the McFarland 1 suspension of some strains might be lower than
8 8
3 × 10 cfu/ml. In this case, a McFarland turbidity corresponding to approximately 3 × 10 cfu/ml should be
used.
8.4.5 Dilution of the bacterial suspension with recommended medium
8.4.5.1 Hand-made microdilution plates
Dilute the bacterial suspension 500 times in the recommended medium (Table 2). The medium is diluted twice
with the antibiotic solution and, therefore, should have twice the concentration of bacteria compared to 8.4.5.2
(see 5.3.8.2).
Distribute the diluted bacterial suspension after its preparation within 30 min.
8.4.5.2 Pre-coated microdilution plates
Dilute the bacterial suspension 1 000 times in the recommended medium.
Distribute the diluted bacterial suspension after its preparation within 30 min.
TM
2) VetMIC is the trade name of a product supplied by the National Veterinary Institute, Uppsala, Sweden. This
information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF
of the product named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
16 © ISO and IDF 2010 – All rights reserved
IDF 223:2010(E)
8.4.6 Distribution of bacterial suspension into the well of the microdilution plate
8.4.6.1 Hand-made microdilution plates
When using frozen-stored plates, thaw the frozen antibiotic solution under anaerobic conditions (6.3)
immediately before use.
Distribute 50 µl of diluted suspension (8.4.5.1) into each well (approximately 3 × 10 cfu/well) of the
microdilution plate (8.4.2).
Incubate the plates under the conditions mentioned in Table 2. When using anaerobic jars, pile the plates with
a lid between every plate to generate a homogeneous environment in the jar.
8.4.6.2 Pre-coated microdilution plates
When using pre-coated plates (8.4.3), distribute 100 µl of the diluted suspension (8.4.5.2) into each well
(approximately 3 × 10 cfu/well) of the microdilution plate (8.4.3).
Incubate the plates under the conditions mentioned in Table 2. When using anaerobic jars, pile the plates with
a lid between every plate for generating a homogeneous environment in the jar.
8.4.7 Reading of MIC
Read the MICs visually after 48 h incubation.
Following incubation, check the negative control wells for presence of visible growth. If contamination is noted,
reject all data generated from the strain concerned.
NOTE The absence of growth in positive control wells implies that the tested strain is sensitive to the solvent which is
used to dissolve the antibiotic (e.g. citric acid included in the buffer used for ampicillin). In such cases, reading of the MIC
for this particular antibiotic is not relevant.
If negative and positive controls are checked and approved, growth is determ
...
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 10932
IDF
Первое издание
2010-06-15
Молоко и молочные продукты
Определение минимальной
подавляющей концентрации (MIC)
антибиотиков, применяемым к
бифидобактериям (LAB)
Milk and milk products – Determination of the minimal inhibitory
concentration (MIC) of antibiotics applicable to bifidobacteria (LAB)
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава
Ссылочные номера
IDF 223:2010(R)
©
ISO и IDF 2010
IDF 223:2010(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или смотреть на экране, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на установку интегрированных шрифтов в компьютере, на котором ведется редактирование. В случае загрузки
настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение лицензионных условий
фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe - торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованным для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General Info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже.
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO и IDF 2010
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
разрешения в письменной форме от ISO или IDF, которое должно быть получено после запроса о разрешении, направленного
по адресу, приведенному ниже.
ISO copyright office International Dairy Federation
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20 Diamant Building • Boulevard Auguste Reyers 80 • B-1030 Brussels
Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88
Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail copyright@iso.org E-mail info@fil-idf.org
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
Содержание Страница
Предисловие . iv
Введение . vi
1 Область применения . 1
2 Нормативные ссылки . 1
3 Термины и определения . 2
4 Сущность метода . 2
5 Разбавители, питательные среды и реактивы . 2
5.1 Основные материалы . 2
5.2 Разбавители. 2
5.3 Питательные среды . 3
6 Аппаратура и стеклянная лабораторная посуда . 12
7 Отбор проб . 13
8 Проведение испытания . 13
8.1 Выращивание . 13
8.2 Штаммы для контроля качества и испытания . 14
8.3 Условия выращивания бактерий для анализа на восприимчивость к антибиотикам . 14
8.4 Подготовка планшета для микро-разведений . 15
9 Обработка результатов . 19
10 Прецизионность . 19
10.1 Межлабораторные испытания . 19
10.2 Повторяемость (сходимость) . 20
10.3 Воспроизводимость . 20
11 Протокол испытания . 20
Приложение A (информативное) Межлабораторные испытания . 21
Библиография . 32
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются iii
IDF 223:2010(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией
национальных организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных
стандартов обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член,
заинтересованный в деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть
представленным в этом комитете. Международные правительственные и неправительственные
организации, имеющие связи с ISO, также принимают участие в работах. ISO тесно сотрудничает с
Международной электротехнической комиссией (IEC) по всем вопросам стандартизации в области
электротехники.
Международные стандарты разрабатываются в соответствии с правилами, приведенными в
Директивах ISO/IEC, Часть 2.
Основная задача технических комитетов состоит в разработке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам на
голосование. Для опубликования их в качестве международного стандарта требуется одобрение не
менее 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Следует учитывать возможность того, что некоторые элементы настоящего документа могут быть
предметом патентного права. ISO не несет ответственности за идентификацию любого из таких
патентных прав.
ISO 10932IDF 223 был подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 34, Пищевые продукты,
Подкомитетом SC 5, Молоко и молочные продукты, и Международной молочной федерацией (IDF).
Публикуется совместно ISO и IDF.
iv © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
Предисловие
Международная Молочная Федерация (IDF) является некоммерческой организацией,
представляющей всемирное молочное животноводство. Членами IDF являются Национальные
комитеты каждой страны-члена, а также региональные ассоциации по молочному животноводству,
которые имеют подписанное официальное соглашение о совместной деятельности с IDF. Каждый член
IDF имеет право быть представленным в Постоянных комитетах IDF, осуществляющих техническую
работу. IDF сотрудничает с ISO по вопросам разработки стандартных методов анализа и отбора проб
молока и молочных продуктов.
Основная задача Постоянных комитетов состоит в подготовке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, принятые Постоянными комитетами, рассылаются Национальным
комитетам для утверждения до опубликования в качестве международных стандартов. Их
опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения не менее 50 %
Национальных комитетов IDF, принимающих участие в голосовании.
Следует иметь в виду, что некоторые элементы настоящего документа могут быть объектом патентных
прав. IDF не должен нести ответственность за идентификацию какого-либо одного или всех патентных
прав.
ISO 10932IDF 223 был подготовлен Международной молочной федерацией (IDF) и Техническим
комитетом ISO/TC 34, Пищевые продукты, Подкомитетом SC 5, Молоко и молочные продукты.
Публикуется совместно IDF и ISO.
Вся работа была выполнена объединенной Рабочей группой ISO-IDF по Минимальной подавляющей
концентрации (MIC) антибиотиков Постоянного комитета по Методам анализа молочнокислых
микроорганизмов под руководством , г-на. M. Даниэльсона (Дания).
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются v
IDF 223:2010(R)
Введение
Опубликовано несколько отчетов по определению различными методами минимальной дозы
ингибитора (MIC) молочнокислых бактерий. Однако, полученное значение MIC зависит от
использованного определения и техники выращивания штамма. Например, MIC, определенная
различными количественными методами, не всегда одинакова. Также некоторые компоненты сред
являются антагонистичными к определенным антибиотикам.
Следовательно, необходимо стандартизованное определение MIC, в котором используется
подходящая питательная среда, имеющая незначительное антагонистическое воздействие или совсем
не имеющая такого воздействия в отношении изучаемых антибиотиков.
Два проекта ЕС (PROSAFE и ACE-ART) были запущены для решения этой проблемы, были
предложены подходящие питательные среды и метод измерения MIC. Настоящий международный
стандарта основан на стандартной рабочей методике (SOP), предложенной в проекте ACE-ART.
vi © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ
IDF 223:2010(R)
Молоко и молочные продукты Определение минимальной
подавляющей концентрации (MIC) антибиотиков,
применяемым к бифидобактериям (LAB)
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Антибиотики являются веществами, которые могут быть опасными.
Следует принять определенные меры, чтобы избежать контакта с этими веществами. В
частности, канамицин может причинить вред нерожденному ребенку (фраза риска R61)
хлорамфеникол может вызвать раковые заболевания (фраза риска R45).
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает метод определения минимальной подавляющей
концентрации (MIC) серии антибиотиков применительно к бифидобактериям и молочнокислым
бактериям (LAB), исключая энтерекокки.
ПРИМЕЧАНИЕ В отличие от диско-диффузионного метода, который является полуколичественным, часто
используемый метод микро-разведений бульона дает количественные MIC испытуемого микроорганизма в серии
разбавления антибиотиков. Наименьшая концентрация антибиотика, которая предотвращает видимый рост
испытуемого организма, считается минимальной подавляющей концентрацией (MIC).
Настоящий международный стандарт рекомендует метод микро-разведений бульона в качестве
стандартного метода.
2 Нормативные ссылки
Следующие ссылочные документы обязательны для применения данного документа. Для
датированных ссылок применяется только указанное издание. Для недатированных ссылок
применяется самое последнее издание указанного документа (включая все изменения).
ISO 6887-5, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для
испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований.
Часть 5. Специальные правила для приготовления молока и молочных продуктов
ISO 7218, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и
рекомендации по микробиологическим исследованиям
ISO/TS 11133-1, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания
по приготовлению и производству питательных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по
обеспечению качества приготовления питательных сред в лаборатории
ISO/TS 11133-2, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный
метод обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 2. Метод подсчета колоний
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 1
IDF 223:2010(R)
3 Термины и определения
Применительно к данному документу используются следующие термины и определения.
3.1
минимальная подавляющая концентрация
minimal inhibitory concentration
MIC
Самая низкая концентрация, определенная в условиях in vitro, предупреждает видимый рост бактерий
в рамках определенного периода времени
[6]
[ISO 20776-1:2006 , 2.4]
ПРИМЕЧАНИЕ MIC выражается в микрограммах на миллилитр.
4 Сущность метода
Большинство отдельных колоний, выращенных на чашке с агаровой средой, собирают и суспендируют
в стерильном физиологическом растворе, а бактерии Bifidobacterium spp. помещают в предварительно
восстановленную среду LSM-Cys.
Бактериальную суспензию разбавляют рекомендованной средой.
Готовят планшет для микро-разведений с серией двукратных разведений антибиотика.
Разбавленную бактериальную суспензию распределяют по лункам планшета и инкубируют в
рекомендованных условиях.
Самая низкая концентрация антибиотика, которая предотвращает видимый рост бактерий, считается
минимальной подавляющей концентрацией (MIC).
5 Разбавители, питательные среды и реактивы
5.1 Основные материалы
Используют только реактивы признанной аналитической чистоты, если нет иных указаний, и
стерильную дистиллированную или деминерализованную воду или воду равноценной чистоты.
См. ISO 6887-5.
5.2 Разбавители
См. ISO 6887-5.
2 © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
5.3 Питательные среды
5.3.1 Агар MRS
5.3.1.1 Состав
Пептон 1 (триптический гидролизат казеина) 10,0 г
Мясной экстракт 10,0 г
Дрожжевой экстракт (высушенный) 5,0 г
Глюкоза 20,0 г
a
Полисорбат 80 (полиэтоксилированный сорбитанмоноолеат) 1,0 мл
Гидрофосфат калия (K HPO ) 2,0 г
2 4
Тригидрат ацетата натрия (NaCH CO ·3H O) 5,0 г
3 2 2
Цинтрат аммония [(NH ) HC H O ] 2,0 г
4 2 6 5 7
Гептагидрат сульфата магния (MgSO ·7H O) 0,2 г
4 2
Тетрагидрат сульфата марганца (MnSO ·4H O) 0,05 г
4 2
b
Агар от 10 г до 15 г
Доводят водой до 1 000 мл
a
Tween 80 является примером подходящего продукта, имеющегося в продажу. Эта информация дается для удобства
пользователей данного международного стандарта и не указывают на предпочтение со стороны ISO или IDF в отношении
данной продукции.
b
В зависимости от прочности агарового геля.
c
При использовании планшетов для микро-разведения, изготовленных вручную (8.4.5.1), среду MRS следует
приготовить при концентрации вдвое выше посредством доведения водой до 500 мл.
5.3.1.2 Приготовление
Суспендируют ингредиенты в воде. Нагревают суспензию до кипения при частом перемешивании до
полного растворения. При необходимости регулируют pH (6.7) до 6,35 ± 0,2 разбавленной соляной
кислотой или разбавленным гидроксидом натрия перед автоклавированием. После обработки в
автоклаве, диапазон pH агаровой среды MRS должна быть 6,2 ± 0,2 при температуре 25 °C.
Разливают среду порциями объемом 100 мл ± 1 мл в склянки (6.8) вместимостью 150 мл или порциями
объемом 200 мл ± 2 мл в склянки (6.8) вместимостью 250 мл.
Стерилизуют в автоклаве (6.5), который поддерживается при температуре 121 °C, в течение 15 мин.
Если среду предполагается использовать немедленно, охлаждают ее на водяной бане (6.6) до
температуры от 44 °C до 47 °C. Если среда не будет использоваться немедленно, плавят агар MRS
(5.3.1.1) на кипящей водяной бане (6.6) и тщательно перемешивают, избегая появление пузырьков,
затем охлаждают на водяной бане (6.6) до температуры от 44 °C до 47 °C.
Разливают от 15 мл до 20 мл приготовленной среды в чашки Петри (6.10). Дают среде охладиться. Для
застывания среды чашки Петри с крышками помещают на прохладную горизонтальную поверхность.
Перед применением сушат агаровую среду в соответствии с ISO/TS 11133-1.
Приготовленные чашки с агаром MRS можно хранить в воздухонепроницаемом пластиковом пакете в
темном месте при температуре от 2 °C до 8 °C в течение 2 недель.
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 3
IDF 223:2010(R)
Чашки с агаровой средой анализируют на загрязнение микроорганизмами в соответствии с
ISO/TS 11133-2.
Полная агаровая питательная среда MRS (концентрат) имеется в продаже, однако полученные
результаты могут значительно отличаться при использовании сред от разных поставщиков. Поэтому
при использовании готовой среды необходимо проверить агар MRS по такой же среде, приготовленной
в соответствии с настоящим международным стандартом.
5.3.2 MRS-цистеиновый агар (агар MRS-Cys)
Агар MRS-Cys включает агар MRS (5.3.1) с добавлением 0,3 г L-цистеина на литр среды.
5.3.2.1 Основная среда — агар MRS
См. 5.3.1.
5.3.2.2 Исходный раствор L-цистеина
5.3.2.2.1 Состав
L-цистеина гидрохлорид 0,3 г
Доводят водой до 10,0 мл
5.3.2.2.2 Приготовление
Растворяют L-цистеина гидрохлорид в воде. Стерилизуют пропусканием через фильтр 0,2 мкм (6.12) в
стерильную пробирку (6.13).
Исходный раствор L-цистеина можно хранить в темном месте при температуре от 2 °C до 8 °C в
течение до 1 недели. Не допускается воздействие прямого солнечного света.
5.3.2.3 Полная среда
5.3.2.3.1 Состав
Основная среда (5.3.1) 100 мл
Исходный раствор L-цистеина
1,0 мл
(5.3.2.2)
5.3.2.3.2 Приготовление
Непосредственно перед применением плавят агар MRS (5.3.1) на кипящей водяной бане (6.6).
Охлаждают на водяной бане (6.6), поддерживаемой при температуре от 44 °C до 47 °C.
Соблюдая правила асептики добавляют 1,0 мл исходного раствора L-цистеина (5.3.2.2) в 100 мл агара
MRS (5.3.1). Тщательно перемешивают, избегая появление пузырьков газа.
Разливают в чашки Петри (6.10) по 15 мл - 20 мл приготовленной среды. Дают среде охладиться. Для
застывания агара помещают чашки Петри со средой с крышками на прохладную горизонтальную
поверхность. Перед применением сушат поверхность агара в соответствии с ISO/TS 11133-1.
4 © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
Подготовленные чашки с агаровой средой MRS-Cys можно хранить в воздухонепроницаемом
пластиковом пакете в темном месте при температуре от 2 °C до 8 °C до 1 недели.
Анализируют чашки со средой на загрязнение микроорганизмами в соответствии с ISO/TS 11133-2.
Полная агаровая среда MRS-Cys имеется в продаже, однако полученные результаты могут
значительно отличаться при использовании сред от разных поставщиков. Поэтому при использовании
готовой среды необходимо проверить агар MRS-Cys по такой же среде, приготовленной в
соответствии с настоящим международным стандартом.
5.3.3 Агар M17-сахароза
Агар M17-сахароза включает агар M17 (5.3.3.1) с добавлением 5,0 г сахарозы на литр среды.
5.3.3.1 Основная среда — агар M17
5.3.3.1.1 Состав
TТриптон (панкреатический гидролизат казеина) 5,0 г
Соевый пептон 5,0 г
Мясной экстракт 5,0 г
Дрожжевой экстракт (высушенный) 2,5 г
Аскорбиновая кислота (C H O ) 0,5 г
6 8 6
Гкптагидрат сульфата магния (MgSO ·7H O) 0,25 г
4 2
Глицерофосфат натрия (C H PO Na ·5H O) 19,0 г
3 7 6 2 2
a
Агар 10 г - 15 г
Доводят водой до 950 мл
a
В зависимости от прочности агарового геля.
5.3.3.1.2 Приготовление
Суспендируют ингредиенты в воде. Нагревают суспензию до кипения при частом перемешивании до
полного растворения. При необходимости регулируют pH (6.7) до 7,35 ± 0,2 разбавленной соляной
кислотой или разбавленным гидроксидом натрия перед автоклавированием. После обработки в
автоклаве, диапазон pH агаровой среды M17 должна быть 7,2 ± 0,2 при температуре 25 °C. Разливают
среду порциями объемом 95 мл ± 1 мл в склянки (6.8) вместимостью 150 мл или порциями объемом
190 мл ± 2 мл в склянки (6.8) вместимостью 250 мл.
Стерилизуют в автоклаве (6.5), который поддерживается при температуре 121 °C, в течение 15 мин.
Если среду предполагается использовать немедленно, охлаждают ее на водяной бане (6.6) до
температуры от 44 °C до 47 °C. Если среда не будет использоваться немедленно, плавят агар M17
(5.3.3.1) на кипящей водяной бане (6.6) и тщательно перемешивают, избегая появление пузырьков
газа, затем охлаждают на водяной бане (6.6) до температуры от 44 °C до 47 °C
5.3.3.2 Исходный раствор сахарозы
5.3.3.2.1 Состав
Сахароза 5,0 г
Доводят водой до 50 мл
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 5
IDF 223:2010(R)
5.3.3.2.2 Приготовление
Растворяют сахарозу в воде. Стерилизуют пропусканием через фильтр 0,2 мкм (6.12) в стерильную
пробирку (6.13).
5.3.3.3 Полная среда
5.3.3.3.1 Состав
Основная среда (5.3.3.1) 95,0 мл
Исходный раствор сахарозы (5.3.3.2) 5,0 мл
5.3.3.3.2 Приготовление
Непосредственно перед применением плавят агар M17 (5.3.3.1) на кипящей водяной бане (6.6).
Охлаждают на водяной бане (6.6), поддерживаемой при температуре от 44 °C до 47 °C.
Соблюдая правила асептики добавляют 5,0 мл исходного раствора сахарозы (5.3.3.2) в 95,0 мл агара
M17 (5.3.3.1). Тщательно перемешивают, избегая появление пузырьков газа.
Разливают в чашки Петри (6.10) по 15 мл - 20 мл приготовленной среды. Дают среде охладиться. Для
застывания агара помещают чашки Петри со средой с крышками на прохладную горизонтальную
поверхность.
Перед применением сушат поверхность агара в соответствии с ISO/TS 11133-1.
Подготовленные чашки со средой агар М17-сахароза можно хранить в воздухонепроницаемом
пластиковом пакете в темном месте при температуре от 2 °C до 8 °C до 2 недель.
Анализируют чашки со средой на загрязнение микроорганизмами в соответствии с ISO/TS 11133-2.
5.3.4 Агар M17-лактоза
Агар M17-лактоза включает агар M17 (5.3.3.1) с добавлением 5,0 г лактозы на литр среды.
5.3.4.1 Основная среда — агар M17
См. 5.3.3.1.
5.3.4.2 Исходный раствор лактозы
5.3.4.2.1 Состав
лактоза 5,0 г
Доводят водой до 50 мл
5.3.4.2.2 Приготовление
Растворяют лактозу в воде. Стерилизуют пропусканием через фильтр 0,2 мкм (6.12) в стерильную
пробирку (6.13).
6 © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
5.3.4.3 Полная среда
5.3.4.3.1 Состав
Основная среда (5.3.3.1) 95,0 мл
Исходный раствор лактозы (5.3.4.2) 5,0 мл
5.3.4.3.2 Приготовление
Непосредственно перед применением плавят агар M17 (5.3.3.1) на кипящей водяной бане (6.6).
Охлаждают на водяной бане (6.6), поддерживаемой при температуре от 44 °C до 47 °C.
Соблюдая правила асептики добавляют 5,0 мл исходного раствора лактозы (5.3.4.2) в 95,0 мл агара
M17 (5.3.3.1). Тщательно перемешивают, избегая появление пузырьков газа.
Разливают в чашки Петри (6.10) по 15 мл - 20 мл приготовленной среды. Дают среде охладиться. Для
застывания агара помещают чашки Петри со средой с крышками на прохладную горизонтальную
поверхность.
Перед применением сушат поверхность агара в соответствии с ISO/TS 11133-1.
Подготовленные чашки со средой агар М17-лактоза можно хранить в воздухонепроницаемом
пластиковом пакете в темном месте при температуре от 2 °C до 8 °C до 2 недель.
Анализируют чашки со средой на загрязнение микроорганизмами в соответствии с ISO/TS 11133-2.
5.3.5 Агар Элликера (Elliker)
5.3.5.1 Состав
Панкреатический гидролизат казеина 20,0 г
Дрожжевой экстракт (высушенный) 5,0 г
Желатин 2,5 г
Декстроза 5,0 г
лактоза 5,0 г
Сахароза 5,0 г
Хлорид натрия (NaCl) 4,0 г
Тригидрат ацетата натрия (Na CH CO ·3H O) 1,5 г
3 2 2
Ас корбиновая кислота (C H O ) 0,5 г
6 8 6
a
Агар 10 г - 15 г
Доводят водой до 1 000 мл
a
В зависимости от прочности агарового геля.
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 7
IDF 223:2010(R)
5.3.5.2 Приготовление
Суспендируют ингредиенты в воде. Нагревают суспензию до кипения при частом перемешивании до
полного растворения. При необходимости регулируют pH (6.7) до 6,95 ± 0,2 разбавленной соляной
кислотой или разбавленным гидроксидом натрия перед автоклавированием. После обработки в
автоклаве, диапазон pH агаровой среды MRS должна быть 6,8 ± 0,2 при температуре 25 °C.
Разливают среду порциями объемом 100 мл ± 1 мл в склянки (6.8) вместимостью 150 мл или порциями
объемом 200 мл ± 2 мл в склянки (6.8) вместимостью 250 мл.
Стерилизуют в автоклаве (6.5), который поддерживается при температуре 121 °C, в течение 15 мин.
Если среду предполагается использовать немедленно, охлаждают ее на водяной бане (6.6) до
температуры от 44 °C до 47 °C. Если среда не будет использоваться немедленно, плавят агар
Элликера (5.3.1.1) на кипящей водяной бане (6.6) и тщательно перемешивают, избегая появление
пузырьков, затем охлаждают на водяной бане (6.6) до температуры от 44 °C до 47 °C.
Разливают от 15 мл до 20 мл приготовленной среды в чашки Петри (6.10). Дают среде охладиться. Для
застывания среды чашки Петри с крышками помещают на прохладную горизонтальную поверхность.
Перед применением сушат агаровую среду в соответствии с ISO/TS 11133-1.
Приготовленные чашки с агаром Элликера можно хранить в воздухонепроницаемом пластиковом
пакете в темном месте при температуре от 2 °C до 8 °C в течение 2 недель.
Чашки с агаровой средой анализируют на загрязнение микроорганизмами в соответствии с
ISO/TS 11133-2.
8 © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
5.3.6 Среда IST
5.3.6.1 Состав
Гидролизат казеина 11,0 г
Пептон 3,0 г
Глюкоза 2,0 г
Хлорид натрия 3,0 г
Растворимый крахмал 1,0 г
Гидрофосфат калия 2,0 г
Ацетат натрия 1,0 г
Глицерофосфат магния 0,2 г
Глюконат кальция 0,1 г
Сульфат кобальта (II) 0,001 г
Сульфат меди (II) 0,001 г
Сульфат цинка 0,001 г
Сульфат железа (II) 0,001 г
Хлорид марганца (II) 0,002 г
Менадион 0,001 г
Цианокобламин 0,001 г
L-цистеина гидрохлорид 0,02 г
L-Tриптофан 0,02 г
Пиродокси н 0,003 г
Пантотенат 0,003 г
Никотинамид 0,003 г
Биотин 0,000 3 г
Тиамин 0,000 04 г
Аденин 0,01 г
Гуанин 0,01 г
Ксантин 0,01 г
Урацил 0,01 г
a
Доводят водой до 1 000 мл
a
При использовании изготовленных вручную планшетов для микро-разведений (8.4.5.1),
среду IST следует готовить при двойной концентрации посредством доведения водой 500 мл.
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 9
IDF 223:2010(R)
5.3.6.2 Приготовление
Суспендируют ингредиенты в воде. Нагревают суспензию до кипения при частом перемешивании до
полного растворения. Разливают среду порциями объемом 100 мл ± 1 мл в склянки (6.8)
вместимостью 150 мл или порциями объемом 200 мл ± 2 мл в склянки (6.8) вместимостью 250 мл.
Стерилизуют в автоклаве (6.5), который поддерживается при температуре 121 °C, в течение 15 мин.
При необходимости регулируют рН (6.7) так, чтобы после стерилизации рН составлял 7,4 ± 0,2. Если
среду планируют использовать немедленно, охлаждают ее на водяной бане (6.6) до температуры
32 °C.
Приготовленную среду IST (5.3.6.1) можно хранить в темном месте при температуре от 2 °C до 8 °C до
2 недель, плотно завинтив колпачок на склянке.
Чашки с агаровой средой анализируют на загрязнение микроорганизмами в соответствии с
ISO/TS 11133-2.
5.3.7 Среда IST - лактоза
Питательная среда IST –лактоза состоит из среды IST и 10,0 г лактозы на литр среды.
5.3.7.1 Состав
Среда IST (5.3.6) 90,0 мл
Исходный раствор лактозы (5.3.4.2) 10,0 мл
5.3.7.2 Приготовление
Готовят среду IST (5.3.6) и исходный раствор лактозы (5.3.4.2). Соблюдая правила асептики,
смешивают приготовленную среду и исходный раствор лактозы в пропорциях, установленных в 5.3.7.1
в стерилизованной склянке (6.8) вместимостью 150 мл. При использовании изготовленных вручную
планшетов для микро-разведений (8.4.5.1), готовят IST с массовой долей лактозы 1 % при
концентрации IST вдвое выше (см. сноску в таблице по составу среды в 5.3.6.1).
Приготовленную среду IST -лактоза можно хранить в закрытой колпачком склянке в темном месте при
температуре от 2 °C до 8 °C до 2 недель. Анализируют среду на загрязнение микроорганизмами в
соответствии с ISO/TS 11133-2.
5.3.8 Среда LSM
Среда LSM состоит из 90 % среды IST и 10 % среды MRS.
5.3.8.1 Состав
Среда IST (5.3.6) 90,0 мл
Среда MRS (5.3.1) без агара 10,0 мл
5.3.8.2 Приготовление
Отдельно готовят среду IST (5.3.6) и среду MRS (5.3.1) без агара. Смешивают обе среды перед
автоклавированием в пропорциях, соответствующих 5.3.8.1. Регулируют pH (6.7) до 6,85 ± 0,1
разбавленной соляной кислотой или разбавленным гидроксидом натрия перед автокрлавированием.
После обработки в автоклаве диапазон pH среды LSM должен составлять 6,7 ± 0,1.
10 © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
При использовании изготовленных вручную планшетов для микро-разведений (8.4.5.1), готовят среду
LSM , используя удвоенную концентрацию среды IST (см. сноску к таблице по составу среды в 5.3.6.1)
и среды MRS (см. сноску к таблице по составу среды в 5.3.1.1).
Разливают среду с отрегулированным pH (5.3.8.1) в склянки (6.8) вместимостью 150 мл. Стерилизуют в
автоклаве (6.5), температура в котором поддерживается на уровне 121 °C в течение 15 мин. Если
среду планируют использовать немедленно, охлаждают ее на водяной бане (6.6) до температуры
28 °C или 37 °C.
Приготовленную среду LSM можно хранить в закрытой колпачком склянке в темном месте при
температуре от 2 °C до 8 °C до 2 недель.
Анализируют среду на загрязнение микроорганизмами в соответствии с ISO/TS 11133-2.
5.3.9 Среда LSM-цистеин (среда LSM-Cys)
Среда LSM-Cys состоит из среды LSM (5.3.8) с добавлением 0,3 г L-цистеина на литр среды.
5.3.9.1 Состав
Среда LSM (5.3.8) 100,0 мл
L-цистеина гидрохлорид 0,03 г
5.3.9.2 Приготовление
Добавляют 0,03 г L-цистеина гидрохлорида в 100 мл среды LSM , не обработанной в автоклаве (5.3.8).
Тщательно перемешивают до полного растворения. Регулируют pH (6.7) до 6,85 ± 0,1 разбавленной
соляной кислотой или разбавленным гидроксидом натрия перед автокрлавированием. После
обработки в автоклаве диапазон pH среды LSM-Cys должен составлять 6,7 ± 0,1.
При использовании изготовленных вручную планшетов для микро-разведений (8.4.5.1), готовят среду
LSM-Cys при концентрации в два раза выше (см. 5.3.8.2).
Разливают среду с отрегулированным pH (5.3.9) в склянки (6.8) вместимостью 150 мл.
Стерилизуют в автоклаве (6.5), температура в котором поддерживается на уровне 121 °C в течение
15 мин. Если среду планируют использовать немедленно, охлаждают ее на водяной бане (6.6) до
температуры 37 °C.
Приготовленную среду LSM-Cys можно хранить в закрытой колпачком склянке в темном месте при
температуре от 2 °C до 8 °C до 1 недели.
Анализируют среду на загрязнение микроорганизмами в соответствии с ISO/TS 11133-2.
5.3.10 Физиологический раствор
Физиологический раствор состоит из 0,85 % по массе хлорида натрия в воде.
5.3.10.1 Состав
Хлорид натрия 0,85 г
Доводят водой до 100 мл
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 11
IDF 223:2010(R)
5.3.10.2 Приготовление
Растворяют хлорид натрия в воде. Стерилизуют пропусканием через фильтр 0,2 мкм (6.12) в
стерильную пробирку (6.13).
6 Аппаратура и стеклянная лабораторная посуда
6.1 Общие положения. Стерилизуют в соответствии с ISO 7218 все оборудование, которое
соприкасается с анализируемой пробой, разбавителем, разведениями или питательной средой.
Стеклянная посуда должна быть устойчива к многократной стерилизации.
Обычное оборудование микробиологической лаборатории, необходимое для приготовления проб для
анализа и разведений в соответствии с ISO 7218 и, в частности, следующее.
6.2 Инкубаторы (термостаты), обеспечивающие поддержание температуры на уровне 28 °C ± 1 °C,
32 °C ± 1 °C, и 37 °C ± 1 °C, соответственно.
6.3 Анаэробные инкубаторы, обеспечивающие поддержание температуры на уровне 28 °C ± 1 °C,
32 °C ± 1 °C, и 37 °C ± 1 °C, соответственно или анаэростаты, обеспечивающие пространство для
приблизительной объемной доли диоксида углерода от 9 % до 13 %.
6.4 Оборудование для подсчета колоний, см. ISO 7218.
6.5 Автоклав, обеспечивающий поддержание температуры 121 °C ± 1 °C.
6.6 Водяные бани, обеспечивающие поддержание температуры на всех уровнях от 28 °C до 55 °C и
в точке кипения.
6.7 pH метр, с температурной компенсацией, точностью до ±0,1 pH при температуре 25 °C.
6.8 Склянки или колбы, вместимостью 150 мл или 250 мл и с подходящими колпачками или
крышками (для помещения питательной среды).
6.9 Пипетки, стерильные, калиброванные для бактериологического использования,
[5]
обеспечивающие перенос 0,05 мл ± 0,002 мл, 0,1 мл ± 0,02 мл, ISO 7550 , 1,0 мл ± 0,02 мл и
[1]
10 мл ± 0,2 мл, ISO 648 класс A.
6.10 Чашки Петри, стерильные, изготовленные из прозрачного бесцветного стекла или пластика,
диаметров 90 мм, минимальной внутренней глубины 10 мм. На дне не должно быть неровностей,
которые могут помешать подсчету колоний.
6.11 Шпатель, стерильный, изготовленный из металла или стекла.
6.12 Оборудование для фильтрования, стерильное, с мембранными фильтрами из ацетата
целлюлозы с номинальным размером отверстий 0,2 мкм.
6.13 Пробирки, стерильные, вместимостью 5 мл, 20 мл или 50 мл с подходящими герметичными
пробками.
6.14 Дозатор, стерильный, стеклянный, металлический или пластиковый.
6.15 Сушильная камера, печь или инкубатор (например, шкаф с ламинарным воздушным течением),
вентилируемые (для просушивания поверхностей агаровой среды).
12 © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
6.16 Криопробирки, стерильные, вместимостью 2 мл.
6.17 Спектрофотометр, обеспечивающий измерение оптической плотности при 625 нм.
6.18 Планшеты для микро-разведений, стандартные на 96 лунок.
7 Отбор проб
В лабораторию следует отсылать представительную пробу. Необходимо следить, чтобы проба не
претерпела изменений в процессе транспортирования или хранения.
Отбор проб не входит в область применения данного метода, установленного в настоящем
[2]
международном стандарте. Рекомендованный метод отбора проб установлен в ISO 707IDF 50 .
8 Проведение испытания
8.1 Выращивание
8.1.1 Перед анализом на восприимчивость выращивают штамм на агаровой среде в
рекомендованных условиях инкубации (см. Таблицу 1). Если штамм плохо растет на рекомендованной
среде или в рекомендованных условиях, то для усиления роста можно ввести другой источник
углерода или изменить условия выращивания.
Таблица 1 — Условия выращивания
Время
Среда Температура
Виды Атмосфера инкубации
(агар) °C
ч
Bifidobacterium spp. MRS-Cys 37 Анаэробная 24 - 48
Анаэробная или
Lactobacillus brevis MRS 28 16 - 24
окружающая
Анаэробная
Lactobacillus plantarum/pentosus MRS 28 16 - 24
окружающая
Анаэробная или
Lactobacillus sakei MRS 28 16 - 24
окружающая
Lactobacillus delbrueckii group MRS 37 Анаэробная 16 - 24
Анаэробная или
Other lactobacilli MRS 37 16 - 24
окружающая
M17-лактоза или Анаэробная или
Lactococcus lactis 32 16 -24
Элликера окружающая
M17-сахароза или Анаэробная или
Streptococcus thermophilus 37 16 - 24
Элликера окружающая
8.1.2 Штамм, хранившийся в замороженном состоянии, сначала должен восстановиться в
питательной жидкой среде по Таблице 1 до готовности к росту, затем он прорастает в агаровую среду.
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 13
IDF 223:2010(R)
8.2 Штаммы для контроля качества и испытания
® TM 1)
a) Lactobacillus plantarum ATCC 14917 (при температуре 28 °C).
® TM 1)
b) Lactobacillus paracasei ATCC 334 (при температуре 37 °C).
® TM 1)
c) Lactococcus lactis ATCC 19435 (при температуре 32 °C).
1)
d) Streptococcus thermophilus LMG 18311 (при температуре 37 °C).
® TM 1)
e) Bifidobacterium longum ATCC 15707 (при температуре 37 °C).
Следующие методики контроля качества дают возможность проверки штаммов.
При испытании представляющего интерес штамма каждый раз исследуют штамм для контроля
качества, который принадлежит к тому же виду, что и анализируемый штамм:
a) для молочнокислых бактерий, которые предполагается выращивать при температуре 28 °C,
® TM 1)
используют Lactobacillus plantarum ATCC 14917 ;
b) ля молочнокислых бактерий, которые предполагается выращивать при температуре 37 °C,
® TM 1)
используют Lactobacillus paracasei ATCC 334 ;
® TM 1)
c) для Bifidobacterium spp., используют Bifidobacterium longum ATCC 15707 .
8.3 Условия выращивания бактерий для анализа на восприимчивость к антибиотикам
См. Таблицу 2.
Таблица 2 — Условия выращивания бактерий для анализа на восприимчивость к антибиотикам
Время
Температура
Организм Среда Атмосфера инкубирования
°C
ч
Bifidobacterium spp. LSM-Cys 37 Анаэробная 48
Lactobacillus brevis LSM 28 Анаэробная 48
Lactobacillus plantarum/pentosus LSM 28 Анаэробная 48
Lactobacillus sakei LSM 28 Анаэробная 48
Other lactobacilli LSM 37 Анаэробная 48
Lactococcus lactis IST 32 Анаэробная 48
Streptococcus thermophilus IST-lactose 37 Анаэробная 48
Для анализа Bifidobacterium spp., рекомендуется предварительно восстановить среду в анаэробных
условиях за день до анализа.
1) Пример подходящего продукта, имеющегося в продажу. Эта информация дается для удобства пользователей
данного международного стандарта и не указывают на предпочтение со стороны ISO или IDF в отношении данной
продукции.
14 © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
8.4 Подготовка планшета для микро-разведений
8.4.1 Диапазон концентраций антибиотиков
Диапазон концентраций антибиотиков представлен в Таблице 3.
Таблица 3 — Диапазон концентраций антибиотиков
Диапазон концентраций
Антибиотик Класс
мкг/мл
Гентамицин Аминогликозид 0,5 - 256
Канамицин Аминогликозид 2 - 1 024
Стрептомицин Аминогликозид 0,5 - 256
Неомицин Аминогликозид 0,5 - 256
Тетрациклин Тетрациклин 0,125 - 64
Эритромицин Макролид 0,016 - 8
Клиндамицин Линкозамид 0,032 - 16
Хлорамфеникол Хлорамфеникол 0,125 - 64
Ампициллин β-Лактам 0,032 - 16
Ванкомицин Гликопептид 0,25 - 128
Квинупристин в сочетании с дальфопистином Стрептограмин 0,016 - 8
Линезолид Оксазолидинон 0,032 - 16
Триметоприм Ингибитор дигидрофолат редуктазы 0,125 - 64
Ципрофлоксацин Флюорохинолог 0,25 - 128
Рифампицин Рифамицин 0,125 - 64
8.4.2 Схема планшета для микро-разведений
8.4.2.1 Общие положения
Схема планшета для микро-разведений показана в Таблице 4 и Таблице 5.
Таблица 4 — Схема планшета для микро-разведений — Панель 1
a b
Антибиотик 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Гентамицин P 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 N
Канамицин P 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 N
Стрептомицин P 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 N
Тетрациклин P 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 N
Эритромицин P 0,016 0,032 0,063 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 N
Циндамицин P 0,032 0,063 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 N
Хлорамфеникол P 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 N
Ампициллин P 0,032 0,063 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 N
a
Лунка положительного контроля (Р) без антибиотика, но содержащая анализируемый штамм и среду, содержащую
растворитель, который используется для растворения антибиотика в максимальной концентрации.
b
Лунка отрицательного контроля (N) не содержит анализируемый штамм и антибиотик, но содержит среду.
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 15
IDF 223:2010(R)
Таблица 5 — Схема планшета для микро-разведений — Панель 2
b c
Антибиотик 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Неомицин P 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 N
Ванкомицин P 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 N
Квинупристин в сочетании с
дальфопистином или P 0,016 0,032 0,064 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 N
a
виргиниамицином
Линезолид P 0,032 0,064 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 N
Триметоприм P 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 N
Ципрофлоксацин P 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 N
Рифампицин P 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 N
a
Планшет для микро0разведений с квинупристином в сочетании с дальфопистином трудно приготовить. Вместо этого
можно использовать заранее приготовленные планшеты с виргиниамицином, в которых используется антибиотик,
аналогичный, например, используемым в ветеринарной практике. Виргиниамицин также был использован в межлабораторном
исследовании (Приложение A).
b
Лунка положительного контроля без антибиотика, но содержащая анализируемый штамм и среду, содержащую
растворитель, который используется для растворения антибиотика в максимальной концентрации.
c
Лунка отрицательного контроля не содержит анализируемый штамм и антибиотик, но содержит среду.
8.4.2.2 Разведение антибиотика
Для анализа с использованием планшета для микро-разведений сначала готовят исходный раствор
антибиотика в рекомендуемой концентрации. При приготовлении исходного раствора регулируют
массу антибиотика, при которой антибиотик будет действенным.
Рассчитывают действенность (эффективность), w , используя формулу:
p
w =w w 1−w
( )
p as ac H O
где
w чистота анализа;
as
w активная фракция, не содержащая кислоты или основания или соли — используют
ac
минимальное количество растворителя для солюбилизации порошка антибиотика;
w содержание воды за счет присутствия гидрата.
H O
Используют одну из следующих формул для расчета количества порошка или разбавителя, как массы,
m, или как объема, V, , требующихся для исходного раствора:
Vρ
m=
w
p
mw
p
V=
ρ
16 © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
Пример с использованием гентамицина показан в Таблице 6.
Таблица 6 — Поэтапное приготовление рабочего раствора антибиотика
Объем Раствор
Раствор-
Этап Концентрация раствора- Вода (5.1) двойной
источник
источника концентрации
мкг/мл мл мл мкг/мл
Исходный
1 5 120 1 9 512
раствор
2 Этап 1 512 1 1 256
3 Этап 1 512 1 3 128
4 Этап 1 512 1 7 64
5 Этап 4 64 1 1 32
6 Этап 4 64 1 3 16
7 Этап 4 64 1 7 8
8 Этап 7 8 1 1 4
9 Этап 7 8 1 3 2
10 Этап 7 8 1 7 1
8.4.2.3 Приготовление конечного раствора
Разбавляют 1 мл каждого раствора-источника, указанного в Таблице 6, этапы 1 - 10 водой (5.1).
8.4.2.4 Распределение конечного раствора
Дозируют, для этапа 1 до этапа 10 (8.4.2.3), 50 мкл полученного раствора двойной концентрации, в
лунку планшетов для микро-разведений (6.18) в соответствии с Таблицей 4 или Таблицей 5.
8.4.2.5 Хранение планшетов для микро-разведений
Если планшеты для микро-разведений не предполагается использовать немедленно, их можно
запечатать и хранить при температуре ниже −20 °C до того момента, когда они потребуются.
Антибиотик в замороженных планшетах обычно остается стабильным в течение нескольких месяцев.
Проверяют эффективность планшетов для микро-разведений на контрольном штамме.
8.4.3 Подготовка планшетов для микро-разведений
TM 2)
Можно использовать планшеты для микро-разведений VetMIC , предварительно покрытые
антибиотиком. Применение раствора 100 мкл (8.4.5.2) дает определенную концентрацию антибиотика,
указанную в инструкции.
Эти планшеты можно хранить до двух лет при комнатной температуре.
TM
2) VetMIC это торговое наименование продукции, поставляемой Национальным институтом ветеринарии
(National Veterinary Institute, Uppsala, Sweden), Швеция. Эта информация дается для удобства пользователей
данного международного стандарта и не указывают на предпочтение со
...
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 10932
IDF
Первое издание
2010-06-15
Молоко и молочные продукты
Определение минимальной
подавляющей концентрации (MIC)
антибиотиков, применяемым к
бифидобактериям (LAB)
Milk and milk products – Determination of the minimal inhibitory
concentration (MIC) of antibiotics applicable to bifidobacteria (LAB)
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава
Ссылочные номера
IDF 223:2010(R)
©
ISO и IDF 2010
IDF 223:2010(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или смотреть на экране, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на установку интегрированных шрифтов в компьютере, на котором ведется редактирование. В случае загрузки
настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение лицензионных условий
фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe - торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованным для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General Info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже.
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO и IDF 2010
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
разрешения в письменной форме от ISO или IDF, которое должно быть получено после запроса о разрешении, направленного
по адресу, приведенному ниже.
ISO copyright office International Dairy Federation
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20 Diamant Building • Boulevard Auguste Reyers 80 • B-1030 Brussels
Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88
Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail copyright@iso.org E-mail info@fil-idf.org
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
Содержание Страница
Предисловие . iv
Введение . vi
1 Область применения . 1
2 Нормативные ссылки . 1
3 Термины и определения . 2
4 Сущность метода . 2
5 Разбавители, питательные среды и реактивы . 2
5.1 Основные материалы . 2
5.2 Разбавители. 2
5.3 Питательные среды . 3
6 Аппаратура и стеклянная лабораторная посуда . 12
7 Отбор проб . 13
8 Проведение испытания . 13
8.1 Выращивание . 13
8.2 Штаммы для контроля качества и испытания . 14
8.3 Условия выращивания бактерий для анализа на восприимчивость к антибиотикам . 14
8.4 Подготовка планшета для микро-разведений . 15
9 Обработка результатов . 19
10 Прецизионность . 19
10.1 Межлабораторные испытания . 19
10.2 Повторяемость (сходимость) . 20
10.3 Воспроизводимость . 20
11 Протокол испытания . 20
Приложение A (информативное) Межлабораторные испытания . 21
Библиография . 32
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются iii
IDF 223:2010(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией
национальных организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных
стандартов обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член,
заинтересованный в деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть
представленным в этом комитете. Международные правительственные и неправительственные
организации, имеющие связи с ISO, также принимают участие в работах. ISO тесно сотрудничает с
Международной электротехнической комиссией (IEC) по всем вопросам стандартизации в области
электротехники.
Международные стандарты разрабатываются в соответствии с правилами, приведенными в
Директивах ISO/IEC, Часть 2.
Основная задача технических комитетов состоит в разработке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам на
голосование. Для опубликования их в качестве международного стандарта требуется одобрение не
менее 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Следует учитывать возможность того, что некоторые элементы настоящего документа могут быть
предметом патентного права. ISO не несет ответственности за идентификацию любого из таких
патентных прав.
ISO 10932IDF 223 был подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 34, Пищевые продукты,
Подкомитетом SC 5, Молоко и молочные продукты, и Международной молочной федерацией (IDF).
Публикуется совместно ISO и IDF.
iv © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
Предисловие
Международная Молочная Федерация (IDF) является некоммерческой организацией,
представляющей всемирное молочное животноводство. Членами IDF являются Национальные
комитеты каждой страны-члена, а также региональные ассоциации по молочному животноводству,
которые имеют подписанное официальное соглашение о совместной деятельности с IDF. Каждый член
IDF имеет право быть представленным в Постоянных комитетах IDF, осуществляющих техническую
работу. IDF сотрудничает с ISO по вопросам разработки стандартных методов анализа и отбора проб
молока и молочных продуктов.
Основная задача Постоянных комитетов состоит в подготовке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, принятые Постоянными комитетами, рассылаются Национальным
комитетам для утверждения до опубликования в качестве международных стандартов. Их
опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения не менее 50 %
Национальных комитетов IDF, принимающих участие в голосовании.
Следует иметь в виду, что некоторые элементы настоящего документа могут быть объектом патентных
прав. IDF не должен нести ответственность за идентификацию какого-либо одного или всех патентных
прав.
ISO 10932IDF 223 был подготовлен Международной молочной федерацией (IDF) и Техническим
комитетом ISO/TC 34, Пищевые продукты, Подкомитетом SC 5, Молоко и молочные продукты.
Публикуется совместно IDF и ISO.
Вся работа была выполнена объединенной Рабочей группой ISO-IDF по Минимальной подавляющей
концентрации (MIC) антибиотиков Постоянного комитета по Методам анализа молочнокислых
микроорганизмов под руководством , г-на. M. Даниэльсона (Дания).
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются v
IDF 223:2010(R)
Введение
Опубликовано несколько отчетов по определению различными методами минимальной дозы
ингибитора (MIC) молочнокислых бактерий. Однако, полученное значение MIC зависит от
использованного определения и техники выращивания штамма. Например, MIC, определенная
различными количественными методами, не всегда одинакова. Также некоторые компоненты сред
являются антагонистичными к определенным антибиотикам.
Следовательно, необходимо стандартизованное определение MIC, в котором используется
подходящая питательная среда, имеющая незначительное антагонистическое воздействие или совсем
не имеющая такого воздействия в отношении изучаемых антибиотиков.
Два проекта ЕС (PROSAFE и ACE-ART) были запущены для решения этой проблемы, были
предложены подходящие питательные среды и метод измерения MIC. Настоящий международный
стандарта основан на стандартной рабочей методике (SOP), предложенной в проекте ACE-ART.
vi © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ
IDF 223:2010(R)
Молоко и молочные продукты Определение минимальной
подавляющей концентрации (MIC) антибиотиков,
применяемым к бифидобактериям (LAB)
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Антибиотики являются веществами, которые могут быть опасными.
Следует принять определенные меры, чтобы избежать контакта с этими веществами. В
частности, канамицин может причинить вред нерожденному ребенку (фраза риска R61)
хлорамфеникол может вызвать раковые заболевания (фраза риска R45).
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает метод определения минимальной подавляющей
концентрации (MIC) серии антибиотиков применительно к бифидобактериям и молочнокислым
бактериям (LAB), исключая энтерекокки.
ПРИМЕЧАНИЕ В отличие от диско-диффузионного метода, который является полуколичественным, часто
используемый метод микро-разведений бульона дает количественные MIC испытуемого микроорганизма в серии
разбавления антибиотиков. Наименьшая концентрация антибиотика, которая предотвращает видимый рост
испытуемого организма, считается минимальной подавляющей концентрацией (MIC).
Настоящий международный стандарт рекомендует метод микро-разведений бульона в качестве
стандартного метода.
2 Нормативные ссылки
Следующие ссылочные документы обязательны для применения данного документа. Для
датированных ссылок применяется только указанное издание. Для недатированных ссылок
применяется самое последнее издание указанного документа (включая все изменения).
ISO 6887-5, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для
испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований.
Часть 5. Специальные правила для приготовления молока и молочных продуктов
ISO 7218, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и
рекомендации по микробиологическим исследованиям
ISO/TS 11133-1, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания
по приготовлению и производству питательных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по
обеспечению качества приготовления питательных сред в лаборатории
ISO/TS 11133-2, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный
метод обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 2. Метод подсчета колоний
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 1
IDF 223:2010(R)
3 Термины и определения
Применительно к данному документу используются следующие термины и определения.
3.1
минимальная подавляющая концентрация
minimal inhibitory concentration
MIC
Самая низкая концентрация, определенная в условиях in vitro, предупреждает видимый рост бактерий
в рамках определенного периода времени
[6]
[ISO 20776-1:2006 , 2.4]
ПРИМЕЧАНИЕ MIC выражается в микрограммах на миллилитр.
4 Сущность метода
Большинство отдельных колоний, выращенных на чашке с агаровой средой, собирают и суспендируют
в стерильном физиологическом растворе, а бактерии Bifidobacterium spp. помещают в предварительно
восстановленную среду LSM-Cys.
Бактериальную суспензию разбавляют рекомендованной средой.
Готовят планшет для микро-разведений с серией двукратных разведений антибиотика.
Разбавленную бактериальную суспензию распределяют по лункам планшета и инкубируют в
рекомендованных условиях.
Самая низкая концентрация антибиотика, которая предотвращает видимый рост бактерий, считается
минимальной подавляющей концентрацией (MIC).
5 Разбавители, питательные среды и реактивы
5.1 Основные материалы
Используют только реактивы признанной аналитической чистоты, если нет иных указаний, и
стерильную дистиллированную или деминерализованную воду или воду равноценной чистоты.
См. ISO 6887-5.
5.2 Разбавители
См. ISO 6887-5.
2 © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
5.3 Питательные среды
5.3.1 Агар MRS
5.3.1.1 Состав
Пептон 1 (триптический гидролизат казеина) 10,0 г
Мясной экстракт 10,0 г
Дрожжевой экстракт (высушенный) 5,0 г
Глюкоза 20,0 г
a
Полисорбат 80 (полиэтоксилированный сорбитанмоноолеат) 1,0 мл
Гидрофосфат калия (K HPO ) 2,0 г
2 4
Тригидрат ацетата натрия (NaCH CO ·3H O) 5,0 г
3 2 2
Цинтрат аммония [(NH ) HC H O ] 2,0 г
4 2 6 5 7
Гептагидрат сульфата магния (MgSO ·7H O) 0,2 г
4 2
Тетрагидрат сульфата марганца (MnSO ·4H O) 0,05 г
4 2
b
Агар от 10 г до 15 г
Доводят водой до 1 000 мл
a
Tween 80 является примером подходящего продукта, имеющегося в продажу. Эта информация дается для удобства
пользователей данного международного стандарта и не указывают на предпочтение со стороны ISO или IDF в отношении
данной продукции.
b
В зависимости от прочности агарового геля.
c
При использовании планшетов для микро-разведения, изготовленных вручную (8.4.5.1), среду MRS следует
приготовить при концентрации вдвое выше посредством доведения водой до 500 мл.
5.3.1.2 Приготовление
Суспендируют ингредиенты в воде. Нагревают суспензию до кипения при частом перемешивании до
полного растворения. При необходимости регулируют pH (6.7) до 6,35 ± 0,2 разбавленной соляной
кислотой или разбавленным гидроксидом натрия перед автоклавированием. После обработки в
автоклаве, диапазон pH агаровой среды MRS должна быть 6,2 ± 0,2 при температуре 25 °C.
Разливают среду порциями объемом 100 мл ± 1 мл в склянки (6.8) вместимостью 150 мл или порциями
объемом 200 мл ± 2 мл в склянки (6.8) вместимостью 250 мл.
Стерилизуют в автоклаве (6.5), который поддерживается при температуре 121 °C, в течение 15 мин.
Если среду предполагается использовать немедленно, охлаждают ее на водяной бане (6.6) до
температуры от 44 °C до 47 °C. Если среда не будет использоваться немедленно, плавят агар MRS
(5.3.1.1) на кипящей водяной бане (6.6) и тщательно перемешивают, избегая появление пузырьков,
затем охлаждают на водяной бане (6.6) до температуры от 44 °C до 47 °C.
Разливают от 15 мл до 20 мл приготовленной среды в чашки Петри (6.10). Дают среде охладиться. Для
застывания среды чашки Петри с крышками помещают на прохладную горизонтальную поверхность.
Перед применением сушат агаровую среду в соответствии с ISO/TS 11133-1.
Приготовленные чашки с агаром MRS можно хранить в воздухонепроницаемом пластиковом пакете в
темном месте при температуре от 2 °C до 8 °C в течение 2 недель.
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 3
IDF 223:2010(R)
Чашки с агаровой средой анализируют на загрязнение микроорганизмами в соответствии с
ISO/TS 11133-2.
Полная агаровая питательная среда MRS (концентрат) имеется в продаже, однако полученные
результаты могут значительно отличаться при использовании сред от разных поставщиков. Поэтому
при использовании готовой среды необходимо проверить агар MRS по такой же среде, приготовленной
в соответствии с настоящим международным стандартом.
5.3.2 MRS-цистеиновый агар (агар MRS-Cys)
Агар MRS-Cys включает агар MRS (5.3.1) с добавлением 0,3 г L-цистеина на литр среды.
5.3.2.1 Основная среда — агар MRS
См. 5.3.1.
5.3.2.2 Исходный раствор L-цистеина
5.3.2.2.1 Состав
L-цистеина гидрохлорид 0,3 г
Доводят водой до 10,0 мл
5.3.2.2.2 Приготовление
Растворяют L-цистеина гидрохлорид в воде. Стерилизуют пропусканием через фильтр 0,2 мкм (6.12) в
стерильную пробирку (6.13).
Исходный раствор L-цистеина можно хранить в темном месте при температуре от 2 °C до 8 °C в
течение до 1 недели. Не допускается воздействие прямого солнечного света.
5.3.2.3 Полная среда
5.3.2.3.1 Состав
Основная среда (5.3.1) 100 мл
Исходный раствор L-цистеина
1,0 мл
(5.3.2.2)
5.3.2.3.2 Приготовление
Непосредственно перед применением плавят агар MRS (5.3.1) на кипящей водяной бане (6.6).
Охлаждают на водяной бане (6.6), поддерживаемой при температуре от 44 °C до 47 °C.
Соблюдая правила асептики добавляют 1,0 мл исходного раствора L-цистеина (5.3.2.2) в 100 мл агара
MRS (5.3.1). Тщательно перемешивают, избегая появление пузырьков газа.
Разливают в чашки Петри (6.10) по 15 мл - 20 мл приготовленной среды. Дают среде охладиться. Для
застывания агара помещают чашки Петри со средой с крышками на прохладную горизонтальную
поверхность. Перед применением сушат поверхность агара в соответствии с ISO/TS 11133-1.
4 © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
Подготовленные чашки с агаровой средой MRS-Cys можно хранить в воздухонепроницаемом
пластиковом пакете в темном месте при температуре от 2 °C до 8 °C до 1 недели.
Анализируют чашки со средой на загрязнение микроорганизмами в соответствии с ISO/TS 11133-2.
Полная агаровая среда MRS-Cys имеется в продаже, однако полученные результаты могут
значительно отличаться при использовании сред от разных поставщиков. Поэтому при использовании
готовой среды необходимо проверить агар MRS-Cys по такой же среде, приготовленной в
соответствии с настоящим международным стандартом.
5.3.3 Агар M17-сахароза
Агар M17-сахароза включает агар M17 (5.3.3.1) с добавлением 5,0 г сахарозы на литр среды.
5.3.3.1 Основная среда — агар M17
5.3.3.1.1 Состав
TТриптон (панкреатический гидролизат казеина) 5,0 г
Соевый пептон 5,0 г
Мясной экстракт 5,0 г
Дрожжевой экстракт (высушенный) 2,5 г
Аскорбиновая кислота (C H O ) 0,5 г
6 8 6
Гкптагидрат сульфата магния (MgSO ·7H O) 0,25 г
4 2
Глицерофосфат натрия (C H PO Na ·5H O) 19,0 г
3 7 6 2 2
a
Агар 10 г - 15 г
Доводят водой до 950 мл
a
В зависимости от прочности агарового геля.
5.3.3.1.2 Приготовление
Суспендируют ингредиенты в воде. Нагревают суспензию до кипения при частом перемешивании до
полного растворения. При необходимости регулируют pH (6.7) до 7,35 ± 0,2 разбавленной соляной
кислотой или разбавленным гидроксидом натрия перед автоклавированием. После обработки в
автоклаве, диапазон pH агаровой среды M17 должна быть 7,2 ± 0,2 при температуре 25 °C. Разливают
среду порциями объемом 95 мл ± 1 мл в склянки (6.8) вместимостью 150 мл или порциями объемом
190 мл ± 2 мл в склянки (6.8) вместимостью 250 мл.
Стерилизуют в автоклаве (6.5), который поддерживается при температуре 121 °C, в течение 15 мин.
Если среду предполагается использовать немедленно, охлаждают ее на водяной бане (6.6) до
температуры от 44 °C до 47 °C. Если среда не будет использоваться немедленно, плавят агар M17
(5.3.3.1) на кипящей водяной бане (6.6) и тщательно перемешивают, избегая появление пузырьков
газа, затем охлаждают на водяной бане (6.6) до температуры от 44 °C до 47 °C
5.3.3.2 Исходный раствор сахарозы
5.3.3.2.1 Состав
Сахароза 5,0 г
Доводят водой до 50 мл
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 5
IDF 223:2010(R)
5.3.3.2.2 Приготовление
Растворяют сахарозу в воде. Стерилизуют пропусканием через фильтр 0,2 мкм (6.12) в стерильную
пробирку (6.13).
5.3.3.3 Полная среда
5.3.3.3.1 Состав
Основная среда (5.3.3.1) 95,0 мл
Исходный раствор сахарозы (5.3.3.2) 5,0 мл
5.3.3.3.2 Приготовление
Непосредственно перед применением плавят агар M17 (5.3.3.1) на кипящей водяной бане (6.6).
Охлаждают на водяной бане (6.6), поддерживаемой при температуре от 44 °C до 47 °C.
Соблюдая правила асептики добавляют 5,0 мл исходного раствора сахарозы (5.3.3.2) в 95,0 мл агара
M17 (5.3.3.1). Тщательно перемешивают, избегая появление пузырьков газа.
Разливают в чашки Петри (6.10) по 15 мл - 20 мл приготовленной среды. Дают среде охладиться. Для
застывания агара помещают чашки Петри со средой с крышками на прохладную горизонтальную
поверхность.
Перед применением сушат поверхность агара в соответствии с ISO/TS 11133-1.
Подготовленные чашки со средой агар М17-сахароза можно хранить в воздухонепроницаемом
пластиковом пакете в темном месте при температуре от 2 °C до 8 °C до 2 недель.
Анализируют чашки со средой на загрязнение микроорганизмами в соответствии с ISO/TS 11133-2.
5.3.4 Агар M17-лактоза
Агар M17-лактоза включает агар M17 (5.3.3.1) с добавлением 5,0 г лактозы на литр среды.
5.3.4.1 Основная среда — агар M17
См. 5.3.3.1.
5.3.4.2 Исходный раствор лактозы
5.3.4.2.1 Состав
лактоза 5,0 г
Доводят водой до 50 мл
5.3.4.2.2 Приготовление
Растворяют лактозу в воде. Стерилизуют пропусканием через фильтр 0,2 мкм (6.12) в стерильную
пробирку (6.13).
6 © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
5.3.4.3 Полная среда
5.3.4.3.1 Состав
Основная среда (5.3.3.1) 95,0 мл
Исходный раствор лактозы (5.3.4.2) 5,0 мл
5.3.4.3.2 Приготовление
Непосредственно перед применением плавят агар M17 (5.3.3.1) на кипящей водяной бане (6.6).
Охлаждают на водяной бане (6.6), поддерживаемой при температуре от 44 °C до 47 °C.
Соблюдая правила асептики добавляют 5,0 мл исходного раствора лактозы (5.3.4.2) в 95,0 мл агара
M17 (5.3.3.1). Тщательно перемешивают, избегая появление пузырьков газа.
Разливают в чашки Петри (6.10) по 15 мл - 20 мл приготовленной среды. Дают среде охладиться. Для
застывания агара помещают чашки Петри со средой с крышками на прохладную горизонтальную
поверхность.
Перед применением сушат поверхность агара в соответствии с ISO/TS 11133-1.
Подготовленные чашки со средой агар М17-лактоза можно хранить в воздухонепроницаемом
пластиковом пакете в темном месте при температуре от 2 °C до 8 °C до 2 недель.
Анализируют чашки со средой на загрязнение микроорганизмами в соответствии с ISO/TS 11133-2.
5.3.5 Агар Элликера (Elliker)
5.3.5.1 Состав
Панкреатический гидролизат казеина 20,0 г
Дрожжевой экстракт (высушенный) 5,0 г
Желатин 2,5 г
Декстроза 5,0 г
лактоза 5,0 г
Сахароза 5,0 г
Хлорид натрия (NaCl) 4,0 г
Тригидрат ацетата натрия (Na CH CO ·3H O) 1,5 г
3 2 2
Ас корбиновая кислота (C H O ) 0,5 г
6 8 6
a
Агар 10 г - 15 г
Доводят водой до 1 000 мл
a
В зависимости от прочности агарового геля.
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 7
IDF 223:2010(R)
5.3.5.2 Приготовление
Суспендируют ингредиенты в воде. Нагревают суспензию до кипения при частом перемешивании до
полного растворения. При необходимости регулируют pH (6.7) до 6,95 ± 0,2 разбавленной соляной
кислотой или разбавленным гидроксидом натрия перед автоклавированием. После обработки в
автоклаве, диапазон pH агаровой среды MRS должна быть 6,8 ± 0,2 при температуре 25 °C.
Разливают среду порциями объемом 100 мл ± 1 мл в склянки (6.8) вместимостью 150 мл или порциями
объемом 200 мл ± 2 мл в склянки (6.8) вместимостью 250 мл.
Стерилизуют в автоклаве (6.5), который поддерживается при температуре 121 °C, в течение 15 мин.
Если среду предполагается использовать немедленно, охлаждают ее на водяной бане (6.6) до
температуры от 44 °C до 47 °C. Если среда не будет использоваться немедленно, плавят агар
Элликера (5.3.1.1) на кипящей водяной бане (6.6) и тщательно перемешивают, избегая появление
пузырьков, затем охлаждают на водяной бане (6.6) до температуры от 44 °C до 47 °C.
Разливают от 15 мл до 20 мл приготовленной среды в чашки Петри (6.10). Дают среде охладиться. Для
застывания среды чашки Петри с крышками помещают на прохладную горизонтальную поверхность.
Перед применением сушат агаровую среду в соответствии с ISO/TS 11133-1.
Приготовленные чашки с агаром Элликера можно хранить в воздухонепроницаемом пластиковом
пакете в темном месте при температуре от 2 °C до 8 °C в течение 2 недель.
Чашки с агаровой средой анализируют на загрязнение микроорганизмами в соответствии с
ISO/TS 11133-2.
8 © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
5.3.6 Среда IST
5.3.6.1 Состав
Гидролизат казеина 11,0 г
Пептон 3,0 г
Глюкоза 2,0 г
Хлорид натрия 3,0 г
Растворимый крахмал 1,0 г
Гидрофосфат калия 2,0 г
Ацетат натрия 1,0 г
Глицерофосфат магния 0,2 г
Глюконат кальция 0,1 г
Сульфат кобальта (II) 0,001 г
Сульфат меди (II) 0,001 г
Сульфат цинка 0,001 г
Сульфат железа (II) 0,001 г
Хлорид марганца (II) 0,002 г
Менадион 0,001 г
Цианокобламин 0,001 г
L-цистеина гидрохлорид 0,02 г
L-Tриптофан 0,02 г
Пиродокси н 0,003 г
Пантотенат 0,003 г
Никотинамид 0,003 г
Биотин 0,000 3 г
Тиамин 0,000 04 г
Аденин 0,01 г
Гуанин 0,01 г
Ксантин 0,01 г
Урацил 0,01 г
a
Доводят водой до 1 000 мл
a
При использовании изготовленных вручную планшетов для микро-разведений (8.4.5.1),
среду IST следует готовить при двойной концентрации посредством доведения водой 500 мл.
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 9
IDF 223:2010(R)
5.3.6.2 Приготовление
Суспендируют ингредиенты в воде. Нагревают суспензию до кипения при частом перемешивании до
полного растворения. Разливают среду порциями объемом 100 мл ± 1 мл в склянки (6.8)
вместимостью 150 мл или порциями объемом 200 мл ± 2 мл в склянки (6.8) вместимостью 250 мл.
Стерилизуют в автоклаве (6.5), который поддерживается при температуре 121 °C, в течение 15 мин.
При необходимости регулируют рН (6.7) так, чтобы после стерилизации рН составлял 7,4 ± 0,2. Если
среду планируют использовать немедленно, охлаждают ее на водяной бане (6.6) до температуры
32 °C.
Приготовленную среду IST (5.3.6.1) можно хранить в темном месте при температуре от 2 °C до 8 °C до
2 недель, плотно завинтив колпачок на склянке.
Чашки с агаровой средой анализируют на загрязнение микроорганизмами в соответствии с
ISO/TS 11133-2.
5.3.7 Среда IST - лактоза
Питательная среда IST –лактоза состоит из среды IST и 10,0 г лактозы на литр среды.
5.3.7.1 Состав
Среда IST (5.3.6) 90,0 мл
Исходный раствор лактозы (5.3.4.2) 10,0 мл
5.3.7.2 Приготовление
Готовят среду IST (5.3.6) и исходный раствор лактозы (5.3.4.2). Соблюдая правила асептики,
смешивают приготовленную среду и исходный раствор лактозы в пропорциях, установленных в 5.3.7.1
в стерилизованной склянке (6.8) вместимостью 150 мл. При использовании изготовленных вручную
планшетов для микро-разведений (8.4.5.1), готовят IST с массовой долей лактозы 1 % при
концентрации IST вдвое выше (см. сноску в таблице по составу среды в 5.3.6.1).
Приготовленную среду IST -лактоза можно хранить в закрытой колпачком склянке в темном месте при
температуре от 2 °C до 8 °C до 2 недель. Анализируют среду на загрязнение микроорганизмами в
соответствии с ISO/TS 11133-2.
5.3.8 Среда LSM
Среда LSM состоит из 90 % среды IST и 10 % среды MRS.
5.3.8.1 Состав
Среда IST (5.3.6) 90,0 мл
Среда MRS (5.3.1) без агара 10,0 мл
5.3.8.2 Приготовление
Отдельно готовят среду IST (5.3.6) и среду MRS (5.3.1) без агара. Смешивают обе среды перед
автоклавированием в пропорциях, соответствующих 5.3.8.1. Регулируют pH (6.7) до 6,85 ± 0,1
разбавленной соляной кислотой или разбавленным гидроксидом натрия перед автокрлавированием.
После обработки в автоклаве диапазон pH среды LSM должен составлять 6,7 ± 0,1.
10 © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
При использовании изготовленных вручную планшетов для микро-разведений (8.4.5.1), готовят среду
LSM , используя удвоенную концентрацию среды IST (см. сноску к таблице по составу среды в 5.3.6.1)
и среды MRS (см. сноску к таблице по составу среды в 5.3.1.1).
Разливают среду с отрегулированным pH (5.3.8.1) в склянки (6.8) вместимостью 150 мл. Стерилизуют в
автоклаве (6.5), температура в котором поддерживается на уровне 121 °C в течение 15 мин. Если
среду планируют использовать немедленно, охлаждают ее на водяной бане (6.6) до температуры
28 °C или 37 °C.
Приготовленную среду LSM можно хранить в закрытой колпачком склянке в темном месте при
температуре от 2 °C до 8 °C до 2 недель.
Анализируют среду на загрязнение микроорганизмами в соответствии с ISO/TS 11133-2.
5.3.9 Среда LSM-цистеин (среда LSM-Cys)
Среда LSM-Cys состоит из среды LSM (5.3.8) с добавлением 0,3 г L-цистеина на литр среды.
5.3.9.1 Состав
Среда LSM (5.3.8) 100,0 мл
L-цистеина гидрохлорид 0,03 г
5.3.9.2 Приготовление
Добавляют 0,03 г L-цистеина гидрохлорида в 100 мл среды LSM , не обработанной в автоклаве (5.3.8).
Тщательно перемешивают до полного растворения. Регулируют pH (6.7) до 6,85 ± 0,1 разбавленной
соляной кислотой или разбавленным гидроксидом натрия перед автокрлавированием. После
обработки в автоклаве диапазон pH среды LSM-Cys должен составлять 6,7 ± 0,1.
При использовании изготовленных вручную планшетов для микро-разведений (8.4.5.1), готовят среду
LSM-Cys при концентрации в два раза выше (см. 5.3.8.2).
Разливают среду с отрегулированным pH (5.3.9) в склянки (6.8) вместимостью 150 мл.
Стерилизуют в автоклаве (6.5), температура в котором поддерживается на уровне 121 °C в течение
15 мин. Если среду планируют использовать немедленно, охлаждают ее на водяной бане (6.6) до
температуры 37 °C.
Приготовленную среду LSM-Cys можно хранить в закрытой колпачком склянке в темном месте при
температуре от 2 °C до 8 °C до 1 недели.
Анализируют среду на загрязнение микроорганизмами в соответствии с ISO/TS 11133-2.
5.3.10 Физиологический раствор
Физиологический раствор состоит из 0,85 % по массе хлорида натрия в воде.
5.3.10.1 Состав
Хлорид натрия 0,85 г
Доводят водой до 100 мл
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 11
IDF 223:2010(R)
5.3.10.2 Приготовление
Растворяют хлорид натрия в воде. Стерилизуют пропусканием через фильтр 0,2 мкм (6.12) в
стерильную пробирку (6.13).
6 Аппаратура и стеклянная лабораторная посуда
6.1 Общие положения. Стерилизуют в соответствии с ISO 7218 все оборудование, которое
соприкасается с анализируемой пробой, разбавителем, разведениями или питательной средой.
Стеклянная посуда должна быть устойчива к многократной стерилизации.
Обычное оборудование микробиологической лаборатории, необходимое для приготовления проб для
анализа и разведений в соответствии с ISO 7218 и, в частности, следующее.
6.2 Инкубаторы (термостаты), обеспечивающие поддержание температуры на уровне 28 °C ± 1 °C,
32 °C ± 1 °C, и 37 °C ± 1 °C, соответственно.
6.3 Анаэробные инкубаторы, обеспечивающие поддержание температуры на уровне 28 °C ± 1 °C,
32 °C ± 1 °C, и 37 °C ± 1 °C, соответственно или анаэростаты, обеспечивающие пространство для
приблизительной объемной доли диоксида углерода от 9 % до 13 %.
6.4 Оборудование для подсчета колоний, см. ISO 7218.
6.5 Автоклав, обеспечивающий поддержание температуры 121 °C ± 1 °C.
6.6 Водяные бани, обеспечивающие поддержание температуры на всех уровнях от 28 °C до 55 °C и
в точке кипения.
6.7 pH метр, с температурной компенсацией, точностью до ±0,1 pH при температуре 25 °C.
6.8 Склянки или колбы, вместимостью 150 мл или 250 мл и с подходящими колпачками или
крышками (для помещения питательной среды).
6.9 Пипетки, стерильные, калиброванные для бактериологического использования,
[5]
обеспечивающие перенос 0,05 мл ± 0,002 мл, 0,1 мл ± 0,02 мл, ISO 7550 , 1,0 мл ± 0,02 мл и
[1]
10 мл ± 0,2 мл, ISO 648 класс A.
6.10 Чашки Петри, стерильные, изготовленные из прозрачного бесцветного стекла или пластика,
диаметров 90 мм, минимальной внутренней глубины 10 мм. На дне не должно быть неровностей,
которые могут помешать подсчету колоний.
6.11 Шпатель, стерильный, изготовленный из металла или стекла.
6.12 Оборудование для фильтрования, стерильное, с мембранными фильтрами из ацетата
целлюлозы с номинальным размером отверстий 0,2 мкм.
6.13 Пробирки, стерильные, вместимостью 5 мл, 20 мл или 50 мл с подходящими герметичными
пробками.
6.14 Дозатор, стерильный, стеклянный, металлический или пластиковый.
6.15 Сушильная камера, печь или инкубатор (например, шкаф с ламинарным воздушным течением),
вентилируемые (для просушивания поверхностей агаровой среды).
12 © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
6.16 Криопробирки, стерильные, вместимостью 2 мл.
6.17 Спектрофотометр, обеспечивающий измерение оптической плотности при 625 нм.
6.18 Планшеты для микро-разведений, стандартные на 96 лунок.
7 Отбор проб
В лабораторию следует отсылать представительную пробу. Необходимо следить, чтобы проба не
претерпела изменений в процессе транспортирования или хранения.
Отбор проб не входит в область применения данного метода, установленного в настоящем
[2]
международном стандарте. Рекомендованный метод отбора проб установлен в ISO 707IDF 50 .
8 Проведение испытания
8.1 Выращивание
8.1.1 Перед анализом на восприимчивость выращивают штамм на агаровой среде в
рекомендованных условиях инкубации (см. Таблицу 1). Если штамм плохо растет на рекомендованной
среде или в рекомендованных условиях, то для усиления роста можно ввести другой источник
углерода или изменить условия выращивания.
Таблица 1 — Условия выращивания
Время
Среда Температура
Виды Атмосфера инкубации
(агар) °C
ч
Bifidobacterium spp. MRS-Cys 37 Анаэробная 24 - 48
Анаэробная или
Lactobacillus brevis MRS 28 16 - 24
окружающая
Анаэробная
Lactobacillus plantarum/pentosus MRS 28 16 - 24
окружающая
Анаэробная или
Lactobacillus sakei MRS 28 16 - 24
окружающая
Lactobacillus delbrueckii group MRS 37 Анаэробная 16 - 24
Анаэробная или
Other lactobacilli MRS 37 16 - 24
окружающая
M17-лактоза или Анаэробная или
Lactococcus lactis 32 16 -24
Элликера окружающая
M17-сахароза или Анаэробная или
Streptococcus thermophilus 37 16 - 24
Элликера окружающая
8.1.2 Штамм, хранившийся в замороженном состоянии, сначала должен восстановиться в
питательной жидкой среде по Таблице 1 до готовности к росту, затем он прорастает в агаровую среду.
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 13
IDF 223:2010(R)
8.2 Штаммы для контроля качества и испытания
® TM 1)
a) Lactobacillus plantarum ATCC 14917 (при температуре 28 °C).
® TM 1)
b) Lactobacillus paracasei ATCC 334 (при температуре 37 °C).
® TM 1)
c) Lactococcus lactis ATCC 19435 (при температуре 32 °C).
1)
d) Streptococcus thermophilus LMG 18311 (при температуре 37 °C).
® TM 1)
e) Bifidobacterium longum ATCC 15707 (при температуре 37 °C).
Следующие методики контроля качества дают возможность проверки штаммов.
При испытании представляющего интерес штамма каждый раз исследуют штамм для контроля
качества, который принадлежит к тому же виду, что и анализируемый штамм:
a) для молочнокислых бактерий, которые предполагается выращивать при температуре 28 °C,
® TM 1)
используют Lactobacillus plantarum ATCC 14917 ;
b) ля молочнокислых бактерий, которые предполагается выращивать при температуре 37 °C,
® TM 1)
используют Lactobacillus paracasei ATCC 334 ;
® TM 1)
c) для Bifidobacterium spp., используют Bifidobacterium longum ATCC 15707 .
8.3 Условия выращивания бактерий для анализа на восприимчивость к антибиотикам
См. Таблицу 2.
Таблица 2 — Условия выращивания бактерий для анализа на восприимчивость к антибиотикам
Время
Температура
Организм Среда Атмосфера инкубирования
°C
ч
Bifidobacterium spp. LSM-Cys 37 Анаэробная 48
Lactobacillus brevis LSM 28 Анаэробная 48
Lactobacillus plantarum/pentosus LSM 28 Анаэробная 48
Lactobacillus sakei LSM 28 Анаэробная 48
Other lactobacilli LSM 37 Анаэробная 48
Lactococcus lactis IST 32 Анаэробная 48
Streptococcus thermophilus IST-lactose 37 Анаэробная 48
Для анализа Bifidobacterium spp., рекомендуется предварительно восстановить среду в анаэробных
условиях за день до анализа.
1) Пример подходящего продукта, имеющегося в продажу. Эта информация дается для удобства пользователей
данного международного стандарта и не указывают на предпочтение со стороны ISO или IDF в отношении данной
продукции.
14 © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
8.4 Подготовка планшета для микро-разведений
8.4.1 Диапазон концентраций антибиотиков
Диапазон концентраций антибиотиков представлен в Таблице 3.
Таблица 3 — Диапазон концентраций антибиотиков
Диапазон концентраций
Антибиотик Класс
мкг/мл
Гентамицин Аминогликозид 0,5 - 256
Канамицин Аминогликозид 2 - 1 024
Стрептомицин Аминогликозид 0,5 - 256
Неомицин Аминогликозид 0,5 - 256
Тетрациклин Тетрациклин 0,125 - 64
Эритромицин Макролид 0,016 - 8
Клиндамицин Линкозамид 0,032 - 16
Хлорамфеникол Хлорамфеникол 0,125 - 64
Ампициллин β-Лактам 0,032 - 16
Ванкомицин Гликопептид 0,25 - 128
Квинупристин в сочетании с дальфопистином Стрептограмин 0,016 - 8
Линезолид Оксазолидинон 0,032 - 16
Триметоприм Ингибитор дигидрофолат редуктазы 0,125 - 64
Ципрофлоксацин Флюорохинолог 0,25 - 128
Рифампицин Рифамицин 0,125 - 64
8.4.2 Схема планшета для микро-разведений
8.4.2.1 Общие положения
Схема планшета для микро-разведений показана в Таблице 4 и Таблице 5.
Таблица 4 — Схема планшета для микро-разведений — Панель 1
a b
Антибиотик 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Гентамицин P 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 N
Канамицин P 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 N
Стрептомицин P 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 N
Тетрациклин P 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 N
Эритромицин P 0,016 0,032 0,063 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 N
Циндамицин P 0,032 0,063 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 N
Хлорамфеникол P 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 N
Ампициллин P 0,032 0,063 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 N
a
Лунка положительного контроля (Р) без антибиотика, но содержащая анализируемый штамм и среду, содержащую
растворитель, который используется для растворения антибиотика в максимальной концентрации.
b
Лунка отрицательного контроля (N) не содержит анализируемый штамм и антибиотик, но содержит среду.
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 15
IDF 223:2010(R)
Таблица 5 — Схема планшета для микро-разведений — Панель 2
b c
Антибиотик 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Неомицин P 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 N
Ванкомицин P 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 N
Квинупристин в сочетании с
дальфопистином или P 0,016 0,032 0,064 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 N
a
виргиниамицином
Линезолид P 0,032 0,064 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 N
Триметоприм P 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 N
Ципрофлоксацин P 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 N
Рифампицин P 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 N
a
Планшет для микро0разведений с квинупристином в сочетании с дальфопистином трудно приготовить. Вместо этого
можно использовать заранее приготовленные планшеты с виргиниамицином, в которых используется антибиотик,
аналогичный, например, используемым в ветеринарной практике. Виргиниамицин также был использован в межлабораторном
исследовании (Приложение A).
b
Лунка положительного контроля без антибиотика, но содержащая анализируемый штамм и среду, содержащую
растворитель, который используется для растворения антибиотика в максимальной концентрации.
c
Лунка отрицательного контроля не содержит анализируемый штамм и антибиотик, но содержит среду.
8.4.2.2 Разведение антибиотика
Для анализа с использованием планшета для микро-разведений сначала готовят исходный раствор
антибиотика в рекомендуемой концентрации. При приготовлении исходного раствора регулируют
массу антибиотика, при которой антибиотик будет действенным.
Рассчитывают действенность (эффективность), w , используя формулу:
p
w =w w 1−w
( )
p as ac H O
где
w чистота анализа;
as
w активная фракция, не содержащая кислоты или основания или соли — используют
ac
минимальное количество растворителя для солюбилизации порошка антибиотика;
w содержание воды за счет присутствия гидрата.
H O
Используют одну из следующих формул для расчета количества порошка или разбавителя, как массы,
m, или как объема, V, , требующихся для исходного раствора:
Vρ
m=
w
p
mw
p
V=
ρ
16 © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются
IDF 223:2010(R)
Пример с использованием гентамицина показан в Таблице 6.
Таблица 6 — Поэтапное приготовление рабочего раствора антибиотика
Объем Раствор
Раствор-
Этап Концентрация раствора- Вода (5.1) двойной
источник
источника концентрации
мкг/мл мл мл мкг/мл
Исходный
1 5 120 1 9 512
раствор
2 Этап 1 512 1 1 256
3 Этап 1 512 1 3 128
4 Этап 1 512 1 7 64
5 Этап 4 64 1 1 32
6 Этап 4 64 1 3 16
7 Этап 4 64 1 7 8
8 Этап 7 8 1 1 4
9 Этап 7 8 1 3 2
10 Этап 7 8 1 7 1
8.4.2.3 Приготовление конечного раствора
Разбавляют 1 мл каждого раствора-источника, указанного в Таблице 6, этапы 1 - 10 водой (5.1).
8.4.2.4 Распределение конечного раствора
Дозируют, для этапа 1 до этапа 10 (8.4.2.3), 50 мкл полученного раствора двойной концентрации, в
лунку планшетов для микро-разведений (6.18) в соответствии с Таблицей 4 или Таблицей 5.
8.4.2.5 Хранение планшетов для микро-разведений
Если планшеты для микро-разведений не предполагается использовать немедленно, их можно
запечатать и хранить при температуре ниже −20 °C до того момента, когда они потребуются.
Антибиотик в замороженных планшетах обычно остается стабильным в течение нескольких месяцев.
Проверяют эффективность планшетов для микро-разведений на контрольном штамме.
8.4.3 Подготовка планшетов для микро-разведений
TM 2)
Можно использовать планшеты для микро-разведений VetMIC , предварительно покрытые
антибиотиком. Применение раствора 100 мкл (8.4.5.2) дает определенную концентрацию антибиотика,
указанную в инструкции.
Эти планшеты можно хранить до двух лет при комнатной температуре.
TM
2) VetMIC это торговое наименование продукции, поставляемой Национальным институтом ветеринарии
(National Veterinary Institute, Uppsala, Sweden), Швеция. Эта информация дается для удобства пользователей
данного международного стандарта и не указывают на предпочтение со
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
Loading comments...