ISO 13366-3:1997
(Main)Milk — Enumeration of somatic cells — Part 3: Fluoro-opto-electronic method
Milk — Enumeration of somatic cells — Part 3: Fluoro-opto-electronic method
Lait — Dénombrement des cellules somatiques — Partie 3: Méthode fluoro-opto-électronique
La présente partie de l'ISO 13366 prescrit une méthode pour le dénombrement des cellules somatiques à la fois dans le lait cru et dans le lait contenant des conservateurs chimiques, en utilisant des instruments de comptage fluoro-opto-électronique1). NOTE -- Le dénombrement des cellules dans des échantillons sans conservateurs dans les premières 24 h suivant la traite pourrait donner des résultats peu fiables avec des instruments plus anciens (par exemple Fossomatic 90 et 215).
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL
IS0
STANDARD
13366-3
First edition
1997-06-I 5
Milk - Enumeration of somatic cells -
Part 3:
Fluoro-opto-electronic method
Lait - Dknombrement des cellules somatiques -
Partie 3: Mkthode fluoro-opto-klectronique
Reference number
IS0 13366-3: 1997(E)
---------------------- Page: 1 ----------------------
IS0 13366-3: 1997(E)
Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (IS0 member bodies). The work of
preparing International Standards is normally carried out through IS0
technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented
on that committee. International organizations, governmental and non-
governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. IS0
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard IS0 13366 was prepared by Technical Committee
ISOmC 34, Agricultural food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk
products, in collaboration with the International Dairy Federation (IDF) and
AOAC INTERNATIONAL, and will also be published by these organiz-
ations.
IS0 13366 consists of the following parts, under the general title Milk -
Enumeration of soma tic cells:
- Part I: Microscopic method
- Par? 2: Electronic particle counter method
- Part 3: Fluoro-opto-electronic method
Annexes A to D of this part of IS0 13366 are for information only.
0 IS0 1997
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case postale 56 l CH-1211 Geneve 20 l Switzerland
Internet central @I isocs.iso.ch
x.400
c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Printed in Switzerland
ii
---------------------- Page: 2 ----------------------
~~
INTERNATIONAL STANDARD @ IS0 IS0 13366-3: 1997(E)
Milk - Enumeration of somatic cells -
Part 3:
Fluoro-opto-electronic method
- The use of this standard may involve hazardous materials, operations and equipment. This
WARNING
standard does not purport to address all of the safety problems associated with its use. It is the
responsibility of the user of this standard to establish appropriate safety and health practices and to
determine the applicability of regulatory limitations prior to use.
1 Scope
This part of IS0 13366 specifies a method for counting somatic cells in both raw and chemically preserved milk,
using a fluoro-opto-electronic counting instrumentI).
NOTE - Counting of cells in unpreserved samples within the first 24 h after milking could give unreliable results with older
instruments (e.g. Fossomatic 90 and 215).
2 Definition
For the purposes of this part of IS0 13366, the following definition applies.
2.1 somatic cells: Those cells that have a minimum intensity of fluorescence due to the staining of DNA in their
nuclei.
3 Principle
Mixing of the milk to be examined with a buffer and stain solution. Transference of the mixture in the form of a thin
film to a rotating disc, serving as an object plane for a microscope. Each stained cell observed by the microscope
produces an electrical pulse that is amplified and recorded. Direct reading of the number of somatic cells in
thousands per millilitre.
4 Reagents
Ethidium bromide is toxic. The preparation and application of the basic and working solutions
WARNING -
shall be carried out in a fume cupboard. Use gloves for protection.
1) The Fossomatic counting instrument (250, 300 or 360) supplied by Foss Electric, Hillerod, Denmark is an example of
suitable equipment available commercially. This information is given for the convenience of users of this part of IS0 13366 and
does not constitute an endorsement by IS0 of the equipment named.
---------------------- Page: 3 ----------------------
@ IS0
IS0 13366-3: 1997(E)
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled or deionized water or
water of equivalent purity.
4.1 Basic solutions
4.1 .l Dye-buffer solution
4.1 .I .l Composition
Ethidium bromide
2s g
Tripotassium citrate 400 g
Citric acid
1495 g
Deionized water 5 litres
Poly(ethylene glycol) mono-p( 1,1,3,3-tetramethylbutyl) 50 ml
phenyl ether ’)
1) For example, Triton X-100 concentrate.
4.1 .1.2 Preparation
Dissolve the ethidium bromide in 1 litre of water in a 5 litre container. Stir gently until the ethidium bromide is
completely dissolved. The process can be speeded up by heating to between 40 “C and 60 “C. Add the
tripotassium citrate and citric acid to the ethidium bromide solution. Add 4 litres of water. Stir gently until the solids
are completely dissolved. Add the poly(ethylene glycol) ether concentrate while stirring. Even when stored under
light-proof, airtight and cool conditions, the solution shall be kept for no longer than 90 days.
4.1.2 Poly(ethylene glycol) mono-p-(1 ,1,3,3=tetramethylbutyI) phe lyl ether solution
4.1.2.1 Composition
Poly(ethylene glycol) mono-p( 1,1,3,3-tetramethylbutyl) 10 ml
phenyl ether ’)
1 litre
Water
1) For example, Triton X-l 00 concentrate.
4.1.2.2 Preparation
Dissolve the poly(ethylene glycol) ether in 1 litre of pre-heated water at approx. 60 “C. Even when stored under
airtight and cool conditions, this solution shall be kept for no longer than 25 days.
4.2 Working solution
4.2.1 Dye-buffer working solution
Mix 1 part of the dye-buffer basic solution (4.1 .l) with 9 parts of water. (This should be enough for approx. 2 700
samples.) Do not use working solutions older than 7 days
---------------------- Page: 4 ----------------------
@ IS0
IS0 13366=3:1997(E)
4.2.2 Rinsing liquid
4.2.2.1 Composition
IOml
Poly(ethylene glycol) mono-p( 1,1,3,3-tetramethylbutyl)
phenyl ether ’)
Ammonia solution, 25 % (V/V) 25 ml
10 litres
Water
1) For example, Triton X-100 concentrate.
4.2.2.2 Preparation
Add the poly(ethylene glycol) ether and the ammonia solution to the water.
The composition of the reagents might vary depending on the counting system used. Therefore follow the
manufacturer ’s instructions exactly.
4.3 Preservatives
Boric acid, potassium dichromate, sodium azide or bronopol may be used.
5 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
5.1 Counting instrument, operating according to the fluorescence optical principle (e.g. Fossomatic). Calibrate in
accordance with the manufacturer ’s instructions. For calibration it is necessary to use milk samples whose cell
count has been made by the microscopic method (details are given in IS0 13366-1).
NOTE - Cell count standards are available from the manufacturer.
5.2 Water bath, with circulation, capable of being maintained at a temperature of 40 OC + 1 OC.
5.3 Sample tubes, with leak-proof seal.
6 Sampling
6.1 It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method is
given in IS0 707 [Il.
6.2 If automatic samplers are used, they shall be tested properly.
6.3 Prior to testing or preservation, samples should be stored at a temperature of between 2 “C and 6 “C.
6.4 Preservation, if necessary, shall be carried out as soon as possible after sampling, but in any case within 24 h,
by addition of one of the following preservatives.
3
---------------------- Page: 5 ----------------------
@ IS0
IS0 13366-3: 1997(E)
a) Boric acid (HsB03): Add the boric acid to the test sample. The final concentration of this preservative in the
sample shall not exceed 0,6 g per 100 ml. Such a preserved test sample may be stored at a temperature of
between 6 “C and 12 “C for up to a further 24 h.
b) Potassium dichromate (K2Cr207): Add the potassium dichromate to the test sample. The final concentration of
this preservative in the test sample shall not exceed 0,2 g per 100 ml. Such a preserved test sample may be stored
at a temperature of between 6 “C and 12 “C for up to further 72 h. Local conditions regarding the discharge of
effluents shall be observed for samples preserved with potassium dichromate.
c) Sodium azide: Immediately after sampling, add the sodium azide to the test sample. The final concentration of
this preservative in the sample shall not exceed 0,024 g per 100 ml. Such a preserved test sample may be stored at
temperature of between 2 “C and 6 “C. Examination should be carried out within 48 h of sampling.
d) Bronopol (2-bromo-2-nitropropan-1,3-diol): Immediately after sampling, add the bronopol to the test sample.
The final concentration of this preservative in the sample shall not exceed 0,05 g per 100 ml (preferably 0,02 g per
100 ml). Such a preserved test sample may be stored at a temperature of between 2 “C and 6 “C. Examination
should be carried out within 72 h of sampling.
NOTES
1 A test sample already preserved with boric acid may be further preserved for up to 48 h using potassium dichromate.
2 The time of storage of test samples with added bronopol can increase up to 5 days under good conditions and with
verification of the quality of the cells using a modern metering device. However this involves the immediate addition of the
preservative and keeping the sample in a cold place until testing.
7 Preparation of test sample
7.1 Store the unpreserved test sample for at least 24 h after milking, at a temperature of between 2 “C and 6 “C. If
examination of the unpreserved sample has nonetheless to be performed within 24 h after milking, the test sample
shall be pretreated by the addition of potassium dichromate (6.4) and left to stand for at least 3 h.
7.2 Heat both the unpreserved and the preserved samples in the water bath (5.2) set at 40 “C and keep them at
room temperature for no longer than 30 min.
8 Procedure
8.1 Test portion
Further dilution of the test sample and preparation of the test portion take place automatically in the instrument
. .
(5 1)
8.2 Determination
Ensure that cell counting is carried out within 30 min of the end of heating (7.2) and before the temperature is below
30 “C. Ensure that the instrument stirrer is operating correctly so as to obtain as homogeneous a distribution of the
cells as possible. If no instrument stirrer is available, thoroughly mix the test portion immediately before counting.
9 Expression of results
Express the number of somatic cells in thousands per millilitre of milk.
NOTE - For a discussion of the use of cell-count standard samples, see annex C.
4
---------------------- Page: 6 ----------------------
@ IS0
IS0 13366-3: 1997(E)
10 Precision
Details of an interlaboratory test on the precision of the method are summarized in annex A. The values derived
from this interlaboratory test may not be applicable to concentration ranges and matrices other than those given.
11 Test report
The test report shall specify:
- the method in accordance with which sampling was carried out, if known;
- the method used;
- the test result(s) obtained; and
- if the repeatability has been checked, the final quoted result obtained.
It shall also mention all operating details not specified in this part of IS0 13366, or regarded as optional, together
with details of any incidents which may have influenced the test result(s).
The test report shall include all information necessary for the complete identification of the sample.
---------------------- Page: 7 ----------------------
IS0 13366-3: 1997(E)
Annex A
(informative)
Results of interlaboratory test
An interlaboratory test (37 participating laboratories) gave the results shown in table A.1 for I- (repeatability limit) and
R (reproducibility limit) in thousands of cells per millilitre.
Table A.1
Mean number
Milk sample of cells per r R
+ SR
millilitre
2 210 13,7 38,9 36,7 103,7
21,2 59,9 51,3 145,0
4 438
92,3 89,4 253,0
6 609 32,6
It should be noted that under practical conditions the geometric mean of several (e.g. three) determinations is used.
NOTE - For the targets of precision, see annex B.
6
---------------------- Page: 8 ----------------------
@ IS0
IS0 13366-3: 1997(E)
Annex B
(informative)
Quality control in the laboratory
B.1 Purpose
The purpose of quality control procedures is to ensure close agreement between cell counts determined in the
routine way and the “true” cell count of the samples. Poor agreement may be due to random errors in individual
determinations (such as may arise from inadequate mixing or inaccurate pipetting) or it may be due to systematic
errors or bias (such as that introduced by incorrect calibration of instruments). The magnitude of both kinds of error
may vary with the true cell count of the sample. Figure B.l illustrates the effect of both random and systematic
errors on the relationship between true and observed cell counts.
Repeatability is a measure of the variation between replicate determinations in one laboratory using the same
sample. Reproducibility is a measure of the variation between determinations carried out in different laboratories
using the same sample. Neither repeatability nor reproducibility, as defined by IS0 5725-lf21, attempts to measure
the bias in measurements relative to “true” values. The procedures recommended in this annex aim to do both, with
a combination of routine checks within laboratories and periodic collaborative trials to assess the relative
performance of different laboratories.
B.2 Routine monitoring within laboratories
B.2.1 Repeatability
For routine monitoring of the repeatability of counts, any sample with about 500 000 cells per millilitre should be
counted at regular intervals (e.g. after e
...
Iso
NORME
13366-3
INTERNATIONAlmE
Première édition
1997-06- 15
Lait - Dénombrement des cellules
somatiques -
Partie 3:
Méthode fluoro-opto-électronique
Milk - Enumeration of somatic cells -
Part 3: Fluoro-opto-electronic method
Numéro de référence
ISO 13366-3: 1997(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 13366-3: 1997(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en
ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 13366-3 a été élaborée par le comité
technique ISOTTC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 5,
Lait et produits laitiers en collaboration avec la Fédération internationale de
laiterie (FIL) et I’AOAC INTERNATIONAL, et sera également publiée par
ces organisations.
L’ISO 13366 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre
général Lait - Dénombrement des cellules somatiques:
- Partie 7: Méthode au microscope
- Partie 2: Méthode au compteur électronique de paflicules
- Partie 3: Méthode fluoro-opto-électronique
Les annexes A à D de la présente partie de I’ISO 13366 sont données
uniquement à titre d’information.
0 ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 l CH-l 211 Genève 20 l Suisse
central @ isocs.iso.ch
Internet
x.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Imprimé en Suisse
ii
---------------------- Page: 2 ----------------------
NORME INTERNATIONALE @ ISO ISO 13366-3: 1997(F)
Lait - Dénombrement des cellules somatiques -
Partie 3:
Méthode fluoro-opto-électronique
AVERTISSEMENT - L’utilisation de la présente Norme internationale implique l’intervention de produits,
d’opérations et d’équipements à caractère dangereux. La présente Norme internationale n’a pas la
prétention d’aborder tous les problèmes de sécurité concernés par son usage. II est de la responsabilité de
l’utilisateur de la présente Norme internationale de consulter et d’établir des règles de sécurité et d’hygiène
appropriées et de déterminer I’applicabilité des restrictions réglementaires avant utilisation.
1 Domaine d’application
La présente partie de I’ISO 13366 prescrit une méthode pour le dénombrement des cellules somatiques à la fois
dans le lait cru et dans le lait contenant des conservateurs chimiques, en utilisant des instruments de comptage
fluoro-opto-électroniquel).
NOTE - Le dénombrement des cellules dans des échantillons sans conservateurs dans les premières 24 h suivant la traite
pourrait donner des résultats peu fiables avec des instruments plus anciens (par exemple Fossomatic 90 et 215).
2 Définition
Pour les besoins de la présente partie de I’ISO 13366, la définition suivante s’applique.
2.1 cellules somatiques: Cellules ayant une intensité de fluorescence moindre due à la coloration de I’ADN dans
leur noyau.
3 Principe
Mélange du lait à examiner avec une solution tampon et une solution colorante. Transfert du mélange sous forme
de film mince sur un disque rotatif servant de support pour microscope. Chaque cellule colorée observée au
microscope produit une impulsion électrique qui est amplifiée et enregistrée
Lecture directe du nombre de cellules somatiques en milliers par millilitre.
1) L’instrument de comptage Fossomatic (250, 300 ou 360), distribué par Foss Electric, Hillerod, Danemark est un exemple
d’instrument approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des
utilisateurs de la présente partie de I’ISO 13366 et n’implique pas l’approbation de l’instrument désigné par I’ISO.
1
---------------------- Page: 3 ----------------------
0 ISO
ISO 13366-3: 1997(F)
4 Réactifs
AVERTISSEMENT - Le brome d’éthidium est toxique. La préparation et l’application des solutions de base
et de travail doivent être effectuées sous hotte fermée. Utiliser des gants de protection.
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau distillée ou
déionisée ou de pureté équivalente.
4.1 Solutions de base
4.1 .l Solution tampon colorante
4.1 .l .l Composition
Bromure d’éthidium
23 g
Citrate tripotassique 400 g
Acide citrique
l4,5 g
Eau déionisée 5 litres
Polyéthylèneglycol mono-p(tétraméthyl-1 ,1,3,3 butyle) 50 ml
phénylétherl)
1) Par exemple Triton X-l 00 concentré.
4.1 .1.2 Préparation
Dissoudre le bromure d’éthidium dans 1 litre d’eau dans un récipient de 5 litres. Remuer doucement jusqu’à
complète dissolution du bromure d’éthidium. Le processus peut être accéléré en chauffant à une température
comprise entre 40 “C et 60 “C. Ajouter le citrate tripotassique et l’acide citrique à la solution de bromure d’éthidium.
Ajouter 4 litres d’eau. Remuer doucement jusqu’à complète dissolution des matières solides. Ajouter le polyéthylène
éther concentré tout en continuant à remuer. Même si la solution est conservée à l’abri de la lumière, dans un
récipient hermétiquement clos et dans un endroit frais, elle ne doit pas être conservée plus de 90 jours.
4.1.2 Solution de polyéthylèneglycol mono-p(tétraméthyl-1 ,I ,3,3 butyle) phényléther
4.1.2.1 Composition
Polyéthylèneglycol mono-p(tétraméthyl-1 ,1,3,3 butyle) 10 ml
phénylétherl)
1 litre
Eau
1) Par exemple Triton X-100, concentré.
4.1.2.2 Préparation
Dissoudre le polyéthylèneglycol éther dans 1 litre d’eau préalablement portée à 60 “C environ. Même si la solution
est conservée à l’abri de la lumière, dans un récipient hermétiquement clos et dans un endroit frais, elle ne doit pas
être conservée plus de 25 jours.
4.2 Solution de travail
4.2.1 Solution tampon colorante de travail
Mélanger 1 partie de la solution tampon colorante de base (4.1.1) à 9 parties d’eau. (Cela devrait suffire pour
environ 2 700 échantillons.) Ne pas utiliser de solutions de travail ayant plus de 7 jours.
2
---------------------- Page: 4 ----------------------
@ ISO
ISO 13366-3: 1997(F)
4.2.2 Liquide de rinçage
4.2.2.1 Composition
Polyéthylèneglycol mono-p-(tétraméthyl-1 ,1,3,3 butyle) 10 ml
phénylétherl)
Ammoniaque, solution à 25 % (WV) 25 ml
Eau
10 litres
1) Par exemple, Triton X-l 00 concentré.
4.2.2.2 Préparation
Ajouter le polyéthylèneglycol éther et l’ammoniaque à l’eau.
La composition des réactifs peut varier en fonction du système de dénombrement utilisé. Suivre strictement les
instructions du fabricant.
4.3 Conservateurs
L’acide borique, le dichromate de potassium, I’azide de sodium ou le bronopol peuvent être utilisés.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
5.1 Instrument de comptage, fonctionnant selon le principe optique de fluorescence (par exemple Fossomatic).
L’étalonner conformément aux instructions du fabricant. Pour l’étalonnage,
il est nécessaire d’utiliser des
échantillons de lait dont les cellules ont été dénombrées selon la méthode au microscope (détails donnés dans
I’ISO 13366-l).
NOTE - Des étalons de comptage de cellules sont disponibles auprès du fabricant.
5.2 Bain d’eau, à circulation, réglable entre 40 “C + 1 OC.
5.3 Tubes pour échantillons, à joint étanche.
6 Échantillonnage
6.1 II est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié
lors du transport et de l’entreposage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode prescrite dans la présente partie de I’ISO 13366. Une méthode
d’échantillonnage recommandée est donnée dans I’ISO 707 [ll.
6.2 Si des échantillonneurs automatiques sont utilisés, ils doivent avoir fait l’objet de contrôles appropriés.
6.3 Avant l’essai ou la conservation, il convient que les échantillons soient entreposés à une température
comprise entre 2 “C et 6 “C.
---------------------- Page: 5 ----------------------
0 ISO
ISO 13366-3: 1997(F)
6.4 Si elle est nécessaire, la conservation doit être effectuée dès que possible après l’échantillonnage, mais dans
tous les cas dans les 24 h, en ajoutant l’un des conservateurs suivants.
a) Acide borique (HsBO,): Ajouter l’acide borique à l’échantillon pour essai. La concentration finale de
l’échantillon en acide borique ne doit pas dépasser 0’6 g pour 100 ml. Ces échantillons peuvent être conservés
pendant une durée supplémentaire pouvant aller jusqu’à 24 h à une température comprise entre 6 “C et 12 OC.
b) Dichromate de potassium (K&r207): Ajouter le dichromate de potassium à l’échantillon pour essai. La
concentration finale de l’échantillon en dichromate de potassium ne doit pas dépasser 0’2 g pour 100 mi, Ces
échantillons peuvent être conservés pendant une durée supplémentaire pouvant aller jusqu’à 72 h à une
température comprise entre 6 “C et 12 “C. II faut tenir compte des conditions locales en matière de déversement
des effluents dans le cas d’échantillons contenant du dichromate de potassium comme conservateur.
c) Azide de sodium: Immédiatement après l’échantillonnage, ajouter I’azide de sodium à l’échantillon pour essai.
La concentration finale de l’échantillon en azide de sodium ne doit pas dépasser 0,024 g pour 100 ml. Ces
échantillons peuvent être conservés à une température comprise entre 2 “C et 6 “C. II convient d’effectuer le
dénombrement dans les 48 h après l’échantillonnage.
d) Bronopol (bromo-2 nitro-2 propane diol-1,3). Immédiatement après l’échantillonnage, ajouter le bronopol à
l’échantillon pour essai. La concentration finale de l’échantillon en bronopol ne doit pas dépasser 0’05 g pour 100 ml
(de préférence 0’02 g pour 100 ml). II convient d’effectuer le dénombrement dans les 72 h après l’échantillonnage.
Ces échantillons peuvent être conservés à un température comprise entre 2 “C et 6 “C.
NOTES
1 Un échantillon contenant déjà de l’acide borique peut être conservé jusqu’à 48 h de plus en utilisant du dichromate de
potassium.
2 La durée de conservation des échantillons pour essai contenant du bronopol ajouté peut augmenter jusqu’à 5 jours sous de
bonnes conditions et avec vérification de la qualité des cellules à l’aide d’un dispositif moderne. Toutefois, cela implique
l’addition immédiate du conservateur et la conservation de l’échantillon dans un endroit froid avant l’essai.
7 Préparation de l’échantillon pour essai
7.1 Entreposer l’échantillon sans conservateur pendant au moins 24 h après la traite, à une température comprise
entre 2 “C et 6 OC. Si l’examen de l’échantillon sans consewateur doit toutefois être effectué dans les 24 h suivant
la traite, l’échantillon pour essai doit être prétraité en ajoutant du dichromate de potassium (6.4) et laisser reposer
pendant au moins 3 h.
dans un bain d’eau (5.2)
72 Chauffer l’échantillon contenant des conservateurs et I’écha ntillon sans conservateur
réglé à 40 “C et les laisser à température ambiante pendan t 30 m in au plus.
8 Mode opératoire
8.1 Prise d’essai
Une nouvelle dilution de l’échantillon pour essai et la préparation de la prise d’essai sont réalisées automatiquement
dans l’instrument de comptage (5.1)
8.2 Détermination
S’assurer que le dénombrement des cellules est effectué dans les 30 min qui suivent la fin du chauffage (7.2) et
avant que la température tombe au-dessous de 30 “C. S’assurer que l’agitateur de l’instrument fonctionne
correctement de manière à obtenir une répartition des cellules aussi homogène que possible. Si l’on ne dispose pas
d’un agitateur, mélanger soigneusement les prises d’essai avant le dénombrement.
4
---------------------- Page: 6 ----------------------
@ ISO
ISO 13366-3: 1997(F)
9 Expression des résultats
Exprimer le nombre de cellules somatiques en milliers par millilitre de lait.
Voir en annexe C une étude concernant l’utilisation d’échantillons étalons de dénombrement des cellules.
NOTE -
10 Fidélité
Les détails de l’essai interlaboratoire relatif à la fidélité de la méthode sont résumés dans l’annexe A. Les valeurs
provenant de l’essai interlaboratoire ne peuvent être appliquées aux plages de concentrations et aux matrices
autres que celles données.
11 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit indiquer:
la méthode selon laquelle l’échantillonnage a été effectué, si elle est connue;
-
- la méthode utilisée;
- le(s) résultat(s) d’essai obtenu(s), et
- si la répétabilité a été vérifiée, le résultat final cité qui a été obtenu.
II doit en outre mentionner tous les détails opératoires non prévus dans la présente partie de I’ISO 13366, ou
facultatifs, ainsi que les incidents éventuels susceptibles d’avoir agi sur le(s) résultat(s).
Le rapport d’essai doit donner tous les renseignements nécessaires à l’identification complète de l’échantillon.
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 13366-3: 1997(F)
Annexe A
(informative)
Résultats de l’essai interlaboratoire
Un essai interlaboratoire auquel ont participé 37 laboratoires a donné les résultats donnés au tableau A.1 pour
r (limite de répétabilité) et R (limite de reproductibilité) (en milliers de cellules par millilitre).
Tableau A.1
Nombre moyen
Échantillon
de cellules Y R
SI- SR
de lait
par millilitre
r
36,7 103,7
2 210 13,7 38'9
4 438 21,2 59,9 51,3 145,0
92,3 89,4 253,0
6 609 32,6
Il convient de noter que, dans la pratique, on utilise la moyenne géométrique de plusieurs déterminations (par
exemple trois).
NOTE - Pour les objectifs de fidélité, voir l’annexe B.
6
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 13366-3: 1997(F)
Annexe B
(informative)
Contrôle de la qualité au laboratoire
B.1 Objectif
Les procédures de contrôle de la qualité ont pour but de s’assurer de la concordance des dénombrements de
cellules déterminés lors des opérations de routine et du wrai >> dénombrement des cellules des échantillons. Une
faible concordance peut être due à des erreurs aléatoires des déterminations individuelles (telles que celles
provoquées par un mélange insuffisant ou un prélèvement à la pipette manquant de précision) ou elle peut
également être due à des erreurs systématiques ou à des biais (comme ceux introduits par un étalonnage incorrect
des instruments). L’importance de ces deux types d’erreurs peut varier en fonction du dénombrement vrai des
cellules de l’échantillon. La figure B.1 illustre les effets des erreurs aléatoires et des erreurs systématiques sur la
relation entre les dénombrements vrais et ceux observés.
La répétabilité est une mesure de la variation entre plusieurs déterminations répétées réalisées au sein d’un seul
laboratoire sur le même échantillon. La reproductibilité est une mesure de la variation entre des déterminations
effectuées dans des laboratoires différents sur le même échantillon. Ni la répétabilité ni la reproductibilité, définies
dans I’ISO 5725If*] ne vise à mesurer les biais lors des mesurages concernant les valeurs <>. Les
procédures recommandées dans la présente annexe ont pour but de faire les deux, en combinant les contrôles de
routine dans les laboratoires et les essais interlaboratoires périodiques destinés à évaluer les performances
relatives des différents laboratoires.
B.2 Surveillance de routine dans les laboratoires
B.2.1 Répétabilité
Pour la surveillance de routine de la répétabilité des dénombrements, il convient de compter tout échantillon
comportant environ 500 000 cellules par millilitre, à intervalles réguliers (par exemple tous les 20e ou
50e échantillon) tout au long de la journée de travail. À la fin de la journée, il convient de calculer le coefficient de
variation des dénombrements. S’il est supérieur à 5 %, il convient de vérifier la méthodologie utilisée par le
laboratoire et de vérifier en particulier si l’on prend suffisamment de précautions lorsqu’on réalise le mélange et le
...
Iso
NORME
13366-3
INTERNATIONAlmE
Première édition
1997-06- 15
Lait - Dénombrement des cellules
somatiques -
Partie 3:
Méthode fluoro-opto-électronique
Milk - Enumeration of somatic cells -
Part 3: Fluoro-opto-electronic method
Numéro de référence
ISO 13366-3: 1997(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 13366-3: 1997(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en
ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 13366-3 a été élaborée par le comité
technique ISOTTC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 5,
Lait et produits laitiers en collaboration avec la Fédération internationale de
laiterie (FIL) et I’AOAC INTERNATIONAL, et sera également publiée par
ces organisations.
L’ISO 13366 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre
général Lait - Dénombrement des cellules somatiques:
- Partie 7: Méthode au microscope
- Partie 2: Méthode au compteur électronique de paflicules
- Partie 3: Méthode fluoro-opto-électronique
Les annexes A à D de la présente partie de I’ISO 13366 sont données
uniquement à titre d’information.
0 ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 l CH-l 211 Genève 20 l Suisse
central @ isocs.iso.ch
Internet
x.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Imprimé en Suisse
ii
---------------------- Page: 2 ----------------------
NORME INTERNATIONALE @ ISO ISO 13366-3: 1997(F)
Lait - Dénombrement des cellules somatiques -
Partie 3:
Méthode fluoro-opto-électronique
AVERTISSEMENT - L’utilisation de la présente Norme internationale implique l’intervention de produits,
d’opérations et d’équipements à caractère dangereux. La présente Norme internationale n’a pas la
prétention d’aborder tous les problèmes de sécurité concernés par son usage. II est de la responsabilité de
l’utilisateur de la présente Norme internationale de consulter et d’établir des règles de sécurité et d’hygiène
appropriées et de déterminer I’applicabilité des restrictions réglementaires avant utilisation.
1 Domaine d’application
La présente partie de I’ISO 13366 prescrit une méthode pour le dénombrement des cellules somatiques à la fois
dans le lait cru et dans le lait contenant des conservateurs chimiques, en utilisant des instruments de comptage
fluoro-opto-électroniquel).
NOTE - Le dénombrement des cellules dans des échantillons sans conservateurs dans les premières 24 h suivant la traite
pourrait donner des résultats peu fiables avec des instruments plus anciens (par exemple Fossomatic 90 et 215).
2 Définition
Pour les besoins de la présente partie de I’ISO 13366, la définition suivante s’applique.
2.1 cellules somatiques: Cellules ayant une intensité de fluorescence moindre due à la coloration de I’ADN dans
leur noyau.
3 Principe
Mélange du lait à examiner avec une solution tampon et une solution colorante. Transfert du mélange sous forme
de film mince sur un disque rotatif servant de support pour microscope. Chaque cellule colorée observée au
microscope produit une impulsion électrique qui est amplifiée et enregistrée
Lecture directe du nombre de cellules somatiques en milliers par millilitre.
1) L’instrument de comptage Fossomatic (250, 300 ou 360), distribué par Foss Electric, Hillerod, Danemark est un exemple
d’instrument approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des
utilisateurs de la présente partie de I’ISO 13366 et n’implique pas l’approbation de l’instrument désigné par I’ISO.
1
---------------------- Page: 3 ----------------------
0 ISO
ISO 13366-3: 1997(F)
4 Réactifs
AVERTISSEMENT - Le brome d’éthidium est toxique. La préparation et l’application des solutions de base
et de travail doivent être effectuées sous hotte fermée. Utiliser des gants de protection.
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau distillée ou
déionisée ou de pureté équivalente.
4.1 Solutions de base
4.1 .l Solution tampon colorante
4.1 .l .l Composition
Bromure d’éthidium
23 g
Citrate tripotassique 400 g
Acide citrique
l4,5 g
Eau déionisée 5 litres
Polyéthylèneglycol mono-p(tétraméthyl-1 ,1,3,3 butyle) 50 ml
phénylétherl)
1) Par exemple Triton X-l 00 concentré.
4.1 .1.2 Préparation
Dissoudre le bromure d’éthidium dans 1 litre d’eau dans un récipient de 5 litres. Remuer doucement jusqu’à
complète dissolution du bromure d’éthidium. Le processus peut être accéléré en chauffant à une température
comprise entre 40 “C et 60 “C. Ajouter le citrate tripotassique et l’acide citrique à la solution de bromure d’éthidium.
Ajouter 4 litres d’eau. Remuer doucement jusqu’à complète dissolution des matières solides. Ajouter le polyéthylène
éther concentré tout en continuant à remuer. Même si la solution est conservée à l’abri de la lumière, dans un
récipient hermétiquement clos et dans un endroit frais, elle ne doit pas être conservée plus de 90 jours.
4.1.2 Solution de polyéthylèneglycol mono-p(tétraméthyl-1 ,I ,3,3 butyle) phényléther
4.1.2.1 Composition
Polyéthylèneglycol mono-p(tétraméthyl-1 ,1,3,3 butyle) 10 ml
phénylétherl)
1 litre
Eau
1) Par exemple Triton X-100, concentré.
4.1.2.2 Préparation
Dissoudre le polyéthylèneglycol éther dans 1 litre d’eau préalablement portée à 60 “C environ. Même si la solution
est conservée à l’abri de la lumière, dans un récipient hermétiquement clos et dans un endroit frais, elle ne doit pas
être conservée plus de 25 jours.
4.2 Solution de travail
4.2.1 Solution tampon colorante de travail
Mélanger 1 partie de la solution tampon colorante de base (4.1.1) à 9 parties d’eau. (Cela devrait suffire pour
environ 2 700 échantillons.) Ne pas utiliser de solutions de travail ayant plus de 7 jours.
2
---------------------- Page: 4 ----------------------
@ ISO
ISO 13366-3: 1997(F)
4.2.2 Liquide de rinçage
4.2.2.1 Composition
Polyéthylèneglycol mono-p-(tétraméthyl-1 ,1,3,3 butyle) 10 ml
phénylétherl)
Ammoniaque, solution à 25 % (WV) 25 ml
Eau
10 litres
1) Par exemple, Triton X-l 00 concentré.
4.2.2.2 Préparation
Ajouter le polyéthylèneglycol éther et l’ammoniaque à l’eau.
La composition des réactifs peut varier en fonction du système de dénombrement utilisé. Suivre strictement les
instructions du fabricant.
4.3 Conservateurs
L’acide borique, le dichromate de potassium, I’azide de sodium ou le bronopol peuvent être utilisés.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
5.1 Instrument de comptage, fonctionnant selon le principe optique de fluorescence (par exemple Fossomatic).
L’étalonner conformément aux instructions du fabricant. Pour l’étalonnage,
il est nécessaire d’utiliser des
échantillons de lait dont les cellules ont été dénombrées selon la méthode au microscope (détails donnés dans
I’ISO 13366-l).
NOTE - Des étalons de comptage de cellules sont disponibles auprès du fabricant.
5.2 Bain d’eau, à circulation, réglable entre 40 “C + 1 OC.
5.3 Tubes pour échantillons, à joint étanche.
6 Échantillonnage
6.1 II est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié
lors du transport et de l’entreposage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode prescrite dans la présente partie de I’ISO 13366. Une méthode
d’échantillonnage recommandée est donnée dans I’ISO 707 [ll.
6.2 Si des échantillonneurs automatiques sont utilisés, ils doivent avoir fait l’objet de contrôles appropriés.
6.3 Avant l’essai ou la conservation, il convient que les échantillons soient entreposés à une température
comprise entre 2 “C et 6 “C.
---------------------- Page: 5 ----------------------
0 ISO
ISO 13366-3: 1997(F)
6.4 Si elle est nécessaire, la conservation doit être effectuée dès que possible après l’échantillonnage, mais dans
tous les cas dans les 24 h, en ajoutant l’un des conservateurs suivants.
a) Acide borique (HsBO,): Ajouter l’acide borique à l’échantillon pour essai. La concentration finale de
l’échantillon en acide borique ne doit pas dépasser 0’6 g pour 100 ml. Ces échantillons peuvent être conservés
pendant une durée supplémentaire pouvant aller jusqu’à 24 h à une température comprise entre 6 “C et 12 OC.
b) Dichromate de potassium (K&r207): Ajouter le dichromate de potassium à l’échantillon pour essai. La
concentration finale de l’échantillon en dichromate de potassium ne doit pas dépasser 0’2 g pour 100 mi, Ces
échantillons peuvent être conservés pendant une durée supplémentaire pouvant aller jusqu’à 72 h à une
température comprise entre 6 “C et 12 “C. II faut tenir compte des conditions locales en matière de déversement
des effluents dans le cas d’échantillons contenant du dichromate de potassium comme conservateur.
c) Azide de sodium: Immédiatement après l’échantillonnage, ajouter I’azide de sodium à l’échantillon pour essai.
La concentration finale de l’échantillon en azide de sodium ne doit pas dépasser 0,024 g pour 100 ml. Ces
échantillons peuvent être conservés à une température comprise entre 2 “C et 6 “C. II convient d’effectuer le
dénombrement dans les 48 h après l’échantillonnage.
d) Bronopol (bromo-2 nitro-2 propane diol-1,3). Immédiatement après l’échantillonnage, ajouter le bronopol à
l’échantillon pour essai. La concentration finale de l’échantillon en bronopol ne doit pas dépasser 0’05 g pour 100 ml
(de préférence 0’02 g pour 100 ml). II convient d’effectuer le dénombrement dans les 72 h après l’échantillonnage.
Ces échantillons peuvent être conservés à un température comprise entre 2 “C et 6 “C.
NOTES
1 Un échantillon contenant déjà de l’acide borique peut être conservé jusqu’à 48 h de plus en utilisant du dichromate de
potassium.
2 La durée de conservation des échantillons pour essai contenant du bronopol ajouté peut augmenter jusqu’à 5 jours sous de
bonnes conditions et avec vérification de la qualité des cellules à l’aide d’un dispositif moderne. Toutefois, cela implique
l’addition immédiate du conservateur et la conservation de l’échantillon dans un endroit froid avant l’essai.
7 Préparation de l’échantillon pour essai
7.1 Entreposer l’échantillon sans conservateur pendant au moins 24 h après la traite, à une température comprise
entre 2 “C et 6 OC. Si l’examen de l’échantillon sans consewateur doit toutefois être effectué dans les 24 h suivant
la traite, l’échantillon pour essai doit être prétraité en ajoutant du dichromate de potassium (6.4) et laisser reposer
pendant au moins 3 h.
dans un bain d’eau (5.2)
72 Chauffer l’échantillon contenant des conservateurs et I’écha ntillon sans conservateur
réglé à 40 “C et les laisser à température ambiante pendan t 30 m in au plus.
8 Mode opératoire
8.1 Prise d’essai
Une nouvelle dilution de l’échantillon pour essai et la préparation de la prise d’essai sont réalisées automatiquement
dans l’instrument de comptage (5.1)
8.2 Détermination
S’assurer que le dénombrement des cellules est effectué dans les 30 min qui suivent la fin du chauffage (7.2) et
avant que la température tombe au-dessous de 30 “C. S’assurer que l’agitateur de l’instrument fonctionne
correctement de manière à obtenir une répartition des cellules aussi homogène que possible. Si l’on ne dispose pas
d’un agitateur, mélanger soigneusement les prises d’essai avant le dénombrement.
4
---------------------- Page: 6 ----------------------
@ ISO
ISO 13366-3: 1997(F)
9 Expression des résultats
Exprimer le nombre de cellules somatiques en milliers par millilitre de lait.
Voir en annexe C une étude concernant l’utilisation d’échantillons étalons de dénombrement des cellules.
NOTE -
10 Fidélité
Les détails de l’essai interlaboratoire relatif à la fidélité de la méthode sont résumés dans l’annexe A. Les valeurs
provenant de l’essai interlaboratoire ne peuvent être appliquées aux plages de concentrations et aux matrices
autres que celles données.
11 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit indiquer:
la méthode selon laquelle l’échantillonnage a été effectué, si elle est connue;
-
- la méthode utilisée;
- le(s) résultat(s) d’essai obtenu(s), et
- si la répétabilité a été vérifiée, le résultat final cité qui a été obtenu.
II doit en outre mentionner tous les détails opératoires non prévus dans la présente partie de I’ISO 13366, ou
facultatifs, ainsi que les incidents éventuels susceptibles d’avoir agi sur le(s) résultat(s).
Le rapport d’essai doit donner tous les renseignements nécessaires à l’identification complète de l’échantillon.
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 13366-3: 1997(F)
Annexe A
(informative)
Résultats de l’essai interlaboratoire
Un essai interlaboratoire auquel ont participé 37 laboratoires a donné les résultats donnés au tableau A.1 pour
r (limite de répétabilité) et R (limite de reproductibilité) (en milliers de cellules par millilitre).
Tableau A.1
Nombre moyen
Échantillon
de cellules Y R
SI- SR
de lait
par millilitre
r
36,7 103,7
2 210 13,7 38'9
4 438 21,2 59,9 51,3 145,0
92,3 89,4 253,0
6 609 32,6
Il convient de noter que, dans la pratique, on utilise la moyenne géométrique de plusieurs déterminations (par
exemple trois).
NOTE - Pour les objectifs de fidélité, voir l’annexe B.
6
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 13366-3: 1997(F)
Annexe B
(informative)
Contrôle de la qualité au laboratoire
B.1 Objectif
Les procédures de contrôle de la qualité ont pour but de s’assurer de la concordance des dénombrements de
cellules déterminés lors des opérations de routine et du wrai >> dénombrement des cellules des échantillons. Une
faible concordance peut être due à des erreurs aléatoires des déterminations individuelles (telles que celles
provoquées par un mélange insuffisant ou un prélèvement à la pipette manquant de précision) ou elle peut
également être due à des erreurs systématiques ou à des biais (comme ceux introduits par un étalonnage incorrect
des instruments). L’importance de ces deux types d’erreurs peut varier en fonction du dénombrement vrai des
cellules de l’échantillon. La figure B.1 illustre les effets des erreurs aléatoires et des erreurs systématiques sur la
relation entre les dénombrements vrais et ceux observés.
La répétabilité est une mesure de la variation entre plusieurs déterminations répétées réalisées au sein d’un seul
laboratoire sur le même échantillon. La reproductibilité est une mesure de la variation entre des déterminations
effectuées dans des laboratoires différents sur le même échantillon. Ni la répétabilité ni la reproductibilité, définies
dans I’ISO 5725If*] ne vise à mesurer les biais lors des mesurages concernant les valeurs <>. Les
procédures recommandées dans la présente annexe ont pour but de faire les deux, en combinant les contrôles de
routine dans les laboratoires et les essais interlaboratoires périodiques destinés à évaluer les performances
relatives des différents laboratoires.
B.2 Surveillance de routine dans les laboratoires
B.2.1 Répétabilité
Pour la surveillance de routine de la répétabilité des dénombrements, il convient de compter tout échantillon
comportant environ 500 000 cellules par millilitre, à intervalles réguliers (par exemple tous les 20e ou
50e échantillon) tout au long de la journée de travail. À la fin de la journée, il convient de calculer le coefficient de
variation des dénombrements. S’il est supérieur à 5 %, il convient de vérifier la méthodologie utilisée par le
laboratoire et de vérifier en particulier si l’on prend suffisamment de précautions lorsqu’on réalise le mélange et le
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.