ISO 11731:1998

SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 11731:1999
01-november-1999
Kakovost vode - Ugotavljanje prisotnosti in števila legionel
Water quality -- Detection and enumeration of Legionella
Qualité de l'eau -- Recherche et dénombrement des Legionella
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 11731:1998
ICS:
07.100.20 Mikrobiologija vode Microbiology of water
SIST ISO 11731:1999 en
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.

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SIST ISO 11731:1999

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SIST ISO 11731:1999
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11731
First edition
1998-5-01
Water quality — Detection and enumeration
of Legionella
Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement des Legionella
A
Reference number
ISO 11731:1998(E)

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ISO 11731:1998(E)
Contents Page
1 Scope . 1
2 Normative reference . 1
3 Definition. 1
........................................................................................
4 Safety 1
5 Principle . 2
6 Culture media and reagents. 2
7 Apparatus . 6
8 Sampling. 7
9 Procedure . 7
10 Expression of results. 10
11 Test report . 11
Annex A: Scraping the bacteria from filter membranes. 12
Annex B: Colony identification on BCYE - Cys. 13
Annex C: Indirect immunofluorescent assay for identification
of L. pneumophila . 14
Annex D: Bibliography. 16
©  ISO 1998
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Switzerland
Internet central@iso.ch
X.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Printed in Switzerland
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SIST ISO 11731:1999
©
ISO ISO 11731:1998(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (ISO member bodies). The work of
preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented
on that committee. International organizations, governmental and non-
governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 11731 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4, Microbiological methods.
Annexes A, B, C and D of this International Standard are for information
only.
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INTERNATIONAL STANDARD  ISO ISO 11731:1998(E)
Water quality — Detection and enumeration of Legionella
1  Scope
This International Standard describes a culture method for the isolation of Legionella organisms and estimation of
their numbers in environmental samples.
This method is applicable to all kinds of environmental samples including potable, industrial and natural waters and
associated materials such as sediments, deposits and slime.
2  Normative reference
The following standard contains provisions, which, through reference in this text, constitute provisions of this
International Standard. At the time of publication, the edition indicated was valid. All standards are subject to
revision, and parties to agreements based on this International Standards are encouraged to investigate the
possibility of applying the most recent edition of the standard listed below. Members of IEC and ISO maintain
registers of currently valid International Standards.
ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods.
3  Definition
For the purposes of this International Standard, the following definition applies:
Legionella
3.1
genus of Gram-negative organisms normally capable of growth in not less than 2 days on Buffered Charcoal Yeast
Extract agar containing L-cysteine and iron(III), and forming colonies, often white, purple to blue or lime green in
colour
NOTE —  Some species fluoresce under long-wavelength UV light. The colonies have a ground-glass appearance when
viewed with a low power stereomicroscope. With a very few exceptions, growth does not occur in the absence of L-cysteine.
4  Safety
The reagents used in this International Standard should be subject to assessment in accordance with Control of
Substances Hazardous to Health.
Legionella species can be handled safely by experienced microbiologists on the open bench in a conventional
microbiology laboratory conforming to Containment Level 2. Infection is caused by inhalation of the organism and it
is advisable therefore to assess all techniques for their ability to produce aerosols. If in doubt, carry out the work in
a safety cabinet.
1

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ISO
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5  Principle
5.1  General
Bacteria, including Legionella organisms, in the water sample are concentrated by membrane filtration or by
centrifugation. Turbid samples can be centrifuged. To reduce the growth of unwanted bacteria, a portion of the
concentrated specimen is subjected to treatment with acid and another portion with heat. Treated and untreated test
portions are then inoculated onto plates of agar medium selective for Legionella and incubated. Samples containing
sufficient numbers of Legionella need not be subject to concentration prior to culture.
5.2  Enumeration
After incubation, morphologically characteristic colonies which form on the selective medium are regarded as
presumptive Legionella.
5.3  Confirmation
Presumptive colonies are confirmed as Legionella organisms by subculture to demonstrate their growth requirement
for L-cysteine and iron. Further biochemical and serological tests are needed for species identification.
6  Culture media and reagents
6.1  General
Use chemicals of analytical grade in the preparation of media and reagents unless otherwise stated (see note 1).
Alternatively, use commercially available dehydrated media and reagents. Prepare the media according to the
manufacturer's instruction and add freshly prepared selective agents or growth supplements (or thaw the stored
material at room temperature prior to use) at the concentrations recommended. Prepare media using glass-distilled
water or water of equivalent quality complying with ISO 3696 Grade 3.
NOTE 1  The use of chemicals of other grades is permissible providing they are shown to be of equal performance in the test.
Use diagnostic serological reagents of known specificity from a known source. Do not use a reagent for which this
information is not available.
NOTE 2  The possibility of cross-reactions with other organisms in environmental samples should be considered.
6.2  Culture media
6.2.1  Buffered Charcoal Yeast Extract agar medium (BCYE)
6.2.1.1  Composition
Yeast extract (bacteriological grade) 10,0 g
Agar 12,0 g
Activated charcoal 2,0 g
Alpha-ketoglutarate, monopotassium salt 1,0 g
ACES buffer
  (N-2-acetamido-2-aminoethanesulfonic acid) 10,0 g
Potassium hydroxide (KOH) (pellets) 2,8 g
L-cysteine hydrochloride monohydrate 0,4 g
Iron(III) pyrophosphate [Fe (P O ) ] 0,25 g
4 2 7 3
Distilled water to 1000 ml
NOTE —  Check manufacturer’s recommendations for concentration of agar to be added to provide adequate gelling strength.
2

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ISO 11731:1998(E)
6.2.1.2  Preparation
a)  Cysteine and iron solutions.
Prepare fresh solutions of L-cysteine hydrochloride and iron(III) pyrophosphate by adding 0,4 g and 0,25 g
respectively to 10-ml volumes of distilled water. Decontaminate each solution by filtration through a membrane filter
o
with an average pore size of 0,22 μm. Store in clean sterile containers at 2(20 + 3) C for not more than 3 months.
b)  ACES buffer.
o
Add the ACES granules to 500 ml of distilled water and dissolve by standing in a water bath at (45 to 50) C. To a
separate 480 ml of distilled water, add all the potassium hydroxide pellets and dissolve with gentle shaking. To
prepare the ACES buffer, mix the two solutions.
NOTE —  ACES buffer can cause denaturation of the yeast extract if the following sequence is not followed.
c)  Final medium.
Add sequentially to the 980 ml of ACES buffer, the charcoal, yeast extract and a-ketoglutarate. Prepare a 0,1 mol/l
solution of potassium hydroxide (KOH) by dissolving 5,6 g in 1 litre of distilled water. Prepare a 0,1 mol/1 solution of
sulfuric acid (H SO ) by carefully adding 5,3 ml of H SO to 1 litre of distilled water. Use the solutions of 0,1 mol/l
2 4 2 4
potassium hydroxide or 0,1 mol/l sulfuric acid as appropriate to adjust the pH to 6,9 + 0,2. Add the agar, mix and
o o
autoclave at (121 + 1) C for (15 + 1) min (see 6.2.4, first paragraph). After autoclaving, allow to cool to (50 + 2) C
in a water bath.
Add the L-cysteine and the iron(III) pyrophosphate solutions aseptically, mixing well between additions.
Dispense in 20 ml volumes into Petri dishes of 90 mm to 100 mm diameter. The pH of the final medium is 6,9 + 0,4
° o
at 25 C. Allow excess moisture on the plates to dry and store at (4 + 2) C in airtight containers in the dark for up to
4 weeks.
6.2.2  Buffered Charcoal Yeast extract medium without L-cysteine (BCYE - Cys)
Prepare this medium in an identical manner to BCYE (6.2.1) but omit the L-cysteine.
6.2.3  Selective medium: Buffered Charcoal Yeast Extract medium with selective supplements
(GVPC medium)
NOTE —  This medium is identical to BCYE except that three antibiotic supplements and glycine are added to the BCYE
medium.
6.2.3.1  Selective supplements
The final concentrations in the GVPC medium shall be:
Ammonium-free glycine 3 g/l
Polymyxin B sulfate 80 000 iu/l
Vancomycin hydrochloride 0,001 g/l
Cycloheximide 0,08 g/l
6.2.3.2  Preparation of antibiotic supplements
Add the appropriate amount (usually 200 mg) of polymyxin B sulfate to 100 ml of distilled water to achieve a
concentration of 14 545 iu/ml. Mix and decontaminate by membrane filtration as described in 6.2.1.2. Dispense
o
5,5 ml volumes into sterile containers and store at -(20 + 3) C. For use, thaw at room temperature.
Add 20 mg of vancomycin hydrochloride to 20 ml of distilled water, mix and decontaminate by membrane filtration
o
(6.2.1.2). Dispense in 1 ml volumes in sterile containers and store at 2(20 + 3) C. For use, thaw at room
temperature.
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ISO 11731:1998(E)
Add 2 g of cycloheximide to 100 ml of distilled water and decontaminate by membrane filtration as described in
o
6.2.1.2. Dispense in 4 ml volumes in sterile containers and store at 2(20 + 3) C. For use, thaw at room
temperature.
NOTE —  Antibiotic supplements may be stored for up to 6 months when frozen.
WARNING —  Cycloheximide is hepatotoxic. Wear gloves and dust mask when handling this chemical in
powder form.
6.2.3.3  Preparation of GVPC medium
Follow the instructions for preparation of BCYE medium given in 6.2.1.2, but add 3 g of ammonium-free glycine after
the addition of the a-ketoglutarate and then adjust the pH to 6,9 + 0,4.
After the addition of the L-cysteine and iron, add one volume of each of the above three antibiotic supplements
(6.2.3.2) to the final medium. Mix well.
6.2.4  Quality control of media
Prolonged heating during sterilization or heating at too high a temperature shall be avoided, as it can affect the
nutritional qualities of BCYE medium. Batch-to-batch variation of the ingredients of the medium (particularly
a-ketoglutarate) can also affect its performance. Therefore it is essential to check the quality of each newly
prepared batch of media for its ability to support the growth of L. pneumophila serogroup 1 within three days of
incubation.
For most bacteria, it is usual to assess the suitability of culture media to support their growth by using cultures of
previously isolated organisms, maintained in the laboratory. For Legionellas this method may be misleading, as they
can easily adapt to grow on culture media that would not support the primary isolation of 'wild' strains. The following
procedure is therefore recommended for assessing the suitability of GVPC selective agar medium for Legionella
organisms.
Either
a) use plates of a previous batch of GVPC medium known to support the growth of Legionella together with plates
from the new batch of medium and inoculate them with a water sample known to contain Legionella organisms, or
b) from a nationally recognized source of reference cultures, obtain a lyophilized strain of Legionella pneumophila
serogroup 1. Reconstitute and recover as recommended, and subculture onto BYCE (6.2.1) for purity. If a type
culture is not available, use a freshly isolated and confirmed strain of L. pneumophila serogroup 1. Stock strains of
L. pneumophila shall be replaced after not more than 10 subcultures. After incubation, make a suspension from
the resulting growth just visible to the naked eye and dispense in 1 ml volumes in sterile glycerol broth (6.3.3.4) for
o o
storage at 2(20 + 3) C, or alternatively in Page's Saline (6.3.2.1) or distilled water for storage at 2(70 + 5) C.
Plate out one suspension of each isolate onto BCYE medium for subsequent identification and recording of the
Legionella species and serogroup (see 9.3). For use, allow a stock suspension of one (or more) isolates to thaw at
room temperature. Shake thoroughly, wait 5 min to 10 min to allow aerosols to settle, and inoculate a measured
volume (e.g. 0,1 ml) onto each of two plates of GVPC medium from the batch to be tested.
After incubation, record and compare the results to ensure that the colonial morphology (9.2.6) and number of colonies
are similar.
6.3  Reagents
6.3.1  Acid buffer
Prepare a 0,2 mol/l solution of hydrochloric acid (HCl) (solution A) (see note). Prepare a 0,2 mol/l solution of
potassium chloride (KCl) by dissolving 14,9 g of KCl in 1 litre of distilled water (solution B). To prepare the acid
buffer, mix 3,9 ml of solution A and 25 ml of solution B. Adjust to pH 2,2 + 0,2 by addition of a solution of 1 mol/l
potassium hydroxide (KOH). Store in a stoppered glass container in the dark at room temperature for not longer
than 1 month.
NOTE —  To prepare a 0,2 mol/l solution of hydrochloric acid, add 17,4 ml concentrated HCI (sp gr 1,18, minimum assay
35,4 %) or 20 ml concentrated HCI (sp gr 1,16, minimum assay 31,5%) to 1 litre of distilled water.
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ISO 11731:1998(E)
6.3.2  Diluents
6.3.2.1  Page's Saline
Composition
Sodium chloride (NaCl) 0,120 g
Magnesium sulfate (MgSO 7H O) 0,004 g
�
4 2
Calcium chloride (CaCl � 2H O) 0,004 g
2 2
Disodium hydrogenphosphate (Na HPO ) 0,142 g
2 4
Potassium dihydrogenphosphate (KH PO ) 0,136 g
2 4
Distilled water 1000 ml
o
Add the chemicals to the distilled water. Allow to dissolve, mix well and autoclave at (121 + 1) C for (15 + 1) min
(see 6.2.4 first paragraph).
NOTE —  To aid accurate preparation, it is recommended that a 10 litre volume of Page's Saline is prepared and dispensed in
o
smaller volumes as required for autoclaving at (121 + 1) C for (20 + 1) min.
6.3.2.2  Dilute Ringer's solution.
Using a commercially available preparation (usually in tablet form), prepare a 1:40 dilution of Ringer's solution.
o
Dispense as required and autoclave at (121 + 1) C for (20 + 1) min.
NOTE —  This is a 1 in 10 dilution of ¼ strength Ringer's solution.
6.3.2.3  Phosphate-buffered saline (pH 7,5).
Use a commercially available preparation and reconstitute according to the manufacturer's instructions.
6.3.2.4  Formol saline.
Prepare by adding 20 ml of an 37 % (volume fraction) aqueous solution of formaldehyde to 980 ml of phosphate-
buffered saline (6.3.2.3).
6.3.3  Serological reagents
6.3.3.1  Antisera to Legionella pneumophila and other Legionella species.
To identify Legionella pneumophila, use polyclonal or monoclonal antibody preparations capable of reacting with all
known serogroups of Legionella pneumophila. If it is necessary to identify species other than L. pneumophila or
serogroups of L. pneumophila, then use specific antisera.
6.3.3.2  Fluoroscein isothiocyanate anti-rabbit conjugate (FITC conjugate)
FITC conjugates raised against rabbit serum proteins that are available commercially.
NOTE —  Different conjugates are required for use with antisera raised in other animals.
6.3.3.3  Glycerol mounting medium
Use a commercially available glycerol mounting medium, or prepare by adding 1 ml of potassium phosphate-
buffered saline (pH 8,5) to 9 ml of glycerol (neutral).
6.3.3.4  Glycerol broth
Dissolve 5 g of a commercially available dehydrated nutrient broth in 170 ml of distilled water and add 30 ml of
glycerol. Mix well and dispense in clean, dry silica-glass bottles in volumes of 2 ml. Sterilize by autoclaving at
o
(121 + 1) C for (20 + 1) min. Store at room temperature until required.
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SIST ISO 11731:1999
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ISO 11731:1998(E)
7  Apparatus
Usual laboratory equipment including
7.1  Sterile Petri dishes with a nominal diameter of either 90 mm or 100 mm.
o
7.2  Incubator, capable of being maintained at (36 + 1,0) C.
7.3  Ultraviolet lamp, emitting light of wavelength (360 + 20) nm.
7.4  Filter stand and funnel, suitable for filtering water volumes of 500 ml to 10 litres.
Filtration equipment shall withstand autoclaving. The filter diameter may vary from 47 mm to 142 mm. Larger filter
apparatus is usually constructed of stainless steel.
7.5  Positive-pressure membrane filtration pump, peristaltic and capable of producing a flowrate of up to 3 l/min
with a variable speed control. Alternatively, a compressor and pressure vessel are permissible.
NOTE —  Alternatively, vacuum-assisted filtration systems for small sample volumes may be used instead of positive-pressure
filtration.
7.6  Nylon or polycarbonate membrane filters, of diameter 47 mm to 142 mm with rated pore sizes of 0,22 μm
or 0,45 μm.
NOTE —  Although membranes of both pore sizes are used successfully for the isolation of Legionella organisms, the
comparative efficiency is not known. Polycarbonate membranes have lower flowrates which will extend processing times if
used.
7.7  Silicone tubing, with inner and outer diameters as specified by the manufacturer of the peristaltic pump (7.5)
but with a wall thickness of not less than 1,5 mm.
7.8  Heat source, such as a hot plate or gas ring burner.
7.9  Centrifuge, capable of (6 000 + 100) g, fitted with safety buckets.
7.10  Rotary shaker, capable of achieving at least (200 + 5) r/min.
7.11  Ultrasound water bath, suitable for use with water samples of up to 25 ml.
o
7.12  Water bath, capable of being maintained at (50 + 1) C.
7.13  Glassware.
o o
Sterilize all glassware either at (170 + 5) C for 1 h in a hot-air oven or at (121 + 1) C for 20 min in an autoclave.

7.14 Microscopes.
7.14.1  Fluorescent microscope.
A binocular microscope fitted with incident fluorescent illumination. The illuminating aperture shall consist of field
and aperture diaphragms and exciting light stop, an exciter filter, a dichroic beam-splitting mirror and matching
suppression filter and lamp holder. The microscope shall be fitted with an oil- or water-immersion lens (at least x40)
and x8 or x10 eyepieces.
7.14.2  Plate microscope, stereoscopic, with magnification of at least x30 and oblique incident illumination.
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SIST ISO 11731:1999
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ISO
ISO 11731:1998(E)
8  Sampling
8.1  Sample containers
Samples of water (generally 1 litre) shall be collected in glass, polyethylene or similar containers. If used previously,
o
they shall be cleaned, rinsed with distilled or mains tap water and autoclaved at (121 + 1) C for 20 min. Containers
o
that cannot withstand autoclaving shall instead be pasteurized either with flowing hot water (> 70 C) or steam for a
period of not less than 5 min. Smaller st
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 11731
Première édition
1998-05-01
Qualité de l'eau — Recherche et
dénombrement des Legionella
Water quality — Detection and enumeration of Legionella
A
Numéro de référence
ISO 11731:1998(F)

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ISO 11731:1998(F)
Sommaire Page
1 Domaine d'application . 1
2 Référence normative . 1
3 Définition . 1
.....................................................................................
4 Sécurité 1
5 Principe. 2
6 Milieux de culture et réactifs . 2
7 Appareillage . 6
8 Échantillonnage. 7
9 Mode opératoire. 8
10 Expression des résultats . 11
11 Rapport d'essai. 12
Annexe A: Grattage des bactéries à partir des membranes
............................................................................................
filtrantes 13
Annexe B: Identification des colonies sur le milieu BCYE - Cys 14
Annexe C: Essai d'immunofluorescence indirecte pour
l'identification de L. pneumophila . 15
Annexe D: Bibliographie. 17
©  ISO 1998
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord
écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
Internet central@iso.ch
X.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Imprimé en Suisse
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ISO ISO 11731:1998(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d'organismes nationaux de normalisation (comités membres de
l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en
ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 11731 a été élaborée par le comité technique
ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 4, Méthodes microbiolo-
giques.
Les annexes A, B, C et D de la présente Norme internationale sont
données uniquement à titre d'information.
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NORME INTERNATIONALE  ISO ISO 11731:1998(F)
Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement des
Legionella
1  Domaine d'application
La présente Norme internationale décrit une méthode de culture pour l'isolement des Legionella et leur
dénombrement dans des échantillons de l'environnement.
Cette méthode est applicable à tous les types d'échantillon de l'environnement, y compris les eaux potables, les
eaux industrielles, les eaux naturelles et les matériaux associés tels que les sédiments, les dépôts et le biofilm.
2  Référence normative
La norme suivante contient des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme internationale. Au moment de la publication, l'édition indiquée était en
vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente Norme
internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer l'édition la plus récente de la norme indiquée ci-
après. Les membres de la CEI et de l'ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur à un
moment donné.
ISO 3696:1986, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai.
3  Définition
Pour les besoins de la présente Norme internationale, la définition suivante s'applique.
3.1
Legionella
genre de bactéries à Gram négatif normalement capables de croître en deux jours au moins avec de la L-cystéine
et du fer(III), sur gélose tamponnée au charbon actif et à l'extrait de levure et formant des colonies, d'une couleur
souvent blanche, pourpre-bleu, ou vert-jaune
NOTE —  Certaines espèces sont fluorescentes sous une lumière ultraviolette de grande longueur d'onde. Les colonies ont
une apparence de verre fritté lorsqu'elles sont observées avec un microscope stéréoscopique de faible puissance. À de rares
exceptions près, la croissance n'a pas lieu en l'absence de L-cystéine.
4  Sécurité
Il convient que les réactifs employés dans la présente Norme internationale soient soumis au contrôle des
substances dangereuses au titre des risques sanitaires.
1

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©
ISO
ISO 11731:1998(F)
Les espèces de Legionella peuvent être manipulées en toute sécurité par des microbiologistes avertis, sur une
paillasse découverte dans un laboratoire de microbiologie traditionnel conforme à un confinement de niveau 2. Des
infections pouvant être causées par inhalation de ces bactéries, il est recommandé d'évaluer toutes les méthodes
du point de vue de leur aptitude à former des aérosols. En cas de doute, les travaux doivent être effectués dans
une hotte de sécurité.
5  Principe
5.1  Généralités
Les bactéries, y compris les Legionella, contenues dans un échantillon d'eau sont concentrées par filtration sur
membrane ou par centrifugation. Les échantillons turbides peuvent être centrifugés. Afin de réduire le
développement de bactéries interférentes, une partie de l'échantillon concentré est soumise à un traitement acide,
une autre partie subissant un traitement thermique. Les fractions traitées et non traitées sont ensuite ensemencées
sur des boîtes de milieu gélosé sélectif pour les Legionella, et incubées. Il n'est pas nécessaire de concentrer les
échantillons contenant un nombre suffisant de Legionella, avant d'être mis en culture.
5.2  Dénombrement
Après incubation, les colonies de morphologie caractéristique qui se forment sur le milieu sélectif sont considérées
comme des Legionella présumées.
5.3  Confirmation
Les colonies présumées sont confirmées comme étant des Legionella par repiquage pour mettre en évidence leur
besoin en L-cystéine et en fer pour se développer. Pour l'identification des espèces, il est nécessaire d'effectuer
des essais biochimiques et sérologiques supplémentaires.
6  Milieux de culture et réactifs
6.1  Généralités
Sauf spécification contraire, utiliser des produits chimiques de qualité analytique pour la préparation des milieux et
des réactifs (voir note 1). Il est également possible d'utiliser des milieux et réactifs déshydratés disponibles dans le
commerce. Préparer les milieux conformément aux instructions du fabricant et ajouter les agents sélectifs ou
adjuvants de croissance de préparation récente (ou décongeler, avant utilisation et à température ambiante, les
ingrédients conservés) aux concentrations recommandées. Préparer les milieux au moyen d'eau distillée dans un
appareillage en verre ou d'une eau de qualité équivalente conforme à l'ISO 3696, Qualité 3.
NOTE 1  L'utilisation de produits chimiques d'autres qualités est permise, sous réserve de démontrer qu'ils ont une
performance égale pour l'essai.
Utiliser des réactifs sérologiques de diagnostic dont les caractéristiques et la provenance sont connues. Ne pas
utiliser de réactifs pour lesquels ces informations ne sont pas disponibles.
NOTE 2  Il convient de prendre en compte l'éventualité de réactions croisées avec d'autres micro-organismes dans les
échantillons de l'environnement.
6.2  Milieux de culture
6.2.1  Milieu BCYE
6.2.1.1  Composition
Extrait de levure (qualité bactériologique) 10,0 g
Agar 12,0 g
Charbon actif 2,0 g
2

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a-cétoglutarate, sel de monopotassium 1,0 g
Tampon ACES
  {Acide [N-(2-acétamido)-2-amino]éthanesulfonique} 10,0 g
Hydroxyde de potassium (KOH) (pastilles) 2,8 g
Chlorhydrate de -cystéine monohydraté 0,4 g
L
Pyrophosphate de fer(III) [Fe (P O ) ] 0,25 g
4 2 7 3
Eau distillée, pour obtenir un volume total de 1 000 ml
NOTE —  Consulter les recommandations du fabricant concernant la concentration en agar à ajouter pour obtenir la
gélification adéquate.
6.2.1.2  Préparation
a)  Solutions de cystéine et de fer
Préparer des solutions fraîches de chlorhydrate de L-cystéine et de pyrophosphate de fer(III) en ajoutant
respectivement 0,4 g et 0,25 g dans 10 ml d'eau distillée. Stériliser chaque solution par filtration sur membrane
filtrante, la dimension moyenne des pores étant de 0,22 mm. Conserver les solutions dans des récipients stériles
propres, à une température de -(20 – 3) °C, pour une durée n'excédant pas 3 mois.
b)  Tampon ACES
Ajouter les granules d'ACES à 500 ml d'eau distillée et les dissoudre en les plaçant dans un bain d'eau à (45 à
50) °C. Ajouter par ailleurs à 480 ml d'eau distillée toutes les pastilles d'hydroxyde de potassium et les dissoudre en
agitant doucement. Pour la préparation du tampon ACES, mélanger les deux solutions.
NOTE —  Le tampon ACES peut provoquer la dénaturation de l'extrait de levure si l'étape suivante n'est pas suivie.
c)  Milieu final
Ajouter successivement aux 980 ml de tampon ACES, le charbon, l'extrait de levure et l'a-cétoglutarate. Préparer
une solution d'hydroxyde de potassium (KOH) à 0,1 mol/l en dissolvant 5,6 g dans 1 l d'eau distillée. Préparer une
solution d'acide sulfurique (H SO ) à 0,1 mol/l en ajoutant avec précaution 5,3 ml de H SO à 1 l d'eau distillée.
2 4 2 4
Utiliser les solutions à 0,1 mol/l d'hydroxyde de potassium ou à 0,1 mol/l d'acide sulfurique afin d'ajuster le pH à
6,9 – 0,2. Ajouter l'agar, mélanger et stériliser par autoclavage à (121 – 1) °C durant (15 – 1) min (voir 6.2.4,
premier alinéa). Après passage à l'autoclave, laisser refroidir jusqu'à (50 – 2) °C dans un bain d'eau.
Ajouter stérilement la solution de L-cystéine et la solution de pyrophosphate de fer(III). Mélanger soigneusement
entre les additions.
Répartir par volumes de 20 ml dans des boîtes de Pétri de 90 mm à 100 mm de diamètre. Le pH du milieu final est
de 6,9 – 0,4 à 25 °C. Laisser sécher l'excès d'humidité dans les boîtes et conserver à (4 – 2) °C dans des récipients
hermétiques, à l'obscurité, pendant 4 semaines au maximum.
6.2.2  BCYE sans L-cystéine (BCYE - Cys)
Préparer ce milieu en opérant de la même façon que pour le BCYE (6.2.1) sans ajouter de L-cystéine.
6.2.3  Milieu sélectif: BCYE avec suppléments sélectifs (milieu GVPC)
NOTE —  Ce milieu est identique au BCYE, excepté l'ajout de trois antibiotiques et de glycine au milieu BCYE.
6.2.3.1  Suppléments sélectifs
Les concentrations finales dans le milieu GVPC doivent être comme suit:
Glycine exempte d'ammonium 3 g/l
3

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Sulfate de polymyxine B 80 000 ui/l
Chlorhydrate de vancomycine 0,001 g/l
Cycloheximide 0,08 g/l
6.2.3.2  Préparation de suppléments antibiotiques
Ajouter la quantité appropriée (en général 200 mg) de sulfate de polymyxine B à 100 ml d'eau distillée pour obtenir
une concentration de 14 454 ui/ml. Mélanger et stériliser par filtration sur membrane, comme décrit en 6.2.1.2.
Répartir par volumes de 5,5 ml dans des récipients stériles et conserver à -(20 – 3) °C. Avant utilisation,
décongeler à température ambiante.
Ajouter 20 mg de chlorhydrate de vancomycine à 20 ml d'eau distillée, mélanger et stériliser par filtration sur
membrane (voir 6.2.1.2). Répartir par volumes de 1 ml dans des récipients stériles et conserver à -(20 – 3) °C.
Avant utilisation, décongeler à température ambiante.
Ajouter 2 g de cycloheximide à 100 ml d'eau distillée et stériliser par filtration sur membrane, comme décrit en
6.2.1.2. Répartir par volumes de 4 ml dans des récipients stériles et conserver à -(20 – 3) °C. Avant utilisation,
décongeler à température ambiante.
NOTE —  Les suppléments antibiotiques peuvent être conservés congelés pendant une période maximale de 6 mois.
AVERTISSEMENT —  Le cycloheximide est hépatotoxique. Des gants et un masque sont nécessaires lors
de sa manipulation sous forme de poudre.
6.2.3.3  Préparation du milieu GVPC
Suivre les instructions données en 6.2.1.2, pour la préparation du milieu BCYE, en ajoutant 3 g de glycine exempte
d'ammonium, après l'ajout de l'a-cétoglutarate. Ajuster ensuite le pH à 6,9 – 0,4.
Après ajout de la L-cystéine et du fer, ajouter au milieu final un volume de chacun des trois suppléments
antibiotiques ci-dessus (6.2.3.2). Mélanger soigneusement.
6.2.4  Contrôle de qualité des milieux
Le chauffage prolongé pendant la stérilisation ou à trop haute température doit être évité, car il peut affecter les
qualités nutritionnelles du milieu BCYE. Des variations d'un lot à l'autre des composants du milieu (notamment
l'a-cétoglutarate) peuvent également affecter les performances du milieu. C'est pourquoi il est essentiel de vérifier
la qualité de chaque lot de milieu fraîchement préparé afin d'évaluer son aptitude à assurer la croissance de
L. pneumophila de sérogroupe 1 en trois jours d'incubation.
Pour la plupart des bactéries, il est habituel d'évaluer l'aptitude des milieux de culture à leur croissance, au moyen
de cultures d'organismes précédemment isolés, maintenues au laboratoire. Dans le cas des Legionella, cette
méthode peut être source d'erreurs, dans la mesure où les Legionella peuvent s'adapter facilement à des milieux de
culture qui ne supporteraient pas l'isolement primaire de souches «sauvages». C'est pourquoi il est recommandé
d'employer le mode opératoire suivant pour évaluer si le milieu gélosé sélectif GVPC convient aux Legionella.
Procéder selon l'une des deux méthodes suivantes:
a) utiliser des boîtes provenant d'un précédent lot de milieu GVPC reconnu apte à la croissance de Legionella
avec des boîtes d'un nouveau lot de milieu et les ensemencer avec un échantillon d'eau contenant des
Legionella, ou
b) obtenir une souche lyophilisée de Legionella pneumophila du sérogroupe 1 à partir d'une collection de cultures
de référence reconnue au plan national. La reconstituer et la récupérer comme recommandé, puis la repiquer
sur le milieu BCYE (6.2.1) pour la purifier. Si une culture type n'est pas disponible, utiliser une souche de
L. pneumophila du sérogroupe 1 fraîchement isolée et confirmée. Les souches de L. pneumophila doivent être
remplacées au plus tard après 10 repiquages. Après incubation, faire à partir de la culture qui s'est produite
une suspension tout juste visible à l'œil nu, et répartir par volumes de 1 ml dans du bouillon au glycérol stérile
(6.3.3.4) pour une conservation à -(20 – 3) °C, ou bien dans une solution saline de Page (6.3.2.1) ou de l'eau
distillée pour une conservation à -(70 – 5) °C. Étaler une suspension de chaque souche sur milieu BCYE pour
4

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identification et enregistrement de l'espèce et du sérogroupe de Legionella (voir 9.3). Avant utilisation,
décongeler à température ambiante une suspension mère ou plusieurs souches. Agiter soigneusement,
attendre 5 min à 10 min pour permettre la déposition des aérosols, puis ensemencer un volume défini (par
exemple 0,1 ml) sur chacune des deux boîtes de milieu GVPC provenant du lot à tester.
Après incubation, enregistrer et comparer les résultats afin de s'assurer qu'il y a similitude dans la morphologie et le
nombre des colonies (9.2.6).
6.3  Réactifs
6.3.1  Tampon acide
Préparer une solution d'acide chlorhydrique (HCl) à 0,2 mol/l (solution A) (voir note). Préparer une solution de
chlorure de potassium (KCl) à 0,2 mol/l en dissolvant 14,9 g de KCl dans 1 l d'eau distillée (solution B). Pour la
préparation du tampon acide, mélanger 3,9 ml de la solution A et 25 ml de la solution B. Ajuster le pH à 2,2 – 0,2 en
ajoutant une solution d'hydroxyde de potassium (KOH) à 1 mol/l. Conserver dans un récipient en verre bouché, à
l'obscurité et à température ambiante, pendant un mois au maximum.
NOTE —  Pour préparer une solution d'acide chlorhydrique à 0,2 mol/l, ajouter 17,4 mol de HCl concentré (1,18 g/ml, teneur
minimale 35,4 %), ou 20 ml de HCl concentré (1,16 g/ml, teneur minimale 31,5 %) à 1 l d'eau distillée.
6.3.2  Diluants
6.3.2.1  Solution saline de Page.
Composition
Chlorure de sodium (NaCl) 0,120 g
Sulfate de magnésium (MgSO ,7H O) 0,004 g
4 2
Chlorure de calcium (CaCl ,2H O) 0,004 g
2 2
Hydrogénophosphate disodique (Na HPO ) 0,142 g
2 4
Dihydrogénophosphate de potassium (KH PO ) 0,136 g
2 4
Eau distillée 1 000 ml
Ajouter les produits chimiques à l'eau distillée. Laisser dissoudre, mélanger soigneusement et stériliser par
autoclavage à (121 – 1) °C pendant (15 – 1) min (voir 6.2.4, premier alinéa).
NOTE —  Afin d'obtenir une préparation précise, il est recommandé de préparer 10 l de la solution saline de Page et de les
répartir en quantités plus faibles pour les stériliser par autoclavage à (121 1) °C pendant (20 1) min.
– –
6.3.2.2  Solution de Ringer diluée.
Utiliser une préparation disponible dans le commerce (généralement sous forme de tablettes) pour préparer une
dilution 1:40 de solution de Ringer. La répartir comme prescrit et la passer à l'autoclave à (121 – 1) °C pendant
(20 – 1) min.
NOTE —  Il s'agit d'une dilution 1:10 d'une solution de Ringer 1:4.
6.3.2.3  Tampon phosphaté salé (pH 7,5).
Utiliser une préparation disponible dans le commerce et la reconstituer conformément aux instructions du fabricant.
6.3.2.4  Solution salée formolée.
Préparer cette solution en ajoutant 20 ml d'une solution aqueuse de formaldéhyde à 37 % (fraction volumique) à
980 ml de tampon phosphaté salé (6.3.2.3).
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6.3.3  Réactifs sérologiques
6.3.3.1  Sérum anti-Legionella pneumophila et autres espèces de Legionella.
Pour identifier la Legionella pneumophila, utiliser des préparations d'anticorps polyclonales ou monoclonales
capables de réagir avec tous les sérogroupes connus de . S'il est nécessaire d'identifier des
Legionella pneumophila
espèces autres que L. pneumophila ou des sérogroupes de L. pneumophila, utiliser des antisérums spécifiques.
6.3.3.2  Conjugué FITC (conjugué d'isothiocyanate de fluorescéine anti-lapin).
Il s'agit de conjugués FITC développés contre les immunoglobulines de lapin, disponibles dans le commerce.
NOTE —  Des conjugués différents sont nécessaires pour une utilisation avec des antisérums développés sur d'autres
animaux.
6.3.3.3  Milieu de montage au glycérol.
Utiliser un milieu disponible dans le commerce, ou le préparer en ajoutant 1 ml de tampon salé au phosphate de
potassium (pH 8,5) à 9 ml de glycérol (neutre).
6.3.3.4  Bouillon au glycérol.
Dissoudre 5 g d'un bouillon nutritif déshydraté disponible dans le commerce dans 170 ml d'eau distillée et ajouter
30 ml de glycérol. Mélanger soigneusement et répartir dans des bouteilles en verre de silice propres et sèches, par
volumes de 2 ml. Stériliser par autoclavage à (121 – 1) °C pendant (20 – 1) min. Conserver à température ambiante
jusqu'à usage.
7  Appareillage
Équipement courant de laboratoire et
7.1  Boîtes de Petri stériles, d'un diamètre nominal de 90 mm ou 100 mm.
7.2  Incubateur, pouvant être maintenu à (36 – 1) °C.
7.3  Lampe à ultraviolets, émettant une lumière d'une longueur d'onde de (360 – 20) nm.
7.4  Support de filtre et entonnoir, convenant pour la filtration de volumes d'eau de 500 ml à 10 l.
Les équipements de filtration doivent résister à l'autoclave. Le diamètre des filtres peut varier de 47 mm à 142 mm.
Les appareils de filtration les plus grands sont généralement en acier inoxydable.
7.5  Pompe péristaltique pour filtration sur membrane par pression positive, d'un débit pouvant atteindre
3 l/min, avec variateur de vitesse. Il est également permis d'utiliser un compresseur et un récipient sous pression.
NOTE —  Au lieu d'une filtration par pression positive, des systèmes de filtration sous vide peuvent également être utilisés
pour de petits volumes d'échantillons.
7.6  Membranes filtrantes en nylon ou en polycarbonate, d'un diamètre de 47 mm à 142 mm, avec des pores
de dimension nominale 0,22 mm ou 0,45 mm.
NOTE —  Bien que des membranes des deux dimensions de pores soient utilisées avec succès dans l'isolement des micro-
organismes Legionella, leur efficacité comparée n'est pas connue. Lorsqu'elles sont utilisées, les membranes en polycarbonate
ont des débits plus réduits, ce qui augmente la durée de filtration.
7.7  Tubes en silicone, de diamètres interne et externe comme spécifiés par le fabricant de la pompe
péristaltique (7.5), mais avec une épaisseur des parois d'au moins 1,5 mm.
7.8  Source de chaleur, telle qu'une plaque chauffante ou un brûleur à gaz à couronne.
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7.9  Centrifugeuse, capable d'atteindre (6 000 – 100) g, munie de godets de sécurité.
7.10  Agitateur rotatif, capable d'atteindre au moins (200 – 5) r/min.
7.11  , adapté à une utilisation avec des échantillons d'eau de 25 ml au maximum.
Bain d'eau à ultrasons
7.12  Bain d'eau, pouvant être maintenu à (50 – 1) °C.
7.13  Verrerie.
Stériliser toute la verrerie soit à (170 – 5) °C pendant 1 h dans un four ou à (121 – 1) °C pendant 20 min à
l'autoclave.
7.14  Microscopes.
7.14.1  Microscope équipé pour la fluorescence.
Microscope binoculaire équipé d'un éclairage fluorescent incident. La fente d'éclairage doit être constituée de
diaphragmes de champ et d'ouverture, d'un dispositif d'arrêt de la lumière excitatrice, de miroirs diviseurs
dichroïques, d'un filtre de suppression correspondant et d'un support de lampe. Le microscope doit être équipé d'un
objectif à immersion dans l'huile ou l'eau (au moins · 40) et d'oculaires de · 8 ou · 10.
7.14.2  Microscope stéréoscopique pour boîtes, d'un grossissement d'au moins · 30 et d'un éclairage incident
oblique.
8  Échantillonnage
8.1  Récipients d'échantillonnage
Les échantillons d'eau (1 l, en général) doivent être recueillis dans des récipients en verre, en polyéthylène ou
récipients similaires. S'ils ont été utilisés auparavant, ils doivent être nettoyés, rincés à l'eau distillée ou à l'eau du
robinet, avant d'être stérilisés par autoclavage pendant 20 min, à une température de (121 1) °C. Les récipients
–
qui ne résistent pas à l'autoclavage doivent au lieu de cela être pasteurisés à l'eau chaude courante (> 70 °C) ou à
la vapeur pendant une durée d'au moins 5 min. Des récipients stériles de plus petite dimension doivent être utilisés
pour le prélèvement du biofilm, de dépôts ou de sédiments. Les récipients à large ouverture recevant le biofilm, etc.,
doivent être équipés de bouchons à vis.
Il convient que les matériaux composant les récipients d'échantillonnage soient adaptés au contact de l'eau potable.
Le volume des échantillons prélevés dépend de la nature de l'eau et de l'objet de l'examen effectué.
L'accès à certains points d'échantillonnage peut être difficile, ce qui peut entraîner un manque de sûreté dans
l'utilisation des récipients en verre, en raison des risques de casse. L'usage de récipients de sécurité en verre
enveloppés dans du plastique est acceptable.
Les détails relatifs à l'origine et au volume des échantillons ainsi qu'à la présence et à la nature de tout biocide
doivent être enregistrés et transmis au laboratoire avec les échantillons, afin de faciliter l'examen. Pour des raisons
de sécurité et d'analyse, il est déconseillé d'examiner les échantillons d'origine inconnue ou prélevés sur des eaux
de refroidissement ou des eaux de traitement, à moins qu'ils ne soient accompagnés d'informations adéquates.
8.2  Échantillonnage en présence de biocide
Si l'échantillon d'eau contient ou est supposé contenir un biocide oxydant, ajouter un excès d'agent neutralisant
dans le récipient avant ou au moment de l'échantillonnage.
NOTE —  Le chlore, ainsi que d'autres biocides oxydants, sont neutralisés par ajout dans le récipient de thiosulfate de
potassium ou de thiosulfate de sodium. Pour d'autres biocides, l'ajout d'un agent neutralisant universel n'est pas encore
possible.
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Il convient de commencer l'analyse dans les plus brefs délais après réception au laboratoire, de préférence le jour
de l'échantillonnage, notamment pour les échantillons dont on sait qu'ils contiennent des biocides. Il est cependant
reconnu que le transport des échantillons au laboratoire d'analyse peut prendre quelque temps, particulièrement si
les sites d'échantillonnage sont éloignés. Il est par conséquent recommandé que l'intervalle de temps entre le
prélèvement de l'échantillon et sa concentration soit dans l'idéal de 2 jours et n'excède pas 5 jours (voir 9.1.5). Le
laps de temps maximal entre le prélèvement de l'échantillon et la culture du concentré est de 14 jours.
8.3  Transport des échantillons
Il convient de transporter les échantillons à une température comprise entre 6 °C et 18 °C, et de les protéger de la
chaleur et des rayons du soleil. Remettre les échantillons au laboratoire dans les plus brefs délais, de préférence
dans la journée, mais en aucun cas au-delà de 2 jours.
9  Mode opératoire
9.1  Échantillons
9.1.1  Généralités
Les échantillons liquides peuvent être directement mis en culture sur les boîtes (voir 9.2.4) si l’on s’attend à ce que
5
le nombre de Legionella excède 10 par litre. Pour assurer la détection de Legionella en dessous de ce nombre
dans les échantillons liquides, une méthode de concentration est nécessaire. Le nombre de Legionella dans un
échantillon donné n'étant pas connu, les méthodes de concentration sont généralement mises en œuvre.
Afin de concentrer les micro-organismes présents dans les échantillons d'eau, la filtration sur membrane (9.1.2), ou
la centrifugation (9.1.3) sont permises. Pour les dépôts, les sédiments ou le biofilm, diluer et mettre en culture
directement (9.1.4). Les eaux contenant un nombre élevé de bactéries autres que les Legionella peuvent être
diluées au moyen de la solution saline de Page (6.3.2.1) ou de la solution de Ringer (6.3.2.2). Enregistrer les
volumes d'échantillons dilués ou traités.
9.1.2  Filtration sur membrane par pression positive des échantillons d'eau
Assembler les tubes (7.7) et le support de filtre (7.4) et insérer la membrane (7.6) dans le support si la membrane
filtrante n'a pas été préstérilisée.
Stériliser à l'autoclave le support de filtre avec la membrane en place (voir, par exemple l'ISO 8199).
Dans des conditions d'asepsie, placer la membrane stérile dans le dispositif de filtration si elle n'y était pas
positionnée auparavant. Filtrer l'eau par pression au travers d'une membrane filtrante (7.6.1), placée sur le support
de filtre (7.4), en utilisant la pompe péristaltique (7.5). Si l'échantillon est trouble ou coloré, préférer la méthode de
centrifugation (9.1.3) à la méthode de filtration.
NOTE 1  Il convient de régler le débit de façon à ne pas dépasser la valeur maximale spécifiée par le fabricant pour la taille ou
le type du filtre.
NOTE 2  Pour de petits volumes (< 200 ml), des systèmes de filtration sous vide peuvent être utilisés selon l'ISO 8199.
Après filtration, sectionner, à l'aide de ciseaux stériles, la languette de la membrane de nylon dépassant du support
de filtre. Retirer soigneusement la membrane du support à l'aide de pinces stériles, de façon à éviter la perte de
dépôt résiduel et la placer directement dans un récipient stérile à bouchon à vis. Afin de détacher les micro-
organismes de la membrane, ajouter 5 ml à 25 ml de diluant stérile (6.3.2.1, 6.3.2.2), de filtrat de l'échantillon ou
d'eau distillée stérile, et agiter vigoureusement pendant au moins 2 min. Ce concentré est représentatif de
l'échantillon préparé. Afin de faciliter l'élution, les filtres peuvent être coupés en plusieurs morceaux à l'aide de
ciseaux stériles.
Il est également possible de placer le récipient dans une cuve à ultrasons pendant 2 min à 10 min. Traiter chaque
échantillon séparément et s'assurer que le niveau de diluant couvrant la membrane est inférieur au niveau de l'eau
contenue dans la cuve à ultrasons.
NOTE 3  Afin d'assurer une récupération optimale, il est recommandé d'utiliser une souche de L. pneumophila pour optimiser
la durée d'immersion dans les différentes cuves à ultrasons. Voir également l'annexe A.
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9.1.3  Centrifugation des échantillons d'eau
Agiter l'échantillon pour remettre en suspension les dépôts éventuels, puis verser (200 – 5) ml de chaque
échantillon dans des bouteilles de centrifugation stériles à bouchon à vis, d'une capacité comprise entre 300 ml et
500 ml. Centrifuger les bouteilles à 6 000 g pendant 10 min ou à 3 000 g pendant 30 min en maintenant la
température entre 15 °C et 25 °C. Retirer le surnageant en opérant de fa
...