ISO 9308-1:2014

DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/DIS 9308-1
ISO/TC 147/SC 4 Secretariat: DIN
Voting begins on Voting terminates on

2012-11-22 2013-04-22
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION  •  МЕЖДУНАРОДНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ  •  ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION

Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform
bacteria —
Part 1:
Membrane filtration method for waters with low bacterial
background flora
Qualité de l'eau — Dénombrement des Escherichia coli et des bactéries coliformes —
Partie 1: Méthode par filtration sur membrane dans des eaux contenant peu de flore bactérienne de fond
[Revision of first edition (ISO 9308-1:2000) and ISO 9308-1:2000/Cor.1:2007]
ICS 07.100.20
ISO/CEN PARALLEL PROCESSING
This draft has been developed within the International Organization for Standardization (ISO), and
processed under the ISO-lead mode of collaboration as defined in the Vienna Agreement.
This draft is hereby submitted to the ISO member bodies and to the CEN member bodies for a parallel
five-month enquiry.
Should this draft be accepted, a final draft, established on the basis of comments received, will be
submitted to a parallel two-month approval vote in ISO and formal vote in CEN.

To expedite distribution, this document is circulated as received from the committee
secretariat. ISO Central Secretariat work of editing and text composition will be undertaken at
publication stage.
Pour accélérer la distribution, le présent document est distribué tel qu'il est parvenu du
secrétariat du comité. Le travail de rédaction et de composition de texte sera effectué au
Secrétariat central de l'ISO au stade de publication.

THIS DOCUMENT IS A DRAFT CIRCULATED FOR COMMENT AND APPROVAL. IT IS THEREFORE SUBJECT TO CHANGE AND MAY NOT BE
REFERRED TO AS AN INTERNATIONAL STANDARD UNTIL PUBLISHED AS SUCH.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL, TECHNOLOGICAL, COMMERCIAL AND USER PURPOSES, DRAFT
INTERNATIONAL STANDARDS MAY ON OCCASION HAVE TO BE CONSIDERED IN THE LIGHT OF THEIR POTENTIAL TO BECOME STANDARDS TO
WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN NATIONAL REGULATIONS.
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED TO SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS, NOTIFICATION OF ANY RELEVANT PATENT RIGHTS OF WHICH
THEY ARE AWARE AND TO PROVIDE SUPPORTING DOCUMENTATION.
©  International Organization for Standardization, 2012

ISO/DIS 9308-1
Copyright notice
This ISO document is a Draft International Standard and is copyright-protected by ISO. Except as permitted
under the applicable laws of the user’s country, neither this ISO draft nor any extract from it may be
reproduced, stored in a retrieval system or transmitted in any form or by any means, electronic,
photocopying, recording or otherwise, without prior written permission being secured.
Requests for permission to reproduce should be addressed to either ISO at the address below or ISO’s
member body in the country of the requester.
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Violators may be prosecuted.
ii © ISO 2012 – All rights reserved

ISO/DIS 9308-1
Contents Page
Foreword . iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 Principle. 2
5 Apparatus and glassware . 2
6 Culture media and reagents . 3
7 Sampling. 3
8 Procedure . 3
9 Expression of results . 4
10 Test report . 4
11 Quality assurance . 4
Annex A (informative) Further microbiological information on coliform bacteria . 6
Annex B (normative) Culture media and reagents . 7
Bibliography . 10

ISO/DIS 9308-1
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 9308-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,
Microbiological methods.
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 9308-1:2000), which has been technically
revised, and the Technical Corrigendum ISO 9308-1:2000/Cor.1:2007.
ISO 9308 consists of the following parts, under the general title Water quality — Enumeration of Escherichia
coli and coliform bacteria:
 Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora
 Part 2: Most probable number method
 Part 3: Miniaturized method (Most Probable Number) by inoculation in liquid medium

iv © ISO 2012 – All rights reserved

ISO/DIS 9308-1
Introduction
The presence and extent of faecal pollution is an important factor in assessing the quality of a body of water
and the risk to human health from infection. Examination of water samples for the presence of Escherichia coli
(E. coli), which normally inhabits the bowel of man and other warm-blooded animals, provides an indication of
such pollution. Examination for coliform bacteria can be more difficult to interpret because some coliform
bacteria live in soil and surface fresh water and are not always intestinal. Therefore, the presence of coliform
bacteria, although not a proof of faecal contamination, may indicate failure in treatment or distribution.

DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/DIS 9308-1

Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform
bacteria — Part 1: Membrane filtration method for waters with
low bacterial background flora
WARNING – Persons using this part of ISO 9308 should be familiar with normal laboratory practice.
This standard does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its use. It
is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to ensure
compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT – It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this part of ISO 9308 be
carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This part of ISO 9308 specifies a method for the enumeration of E. coli and coliform bacteria. The method is
based on membrane filtration, subsequent culture on a chromogenic agar medium and calculation of the
number of target organisms in the sample. Due to the low selectivity of the differential agar medium,
background growth can interfere with the reliable enumeration of coliform bacteria and E. coli, for example in
surface waters or shallow well waters. This method is not suitable for these types of water.
This part of ISO 9308 is especially suitable for waters with low bacterial numbers that will cause less than 80
total colonies on chromogenic coliform agar. These may be drinking water, disinfected pool water or finished
water from treatment plants.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 5667-1, Water quality — Sampling — Part 1: Guidance on the design of sampling programmes and
sampling techniques
ISO 5667-3, Water quality — Sampling — Part 3: Guidance on the preservation and handling of water
samples
ISO 7704, Water quality — Validation of membrane filters for microbiological analysis
ISO 8199, Water quality — General guide to the enumeration of micro-organisms by culture
ISO 11133, Microbiology of food, animal feeding stuffs, food production environment and water —
Preparation, production, storage and performance testing of culture media
ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis
ISO/DIS 9308-1
3 Terms and definitions
For the purpose of this document, the definitions given in ISO/IEC Guide 2 and the following apply.
3.1
coliform bacteria
members of the Enterobacteriaceae that express ß-galactosidase
3.2
Escherichia coli
member of the Enterobacteriaceae that expresses ß-galactosidase and ß-glucuronidase
4 Principle
Filtration of a test portion of the sample through a membrane composed of cellulose esters or equivalent,
which retains the organisms; placing of the membrane on a chromogenic agar plate.
Incubation of the membrane for (21 ± 3) h at (36 ± 2) °C.
Counting of ß-galactosidase positive colonies (salmon to red) as presumptive coliforms that are not E. coli. To
avoid false-positive results, caused by oxidase positive bacteria like Aeromonas spp, the presumptive colonies
shall be confirmed by a negative oxidase reaction.
Counting of ß-galactosidase and ß-glucuronidase positive colonies (dark-blue to violet) as E. coli.
Total coliforms are the sum of oxidase negative colonies with salmon to red colour and all dark-blue to violet
colonies.
5 Apparatus and glassware
Usual microbiological laboratory equipment, and in particular:
5.1 Apparatus for sterilization by steam (autoclave)
Apparatus and glassware not supplied sterile shall be sterilized according to the instructions given in
ISO 8199.
5.2 Incubator, thermostatically controlled at (36 ± 2) °C.
5.3 pH meter, with an accuracy of ± 0,1 at 20 °C to 25 °C.
5.4 Equipment for membrane filtration, as specified in ISO 8199.
5.5 Membrane filters, composed of cellulose esters, usually about 47 mm or 50 mm in diameter, with
filtration characteristics equivalent to a rated nominal pore diameter of 0,45 µm and, preferentially, with grids.
The filters shall be free from growth-inhibiting or growth-promoting properties and the printing ink used for the
grid shall not affect the growth of bacteria. If not obtained sterile, they shall be sterilized according to the
manufacturer's instructions. Every batch of membranes shall be tested for its suitability for the test according
to ISO 7704 especially since the use of different brands of filters may result in different recovery and colour
development.
5.6 Forceps with rounded tips for handling membranes
2 © ISO 2012 – All rights reserved

ISO/DIS 9308-1
6 Culture media and reagents
For the preparation of culture media and reagents, use ingredients of uniform quality and chemicals of
analytical grade (see note); follow the instructions given in Annex B. Alternatively, use commercially available
media and reagents which comply with the compositions given in Annex B and follow strictly the
manufacturer's instructions.
NOTE The use of chemicals of other grades is possible providing they are shown to be of equal performance in the
test.
For preparation of culture media, use glass-distilled water or deionized water free from substances which
might inhibit bacterial growth under the conditions of the test, and which is in accordance with ISO 3696.
Unless specified otherwise, the prepared media are stable for at least one month if stored in the dark at
(5 ± 3) °C and protected against evaporation.
7 Sampling
Take the samples and deliver them to the laboratory in accordance with ISO 19458.
8 Procedure
8.1 Preparation of the sample
For preparation of the sample, filtration and inoculation on isolation media, follow the instructions given in
ISO 8199. Samples have to
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 9308-1
Troisième édition
2014-09-15
Qualité de l’eau — Dénombrement
des Escherichia coli et des bactéries
coliformes —
Partie 1:
Méthode par filtration sur membrane
pour les eaux à faible teneur en
bactéries
Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform
bacteria —
Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial
background flora
Numéro de référence
©
ISO 2014
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2014
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2014 – Tous droits réservés

Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 2
5 Appareillage et verrerie . 2
6 Milieux de culture et réactifs . 3
7 Échantillonnage . 3
8 Mode opératoire. 3
8.1 Préparation de l’échantillon . 3
8.2 Filtration . 3
8.3 Incubation et différenciation . 3
9 Expression des résultats. 4
10 Rapport d’essai . 4
11 Assurance qualité . 4
11.1 Généralités . 4
11.2 Essais de performance de la gélose chromogène pour bactéries coliformes (CCA) . 4
11.3 Essais de performance de l’essai de recherche de l’oxydase . 5
Annexe A (informative) Informations microbiologiques complémentaires sur les
bactéries coliformes . 6
Annexe B (normative) Composition et préparation des milieux de culture et réactifs .7
Annexe C (informative) Caractéristiques de performance . 9
Bibliographie .10
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de
la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’OMC concernant
les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos — Informations
supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité
SC 4, Méthodes microbiologiques.
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 9308-1:2000), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Elle comprend également le rectificatif ISO 9308-1:2000/Cor.1:2007.
L’ISO 9308 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l’eau —
Dénombrement des Escherichia coli et des bactéries coliformes:
— Partie 1: Méthode par filtration sur membrane pour les eaux à faible teneur en bactéries
— Partie 2: Méthode du nombre le plus probable
— Partie 3: Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) pour la recherche et le dénombrement des
E. coli dans les eaux de surface et les eaux résiduaires
iv © ISO 2014 – Tous droits réservés

Introduction
La présence et l’étendue de la pollution fécale est un facteur important dans l’évaluation de la qualité
de l’eau ainsi que du risque infectieux représenté pour la santé humaine. L’examen d’échantillons d’eau
pour y rechercher des Escherichia coli (E. coli), normalement présents dans les intestins de l’homme et
des animaux homéothermes, fournit une indication sur ce type de pollution. Les résultats de l’examen
des bactéries coliformes peuvent s’avérer plus difficiles à interpréter en raison du fait que certains
coliformes vivent également dans le sol et dans les eaux douces de surface, et ne sont donc pas toujours
d’origine intestinale. La présence de bactéries coliformes peut donc, bien que ce ne soit pas la preuve
d’une contamination d’origine fécale, indiquer une défaillance du traitement, du stockage ou de la
distribution de l’eau.
NORME INTERNATIONALE ISO 9308-1:2014(F)
Qualité de l’eau — Dénombrement des Escherichia coli et
des bactéries coliformes —
Partie 1:
Méthode par filtration sur membrane pour les eaux à
faible teneur en bactéries
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les pratiques
courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter de tous les problèmes
de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur d’établir des
pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité et de s’assurer de la conformité à la
réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est indispensable que les essais menés selon le présent document soient
effectués par un personnel adéquatement qualifié.
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 9308 spécifie une méthode de dénombrement des Escherichia coli (E. coli) et des
bactéries coliformes. La méthode consiste en une filtration sur membrane, suivie d’une mise en culture
dans une gélose chromogène et d’un calcul du nombre des organismes cibles présents dans l’échantillon.
La gélose de différenciation étant peu sélective, la flore bactérienne générale peut perturber la fiabilité
du dénombrement des E. coli et des bactéries coliformes, par exemple, dans certaines eaux de surface ou
certaines eaux de puits peu profonds. Cette méthode ne convient pas à ces types d’eau.
La présente partie de l’ISO 9308 est particulièrement adaptée aux eaux à faible teneur en bactéries
qui produiront moins de 100 colonies totales sur de la gélose chromogène pour le dénombrement des
bactéries coliformes. Ces eaux peuvent être l’eau potable, l’eau de piscine désinfectée ou l’eau propre
sortant de stations de production d’eau potable.
Certaines souches d’E. coli négatives à la β-D-glucuronidase, telles qu’Escherichia coli O157, ne sont pas
détectées en tant qu’E. coli. Comme elles sont positives à la β-D-galactosidase, elles sont considérées
comme des bactéries coliformes sur la gélose chromogène pour bactéries coliformes (CCA).
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
ISO 7704, Qualité de l’eau — Évaluation des membranes filtrantes utilisées pour des analyses microbiologiques
ISO 8199, Qualité de l’eau — Lignes directrices générales pour le dénombrement des micro-organismes sur
milieu de culture
ISO 11133, Microbiologie des aliments et de l’eau — Préparation, production, stockage et essais de
performance des milieux de culture
ISO 19458, Qualité de l’eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les définitions suivantes et celles données dans l’ISO/IEC Guide 2
s’appliquent.
3.1
bactéries coliformes
membres de la famille des Entérobactéries qui expriment la β-D-galactosidase
3.2
Escherichia coli
E. coli
membre de la famille des Entérobactéries qui exprime la β-D-galactosidase et la β-D-glucuronidase
4 Principe
Filtration d’une prise d’essai de l’échantillon sur une membrane filtrante, qui retient les organismes, et
placement de la membrane filtrante dans une boîte de gélose chromogène coliforme.
Incubation de la membrane filtrante à (36 ± 2) °C pendant (21 ± 3) h.
Comptage des colonies positives pour la β-D-galactosidase (couleur rose à rouge) en tant que bactéries
coliformes présomptives qui ne sont pas des E. coli. Pour éviter les résultats faux-positifs, provoqués par
les bactéries positives à l’oxydase, par exemple Aeromonas spp, les colonies présomptives doivent être
confirmées par une réaction négative à l’oxydase.
Comptage des colonies positives pour la β-D-galactosidase et la β-D-glucuronidase (couleur bleu foncé à
violet) en tant qu’E. coli.
Les bactéries coliformes totales sont la somme des colonies négatives à l’oxydase de couleur rose à rouge
et de toutes les colonies de couleur bleu foncé à violet.
5 Appareillage et verrerie
Matériel de laboratoire de microbiologie habituel, et en particulier:
5.1 Appareil adapté pour la stérilisation à la vapeur (autoclave), conformément aux instructions
de l’ISO 8199.
5.2 Incubateur, contrôlé par thermostat à (36 ± 2) °C.
5.3 pH-mètre, avec une exactitude de ± 0,1 unité entre 20 °C et 25 °C.
5.4 Appareil de filtration sur membrane.
5.5 Membranes filtrantes, composées d’esters de cellulos
...

PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 9308-1
ISO/TC 147/SC 4 Secrétariat: DIN
Début de vote Vote clos le
2012-11-22 2013-04-22
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION    МЕЖДУНАРОДНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ    ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION

Qualité de l'eau — Dénombrement des Escherichia coli et des
bactéries coliformes —
Partie 1:
Méthode par filtration sur membrane dans des eaux contenant
peu de flore bactérienne de fond
Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria —
Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora
[Révision de la première édition (ISO 9308-1:2000) et de l'ISO 9308-1:2000/Cor.1:2007]
ICS 07.100.20
TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
Le présent projet a été élaboré dans le cadre de l'Organisation internationale de normalisation (ISO) et
soumis selon le mode de collaboration sous la direction de l'ISO, tel que défini dans l'Accord de
Vienne.
Le projet est par conséquent soumis en parallèle aux comités membres de l'ISO et aux comités
membres du CEN pour enquête de cinq mois.
En cas d'acceptation de ce projet, un projet final, établi sur la base des observations reçues, sera
soumis en parallèle à un vote d'approbation de deux mois au sein de l'ISO et à un vote formel au sein
du CEN.
Pour accélérer la distribution, le présent document est distribué tel qu'il est parvenu du
secrétariat du comité. Le travail de rédaction et de composition de texte sera effectué au
Secrétariat central de l'ISO au stade de publication.
To expedite distribution, this document is circulated as received from the committee
secretariat. ISO Central Secretariat work of editing and text composition will be undertaken at
publication stage.
CE DOCUMENT EST UN PROJET DIFFUSÉ POUR OBSERVATIONS ET APPROBATION. IL EST DONC SUSCEPTIBLE DE MODIFICATION ET NE
PEUT ETRE CITE COMME NORME INTERNATIONALE AVANT SA PUBLICATION EN TANT QUE TELLE.
OUTRE LE FAIT D'ETRE EXAMINES POUR ETABLIR S'ILS SONT ACCEPTABLES A DES FINS INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET
COMMERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ETRE
CONSIDERES DU POINT DE VUE DE LEUR POSSIBILITE DE DEVENIR DES NORMES POUVANT SERVIR DE REFERENCE DANS LA
REGLEMENTATION NATIONALE.
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSERVATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE.
©  Organisation Internationale de Normalisation, 2012

ISO/DIS 9308-1
Notice de droit d'auteur
Ce document de l'ISO est un projet de Norme internationale qui est protégé par les droits d'auteur de l'ISO.
Sauf autorisé par les lois en matière de droits d'auteur du pays utilisateur, aucune partie de ce projet ISO ne
peut être reproduite, enregistrée dans un système d'extraction ou transmise sous quelque forme que ce soit
et par aucun procédé électronique ou mécanique, y compris la photocopie, les enregistrements ou autres,
sans autorisation écrite préalable.
Les demandes d'autorisation de reproduction doivent être envoyées à l'ISO à l'adresse ci-après ou au
comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
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Toute reproduction est soumise au paiement de droits ou à un contrat de licence.
Les contrevenants pourront être poursuivis.

ii © ISO 2012 – Tous droits réservés

ISO/DIS 9308-1
Sommaire Page
Avant-propos . iv
Introduction . v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 2
5 Appareillage et verrerie . 2
6 Milieux de culture et réactifs . 3
7 Échantillonnage . 3
8 Mode opératoire . 3
9 Expression des résultats . 4
10 Rapport d’essai . 4
11 Assurance qualité . 5
Annexe A (informative) Informations microbiologiques complémentaires sur les bactéries
coliformes . 6
Annexe B (normative) Milieux de culture et réactifs . 7
Annexe C (informative) Caractéristiques de performance . 9
Bibliographie . 10

ISO/DIS 9308-1
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 9308-1 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 4,
Méthodes microbiologiques.
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 9308-1:2000), qui a fait l'objet d'une
révision technique, ainsi que le corrigendum technique ISO 9308-1:2000/Cor.1:2007.
L'ISO 9308 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l'eau —
Dénombrement des Escherichia coli et des bactéries coliformes :
⎯ Partie 1 : Méthode par filtration sur membrane pour les eaux à faible teneur en bactéries
⎯ Partie 2 : Méthode du nombre le plus probable
⎯ Partie 3 : Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) pour ensemencement en milieu liquide
iv © ISO 2012 – Tous droits réservés

ISO/DIS 9308-1
Introduction
La présence et l'étendue de la pollution fécale est un facteur important dans l'évaluation de la qualité d'une
masse d'eau ainsi que du risque infectieux représenté pour la santé humaine. L'examen d'échantillons d'eau
pour y rechercher des Escherichia coli (E. coli), normalement présents dans les intestins de l'homme et des
animaux homéothermes, fournit une indication sur ce type de pollution. Les résultats de l'examen des
bactéries coliformes peuvent s'avérer plus difficiles à interpréter en raison du fait que certaines bactéries
coliformes vivent également dans le sol et dans les eaux douces de surface, et ne sont donc pas toujours
d'origine intestinale. La présence de bactéries coliformes peut donc, bien que ce ne soit pas la preuve d’une
contamination d'origine fécale, indiquer une défaillance du traitement ou de la distribution de l'eau.
PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 9308-1

Qualité de l'eau — Dénombrement des Escherichia coli et des
bactéries coliformes — Partie 1: Méthode par filtration sur
membrane pour les eaux à faible teneur en bactéries
AVERTISSEMENT — Il convient que l'utilisateur de la présente partie de l'ISO 9308 connaisse bien les
pratiques courantes de laboratoire. La présente norme n’a pas pour but de traiter de tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur de la
présente norme d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité et de s’assurer
de la conformité à la réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est indispensable que les essais menés selon la présente partie de l'ISO 9308 soient
effectués par un personnel adéquatement qualifié.
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 9308 spécifie une méthode de dénombrement des Escherichia coli et des
bactéries coliformes. La méthode consiste en une filtration sur membrane, suivie d'une mise en culture dans
une gélose chromogène et d'un calcul du nombre des organismes cibles présents dans l'échantillon. La
gélose de différenciation étant peu sélective, la flore bactérienne générale peut perturber la fiabilité du
dénombrement des bactéries coliformes et des E. coli, par exemple, dans certaines eaux de surface ou
certaines eaux de puits peu profonds. Cette méthode ne convient pas à ces types d’eau.
La présente partie de l’ISO 9308 est particulièrement adaptée aux eaux à faible teneur en bactéries qui
produiront moins de 80 colonies totales sur le milieu chromogène pour le dénombrement des bactéries
coliformes. Ces eaux peuvent être l’eau potable, l’eau de piscine désinfectée ou l’eau propre sortant des
usines de traitement.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
ISO 5667-1, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 1 : Lignes directrices pour la conception des
programmes et des techniques d’échantillonnage
ISO 5667-3, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 3 : Lignes directrices pour la conservation et la
manipulation des échantillons d'eau
ISO 7704, Qualité de l'eau — Validation des membranes filtrantes pour l’analyse microbiologique
ISO 8199, Qualité de l'eau — Lignes directrices générales pour le dénombrement des micro-organismes sur
milieu de culture
ISO/DIS 9308-1
ISO 11133, Microbiologie des aliments et de l’eau — Préparation, production, stockage et essais de
performance des milieux de culture
ISO 19458, Qualité de l’eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les définitions suivantes et celles données dans l’ISO/CEI Guide 2
s’appliquent.
3.1
bactéries coliformes
membres de la famille des Entérobactéries qui expriment la ß-galactosidase
3.2
Escherichia coli
membre de la famille des Entérobactéries qui exprime la ß-galactosidase et la ß-glucuronidase
4 Principe
Filtration d’une prise d’essai de l’échantillon sur une membrane constituée d’esters de cellulose ou
équivalents, qui retient les organismes ; placement de la membrane dans une boîte de gélose chromogène.
Incubation de la membrane pendant (21 ± 3) h à (36 ± 2) °C.
Comptage des colonies positives pour la ß-galactosidase (couleur saumon à rouge) en tant que bactéries
coliformes présomptives qui ne sont pas des E. coli. Pour éviter les résultats faux-positifs, provoqués par les
bactéries positives à l’oxydase, telles qu’Aeromonas spp, les colonies présomptives doivent être confirmées
par une réaction négative à l’oxydase.
Comptage des colonies positives pour la ß-galactosidase et la ß-glucuronidase (couleur bleu foncé à violet)
en tant qu’E. coli.
Les bactéries coliformes totales sont la somme des colonies négatives à l’oxydase de couleur saumon à
rouge et de toutes les colonies de couleur bleu foncé à violet.
5 Appareillage et verrerie
Matériel de laboratoire de microbiologie habituel, et en particulier :
5.1 Appareil de stérilisation à la vapeur (autoclave).
Tout appareil ou toute verrerie fourni(e) non stérile doit être stérilisé(e) conformément aux instructions de
l'ISO 8199.
5.2 Incubateur, contrôlé par thermostat à (36 ± 2) °C.
5.3 pH-mètre, avec une exactitude de ± 0,1 unité de 20 °C à 25 °C.
5.4 Appareil de filtration sur membrane, comme spécifié dans l'ISO 8199.
2 © ISO 2012 – Tous droits réservés

ISO/DIS 9308-1
5.5 Membranes filtrantes, composées d'esters de cellulose, généralement d'environ 47 mm ou 50 mm de
diamètre, présentant des caractéristiques de filtration équivalentes à une porosité nominale de 0,45 µm,
munies, de préférence, d’une
...

МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 9308-1
Третье издание
2014-09-15
Качество воды. Подсчет количества
кишечных палочек Escherichia coli и
колиформных бактерий.
Часть 1.
Метод мембранной фильтрации для
воды с низким содержанием
бактериальной флоры
Water quality —Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria —
Part 1:
Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
©
ISO 2014
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предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами ISO. В редких
случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный секретариат по
адресу, приведенному ниже.
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либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без предварительного
письменного согласия ISO, которое должно быть получено после запроса о разрешении, направленного по адресу, приведенному
ниже, или в комитет-член ISO в стране запрашивающей стороны.
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Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2014 – Все права сохраняются

Содержание Страница
Предисловие.iv
Введение .v
1 Область применения.1
2 Нормативные ссылки .1
3 Термины и определения .2
4 Сущность метода.2
5 Приборы и стеклянная посуда.2
6 Культуральные среды и реактивы .3
7 Отбор проб.3
8 Процедура .3
8.1 Подготовка пробы .3
8.2 Фильтрация.3
8.3 Инкубация и дифференциация.3
9 Выражение результатов .4
10 Протокол испытания.4
11 Обеспечение качества .4
11.1 Общие вопросы .4
11.2 Испытание рабочих характеристик хромогенного агара для колиформных бактерий
(CCA) .5
11.3 Испытание рабочих характеристик оксидазного теста.5
Приложение А (информативное) Дополнительная микробиологическая информация о
колиформных бактериях .6
Приложение B (нормативное) Состав и приготовление культуральных сред и реактивов .7
Приложение С (информативное) Рабочие характеристики.9
Библиография .10

Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является Всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов обычно
осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в деятельности,
для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом комитете.
Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие связи с ISO, также
принимают участие в работах. Что касается стандартизации в области электротехники, ISO работает в
тесном сотрудничестве с Международной электротехнической комиссией (IEC).
Процедуры, используемые для разработки этого документа и для его дальнейшего ведения, описаны в
Директивах ISO/IEC, Часть 1. В частности, следует отметить различные критерии, необходимые для
одобрения различных типов документов ISO. Настоящий документ был подготовлен в соответствии с
редакционными правилами, указанными в Директивах ISO/IEC, Часть 2 (see www.iso.org/directives).
Обращается внимание на то, что некоторые элементы данного документа могут быть объектом патентных
прав. ISO не несет ответственности за идентификацию какого-либо одного или всех таких патентных прав.
Детали любых патентных прав, идентифицированных при разработке настоящего документа, будут указаны
во введении и/или в списке патентных заявок, полученных ISO (см. www.iso.org/patents).
Любое фирменное название, используемое в этом документе, указывается только как информация для
удобства пользователей и не является рекомендацией.
Объяснение значения специфических терминов ISO и выражений, относящихся к оценке соответствия, а
также информацию о строгом соблюдении ISO принципов WTO относительно Технических барьеров в
торговле (ТВТ) см. по URL: Foreword - Supplementary information (Предисловие – Дополнительная
информация)
ISO 9308-1 был разработан Техническим Комитетом ISO/TC 147, Качество воды, Подкомитетом SC 4,
Микробиологические методы.
Настоящее третье издание отменяет и заменяет второе издание (ISO 9308-1:2000), которое было
технически пересмотрено.
Оно также включает исправление Corrigendum ISO 9308-1:2000/Cor.1:2007
Международный стандарт ISO 9308, имеющий общее название Качество воды. Подсчет количества
кишечных палочек Escherichia coli и колиформных бактерий, состоит из следующих частей:
⎯ Часть 1. Метод мембранной фильтрации для воды с низким содержанием бактериальной флоры
⎯ Часть 2. Метод наиболее вероятного количества
⎯ Часть 3. Миниатюризированный метод выявления и оценки E. coli в поверхностных и сточных водах
(Метод наиболее вероятного количества (МНВК).
iv © ISO 2014 – Все права сохраняются

Введение
Наличие и степень фекальных загрязнений является важным фактором в оценке качества воды и риска
инфекционных заболеваний для человека. В результате анализа водных проб на присутствие кишечной
палочки Escherichia coli (E. coli), которая обычно обитает в кишечнике человека и других теплокровных
животных, получают показатель такого загрязнения. Анализ на присутствие колиформных бактерий
вызывает больше трудностей для интерпретации, так как некоторые колиформные бактерии живут в почве
и поверхностных пресных водах и не всегда имеют кишечное происхождение. Поэтому присутствие
колиформных бактерий, хотя и не является доказательством фекального загрязнения, может указывать на
нарушения обработки, хранения или распределения.

МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 9308-1:2014(R)

Качество воды. Подсчет количества кишечных палочек
Escherichia coli и колиформных бактерий.
Часть 1.
Метод мембранной фильтрации для воды с низким
содержанием бактериальной флоры
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Лица, использующие этот международный стандарт, должны быть знакомы с
нормальной лабораторной практикой. В настоящем международном стандарте не
предусматривается рассмотрение всех проблем безопасности, если таковые имеются, связанных с
его использованием. Пользователь сам должен установить надлежащие нормативы по технике
безопасности и защите здоровья и обеспечить их соответствие условиям национального
регулирования.
ВАЖНО — Необходимо, чтобы испытания согласно этому документу проводились соответственно
обученным персоналом.
1 Область применения
В данной части ISO 9308 устанавливается метод для подсчета кишечных палочек Escherichia coli (E. coli) и
колиформных бактерий. Метод основан на мембранной фильтрации, последующем культивировании на
хромогенной агаровой среде для колиформных бактерий и подсчете числа целевых организмов в пробе.
Из-за низкой селективности дифференциальной агаровой среды фоновый рост может отрицательно влиять
на надежный подсчет E. coli и колиформных бактерий, например, в поверхностных водах или неглубоких
колодцах. Для этих типов воды настоящий метод не годится.
Настоящая часть ISO 9308 главным образом применима для типов воды с низким микробным числом,
обуславливающим образование менее 100 общего числа колоний на хромогенном агаре для колиформных
бактерий (CCA). Это может быть питьевая вода, дезинфицированная вода бассейнов или обработанная
питьевая вода из водоочистных станций.
Некоторые штаммы E. coli, являющиеся β-D-глюкуронидазоотрицательными, такие как Escherichia
coli O157, не будут обнаруживаться как E. coli. Они относятся к β-D-галактосидазоположительным штаммам
и проявляются как колиформные бактерии на этом хромогенном агаре.
2 Нормативные ссылки
ISO 3696, Вода, предназначенная для использования в аналитических лабораторных целях. Технические
требования и методы испытаний
ISO 7704, Качество воды. Оценка мембранных фильтров, используемых для микробиологических анализов
ISO 8199, Качество воды. Общее руководство по подсчету микроорганизмов, выращенных методом
посева на питательной среде
ISO 11133, Микробиология пищевых продуктов, кормов для животных и воды. Приготовление,
производство, хранение и испытания для определения рабочих характеристик питательных сред
ISO 19458, Качество воды. Обор проб для микробиологического анализа
3 Термины и определения
Применительно к настоящему документу используются определения, данные в руководящих указаниях
ISO/IEC Guide 2, и следующие.
3.1
колиформные бактерии
coliform bacteria
представители семейства энтеробактерий (Enterobacteriaceae), которые активируют β-D-галактосидазу
3.2
кишечные палочки Escherichia coli
Escherichia coli
E. coli
представители семейства энтеробактерий (Enterobacteriaceae), которые активируют β-D-галактосидазу и β-
D-глюкуронидазу
4 Сущность метода
Фильтрация испытательного образца через мембранный фильтр, который удерживает организмы, и
помещение мембранного фильтра на пластинку хромогенного агара для колиформных бактерий.
Инкубация мембранного фильтра при (36 ± 2) °C в течение (21 ± 3) ч.
Подсчет β-D-галактосидазопозитивных колоний (от розовых до красных) как презумптивных колиформных
бактерий, которые не являются E. coli. Для избежания ложноположительных результатов, обусловленных
оксидазопозитивными бактериями, например, Aeromonas spp, презумптивные колонии должны быть
подтверждены отрицательной реакцией на оксидазу.
Подсчет β-D-галактосидазо- и β-D-глюкуронидазопозитивных колоний (от темно-синих до фиолетовых) как
E. coli.
Общее количество колиформных бактерий является суммой оксидазонегативных колоний от розовых до
красных и всех колоний от темно-синего до фиолетового цвета
5 Приборы и стеклянная посуда
Ниже приводится обычное микробиологическое лабораторное оборудование.
5.1 Аппарат для паровой стерилизации (автоклав), соответствующий инструкциям, указанным в ISO
8199.
5.2 Инкубатор, с термостатическим регулированием при (36 ± 2) °C.
5.3 pH метр, с точностью ±0,1 при 20 °C до 25 °C.
5.4 Оборудование для мембранной фильтрации.
5.5 Мембранные фильтры, изготовленные из эфиров целлюлозы или другого подходящего материала,
диаметром обычно около 47 мм или 50 мм, с характеристиками фильтрации, соответствующими
номинальному диаметру пор 0,45 мкм, и, предпочтительно, с нанесенной сеткой.
Мембранные фильтры не должны обладать свойствами, ингибирующими или стимулирующими рост
микроорганизмов, и чернила, используемые для нанесения сетки, не должны оказывать влияние на рост
бактерий. Если мембранные фильтры поставляются нестерильными, их следует стерилизовать согласно
инструкциям изготовителя. Каждая партия мембранных фильтров до
...