ISO 9308-2:1990

SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 9308-2:1998
01-februar-1998
.DNRYRVWYRGH8JRWDYOMDQMHSULVRWQRVWLLQãWHYLODNROLIRUPQLKRUJDQL]PRY
WHUPRWROHUDQWQLKNROLIRUPQLKRUJDQL]PRYLQYHUMHWQH(VFKHULFKLDFROLGHO
0HWRGD]YHþHSUXYHWDPLQDMEROMYHUMHWQRãWHYLOR
Water quality -- Detection and enumeration of coliform organisms, thermotolerant
coliform organisms and presumptive Escherichia coli -- Part 2: Multiple tube (most
probable number) method
Qualité de l'eau -- Recherche et dénombrement des organismes coliformes, des
organismes coliformes thermotolérants et des Escherichia coli présumés -- Partie 2:
Méthode du nombre le plus probable
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 9308-2:1990
ICS:
07.100.20 Mikrobiologija vode Microbiology of water
SIST ISO 9308-2:1998 en
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.

---------------------- Page: 1 ----------------------

SIST ISO 9308-2:1998

---------------------- Page: 2 ----------------------

SIST ISO 9308-2:1998
IS0
INTERNATIONAL
STANDARD 9308-2
First edition
1990-l O-01
Water quality - Detection and enumeration of
coliform organisms, thermotolerant coliform
organisms and presumptive Escherichia co/i -
Part 2:
Multiple tube (most probable number) method
QuaW de I’eau - Recherche et dgnombrement des organismes
coliformes, des organismes coliformes thermotolkrants et des
Escherichia coli pr&um@s -
Partie 2: Metbode du nombre le plus probable
Reference number
IS0 9308-2: 1990(E)

---------------------- Page: 3 ----------------------

SIST ISO 9308-2:1998
IS0 9308-2:1990(E)
Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (IS0 member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through IS0
technical committees. Each member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the
work. IS0 collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an Interna-
tional Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies
casting a vote.
International Standard IS0 9308-2 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 147, Water quality.
IS0 9308 consists of the following parts, under the general title Water
quality - Detection and enumeration of coliform organisms,
thermotolerant coliform organisms and presumptive Escherichia coli:
- Part 1: Membrane filtration method
- Part 2: Multiple tube (most probable number) method
Annexes A and B of this part of IS0 9308 are for information only.
0 IS0 1990
All rights reserved. No part of this publication may be reproduced or utilized in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without
permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case Postaie 56 l CH-1211 Geneve 20 l Switzerland
Printed in Switzerland
ii

---------------------- Page: 4 ----------------------

SIST ISO 9308-2:1998
IS0 9308-2:1990(E)
Introduction
The presence and extent of faecal pollution is an important factor in
assessing the quality of a body of water. Examination of water samples
for the presence of members of the coliform group of organismsl), which
normally inhabit the bowel of man and other warm-blooded animals,
provides an indication of such pollution. As the ability of some members
of the coliform group of organism to survive in water is limited, their
numbers can also be used to estimate the degree of recent faecal pol-
lution.
for furth er microbi
See annex A ological information relevant to water ex-
1)
coli form
ami nation for the group of 0 lrganism S.
. . .
III

---------------------- Page: 5 ----------------------

SIST ISO 9308-2:1998
This page intentionally left blank

---------------------- Page: 6 ----------------------

SIST ISO 9308-2:1998
INTERNATIONAL STANDARD IS0 9308=2:1990(E)
Water quality - Detection and enumeration of coliform
organisms, thermotolerant coliform organisms and
presumptive Escherichia co/i -
Part 2:
Multiple tube (most probable number) method
IS0 3696:1987, Water for analytical laboratory use -
1 Scope
Specification and test methods.
This part of IS0 9308 specifies a method for the de-
IS0 5667-l :1980, Water quality - Sampling -
tection and enumeration in water of coliform
Fart 1: Guidance on the design of sampling pro-
organisms, thermotolerant coliform organisms and
grammes.
presumptive Escherichia co/i (presumptive E. co/i)
by culture in a liquid medium in multiple tubes and
IS0 5667-2:1982, Water quality - Sampling -
calculation of their most probable numbers in the
Part 2: Guidance on sampling techniques.
sample.
IS0 5667-3:1985, Water quality - Sampling -
This method can be applied to all types of water,
Part 3: Guidance on the preservation and handling
including those containing an appreciable amount
of samples.
of suspended matter.
The choice of tests used in the detection and confir-
IS0 6887:1983, Microbiology - General guidance for
mation of the coliform group of organisms, including
the preparation of dilutions for microbiological ex-
E. co/i, can be regarded as part of a continuous se-
amina tion.
quence. The extent of confirmation with a particular
sample depends partly on the nature of the water
IS0 8199:1988, Water qualify - General guide to the
and partly on the reasons for the examination. In
enumeration of micro-organisms by culture.
practice, the detection in water of presumptive
E. coli as defined in 3.3 of this part of IS0 9308,
usually provides an indication of recent faecal pol-
lution.
3 Definitions
For the purposes of this part of IS0 9308, the follow-
2 Normative references
ing definitions apply.
The following standards contain provisions which,
3.1 coliform organisms: Organisms capable of
through reference in this text, constitute provisions
aerobic growth at either 35 “C + 0,5 “C or
of this part of IS0 9308. At the time of publication,
37 “C + 0,5 “C in a liquid lactose culture medium
the editions indicated were valid. All standards are
with theproduction of acid and gas within 48 h.
subject to revision, and parties to agreements based
on this part of IS0 9308 are encouraged to investi-
gate the possibility of applying the most recent edi- 3.2 thermotolerant coliform organisms: Coliform
organisms as described in 3.1 which have the same
tions of the standards indicated below. Members of
fermentative properties within 24 h, at either
IEC and IS0 maintain registers of currently valid
44 “C + 0,25 “C or 44,5 “C + 0,25 “C.
International Standards. - -

---------------------- Page: 7 ----------------------

SIST ISO 9308-2:1998
IS0 9308=2:1990(E)
3.3 presumptive Escherichia co/i (presumptive 5.3.1 Lactose broth
E. a=oli): Thermotolerant coliform organisms as de-
scribed in 3.2 which also produce indole from
5.3.2 MacConkey broth
tryptophan within 24 h, at either 44 “C + 0,25 “C
-
or 44,5 “C + 0,25 “C.
-
5.3.3 Improved formate lactose glutamate
medium2)
4 Principle
53.4 Lauryl tryptose (lactose) broth
Inoculation of test portions of the sample, diluted or
undiluted, into a series of tubes of a selective liquid
5.4 Confirmatory media
culture medium containing lactose.
Use one or more of the following.
Examination of the tubes after 24 h and 48 h incu-
bation at either 35 “C or 37 “C; subculture from each
54.1 Media for gas production
tube showing turbidity with gas production into a
more selective confirmatory medium and, when
5.4.1 .I Brilliant-green lactose (bile) broth
presumptive E. co/i is sought, to a medium in which
the formation of indole can be demonstrated.
5.4.1.2 EC medium
Incubation of these confirmatory media for up to
48 h at either 35 “C or 37 “C for the detection of
5.4.2 Medium for lndole production
coliform organisms, and at 44 “C for up to 24 h for
thermotolerant coliform organisms and presumptive
Tryptone water.
E. co/i.
5.4.3 Single-tube medium for both gas and indole
By means of statistical tables, calculation of the
production
most probable numbers (MPN) of coliform
organisms, thermotolerant coliform organisms and
Lauryl tryptose mannitol broth with tryptophan.
presumptive E. co/i likely to be present in 100 ml of
the sample, from the number of tubes giving positive
confirmatory results.
5.5 Reagents
55.1 Kovacs’ reagent for indole
5 Diluent, culture media and reagents
5.5.2 Oxidase reagent for the oxidase test
5.1 Basic materials
Use ingredients of uniform quality and chemicals of
6 Apparatus
analytical grade for the preparation of culture media
and reagents and follow the instructions given in
Usual microbiological laboratory equipment, includ-
annex B. For information on storage see IS0 8199.
ing
Alternatively, use dehydrated complete media and
follow strictly the manufacturer’s instructions.
6.1 Hot-air oven for dry-heat sterilization and an
use glass-distilled autoclave.
For the preparation of media,
water or de-ionized water free from substances
Apart from apparatus supplied sterile, glassware
which might inhibit bacterial growth under the con-
and other equipment shall be sterilized according to
ditions of the test, and in accordance with IS0 3696.
the instructions given in IS0 8199.
5.2 Diluent
6.2 Incubator or water bath, thermostatically
controlled at either 35 “C + 0,5 “C or
-
For making sample dilutions, use one of the diluents
37 “C + 0,5 “C.
-
recommended in annex B . Prepare the diluent ac-
cording to the instructions given in annex B.
6.3 Incubator or water bath, thermostatically
controlled at either 44 “C + 0,25 “C or
-
5.3 Isolation media
44,5 “C + 0,25 “C.
-
Use one of the following culture media. Instructions
6.4 pH meter.
for preparing the media are given in annex A.
2) Available commercially in dehydrated form as “Minerals modified glutamate medium”. This information is given for the
convenience of users of this part of IS0 9308 and does not constitue an endorsement by IS0 of this product.
2

---------------------- Page: 8 ----------------------

SIST ISO 9308-2:1998
IS0 9308-2:1990(E)
8.4.1.2 Thermotolerant coliform organisms and
7 Sampling
presumptive E. co/i
Take the samples and deliver them to the laboratory
To confirm the presence of thermotolerant coliform
in accordance with IS0 8199, IS0 5667-1, IS0 5667-2
organisms, incubate another tube of EC medium
and IS0 5667-3.
(5.4.1) at 44 “C for 24 h, and examine for gas pro-
duction.
8 Procedure
To confirm the presence of presumptive E. co/i, in-
cubate a tube of tryptone water (5.4.2) for indole
ation
8.1 Preparation of the sample and inocul
formation at 44 “C for 24 h. Then add 0,2 ml to
of media 0,3 ml of Kovacs’ reagent (5.5.1) to the tube of
tryptone water: development of a red colour after
For preparation of the sample, making dilutior s and
gentle agitation denotes the presence of indole.
inoculation of isolation medium with test portions,
NOTES
follow the instructions given in IS0 8199. For test
portions of volume greater than 5 ml, use tubes
2 The use of lauryl tryptose mannitol broth with
containing “double strength” isolation medium.
tryptophan allows both gas and indole production by
presumptive E. co/i to be demonstrated in a single tube.
8.2 Incubation of tubes
3 The detection of presumptive E. co/i is regarded as
satisfactory evidence of faecal pollution. However, further
Incubate the inoculated tubes for 48 h at either
tests for the confirmation of E. co/i may be carried out if
35 “C + 0,5 “C or 37 “C + 0,5 “C.
- -
considered necessary (see 8.5).
4 When subculturing from colonies on the membrane to
8.3 Examination of tubes
tubes of confirmatory media, it is preferable to subculture
also to a plate of nutrient agar medium for the oxidase
Examine the tube-cultures after incubation for 18 h
test.
to 24 h and regard as positive reactions those which
show turbidity due to bacterial growth and gas for-
8.5 Oxidase test
mation in the inner inverted (Durham) tubes, to-
gether wifh acid production if the isolation medium
Some bacteria found in water may conform to the
contains a pH indicator. Reincubate those tubes
definition of coliform organisms in most respects,
which do not show any or all of these changes and
but are able to produce gas from lactose only at
examine them again for positive reactions after
temperatures below 37 OC. They therefore give neg-
48 h.
ative results in the standard confirmatory tests for
coliform organisms and their presence in water is
8.4 Confirmatory tests
not usually regarded as significant. Aeromonas spe-
cies, which occur naturally in water, interfere with
It is important to note that positive reactions in tubes
the determination only at a temperature of 37 “C and
of isolation medium are only presumptive coliform
below, confirmation with the oxidase test is needed
results. It is therefore important to carry out con-
only when determining coliforms.
firmatory tests, preferably on pure subcultures.
8.51 Carry out the oxidase test with pure subcul-
8.4.1 Subculture, incubation and examination
tures of lactose-fermenting organisms, grown on
nutrient agar medium, as follows:
Subculture from each tube of isolation medium giv-
ing a positive result into one or more tubes of the
- place 2 or 3 drops of freshly prepared oxidase
confirmatory media (5.4) for gas and indole pro-
reagent (5.5.2) on a filter paper in a Petri dish;
duction.
I_
with a glass rod, swab stick or platinum (not
NOTE 1 If the least inhibitory medium (lactose broth) is
nichrome) wire loop, smear some of the growth
used for isolation, subculture to either of the two more
on the prepared filter paper (see note 4);
selective confirmatory media [brillian
...

NORME
INTERNATIONALE 9308-2
Première édition
1990-l o-o 1
Qualité de l’eau - Recherche et dénombrement
des organismes coliformes, des OI ganismes
coliformes thermotolérants et des Escherichia
coli présumés -
Partie 2:
Méthode du nombre le plus proba de
Water quality - Detecfion and enumeration of coliform organisms,
thermotolerant coliform organisms and presumptive Escherichia coli -
Part 2: Multiple tube (most probable number) method
Numéro de référence
ISO 9308-2: 1990(F)

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 9308-2:1990(F)
Avant-propos
LIS0 (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres
de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre inté-
ressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique créé
à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I’ISO participent également aux tra-
vaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique
internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotech-
nique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techni-
ques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins
des comités membres votants.
La Norme internationale ISO 9308-2 a été élaborée par le comité tech-
nique ISO/TC 147, Qualité de l’eau.
L’ISO 9308 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre gé-
néral Qualité de l’eau - Recherche et dénombrement des organismes
coliformes, des organismes coliformes thermotolérants et des
Escherichia coli présumés:
- Partie 1: Méthode de filtration sur membrane
- Partie 2: Méthode du nombre le plus probable
Les annexes A et B de la présente partie de I’ISO 9308 sont données
uniquement à titre d’information.
0 iso 1990
Droits de reproduction réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être repro-
duite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou
mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii

---------------------- Page: 2 ----------------------
KO 9308=2:1990(F)
Introduction
La présence et l’importance de la pollution fécale est un facteur impor-
tant de l’évaluation de la qualité d’une masse d’eau. L’examen
d’échantillons d’eau pour la recherche de bactéries du groupe des or-
ganismes coliformesl), normalement présents dans les intestins de
l’homme et des animaux homéothermes, fournit une indication sur ce
type de pollution. L’aptitude de certains membres du groupe coliforme
à vivre dans l’eau étant limitée, leur nombre peut également être utilisé
pour estimer le degré de pollution fécale récente.
tmations microbiologi
Voi r annexe A pour de plus amples infor ques
1)
groupe coliforme.
rét .ude de l’eau à la recherch e d’organismes du

---------------------- Page: 3 ----------------------
Page blanche

---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 9308-2:1990(F)
Qualité de l’eau - Recherche et dénombrement des
organismes coliformes, des organismes coliformes
thermotolérants et des Escherichia Co/i présumés -
Partie 2:
Méthode du nombre le plus probable
et de I’ISO possèdent le registre des Normes inter-
1 Domaine d’application
nationales en vigueur à un moment donné.
La présente partie de I’ISO 9308 prescrit une mé-
ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire à usage analyti-
thode de recherche et de dénombrement des orga-
- Spécifkation et méthodes d’essai.
que
nismes coliformes, des organismes coliformes
thermotolérants et des Eschwkhia coli présumés
ISO 5667,1:1980, Qualité de l’eau - Échantillonnage
(E. coli présumés) par culture dans un milieu liquide
- Partie 1: Guide général pour l’établissement des
dans des tubes multiples et calcul de leur nombre
programmes d’échantillonnage.
le plus probable dans l’échantillon.
ISO 5667-2:1982, Qualité de l’eau - Échantillonnage
Cette méthode peut être appliquée à tous les types
- Partie 2: Guide général sur les techniques
d’eau, même ceux contenant une quantité appré-
ciable de particules en suspension. d’échanfillonnage.
Le choix des essais utilisés pour la recherche et la
ISO 5667-3:1985, Qualité de l’eau - Échantillonnage
confirmation des organismes du groupe coliforme, -
Partie 3: Guide général pour la conservation et la
y compris IF coli, peut être considéré comme fai-
manipulation des échantillons.
sant partie d’une séquence continue. L’importance
de la confirmation pour un échantillon donné dé-
ISO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales
pend en partie de la nature de l’eau et en partie des
pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
raisons ayant conduit à cet examen. Dans la prati-
microbiologique.
que, la recherche d’E. coli présumés dans l’eau
comme indiqué en 3.3 fournit généralement une in-
ISO 8199: 1988, Qualité de l’eau - Guide général pour
dication sur la pollution fécale récente.
le dénombrement des micro-organismes sur milieu
de culture.
2 Références normatives
3 Définitions
Les normes suivantes contiennent des dispositions
qui, par suite de la référence qui en est faite,
Pour les besoins de la présente partie de I’ISO 9308,
constituent des dispositions valables pour la pré-
les définitions suivantes s’appliquent.
sente partie de I’ISO 9308. Au moment de la publi-
cation, les éditions indiquées étaient en vigueur.
Toute norme est sujette à révision et les parties 3.1 organismes coliformes: Organismes capables
colonies en aérobiose à
prenantes des accords fondés sur la présente partie de former des
de I’ISO 9308 sont invitées à rechercher la possi- 35 “C + 0,5 “C ou à 37 “C + 0,5 “C sur un milieu
bilité d’appliquer les éditions les plus récentes des lactosé- sélectif et différentiel, avec production
d’acide (et d’aldéhyde) dans les 24 h.
normes indiquées ci-après. Les membres de la CEI
1

---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 9308=2:1990(F)
3.2 organismes coliformes thermotolérants: Orga- Pour la préparation des milieux, utiliser de l’eau
nismes coliformes répondant à la définition donnée distillée ou de l’eau désionisée, exempte de sub-
en 3.1, présentant les mêmes propriétés de fermen- stances susceptibles d’inhiber la croissance
tation dans les 24 h, à 44 “C + 0,25 OC ou à bactérienne dans les conditions de l’essai et
-
conforme à I’ISO 3696.
44,5 “C + 0,25 “C.
-
3.3 Escherichia coli présumés (E. coli présumés):
5.2 Diluant
Organismes coliformes thermotolérants répondant
à la définition donnée en 3.2 qui produisent, en plus,
Pour préparer les dilutions de l’échantillon, utiliser
du gaz à partir du lactose (et du mannitol) ainsi que
l’un des diluants recommandés dans l’annexe 8.
de l’indole à partir du tryptophane dans les 24 h, soit
Préparer le diluant conformément aux instructions
à 44 “C + 0,25 OC, soit à 44,5 “C + 0,25 “C.
- -
données dans l’annexe B.
5.3 Milieux d’isolement
4 Principe
Utiliser un ou plusieurs des milieux de culture sui-
vants. Les instructions pour la préparation sont
Ensemencement d’une série de tubes à essai
données dans l’annexe B.
contenant un milieu de culture sélectif Iactosé avec
des prises d’essai de l’échantillon dilué ou non.
5.3.1 Bouillon lactosé
Examen des tubes à essai après une incubation de
24 h et de 48 h à 35 “C ou 37 “C; repiquage à partir
5.3.2 Bouillon de MacConkey
de chaque tube à essai montrant une turbidité avec
une production de gaz dans un milieu de confir-
5.3.3 Milieu lactosé amélioré au glutamate et au
mation plus sélectif et, si l’on recherche les E. coli
formiate2)
présumés, sur un milieu sur lequel peut être prou-
vée la formation d’indole.
53.4 Bouillon au lauryltryptose (lactose)
Incubation de ces milieux de confirmation pendant
48 h au plus à 35 “C ou à 37 “C pour la recherche
d’organismes coliformes, et à 44 OC pendant 24 h
5.4 Milieux de confirmation
au plus pour les organismes coliformes
thermotolérants et les E. coli présumés.
Utiliser un ou plusieurs des milieux suivants.
Au moyen de tables statistiques, calcul du nombre
5.4.1 Milieux pour la production de gaz
le plus probable (NPP) d’organismes coliformes,
d’organismes coliformes thermotolérants et de
E. coli présumés, susceptibles d’être présents dans 5.4.1.1 Bouillon (bilié) lactosé au vert brillant
100 ml de l’échantillon, à partir du nombre de tubes
donnant des résultats de confirmation positifs.
5.4.1.2 Milieu EC
5.4.2 Milieu pour la production d’indole
5 Diluants, milieux de culture et réactifs
Eau tryptonée.
5.4.3 Milieu pour tube à essai unique pour
production de gaz et d’indole
5.1 Produits de base
Bouillon tryptosé au mannitol, au Iaurylsulfate et au
Pour la préparation des milieux de culture et des
tryptophane.
réactifs, utiliser des ingrédients de qualité homo-
gène et des produits chimiques de qualité analyti-
suivre les instructions données dans
que;
5.5 Réactifs
l’annexe B. Pour des informations sur la conser-
vation, voir ISO 8199. II est possible également
5.5.1 Réactif de Kovacs pour la recherche de
d’utiliser des milieux complets déshydratés, suivre
alors à la lettre les instructions du fabricant. I’indole
((MineraIs modified glutamate medium)>. Cette
2) Disponible dans le commerce sous forme déshydratée, sous l’appellation
information est donnée à l’intention des utilisateurs de la présente partie de I’ISO 9308 et ne signifie nullement que I’ISO
approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
2

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 9308=2:1990(F)
5.5.2 Réactif à l’oxydase pour la recherche de ces changements et les examiner à nouveau après
48 h pour rechercher une réaction positive.
l’oxydase
8.4 Essais de confirmation
6 Appareillage
II convient de noter que les réactions positives dans
Matériel courant de laboratoire microbiologique, y
les tubes à essai contenant un milieu d’isolement
compris
n’indiquent que la présence d’organismes coli-
formes présumés. II est donc important de procéder
6.1 Four à air chaud pour stérilisation en chaleur
à des essais de confirmation.
sèche et autoclave.
Outre l’appareillage livré stérile, la verrerie et tout
8.4.1 Repiquage, incubation et examen
autre matériel doivent être stérilisés conformément
aux instructions données dans I’ISO 8199.
Faire un repiquage à partir de chaque tube de milieu
d’isolement présentant un résultat positif dans un
ou plusieurs tubes contenant des milieux de confir-
6.2 Incubateur ou bain d’eau, réglable à
mation (5.4) pour la production de gaz et d’indole.
35 OC + 0,5 “C ou à 37 OC + 0,5 “C.
- -
NOTE 1 Si l’on utilise le bouillon lactosé le moins inhi-
biteur pour l’isolement, il est recommandé de repiquer sur
6.3 Incubateur ou bain d‘eau, réglable à
l’un des deux milieux de confirmation les plus sélectifs
44 “C + 0,25 OC ou à 44,5 “C + 0,25 “C.
- -
[bouillon (bilié) lactosé au vert-brillant ou bouillon EC]
pour confirmation.
6.4 pH-mètre.
8.4.1 .l Organismes coliformes
7 Échantillonnage
Pour confirmer la présence d’organismes coli-
formes, faire incuber un tube à essai de bouillon
Prélever les échantillons et les transmettre au la-
(bilié) lactosé au vert-brillant (5.4.1) à 35 “C ou à
boratoire conformément à I’ISO 8199, I’ISO 5667-1,
37 “C et rechercher la production de gaz dans les
I’ISO 5667-2 et I’ISO 5667-3.
48 h.
8.4.1.2 Organismes coliformes thermotolérants et
8 Mode opératoire
E. coli présumés
8.1 Préparation de l’échantillon et
Pour confirmer la présence d’organismes coliformes
ensemencement des milieux
thermotolérants, faire incuber un autre tube à essai
de milieu EC (5.4.1) à 44 “C pendant 24 h et recher-
Pour la préparation de l’échantillon et des dilutions
cher la production de gaz.
et l’ensemencement des milieux d’isolement avec
les prises d’essai, suivre les instructions données Pour confirmer la présence d’E. coli présumés, faire
dans I’ISO 8199. Ensemencer des tubes à essai incuber un tube à essai d’eau tryptonée (8.4.1) pour
contenant un milieu d’isolement double concen- la recherche d’indole à 44 “C pendant 24 h. Puis
tration avec des prises d’essai de 5 ml ou plus. ajouter 0,2 ml à 0,3 ml de réactif de Kovacs (5.5.1)
dans le tube contenant de l’eau tryptonée: I’appari-
tion d’une coloration rouge après l’avoir mélangé
8.2 Incubation des tubes
avec précaution indique la présence d’indole.
Faire incuber les tubes ensemencés à
NOTES
35 OC + 0,5 OC ou à 37 OC + 0,5 “C pendant 48 h.
- -
2 L’utilisation d’un bouillon tryptosé au mannitol, au
laurylsulfate et au tryptophane permet de montrer la
8.3 Examen des tubes à essai production de gaz et d’indole par les E. co/i.
3 La détection d’E. coli présumés est considérée comme
Examiner les cultures en tubes à essai après
une preuve suffisante de pollution fécale. Toutefois, des
incubation pendant 18 h à 24 h et considérer comme
essais complémentaires des E. coli peuvent être effectués
réactions positives les tubes présentant une turbi-
si nécessaire (voir 8.5).
dité due à une croissance bactérienne et à la for-
mation de gaz dans les cloches de Durham, ainsi
4 Lorsqu’on procède à des repiquages de colonies sur
qu’une production d’acide si le milieu d’isolement
membranes dans des tubes de milieux de confirmation, il
contient un indicateur de pH. Faire incuber à nou-
est préférable de repiquer également sur boîte de milieu
veau les tubes à essai qui ne présentent aucun de nutritif gélosé pour l’essai à l’oxydase.

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 9308-2:1990(F)
cultures d’organismes connues pour donner une réaction
8.5 Essai à l’oxydase
positive (Pseudomonas aeruginosa) ainsi qu’avec une
culture donnant une réaction négative (E. Co/i).
Certaines bactéries présentes dans l’eau peuvent,
à de nombreux égards, être conformes à la défini-
tion des organismes coliformes, mais elles ne peu- 9 Expression des résultats
vent produire de gaz à partir du lactose qu’à des
températures inférieures à 37 “C. Elles donnent A partir du nombre de tubes de milieu d’isolement
donc des résultats négatifs lors des essais de ayant donné des reactions positives aux essais
confirmation normalisés pour les organismes coli- confirmatifs, calculer, par référence aux tables sta-
formes et leur présence dans l’eau n’est donc pas tistiques de I’ISO 8199, le nombre le plus probable
considérée comme significative. Parce que les es- d’organismes coliformes, d’organismes coliformes
pèces d’aéromones qui se présentent naturellement thermotolérants et d’Escherichia CO// présumés pré-
dans l’eau interfèrent seulement à une température sents dans 100 ml d’échantillon.
de 37 OC et en dessous, il est seulement nécessaire
d’effectuer l’essai à l’oxydase en déterminant des
30 Rapport d’essai
coliformes.
Le rapp or-t d’essai doit contenir les informations
8.51 Effectuer l’essai à l’oxydase avec des cultu-
suivante s:
res pures d’organismes en faisant fermenter le lac-
tose, cultivés sur un milieu nutritif à la gélose,
a) la référence à la présente partie de I’ISO 9308;
comme suit:
b) tous les détails nécessaires à l’identification
- placer 2 ou 3 gouttes de réactif à l’oxydase nou-
complèt
...

NORME
INTERNATIONALE 9308-2
Première édition
1990-l o-o 1
Qualité de l’eau - Recherche et dénombrement
des organismes coliformes, des OI ganismes
coliformes thermotolérants et des Escherichia
coli présumés -
Partie 2:
Méthode du nombre le plus proba de
Water quality - Detecfion and enumeration of coliform organisms,
thermotolerant coliform organisms and presumptive Escherichia coli -
Part 2: Multiple tube (most probable number) method
Numéro de référence
ISO 9308-2: 1990(F)

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 9308-2:1990(F)
Avant-propos
LIS0 (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres
de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre inté-
ressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique créé
à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I’ISO participent également aux tra-
vaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique
internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotech-
nique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techni-
ques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins
des comités membres votants.
La Norme internationale ISO 9308-2 a été élaborée par le comité tech-
nique ISO/TC 147, Qualité de l’eau.
L’ISO 9308 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre gé-
néral Qualité de l’eau - Recherche et dénombrement des organismes
coliformes, des organismes coliformes thermotolérants et des
Escherichia coli présumés:
- Partie 1: Méthode de filtration sur membrane
- Partie 2: Méthode du nombre le plus probable
Les annexes A et B de la présente partie de I’ISO 9308 sont données
uniquement à titre d’information.
0 iso 1990
Droits de reproduction réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être repro-
duite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou
mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii

---------------------- Page: 2 ----------------------
KO 9308=2:1990(F)
Introduction
La présence et l’importance de la pollution fécale est un facteur impor-
tant de l’évaluation de la qualité d’une masse d’eau. L’examen
d’échantillons d’eau pour la recherche de bactéries du groupe des or-
ganismes coliformesl), normalement présents dans les intestins de
l’homme et des animaux homéothermes, fournit une indication sur ce
type de pollution. L’aptitude de certains membres du groupe coliforme
à vivre dans l’eau étant limitée, leur nombre peut également être utilisé
pour estimer le degré de pollution fécale récente.
tmations microbiologi
Voi r annexe A pour de plus amples infor ques
1)
groupe coliforme.
rét .ude de l’eau à la recherch e d’organismes du

---------------------- Page: 3 ----------------------
Page blanche

---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 9308-2:1990(F)
Qualité de l’eau - Recherche et dénombrement des
organismes coliformes, des organismes coliformes
thermotolérants et des Escherichia Co/i présumés -
Partie 2:
Méthode du nombre le plus probable
et de I’ISO possèdent le registre des Normes inter-
1 Domaine d’application
nationales en vigueur à un moment donné.
La présente partie de I’ISO 9308 prescrit une mé-
ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire à usage analyti-
thode de recherche et de dénombrement des orga-
- Spécifkation et méthodes d’essai.
que
nismes coliformes, des organismes coliformes
thermotolérants et des Eschwkhia coli présumés
ISO 5667,1:1980, Qualité de l’eau - Échantillonnage
(E. coli présumés) par culture dans un milieu liquide
- Partie 1: Guide général pour l’établissement des
dans des tubes multiples et calcul de leur nombre
programmes d’échantillonnage.
le plus probable dans l’échantillon.
ISO 5667-2:1982, Qualité de l’eau - Échantillonnage
Cette méthode peut être appliquée à tous les types
- Partie 2: Guide général sur les techniques
d’eau, même ceux contenant une quantité appré-
ciable de particules en suspension. d’échanfillonnage.
Le choix des essais utilisés pour la recherche et la
ISO 5667-3:1985, Qualité de l’eau - Échantillonnage
confirmation des organismes du groupe coliforme, -
Partie 3: Guide général pour la conservation et la
y compris IF coli, peut être considéré comme fai-
manipulation des échantillons.
sant partie d’une séquence continue. L’importance
de la confirmation pour un échantillon donné dé-
ISO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales
pend en partie de la nature de l’eau et en partie des
pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
raisons ayant conduit à cet examen. Dans la prati-
microbiologique.
que, la recherche d’E. coli présumés dans l’eau
comme indiqué en 3.3 fournit généralement une in-
ISO 8199: 1988, Qualité de l’eau - Guide général pour
dication sur la pollution fécale récente.
le dénombrement des micro-organismes sur milieu
de culture.
2 Références normatives
3 Définitions
Les normes suivantes contiennent des dispositions
qui, par suite de la référence qui en est faite,
Pour les besoins de la présente partie de I’ISO 9308,
constituent des dispositions valables pour la pré-
les définitions suivantes s’appliquent.
sente partie de I’ISO 9308. Au moment de la publi-
cation, les éditions indiquées étaient en vigueur.
Toute norme est sujette à révision et les parties 3.1 organismes coliformes: Organismes capables
colonies en aérobiose à
prenantes des accords fondés sur la présente partie de former des
de I’ISO 9308 sont invitées à rechercher la possi- 35 “C + 0,5 “C ou à 37 “C + 0,5 “C sur un milieu
bilité d’appliquer les éditions les plus récentes des lactosé- sélectif et différentiel, avec production
d’acide (et d’aldéhyde) dans les 24 h.
normes indiquées ci-après. Les membres de la CEI
1

---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 9308=2:1990(F)
3.2 organismes coliformes thermotolérants: Orga- Pour la préparation des milieux, utiliser de l’eau
nismes coliformes répondant à la définition donnée distillée ou de l’eau désionisée, exempte de sub-
en 3.1, présentant les mêmes propriétés de fermen- stances susceptibles d’inhiber la croissance
tation dans les 24 h, à 44 “C + 0,25 OC ou à bactérienne dans les conditions de l’essai et
-
conforme à I’ISO 3696.
44,5 “C + 0,25 “C.
-
3.3 Escherichia coli présumés (E. coli présumés):
5.2 Diluant
Organismes coliformes thermotolérants répondant
à la définition donnée en 3.2 qui produisent, en plus,
Pour préparer les dilutions de l’échantillon, utiliser
du gaz à partir du lactose (et du mannitol) ainsi que
l’un des diluants recommandés dans l’annexe 8.
de l’indole à partir du tryptophane dans les 24 h, soit
Préparer le diluant conformément aux instructions
à 44 “C + 0,25 OC, soit à 44,5 “C + 0,25 “C.
- -
données dans l’annexe B.
5.3 Milieux d’isolement
4 Principe
Utiliser un ou plusieurs des milieux de culture sui-
vants. Les instructions pour la préparation sont
Ensemencement d’une série de tubes à essai
données dans l’annexe B.
contenant un milieu de culture sélectif Iactosé avec
des prises d’essai de l’échantillon dilué ou non.
5.3.1 Bouillon lactosé
Examen des tubes à essai après une incubation de
24 h et de 48 h à 35 “C ou 37 “C; repiquage à partir
5.3.2 Bouillon de MacConkey
de chaque tube à essai montrant une turbidité avec
une production de gaz dans un milieu de confir-
5.3.3 Milieu lactosé amélioré au glutamate et au
mation plus sélectif et, si l’on recherche les E. coli
formiate2)
présumés, sur un milieu sur lequel peut être prou-
vée la formation d’indole.
53.4 Bouillon au lauryltryptose (lactose)
Incubation de ces milieux de confirmation pendant
48 h au plus à 35 “C ou à 37 “C pour la recherche
d’organismes coliformes, et à 44 OC pendant 24 h
5.4 Milieux de confirmation
au plus pour les organismes coliformes
thermotolérants et les E. coli présumés.
Utiliser un ou plusieurs des milieux suivants.
Au moyen de tables statistiques, calcul du nombre
5.4.1 Milieux pour la production de gaz
le plus probable (NPP) d’organismes coliformes,
d’organismes coliformes thermotolérants et de
E. coli présumés, susceptibles d’être présents dans 5.4.1.1 Bouillon (bilié) lactosé au vert brillant
100 ml de l’échantillon, à partir du nombre de tubes
donnant des résultats de confirmation positifs.
5.4.1.2 Milieu EC
5.4.2 Milieu pour la production d’indole
5 Diluants, milieux de culture et réactifs
Eau tryptonée.
5.4.3 Milieu pour tube à essai unique pour
production de gaz et d’indole
5.1 Produits de base
Bouillon tryptosé au mannitol, au Iaurylsulfate et au
Pour la préparation des milieux de culture et des
tryptophane.
réactifs, utiliser des ingrédients de qualité homo-
gène et des produits chimiques de qualité analyti-
suivre les instructions données dans
que;
5.5 Réactifs
l’annexe B. Pour des informations sur la conser-
vation, voir ISO 8199. II est possible également
5.5.1 Réactif de Kovacs pour la recherche de
d’utiliser des milieux complets déshydratés, suivre
alors à la lettre les instructions du fabricant. I’indole
((MineraIs modified glutamate medium)>. Cette
2) Disponible dans le commerce sous forme déshydratée, sous l’appellation
information est donnée à l’intention des utilisateurs de la présente partie de I’ISO 9308 et ne signifie nullement que I’ISO
approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
2

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 9308=2:1990(F)
5.5.2 Réactif à l’oxydase pour la recherche de ces changements et les examiner à nouveau après
48 h pour rechercher une réaction positive.
l’oxydase
8.4 Essais de confirmation
6 Appareillage
II convient de noter que les réactions positives dans
Matériel courant de laboratoire microbiologique, y
les tubes à essai contenant un milieu d’isolement
compris
n’indiquent que la présence d’organismes coli-
formes présumés. II est donc important de procéder
6.1 Four à air chaud pour stérilisation en chaleur
à des essais de confirmation.
sèche et autoclave.
Outre l’appareillage livré stérile, la verrerie et tout
8.4.1 Repiquage, incubation et examen
autre matériel doivent être stérilisés conformément
aux instructions données dans I’ISO 8199.
Faire un repiquage à partir de chaque tube de milieu
d’isolement présentant un résultat positif dans un
ou plusieurs tubes contenant des milieux de confir-
6.2 Incubateur ou bain d’eau, réglable à
mation (5.4) pour la production de gaz et d’indole.
35 OC + 0,5 “C ou à 37 OC + 0,5 “C.
- -
NOTE 1 Si l’on utilise le bouillon lactosé le moins inhi-
biteur pour l’isolement, il est recommandé de repiquer sur
6.3 Incubateur ou bain d‘eau, réglable à
l’un des deux milieux de confirmation les plus sélectifs
44 “C + 0,25 OC ou à 44,5 “C + 0,25 “C.
- -
[bouillon (bilié) lactosé au vert-brillant ou bouillon EC]
pour confirmation.
6.4 pH-mètre.
8.4.1 .l Organismes coliformes
7 Échantillonnage
Pour confirmer la présence d’organismes coli-
formes, faire incuber un tube à essai de bouillon
Prélever les échantillons et les transmettre au la-
(bilié) lactosé au vert-brillant (5.4.1) à 35 “C ou à
boratoire conformément à I’ISO 8199, I’ISO 5667-1,
37 “C et rechercher la production de gaz dans les
I’ISO 5667-2 et I’ISO 5667-3.
48 h.
8.4.1.2 Organismes coliformes thermotolérants et
8 Mode opératoire
E. coli présumés
8.1 Préparation de l’échantillon et
Pour confirmer la présence d’organismes coliformes
ensemencement des milieux
thermotolérants, faire incuber un autre tube à essai
de milieu EC (5.4.1) à 44 “C pendant 24 h et recher-
Pour la préparation de l’échantillon et des dilutions
cher la production de gaz.
et l’ensemencement des milieux d’isolement avec
les prises d’essai, suivre les instructions données Pour confirmer la présence d’E. coli présumés, faire
dans I’ISO 8199. Ensemencer des tubes à essai incuber un tube à essai d’eau tryptonée (8.4.1) pour
contenant un milieu d’isolement double concen- la recherche d’indole à 44 “C pendant 24 h. Puis
tration avec des prises d’essai de 5 ml ou plus. ajouter 0,2 ml à 0,3 ml de réactif de Kovacs (5.5.1)
dans le tube contenant de l’eau tryptonée: I’appari-
tion d’une coloration rouge après l’avoir mélangé
8.2 Incubation des tubes
avec précaution indique la présence d’indole.
Faire incuber les tubes ensemencés à
NOTES
35 OC + 0,5 OC ou à 37 OC + 0,5 “C pendant 48 h.
- -
2 L’utilisation d’un bouillon tryptosé au mannitol, au
laurylsulfate et au tryptophane permet de montrer la
8.3 Examen des tubes à essai production de gaz et d’indole par les E. co/i.
3 La détection d’E. coli présumés est considérée comme
Examiner les cultures en tubes à essai après
une preuve suffisante de pollution fécale. Toutefois, des
incubation pendant 18 h à 24 h et considérer comme
essais complémentaires des E. coli peuvent être effectués
réactions positives les tubes présentant une turbi-
si nécessaire (voir 8.5).
dité due à une croissance bactérienne et à la for-
mation de gaz dans les cloches de Durham, ainsi
4 Lorsqu’on procède à des repiquages de colonies sur
qu’une production d’acide si le milieu d’isolement
membranes dans des tubes de milieux de confirmation, il
contient un indicateur de pH. Faire incuber à nou-
est préférable de repiquer également sur boîte de milieu
veau les tubes à essai qui ne présentent aucun de nutritif gélosé pour l’essai à l’oxydase.

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 9308-2:1990(F)
cultures d’organismes connues pour donner une réaction
8.5 Essai à l’oxydase
positive (Pseudomonas aeruginosa) ainsi qu’avec une
culture donnant une réaction négative (E. Co/i).
Certaines bactéries présentes dans l’eau peuvent,
à de nombreux égards, être conformes à la défini-
tion des organismes coliformes, mais elles ne peu- 9 Expression des résultats
vent produire de gaz à partir du lactose qu’à des
températures inférieures à 37 “C. Elles donnent A partir du nombre de tubes de milieu d’isolement
donc des résultats négatifs lors des essais de ayant donné des reactions positives aux essais
confirmation normalisés pour les organismes coli- confirmatifs, calculer, par référence aux tables sta-
formes et leur présence dans l’eau n’est donc pas tistiques de I’ISO 8199, le nombre le plus probable
considérée comme significative. Parce que les es- d’organismes coliformes, d’organismes coliformes
pèces d’aéromones qui se présentent naturellement thermotolérants et d’Escherichia CO// présumés pré-
dans l’eau interfèrent seulement à une température sents dans 100 ml d’échantillon.
de 37 OC et en dessous, il est seulement nécessaire
d’effectuer l’essai à l’oxydase en déterminant des
30 Rapport d’essai
coliformes.
Le rapp or-t d’essai doit contenir les informations
8.51 Effectuer l’essai à l’oxydase avec des cultu-
suivante s:
res pures d’organismes en faisant fermenter le lac-
tose, cultivés sur un milieu nutritif à la gélose,
a) la référence à la présente partie de I’ISO 9308;
comme suit:
b) tous les détails nécessaires à l’identification
- placer 2 ou 3 gouttes de réactif à l’oxydase nou-
complèt
...