ISO 20166-2:2018
(Main)Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-examinations processes for formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue — Part 2: Isolated proteins
Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-examinations processes for formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue — Part 2: Isolated proteins
This document gives guidelines on the handling, documentation, storage and processing of formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue specimens intended for the examination of isolated proteins during the pre-examination phase before a molecular assay is performed. This document is applicable to molecular in vitro diagnostic examinations including laboratory developed tests performed by medical laboratories and molecular pathology laboratories. It is also intended to be used by laboratory customers, in vitro diagnostics developers and manufacturers, biobanks, institutions and commercial organizations performing biomedical research, and regulatory authorities. This document is not applicable for protein examination by immunohistochemistry. NOTE International, national or regional regulations or requirements can also apply to specific topics covered in this document.
Analyses de diagnostic moléculaire in vitro — Spécifications relatives aux processus préanalytiques pour les tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) — Partie 2: Protéines extraites
Le présent document fournit des lignes directrices concernant la manipulation, la documentation, le stockage et le traitement de prélèvements de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) destinés à l'analyse des protéines extraites durant la phase préanalytique précédant la réalisation d'une analyse moléculaire. Le présent document s'applique aux analyses de diagnostic moléculaire in vitro, y compris les analyses développées en laboratoire réalisées par des laboratoires de biologie médicale et des laboratoires de pathologie moléculaire. Il est également destiné à être utilisé par des clients de laboratoires, des développeurs et fabricants de l'industrie du diagnostic in vitro, ainsi que par des biobanques, des institutions et des organismes commerciaux spécialisés en recherche biomédicale, de même que des autorités de réglementation. Le présent document n'est pas applicable pour l'analyse des protéines par immunohistochimie. NOTE Des réglementations ou exigences internationales, nationales ou régionales peuvent également s'appliquer à des sujets spécifiques traités dans le présent document.
General Information
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20166-2
First edition
2018-12
Molecular in vitro diagnostic
examinations — Specifications for pre-
examinations processes for formalin-
fixed and paraffin-embedded (FFPE)
tissue —
Part 2:
Isolated proteins
Analyses de diagnostic moléculaire in vitro — Spécifications relatives
aux processus préanalytiques pour les tissus fixés au formol et inclus
en paraffine (FFPE) —
Partie 2: Protéines extraites
Reference number
©
ISO 2018
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Published in Switzerland
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Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 General considerations . 4
5 Outside the laboratory . 5
5.1 Specimen collection . 5
5.1.1 General. 5
5.1.2 Information about the specimen donor/patient . 6
5.1.3 Information about the specimen . 6
5.1.4 Specimen processing . 6
5.2 Transport requirements . 7
6 Inside the laboratory . 7
6.1 Information about the reception of the specimen . 7
6.2 Formalin fixation of the specimen or sample(s) . 7
6.3 Evaluation of the pathology of the specimen and selection of the sample(s) . 9
6.4 Post-fixation of frozen samples . 9
6.5 Processing and paraffin embedding .10
6.6 Storage requirements .10
6.7 Isolation of the total protein.11
6.7.1 General.11
6.7.2 General information for protein isolation procedures .11
6.7.3 Using commercial kits .11
6.7.4 Using the laboratories’ own protocols .11
6.8 Quality assessment of isolated proteins .12
6.9 Storage of isolated total protein .13
Annex A (informative) Examination of protein demonstrates changes of protein amounts
during cold ischemia .14
Bibliography .18
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Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso
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This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 212, Clinical laboratory testing and in
vitro diagnostic test systems.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
A list of all parts in the ISO 20166 series can be found on the ISO website.
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ISO 20166-2:2018(E)
Introduction
Molecular in vitro diagnostics, including molecular pathology, has enabled a significant progress in
medicine. Further progress is expected with new technologies analyzing nucleic acids, proteins, and
metabolites in human tissues and body fluids. However, the profiles and/or integrity of these molecules
can change drastically during specimen collection, transport, storage, and processing, thus making
the outcome from diagnostics or research unreliable or even impossible because the subsequent
examination assay will not determine the situation in the patient but an artificial molecular pattern
generated during the pre-examination process.
Although originally thought as being impossible due to the crosslinking activities of formaldehyde,
protein isolation techniques from formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissues have been
much improved in recent years. Heat-induced reversal of formaldehyde-induced crosslinks has been
[5][6]
demonstrated as an essential step in the protein isolation procedures . Currently, most investigators
[7]
accept that proteins isolated from FFPE tissue are suitable for downstream proteomic examination .
Protein profiles, protein integrities, and protein–protein interactions in tissues can change drastically
before, during and after collection (due to, e.g. gene induction, gene down regulation, protein
degradation). Protein species amounts can change differently in different donors’/patients’ tissues.
The expression of genes can be influenced by the given treatment or intervention (surgery, biopsy), or
drugs administered for anaesthesia or even treatment of concomitant disease as well as by the different
environmental conditions after the tissue removal from the body.
Furthermore, the formalin-fixation and paraffin-embedding processes lead to modifications of the
protein molecules, which can impact the validity and reliability of the examination test results.
Therefore, it is essential to take special measures to minimize the described protein profile changes
and modifications within tissues for subsequent examination.
A standardization of the entire process from specimen collection to the protein examination is needed.
Studies have been undertaken to determine the important influencing factors. This document draws
upon such work to codify and standardize the steps for FFPE tissue with regard to protein examination
in what is referred to as the pre-examination phase.
In this document, the following verbal forms are used:
— "shall" indicates a requirement;
— "should" indicates a recommendation;
— "may" indicates a permission;
— "can" indicates a possibility or a capability.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 20166-2:2018(E)
Molecular in vitro diagnostic examinations —
Specifications for pre-examinations processes for
formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue —
Part 2:
Isolated proteins
1 Scope
This document gives guidelines on the handling, documentation, storage and processing of formalin-
fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue specimens intended for the examination of isolated proteins
during the pre-examination phase before a molecular assay is performed.
This document is applicable to molecular in vitro diagnostic examinations including laboratory
developed tests performed by medical laboratories and molecular pathology laboratories. It is also
intended to be used by laboratory customers, in vitro diagnostics developers and manufacturers,
biobanks, institutions and commercial organizations performing biomedical research, and regulatory
authorities.
This document is not applicable for protein examination by immunohistochemistry.
NOTE International, national or regional regulations or requirements can also apply to specific topics
covered in this document.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 15189:2012, Medical laboratories — Requirements for quality and competence
ISO 15190, Medical laboratories — Requirements for safety
ISO/IEC 17020:2012, Conformity assessment — Requirements for the operation of various types of bodies
performing inspection
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 15189 and the following apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
aliquot
portion of a larger amount of homogeneous material, assumed to be taken with negligible sampling error
Note 1 to entry: The term is usually applied to fluids. Tissues are heterogeneous and therefore cannot be
aliquoted.
ISO 20166-2:2018(E)
Note 2 to entry: The definition is derived from References [28], [29], and [30].
3.2
ambient temperature
unregulated temperature of the surrounding air
3.3
analyte
component represented in the name of a measurable quantity
[SOURCE: ISO 17511:2003, 3.2 — EXAMPLE has been removed.]
3.4
analytical test performance
accuracy, precision, and sensitivity of a test to measure the analyte (3.3) of interest
Note 1 to entry: Other test performance characteristics such as robustness, repeatability can apply as well.
3.5
cold ischemia
condition after removal of the tissue from the body until stabilization or fixation
3.6
diagnosis
identification of a health or disease state from its signs and/or symptoms, where the diagnostic process
can involve examinations (3.7) and tests for classification of an individual's condition into separate and
distinct categories or subclasses that allow medical decisions about treatment and prognosis to be made
3.7
examination
analytical test
set of operations having the object of determining the value or characteristics of a property
Note 1 to entry: Processes that start with the isolated analyte and include all kinds of parameter testing or
chemical manipulation for quantitative or qualitative examination.
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.7, modified — Notes to entry 1 to 3 have been removed, Note 1 to entry has
been added and “analytical test” has been added as a preferred term.]
3.8
formalin
saturated aqueous formaldehyde solution which at 100 % contains 37 % formaldehyde by mass
(corresponding to 40 % by volume)
3.9
formalin fixation
treatment of a sample with standard buffered formalin solution (3.21) for stabilization
3.10
grossing
gross examination
inspection of pathology specimens with the bare eye to obtain diagnostic information, while being
processed for further microscopic examination
3.11
paraffin embedding
process in which a tissue sample (3.19) is placed in paraffin to achieve a hard surrounding matrix so
that thin microscopic sections can be cut
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ISO 20166-2:2018(E)
3.12
pre-examination process
pre-analytical phase
pre-analytical workflow
process that starts, in chronological order, from the clinician’s request and includes the examination
request, preparation and identification of the patient, collection of the primary sample(s), transportation
to and within the medical or pathology laboratory, isolation of analytes, and ends when the analytical
examination begins
Note 1 to entry: The pre-examination phase includes preparative processes, e.g. protein isolation procedures,
which influence the outcome of the intended examination.
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.15, modified — “pre-analytical workflow” has been added as a preferred
term, Note 1 to entry has been added and the definition has been extended.]
3.13
primary sample
specimen
discrete portion of a body fluid, breath, hair or tissue taken for examination (3.7), study or analysis of
one or more quantities or properties assumed to apply for the whole
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.16, modified — Notes to entry 1 to 3 have been removed.]
3.14
protein
type of biological macromolecule composed of one or more chains with a defined sequence of amino
acids connected through peptide bonds
3.15
protein profile
amounts of the individual protein (3.14) molecules that are present in a sample and that can be measured
in the absence of any losses, inhibition and interference
3.16
protein species
amounts of a chemically clearly-defined protein corresponding to one spot on a high-performance two-
dimensional gel electrophoresis pattern
Note 1 to entry: The definition is taken from Reference [7].
3.17
post-translational modification
chemical alterations to a primary protein structure, often crucial for conferring biological activity on
a protein
Note 1 to entry: The definition is taken from Reference [8].
3.18
room temperature
for the purposes of this document, temperature in the range of 18 °C to 25 °C
Note 1 to entry: Local or national regulations can have different definitions.
3.19
sample
one or more parts taken from a primary sample (3.13)
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.24, modified — EXAMPLE has been removed.]
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3.20
stability
ability of a sample material, when stored under specified conditions, to maintain a stated property
value within specified limits for a specified period of time
Note 1 to entry: The analyte for the purpose of this document is isolated protein.
[SOURCE: ISO Guide 30:2015, 2.1.15, modified — “reference material” has been replaced by “sample
material”, “characteristic” has been replaced by “ability” and Note 1 to entry has been changed.]
3.21
standard buffered formalin solution
neutral buffered formalin
NBF
10 % formalin (3.8) solution in water with a mass fraction of 3,7 % (corresponding to a volume fraction
of 4 %) formaldehyde, buffered to pH 6,8 to pH 7,2
Note 1 to entry: Standard buffered formalin solutions often contain small amounts of methanol to inhibit
oxidation and polymerization of formaldehyde.
3.22
storage
prolonged interruption of the pre-analytical workflow (3.12) of a sample or analyte respectively, or of
their derivatives, such as stained sections or tissue blocks, under appropriate conditions in order to
preserve their properties
Note 1 to entry: Long-term storage typically occurs in laboratory archives or in biobanks.
3.23
tissue processor
automated instrument where tissue fixation, dehydration, clearing and paraffin infiltration occurs
3.24
validation
confirmation, throughout the provision of objective evidence, that the requirements for a specific
intended use or application have been fulfilled
Note 1 to entry: “Validated” is used to designate the corresponding status.
[SOURCE: ISO 9000:2015, 3.8.13, modified — Notes to entry 1 and 3 have been removed.]
3.25
warm ischemia
condition before the tissue is removed from the body, but where it is deprived of its normal blood supply
3.26
workflow
series of activities necessary to complete a task
3.27
homogeneous
uniform in structure and composition
4 General considerations
For general statements on medical laboratory quality management systems and in particular on
specimen collection, reception, and handling (including avoidance of cross contaminations) see
ISO 15189:2012, 4.2, 5.4.4, 5.4.6 or ISO/IEC 17020:2012, Clause 8 and 7.2. The requirements on
laboratory equipment, reagents, and consumables in accordance with ISO 15189:2012, 5.3 shall be
followed; ISO 15189:2012, 5.5.1.2 and 5.5.1.3, and ISO/IEC 17020:2012, 6.2 can also apply.
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ISO 20166-2:2018(E)
All steps of a diagnostic workflow can influence the final analytical test result. Thus, the entire
workflow including biomolecule stability and sample storage conditions shall be verified and validated.
Workflow steps which cannot always be controlled (e.g. warm ischemia) shall be documented. A risk
assessment of non-controllable workflow steps including their potential impact on the analytical test
performance shall be performed and mitigation measures shall be established to enable the required
analytical test performance.
The stability of the specific protein(s) of interest and their post-translational modifications (if important
for the assay) should be investigated throughout the complete pre-examination process prior to the
development and implementation of an examination test (e.g. by performing a time course experiment
or study; see also Annex A and Reference [9]).
Before tissues are fixed in standard buffered formalin solution, protein amounts, conformations and
binding status can change, e.g. by protein degradation and altered synthesis following gene induction,
gene down regulation, RNA degradation, and changes of the biochemical pathway and energy status.
These effects depend on the duration of warm and cold ischemia and the ambient temperature before
formalin fixation. In addition, the described effects can vary in different donors’/patients’ tissues.
Generally, the longer the durations of warm and cold ischemia and the higher the ambient temperature
before fixation of the tissue specimen, the higher is the risk that changes in the protein profile can occur.
NOTE Prolonged cold ischemia results in changes of protein (e.g. cytokeratin 18) and phosphoprotein (e.g.
[9][10] [11]
phospho-p42/44) amounts . Keeping the specimen on wet-ice diminishes this effect . Protein amounts as
well as the protein modifications can also vary, depending on the origin and type of tissue, the underlying disease,
the surgical procedure, the drug regime, and drugs administered for anaesthesia or treatment of concomitant
disease, and on the different environmental conditions after the tissue removal from the body.
As warm ischemia cannot be easily standardized, its duration shall be documented. When it is not
possible to avoid cold ischemia, its duration shall be documented and the temperatures of the specimen
container's surroundings shall be documented. Where the specimen is transported to another facility
for formalin fixation, the transport duration shall be documented and the ambient conditions should
also be documented.
In addition, the formalin fixation itself, as well as the subsequent FFPE tissue storage duration and
storage temperature causes modifications of biomolecules and leads to suboptimal performance of
[12]
protein isolated from FFPE tissues . This should be considered in the quality control and application
of molecular analytical tests. Analytical test optimization for FFPE tissues or the use of non-crosslinking
alternatives to standard buffered formalin solution are options to minimize this issue for molecular
examinations.
Safety instructions on transport and handling shall be considered and followed in accordance with
ISO 15189:2012, 5.2.3 and 5.4.5, and ISO 15190.
During the whole pre-examination process precautions shall be taken to avoid cross contamination
between different specimens/samples, e.g. by using single-use material whenever feasible or
appropriate cleaning procedures between processing of different specimens/samples.
If a commercial product is not used in accordance with the manufacturers' instructions, responsibility
for its use and performance lies with the user.
5 Outside the laboratory
5.1 Specimen collection
5.1.1 General
For the collection of the specimen, the requirements (e.g. disease condition, specimen size) for the
intended molecular examination (see also Clause 6) should be considered.
See also ISO 15189:2012, 5.4.4.
ISO 20166-2:2018(E)
5.1.2 Information about the specimen donor/patient
The documentation shall include the ID of the specimen donor/patient, which can be in the form of a code.
The documentation should include, but is not limited to:
a) the relevant health status of the specimen donor/patient [e.g. healthy, disease type, concomitant
disease, demographics (e.g. age and gender)];
b) the information about routine medical treatment and special treatment prior to tissue collection
(e.g. anaesthetics, medications, surgical or diagnostic procedures);
c) the appropriate consent from the specimen donor/patient.
5.1.3 Information about the specimen
The documentation shall include, but is not limited to:
a) the start of ischemia within the body (warm ischemia) by documentation of the ischemia-relevant
vessel ligation/clamping time point (usually arterial clamping time);
b) the time and date when tissue is removed from the body and the method of removal (e.g. core-
needle biopsy, resection, biopsy device used for the collection);
c) the description of tissue type and origin, tissue condition (e.g. diseased, unaffected by the disease),
including references to any marking applied in or outside the operating theatre made by surgeon,
radiologist or pathologist;
d) the documentation steps described under 6.2, if the formalin fixation starts outside the laboratory,
and also the documentation steps described under 6.3, if the evaluation of the pathology of the
specimen and selection of the sample(s) is also done outside the laboratory.
The documentation should also include the ID of the responsible person for collecting the specimen.
5.1.4 Specimen processing
The following steps shall be performed:
a) the documentation of any additions or modifications to the specimen after removal from the body
[e.g. labelling for the orientation of the specimen (e.g. ink-marking, stitches), incision(s)];
b) the selection and use of containers and packages (e.g. cooling box, box for storing and transportation,
vacuum packaging) according to applicable transport regulations;
c) the selection and use of stabilization procedures (e.g. cooling methods) for transport;
NOTE 1 Accidentally freezing the tissue (e.g. by using cool packs in a wrong manner) can lead to protein
degradation when the tissue thaws thereafter. It can also impact the morphological characterization.
NOTE 2 This step can be omitted, if the specimen is transferred directly into standard buffered formalin
solution (see 6.2 and notice the importance of volume of fixative and tissue sectioning to allow adequate
penetration of fixative).
d) the labelling of the container (e.g. registration-number, barcode (1D or 2D), specimen type, quantity,
and organ tissue of origin) and additional documentation [information as specified in 5.1.2, 5.1.3,
and 5.1.4 a) to c)].
Several specimens from the same patient/donor sharing similar features (macroscopic appearance,
tissue type, disease status and anatomical location) may be put into a single container/container
compartment.
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ISO 20166-2:2018(E)
Specimens should be transferred without delay into the container after the removal from the body. The
container then should be kept on wet-ice or at 2 °C to 8 °C in order to minimize protein profile changes.
The temperatures of the container’s surroundings during cold ischemia (e.g. temperatures in different
rooms; transport) should be documented. If the temperature cannot be measured, the temperature
range should be estimated by classification as ambient temperature, room temperature, or at 2 °C to 8 °C.
5.2 Transport requirements
The laboratory in collaboration with the clinical or surgery department shall establish a protocol for
the transport procedure of the specimen.
Temperature monitoring should be applied in a suitable manner.
If the specimen is not already placed into standard buffered formalin solution, it should be transported
on wet-ice or at 2 °C to 8 °C without delay in order to minimize changes to the protein profile.
NOTE There is evidence that proteins in tissues can be stabilized in plastic bags under vacuum when kept
[13]
at 0 °C to 4 °C during transport before the samples are archived for biobanks or used for histopathological
evaluation.
If the specimen is already placed into standard buffered formalin solution outside the laboratory, the
temperature during transport should not exceed room temperature.
The conformity with the protocol for the transport procedure shall be documented. Any deviations
from the protocol shall be described and documented.
6 Inside the laboratory
6.1 Information about the reception of the specimen
The ID or name of the person receiving the specimen shall be documented. The specimen arrival
date and time, and conditions (e.g. labelling, transport conditions including temperature, tissue type
and quantity of the specimen, leaking/breaking of the container) of the received specimens shall be
documented. Any deviations from the established protocol for the transport procedure (see 5.2) shall
be documented.
The correct identity of the specimen shall be checked. This should include the clinical information
(see 5.1.1 and 5.1.3) of the specimen, hospital admission number and/or donor/patient ID, name of the
patient, date of birth of the patient.
6.2 Formalin fixation of the specimen or sample(s)
This procedure is applicable to the specimen, and, in case that one or more parts are taken from a
specimen to the resulting sample(s).
The fixative used should be standard buffered formalin solution.
NOTE 1 In some countries, standard buffered formalin solution is referred to as neutral buffered formalin (NBF).
NOTE 2 There is evidence that the yield of certain proteins, as determined by Western blot examination, can
[14]
be increased by ultrasound mediated acceleration of tissue fixation .
The pH-value of the standard buffered formalin solution should be checked at least once per week
and before use or with every new batch as formalin is not stable (e.g. formaldehyde has a tendency to
[15]
oxidize to formic acid) .
ISO 20166-2:2018(E)
The following steps shall be performed:
a) the consultation of the manufacturer's Safety Data Sheet (SDS) before handling standard buffered
formalin solution;
NOTE Formaldehyde is a carcinogenic and hazardous compound that penetrates the tissue and
chemically modifies biomolecules. However, there are potential different local classifications.
b) the documentation of the time point of placing the tissue specimen or sample into standard buffered
formalin solution;
NOTE The total formalin fixation duration can have an impact on further examinations, e.g.
immunohistochemical techniques, nucleic acid based molecular examinations. The optimal formalin fixation
duration can vary depending on tissue type and size. For larger surgical specimens, e.g. a resected stomach,
inhomogeneous fixation can occur before the grossing process due to slow penetration of formaldehyde
from the surface of the tissue to the interior. Formalin fixation for more than 24 h can lead to a crosslinking
intensity that can impact the protein examination test. It has been shown that the protein yield decreased
[16][17]
with increasing fixation duration .
EXAMPLE For tissue pieces with a thickness of 5 mm, fixation durations between 12 h and 24 h are in
most cases reasonable for an appropriate penetration and fixation. See also 6.7.2.
c) the selection of container(s):
1) the capacity of the containers should be such that the specimen can be completely submerged
into the standard buffered formalin solution. The minimum standard buffered formalin
solution to tissue ratio depends on the tissue concerned, but should be at least 10:1 (volume to
[18]
volume) . To ensure complete formalin fixation of larger specimens, a special tissue handling
such as incision(s) of solid organs or opening of hollow organs should be performed.
Larger specimens may need to be bisected and appropriate portions selected to ensure
adequate fixative penetration. In this case, the standard buffered formalin solution shall be
changed periodically.
2) when using containers pre-filled with standard buffered formalin solution, provider’s product
instructions shall be followed;
3) the container shall be securely closable;
d) the labelling of the container [e.g. by using self-adhesive labels, handwriting, Radio Frequency
Identification Devices (RFID), pre-labelled containers, bar codes] shall ensure appropriate
traceability of specimens or samples. Therefore, the container labelling shall provide the minimum
information of:
1) the patient/donor ID, unique specimen/sample ID and date when the sample was collected,
which all can be in the form of a code (unique for every sample);
2) the basic specimen information, e.g. the tissue type, tissue condition, and related additional
information such as affected (e.g. tumour) or unaffected, unless a sample tracking system can
supply this information coupled to the identification of the specimen or sample used in 6.2 d) 1);
3) the unique numbering of each container, which can be included in 6.2 d) 1);
e) the documentation of types, quantity and description of specimen or samples.
It should be considered that under some disease conditions, such as tumours, molecular features
may not be present homogeneously in the specimen or tissue sample. Therefore, it is important that
the part of the actual specimen or tissue sample used for molecular examination is evaluated by a
medically qualified (e.g. board certified) pathologist (see 6.3). In this context it should be documented
which features of a disease are actually reflected in the tissue specimen or sample used for molecular
examination (e.g. different molecular mechanisms can be activated in the centre and at the invasion
front of the tumour, also tumours can be composed of areas showing different differentiation grades).
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6.3 Evaluation of the pathology of the specimen and selection of the sample(s)
The evaluation and documentation of the pathology of the specimen and the selection of the sample(s)
from the specimen for further processing shall be done by or under supervision or responsibility of a
medically qualified (e.g. board certified) pathologist.
Local, national or regional regulations can apply.
Options to select the sample(s) for protein examination:
a) The selection of appropriate parts of the specimen for molecular and histopathological
examinations as well as for further research purposes shall be done by or under supervision of a
medically qualified (e.g. board certified) pathologist to ensure that the collection of the sample(s)
for protein examination does not compromise the histopathological examination. For molecular
examination, suitable tissue parts should be selected, whereas parts potentially compromising the
molecular examination, such as bleeding and necrotic parts, should be avoided where appropriate.
Microdissection of tissue should be considered to select or enrich for certain cellular features of a
disease.
NOTE 1 Depending on local procedures, the selection of appropriate parts of the specimen can also be
done outside of the laboratory, e.g. in the operating theatre (see 5.1.3).
In the context of the macroscopic evaluation of the surgical specimen before and/or after formalin
fixation, the clinical information (see 5.1.2 and 5.1.3), of the specimen (e.g. type, size, number),
hospital admission number and/or pathology case number and/or donor/patient ID, name of the
patient, date of birth of the patient and type of tissue should be checked. The surgical specimen and
all findings shall be described appropriately according to the guidelines of the respective medical
societies, e.g. societies of pathology, and in correlation with the clinical information and questions,
e.g. patient record or clinician’s request. The anatomic localization represented in the specimen
shall be described, resection margins and other important areas may be marked if necessary
and helpful for later microscopic evaluation; photographs may be taken. Representative samples
for microscopic evaluation shall be taken (i.e. grossing) according to the organ/disease specific
guidelines from the respective medical societies.
NOTE 2 The above described evaluation or documentation can also be done outside of the laboratory, e.g.
in the operating theatre.
b) Where the tissue specimen was removed from the body without the requirement of a
histopathological diagnosis, the documentation of this specimen, the evaluation, selection and
documentation of the samples may be done by other qualified persons than pathologists.
The documentation can include photographs. The size of the samples shall be appropriate for the
tissue cassette (maximum of approximately 3 cm × 2 cm × 0,5 cm). If the specimen is not yet fixed
appropriately, post-fixation can be performed within the tissue cassette. Each tissue cassette shall be
labelled with a unique identifier (e.g. barcode, number, tissue abbreviation). If a single tissue cassette
contains several samples from the same specimen, and the samples represent different features (e.g.
tissue type, disease status, location), this shall be documented.
When the sample taken from the specimen is transferred into the tissue cassette, this time point shall
be documented.
Without delay, the sample shall be placed into either standard buffered formalin solution or, if already
fixed, it should be placed into an alcohol-containing solution (e.g. 70 % ethanol) on the tissue processor.
The total duration of formalin fixation and the temperature during the fixation process shall be
documented.
6.4 Post-fixation of frozen samples
Frozen specimens or samples (e.g. after frozen section diagnosis) can be post-fixed in standard buffered
formalin solution for further paraffin embedding.
ISO 20166-2:2018(E)
In this case, the total formalin fixation duration period shall be documented.
If a formalin-fixed and paraffin-embedded specimen or sample was generated from a frozen specimen
or sample this shall be documented.
6.5 Processing and paraffin embedding
After the specimen or sample is fixed in standard buffered formalin solution, the time point when it is
subsequently placed into an alcohol-containing solution of the tissue processor shall be documented.
Further processing shall be performed in a tissue processor according to the manufacturer’s
instructions.
NOTE 1 During processing, the tissue is dehydrated and water is replaced with paraffin wax. Residual water
[18]
can affect the quality and stability of tissues, including protein, during storage .
The replacement of all reagents shall be done on a regular basis according to the manufacturers'
instructions.
The duration and temperature of paraffin infiltration can impact the biomolecule integrity in fixed
tissue. Paraffin with standardized composition and with low melting temperature for tissue infiltration
should be used. The duration and temperature of each embedding step shall be performed according
to the manufacturers’ instructions or laboratories’ validated protocols. The applied protocol shall be
documented.
NOTE 2 Typical low melting point temperatures for paraffin are in the range from 50 °C to 56 °C.
The paraffin and embedding procedures can have an influence on the quality of proteins especially the
(high) temperature applied and the process duration. The protein examination test shall therefore be
validated and verified for the paraffin embedding processes used. If impacts on the examination test
are recognized, the temperature and/or the duration should be reduced.
6.6 Storage requirements
[19]
FFPE tissue can be stored in several ways, e.g. as blocks, cut sections or as multi tissue arrays .
Storage time may influence the retrieval of a protein or group of proteins over time and thus impact the
[20]
subsequent proteomic measurements . While histology is hardly affected by storage, protein yield
[19]
may decrease with increasing storage time, especially if specimens or samples are stored for years .
Storage conditions, e.g. humidity and temperature, can have an impact on protein amounts in archival
[19]
FFPE tissues .
NOTE 1 One study reported a decreased Western blot signal of proteins isolated from FFPE tissue sections
[21]
depending on the storage temperature and humidity .
In order to minimize protein amount changes, FFPE tissue should be stored dry at room temperature or
preferably at lower temperature.
NOTE 2 Lower storage temperatures (e.g. 2 °C to 8 °C, –20 °C) slow down the protein degradation process
over time.
NOTE 3 If FFPE tissue is not stored dry, the protein degradation can increase, and fungal and bacterial growth
can be stimulated.
For protein isolation, FFPE sections should be freshly prepared. If storage of these sections cannot be
avoided before isolating total protein, they should be stored dry and at room temperature or lower
temperature for as short as possible.
A system for long-term storage of FFPE tissues should be in place. The storage position, storage
temperature and the retrieval of any specimen or sample from the storage system, its use, and its
return to the storage system shall be documented.
10 © ISO 2018 – All rights reserved
ISO 20166-2:2018(E)
6.7 Isolation of the total protein
6.7.1 General
A histopathological characterization of the cellular composition and disease condition of the specimen
or sample shall be performed (e.g. on hematoxylin/eosin (H&E) sections) according to an internationally
[22]
defined histopathological classification (e.g. WHO/IARC Classification of Tumours ). When the
specimen or sample is used for molecular diagnosis, the fraction of target cells shall be evaluated prior
to the protein isolation. The quantity of target cells shall be sufficient to perform the examination. When
the specimen or sample is not used for diagnosis, e.g. for research, a similar approach is recommended.
6.7.2 General information for protein isolation procedures
There are several challenges, including selective or incomplete recovery of proteins, protein degradation
and protein modifications, that shall be taken into account to interpret the results obtained from the
examination test.
Requirements and recommendations:
[19]
a) The optimal fixation duration depends on the tissue type and thickness . Prolonged tissue
fixation can result in reduced protein yields and should be avoided. For a tissue thickness of up to
5 mm the fixation duration should be 12 h to 24 h in standard buffered formalin solution.
b) Starting material for protein purification should be freshly cut sections, with a thickness of up to
[23]
10 µm, obtained from FFPE tissue blocks, manually dissected samples, laser microdissected
[24][25]
(LMD) samples or tissue cores [for, e.g. tissue microarray (TMA)]. Histotechnologists shall
wear gloves. The relevant parts of the microtome, including
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 20166-2
Première édition
2018-12
Analyses de diagnostic moléculaire
in vitro — Spécifications relatives
aux processus préanalytiques pour
les tissus fixés au formol et inclus en
paraffine (FFPE) —
Partie 2:
Protéines extraites
Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-
examinations processes for formalin-fixed and paraffin-embedded
(FFPE) tissue —
Part 2: Isolated proteins
Numéro de référence
©
ISO 2018
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Fax: +41 22 749 09 47
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2018 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Considérations générales . 5
5 Hors du laboratoire . 6
5.1 Recueil des prélèvements . 6
5.1.1 Généralités . 6
5.1.2 Informations relatives au donneur/patient . 6
5.1.3 Informations relatives au prélèvement . 6
5.1.4 Traitement du prélèvement . . 7
5.2 Exigences de transport . 7
6 Dans le laboratoire . 8
6.1 Informations relatives à la réception des prélèvements . 8
6.2 Fixation au formol du prélèvement ou de l’échantillon . 8
6.3 Évaluation de la pathologie du prélèvement et sélection du ou des échantillons . 9
6.4 Post-fixation d’échantillons congelés .10
6.5 Traitement et inclusion en paraffine .11
6.6 Exigences relatives au stockage .11
6.7 Extraction des protéines totales .12
6.7.1 Généralités .12
6.7.2 Informations générales relatives aux protocoles d’extraction de protéines .12
6.7.3 Utilisation de kits commerciaux .12
6.7.4 Utilisation des protocoles propres aux laboratoires .13
6.8 Évaluation qualitative des protéines extraites .14
6.9 Stockage des protéines totales extraites .14
Annexe A (informative) L’analyse de protéines démontre les variations de quantités de
protéines pendant l’ischémie froide .16
Bibliographie .20
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos.
Laboratoires d'analyses de
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 212,
biologie médicale et systèmes de diagnostic in vitro.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 20166 se trouve sur le site web de l’ISO.
iv © ISO 2018 – Tous droits réservés
Introduction
Le diagnostic moléculaire in vitro, y compris la pathologie moléculaire, a permis de faire
considérablement progresser la médecine. D’autres avancées sont attendues avec les nouvelles
technologies d’analyse des acides nucléiques, des protéines et des métabolites dans les tissus
humains et les fluides corporels. Toutefois, les profils et/ou l’intégrité de ces molécules peuvent varier
considérablement au cours du prélèvement des échantillons primaires, du transport, du stockage et du
traitement, et engendrer ainsi un résultat de diagnostic ou de recherche peu fiable, voire impossible, car
l’analyse subséquente ne déterminera pas l’état du patient, mais un motif moléculaire artificiel généré
pendant le processus préanalytique.
Bien que l’extraction de protéines ait initialement été considérée comme impossible en raison des
activités de pontage du formaldéhyde, les techniques d’extraction de protéines de tissus fixés au formol
et inclus en paraffine (FFPE) ont connu une amélioration considérable au cours des dernières années.
L’inversion induite par la chaleur des pontages induits par le formaldéhyde a été démontrée comme
[5][6]
étant une étape essentielle des protocoles d’extraction des protéines . À l’heure actuelle, la plupart
des chercheurs reconnaissent que les protéines extraites de tissus FFPE sont adaptées aux analyses
[7]
protéomiques en aval .
Les profils protéiques, l’intégrité des protéines et les interactions protéine-protéine dans les tissus
peuvent considérablement varier avant, pendant et après le prélèvement (par exemple, en raison de
l’induction de gènes, de la régulation à la baisse de l’expression de gènes ou de la dégradation des
protéines). Les quantités d’espèces protéiques peuvent varier différemment dans les tissus de différents
donneurs/patients. L’expression des gènes peut être influencée par le traitement donné ou l’intervention
réalisée (chirurgie, biopsie) ou par les médicaments administrés pour l’anesthésie, voire même pour
le traitement d’une maladie concomitante, ainsi que par les différentes conditions environnementales
après le prélèvement du tissu sur l’organisme.
En outre, les processus de fixation au formol et d’inclusion en paraffine conduisent à des modifications
des molécules de protéines, ce qui peut avoir un impact sur la validité et la fiabilité des résultats d’essais
analytiques.
Il est donc essentiel de prendre des mesures particulières afin de réduire le plus possible, au sein des
tissus, les changements et modifications de profil protéique décrits, pour l’analyse ultérieure.
Une normalisation de l’ensemble du processus, allant du prélèvement des échantillons primaires jusqu’à
l’analyse des protéines, est nécessaire. Des études ont été réalisées afin de définir les facteurs ayant un
impact important. Le présent document se fonde sur ces travaux pour codifier et normaliser les étapes
des processus dits de la phase préanalytique pour tissus FFPE au regard de l’analyse des protéines.
Dans le présent document, les formes verbales suivantes sont utilisées:
— «doit» indique une exigence;
— «il convient de/que» indique une recommandation;
— «peut/il est admis/permis» indique une autorisation;
— «peut/il est possible» indique une possibilité ou une capacité.
NORME INTERNATIONALE ISO 20166-2:2018(F)
Analyses de diagnostic moléculaire in vitro —
Spécifications relatives aux processus préanalytiques pour
les tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) —
Partie 2:
Protéines extraites
1 Domaine d’application
Le présent document fournit des lignes directrices concernant la manipulation, la documentation, le
stockage et le traitement de prélèvements de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) destinés
à l’analyse des protéines extraites durant la phase préanalytique précédant la réalisation d’une analyse
moléculaire.
Le présent document s’applique aux analyses de diagnostic moléculaire in vitro, y compris les analyses
développées en laboratoire réalisées par des laboratoires de biologie médicale et des laboratoires
de pathologie moléculaire. Il est également destiné à être utilisé par des clients de laboratoires, des
développeurs et fabricants de l’industrie du diagnostic in vitro, ainsi que par des biobanques, des
institutions et des organismes commerciaux spécialisés en recherche biomédicale, de même que des
autorités de réglementation.
Le présent document n’est pas applicable pour l’analyse des protéines par immunohistochimie.
NOTE Des réglementations ou exigences internationales, nationales ou régionales peuvent également
s’appliquer à des sujets spécifiques traités dans le présent document.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 15189:2012, Laboratoires de biologie médicale — Exigences concernant la qualité et la compétence
ISO 15190, Laboratoires de médecine — Exigences pour la sécurité
ISO/IEC 17020:2012, Évaluation de la conformité — Exigences pour le fonctionnement de différents types
d'organismes procédant à l'inspection
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l’ISO 15189, ainsi que les suivants,
s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/.
3.1
aliquote
partie d’une quantité plus importante d’un matériau homogène, prélevée avec une erreur
d’échantillonnage supposée négligeable
Note 1 à l'article: Le terme s’applique généralement à des fluides. Les tissus sont hétérogènes et ne peuvent donc
pas être aliquotés.
Note 2 à l'article: La définition est issue des Références [28], [29] et [30].
3.2
température ambiante
température non régulée de l’air environnant
3.3
analyte
composant indiqué dans le nom d’une grandeur mesurable
[SOURCE: ISO 17511:2003, 3.2, modifiée — l’EXEMPLE a été supprimé.]
3.4
performance analytique
l’exactitude, la précision et la sensibilité d’une analyse pour mesurer l’analyte (3.3) concerné
Note 1 à l'article: D’autres caractéristiques de performance d’analyse, telles que la robustesse ou la répétabilité,
peuvent également s’appliquer.
3.5
ischémie froide
état d’un tissu suite à son prélèvement de l’organisme jusqu’à sa stabilisation ou sa fixation
3.6
diagnostic
identification d’un état de santé sain ou pathologique à partir de ses signes et/ou symptômes, dans
laquelle le processus de diagnostic peut impliquer des analyses (3.7) et essais pour la classification
de l’état d’un individu en catégories ou sous-classes distinctes, laquelle permet la prise de décisions
médicales concernant le traitement et le pronostic à établir
3.7
analyse
phase analytique
ensemble des opérations destinées à déterminer la valeur ou les caractéristiques d’une propriété
Note 1 à l'article: Les processus débutent avec l’analyte extrait et comprennent toutes sortes d’essais
paramétriques ou une manipulation chimique en vue de réaliser l’analyse quantitative ou qualitative.
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.7, modifiée — Les Notes à l’Article 1 à 3 ont été supprimées, la Note 1 à
l’article a été ajoutée, le terme «examen» a été remplacé par «analyse» et «phase analytique» a été
ajouté comme terme privilégié.]
3.8
formol
solution aqueuse saturée en formaldéhyde qui, à 100 %, contient 37 % de formaldéhyde en masse
(correspondant à 40 % en volume)
3.9
fixation au formol
traitement d’un échantillon avec une solution de formol tamponnée standard (3.21) à des fins de
stabilisation
2 © ISO 2018 – Tous droits réservés
3.10
macroscopie
analyse macroscopique
contrôle de prélèvements pathologiques à l’œil nu, au cours de leur traitement à des fins d’analyse
microscopique ultérieure, en vue d’obtenir des informations de diagnostic
3.11
inclusion en paraffine
processus dans lequel un échantillon (3.19) de tissu est placé dans de la paraffine en vue d’obtenir une
matrice rigide environnante permettant le découpage de fines coupes microscopiques
3.12
processus préanalytique
phase préanalytique
flux de travail préanalytique
processus commençant chronologiquement par la prescription des analyses par le clinicien, comprenant
la demande d’analyse, la préparation et l’identification du patient, le prélèvement de l’échantillon
primaire, son acheminement jusqu’au laboratoire et au sein du laboratoire médical ou de pathologie,
l’extraction des analytes, et finissant au début de l’analyse
Note 1 à l'article: La phase préanalytique comprend des processus de préparation, par exemple des protocoles
d’extraction des protéines, qui influencent le résultat prévu de l’analyse.
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.15, modifiée — «Flux de travail préanalytique» a été ajouté comme terme
privilégié, la Note 1 à l’article a été ajoutée et la définition a été complétée.]
3.13
échantillon primaire
prélèvement
spécimen
partie discrète d’un liquide corporel, d’une haleine, d’un cheveu ou d’un tissu prélevé à des fins
d’examens, d’étude ou d’analyse (3.7) d’une ou plusieurs grandeurs ou propriétés pour déterminer le
caractère de l’ensemble
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.16, modifiée — Les Notes à l’Article 1 à 3 ont été supprimées.]
3.14
protéine
type de macromolécules biologiques composées d’une ou plusieurs chaînes avec une séquence définie
d’acides aminés reliés par des liaisons peptidiques
3.15
profil protéique
quantités de molécules de protéines (3.14) individuelles qui sont présentes dans un échantillon et qui
peuvent être mesurées en l’absence de toute perte, inhibition et interférence
3.16
espèce protéique
quantités d’une protéine clairement définie d’un point de vue chimique, correspondant à un spot sur
une image d’électrophorèse bidimensionnelle sur gel à haute performance
Note 1 à l'article: La définition est issue de la Référence [7].
3.17
modification post-traductionnelle
modifications chimiques d’une structure protéique primaire, souvent cruciales pour conférer une
activité biologique à une protéine
Note 1 à l'article: La définition est issue de la Référence [8].
3.18
température de laboratoire
pour les besoins du présent document, température dans la plage de 18 °C à 25 °C
Note 1 à l'article: Des réglementations locales ou nationales peuvent stipuler des définitions différentes.
3.19
échantillon
une ou plusieurs parties prélevées à partir d’un échantillon primaire (3.13)
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.24, modifiée — L’EXEMPLE a été supprimé.]
3.20
stabilité
capacité d’un échantillon, lorsqu’il est entreposé dans des conditions spécifiées, à conserver une valeur
de propriété spécifiée dans des limites spécifiées pendant une période de temps spécifiée
Note 1 à l'article: L’analyte pour les besoins du présent document est composé de protéines extraites.
[SOURCE: Guide ISO 30:2015, 2.1.15, modifiée — L’expression «matériau de référence» a été remplacée
par «échantillon», «caractéristique» a été remplacée par «capacité» et la Note 1 à l’article a été modifiée.]
3.21
solution de formol tamponnée standard
formol neutre tamponné
NBF
solution de formol (3.8) à 10 % dans l’eau, avec une fraction massique de 3,7 % (correspondant à une
fraction volumique de 4 %) de formaldéhyde, tamponnée entre un pH 6,8 et un pH 7,2
Note 1 à l'article: Les solutions de formol tamponnées standard contiennent souvent de petites quantités de
méthanol pour inhiber l’oxydation et la polymérisation du formaldéhyde.
3.22
stockage
interruption prolongée du flux de travail préanalytique (3.12) d’un échantillon, d’un analyte,
respectivement, ou de leurs dérivés, tels que des coupes colorées ou des blocs de tissus, dans des
conditions appropriées afin de préserver leurs propriétés
Note 1 à l'article: Le stockage à long terme a généralement lieu dans les sites d’archivage des laboratoires ou dans
les biobanques.
3.23
appareil de préparation des tissus
instrument automatisé où la fixation, la déshydratation, le nettoyage et l’infiltration de paraffine des
tissus sont opérés
3.24
validation
confirmation, par des preuves tangibles, que les exigences pour une utilisation spécifique ou une
application prévue ont été satisfaites
Note 1 à l'article: Le terme «validé» est utilisé pour désigner l’état correspondant.
[SOURCE: ISO 9000:2015, 3.8.13, modifiée — Les Notes à l’Article 1 et 3 ont été supprimées.]
3.25
ischémie chaude
situation avant que le tissu soit prélevé de l’organisme, mais dans laquelle il est privé de son apport
sanguin normal
4 © ISO 2018 – Tous droits réservés
3.26
flux de travail
série d’activités nécessaires à la réalisation d’une tâche
3.27
homogène
de structure et de composition uniformes
4 Considérations générales
Pour les instructions générales relatives aux systèmes de management de la qualité de laboratoire
de biologie médicale et portant en particulier sur le prélèvement, la réception et la manipulation
d’échantillons primaires (y compris la prévention des contaminations croisées), voir l’ISO 15189:2012,
4.2, 5.4.4, 5.4.6 ou l’ISO/IEC 17020:2012, Article 8 et 7.2. Les exigences relatives aux équipements
de laboratoire, aux réactifs et aux consommables conformément à l’ISO 15189:2012, 5.3 doivent
être respectées; l’ISO 15189:2012, 5.5.1.2 et 5.5.1.3 et l’ISO/IEC 17020:2012, 6.2 peuvent également
s’appliquer.
Toutes les étapes d’un flux de travail de diagnostic peuvent influencer le résultat final de l’analyse.
Par conséquent, le flux de travail complet, y compris la stabilité des biomolécules et les conditions de
stockage des échantillons, doit être vérifié et validé. Les étapes du flux de travail qui ne peuvent pas
toujours être contrôlées (par exemple, l’ischémie chaude) doivent être documentées. Une évaluation des
risques des étapes non contrôlables du flux de travail, incluant leur impact potentiel sur la performance
analytique, doit être réalisée et des mesures d’atténuation doivent être mises en place pour obtenir la
performance analytique requise.
Avant le développement et la mise en œuvre d’une analyse, il convient d’étudier la stabilité de la ou des
protéines spécifiques concernées et leurs modifications post-traductionnelles (si elles sont importantes
pour l’analyse) durant l’ensemble du processus préanalytique (par exemple en réalisant une expérience
ou une étude cinétique; voir également l’Annexe A et la Référence [9]).
Avant que les tissus ne soient fixés dans une solution de formol tamponnée standard, les quantités,
les conformations et l’état des liaisons des protéines peuvent changer, par exemple par dégradation et
synthèse modifiée des protéines suite à l’induction de gènes, la régulation à la baisse de l’expression
de gènes, la dégradation de l’ARN, et des changements des voies biochimiques et d’état énergétique.
Ces effets dépendent de la durée des ischémies chaude et froide et de la température ambiante avant
la fixation au formol. De plus, les effets décrits peuvent varier dans les tissus de différents donneurs/
patients.
En général, plus les durées d’ischémies chaude et froide sont longues et plus la température ambiante
est élevée avant la fixation du prélèvement tissulaire, plus le risque est élevé de voir se produire des
modifications du profil protéique.
NOTE Une ischémie froide prolongée entraîne des modifications des quantités de protéines (par exemple,
[9][10]
de la cytokératine 18) et de phosphoprotéines (par exemple, phospho-p42/44) . La conservation du
[11]
prélèvement sur un bain de glace atténue cet effet . Les quantités de protéines ainsi que les modifications
des protéines peuvent également varier en fonction de l’origine et du type du tissu, de la maladie sous-jacente,
de l’intervention chirurgicale, du traitement et des médicaments administrés pour l’anesthésie ou pour le
traitement d’une maladie concomitante, ainsi qu’en fonction des différentes conditions environnementales après
le prélèvement du tissu sur l’organisme.
Comme une normalisation de l’ischémie chaude n’est pas facilement réalisable, sa durée doit être
documentée. Lorsqu’il n’est pas possible d’éviter l’ischémie froide, sa durée doit être documentée et les
températures aux abords du récipient du prélèvement doivent être consignées. Lorsque le prélèvement
est transporté vers un autre établissement pour la fixation au formol, la durée du transport doit être
documentée et il convient de documenter également les conditions ambiantes.
De plus, la fixation au formol elle-même, ainsi que la durée et la température du stockage subséquent
des tissus FFPE, entraînent des modifications des biomolécules et conduisent à une performance sous-
[12]
optimale des protéines extraites des tissus FFPE . Il convient de tenir compte de ce fait dans le
contrôle de la qualité et l’application des analyses moléculaires. L’optimisation des analyses des tissus
FFPE ou l’utilisation de méthodes sans agent de pontage en remplacement de la solution de formol
tamponnée standard sont des options pour réduire le plus possible ce problème en vue des analyses
moléculaires.
Les instructions en matière de sécurité pour le transport et la manipulation doivent être prises en
considération et respectées conformément à l’ISO 15189:2012, 5.2.3 et 5.4.5, et à l’ISO 15190.
Des précautions doivent être prises au cours de l’ensemble du processus préanalytique afin d’éviter
toute contamination croisée entre les différents prélèvements/échantillons, par exemple en utilisant,
dans la mesure du possible, du matériel à usage unique ou en mettant en place des méthodes de
nettoyage appropriées entre les traitements des différents prélèvements/échantillons.
Si un produit commercial n’est pas utilisé selon les instructions du fabricant, la responsabilité de son
utilisation et de sa performance incombe à l’utilisateur.
5 Hors du laboratoire
5.1 Recueil des prélèvements
5.1.1 Généralités
Pour le recueil du prélèvement, il convient de prendre en compte les exigences (par exemple, pathologie,
taille du prélèvement) applicables à l’analyse moléculaire prévue (voir également l’Article 6).
Voir également l’ISO 15189:2012, 5.4.4.
5.1.2 Informations relatives au donneur/patient
La documentation doit inclure l’identifiant du donneur/patient, lequel peut se présenter sous la forme
d’un code.
Il convient que la documentation comprenne, sans toutefois s’y limiter:
a) l’état de santé correspondant du donneur/patient (par exemple, sain, type de maladie, maladie
concomitante, données démographiques [âge et sexe, par exemple]);
b) les informations concernant le traitement médical de routine et le traitement particulier avant le
prélèvement du tissu (par exemple, anesthésiques, médicaments, protocoles chirurgicaux ou de
diagnostic);
c) le consentement approprié du donneur/patient.
5.1.3 Informations relatives au prélèvement
La documentation doit mentionner, sans toutefois s’y limiter:
a) le début d’ischémie dans l’organisme (ischémie chaude) établi par une documentation de l’heure
de la ligature/du clampage du vaisseau concerné par l’ischémie (généralement l’heure du clampage
artériel);
b) l’heure et la date auxquelles le tissu est prélevé sur l’organisme, ainsi que la méthode de prélèvement
(par exemple, microbiopsie au trocart, résection, dispositif de biopsie utilisé pour le prélèvement);
c) la description du type et de l’origine du tissu, de l’état du tissu (par exemple, pathologique, exempt
de la maladie), y compris les références de tout marquage réalisé par le chirurgien, le radiologue ou
le pathologiste à l’intérieur ou à l’extérieur du bloc opératoire;
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d) les étapes de documentation décrites en 6.2, si la fixation au formol commence hors du laboratoire,
ainsi que les étapes de documentation décrites en 6.3, si l’évaluation de la pathologie du prélèvement
et la sélection du ou des échantillons sont également effectuées en dehors du laboratoire.
Il convient que la documentation inclue l’identifiant de la personne responsable du prélèvement de
l’échantillon primaire.
5.1.4 Traitement du prélèvement
Les étapes suivantes doivent être suivies:
a) la documentation de tout ajout ou changement apporté à l’échantillon primaire après le prélèvement
sur l’organisme (par exemple, étiquetage pour l’orientation du prélèvement [tel que marquage à
l’encre, points de suture(s), incision(s)]);
b) la sélection et l’utilisation de récipients et d’emballages (par exemple, boîte réfrigérante, boîte pour
stockage et transport, emballage sous vide), conformément aux réglementations de transport en
vigueur;
c) la sélection et l’utilisation de méthodes de stabilisation (par exemple, techniques de réfrigération)
en vue du transport;
NOTE 1 Une congélation accidentelle du tissu (dues par exemple à l’utilisation à mauvais escient de blocs
réfrigérants) peut mener à une dégradation des protéines lorsque le tissu se décongèle par la suite. Elles
peuvent également avoir un impact sur la caractérisation morphologique.
NOTE 2 Cette étape peut être omise si le prélèvement est transféré directement dans une solution de
formol tamponnée standard (voir 6.2 et observer l’importance du volume de fixateur et de coupe de tissus
pour permettre une pénétration adéquate du fixateur).
d) l’étiquetage du récipient (par exemple, numéro d’enregistrement, code-barres (1D ou 2D), type
de prélèvement, quantité et organe d’origine du tissu) et une documentation supplémentaire
[informations spécifiées en 5.1.2, 5.1.3 et 5.1.4, a) à c)].
Plusieurs prélèvements issus du même patient/donneur et partageant des caractéristiques communes
(aspect macroscopique, type de tissu, état pathologique et emplacement anatomique) peuvent être
placés dans un même récipient/compartiment de récipient.
Il convient de transférer sans délai les prélèvements dans le récipient après l’ablation sur l’organisme.
Il convient ensuite de conserver le récipient sur un bain de glace ou entre 2 °C et 8 °C afin de réduire le
plus possible les modifications de profils protéiques.
Il convient de consigner les températures de l’environnement du récipient durant l’ischémie froide (par
exemple, les températures dans les différents locaux, pendant le transport). Si la température ne peut
pas être mesurée, il convient d’évaluer la plage de températures en la classant comme température
ambiante, température de laboratoire ou entre 2 °C et 8 °C.
5.2 Exigences de transport
Le laboratoire partenaire du service clinique ou chirurgical doit établir un protocole pour la méthode
de transport du prélèvement.
Il convient de mettre en œuvre une surveillance de la température de manière appropriée.
Si le prélèvement n’est pas déjà placé dans la solution de formol tamponnée standard, il convient de
l’acheminer sans délai sur un bain de glace ou entre 2 °C et 8 °C afin de réduire le plus possible les
modifications du profil protéique.
NOTE Il a été montré que les protéines présentes dans les tissus peuvent être stabilisées dans des sacs en
[13]
plastique sous vide lorsque les tissus sont maintenus entre 0 °C et 4 °C au cours du transport avant que les
échantillons soient archivés pour les biobanques ou utilisés pour l’évaluation histopathologique.
Si le prélèvement a déjà été placé dans la solution de formol tamponnée standard hors du laboratoire, il
convient de ne pas dépasser la température de laboratoire au cours du transport.
La conformité au protocole de la méthode de transport doit être consignée. Tout écart au protocole doit
être décrit et documenté.
6 Dans le laboratoire
6.1 Informations relatives à la réception des prélèvements
L’identifiant ou le nom de la personne réceptionnant le prélèvement doit être consigné. La date et l’heure
d’arrivée du prélèvement, ainsi que les conditions (par exemple, étiquetage, conditions de transport
incluant la température, le type et la quantité de tissu du prélèvement, fuite/bris du récipient) des
prélèvements reçus doivent être consignées. Tout écart au protocole établi pour la méthode de transport
(voir 5.2) doit être consigné.
L’identité correcte du prélèvement doit être vérifiée. Il convient que cela comprenne les informations
cliniques (voir 5.1.1 et 5.1.3) du prélèvement, du numéro d’admission à l’hôpital et/ou de l’identifiant du
donneur/patient, le nom du patient et la date de naissance du patient.
6.2 Fixation au formol du prélèvement ou de l’échantillon
Cette méthode s’applique aux prélèvements et, dans le cas où une ou plusieurs pièces sont prélevées à
partir d’un échantillon primaire, à l’échantillon ou aux échantillons en résultant.
Il convient que le fixateur utilisé soit une solution de formol tamponnée standard.
NOTE 1 Dans certains pays, la solution de formol tamponnée standard est appelée formol neutre tamponné
(NBF).
NOTE 2 Il a été montré que certains rendements en protéines, tels que déterminés par le transfert de protéines
[14]
(Western blot), peuvent être augmentés par une accélération de la fixation des tissus induite par ultrasons .
Il convient de vérifier le pH de la solution de formol tamponnée standard au moins une fois par semaine
avant utilisation ou à chaque nouveau lot, étant donné que le formol n’est pas stable (le formaldéhyde a
[15]
par exemple tendance à s’oxyder en acide formique) .
Les étapes suivantes doivent être suivies:
a) la consultation de la fiche de données de sécurité fournie par le fabricant (FDS) avant la
manipulation de la solution de formol tamponnée standard;
NOTE Le formaldéhyde est un composé cancérigène et dangereux qui pénètre dans le tissu et modifie
chimiquement les biomolécules. Cependant, il existe potentiellement différentes classifications locales.
b) la documentation de l’heure d’introduction du prélèvement ou de l’échantillon de tissu dans la
solution de formol tamponnée standard;
NOTE La durée totale de la fixation au formol peut avoir un impact sur les analyses subséquentes, telles
que les techniques immunohistochimiques et les analyses moléculaires basées sur l’utilisation des acides
nucléiques. La durée optimale de la fixation au formol peut varier selon le type et la taille du tissu. Dans le
cas d’un prélèvement chirurgical de plus grandes dimensions, comme, par exemple, un estomac réséqué,
une fixation hétérogène peut se produire avant le processus de découpe en petites pièces en raison de la
lente pénétration du formaldéhyde de la surface vers l’intérieur du tissu. Une fixation au formol d’une durée
supérieure à 24 h peut induire une intensité de pontage qui peut avoir un impact sur l’analyse des protéines.
[16][17]
Il a été démontré que le rendement en protéines diminuait avec l’augmentation de la durée de fixation .
EXEMPLE Pour les pièces de tissus d’une épaisseur de 5 mm, des durées de fixation entre 12 h et 24 h
sont satisfaisantes dans la plupart des cas pour obtenir une pénétration et une fixation appropriées. Voir
également 6.7.2.
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c) la sélection du ou des récipients:
1) il convient que la capacité des récipients permette de plonger entièrement le prélèvement dans
la solution de formol tamponnée standard. Le rapport minimal entre la solution de formol
tamponnée standard et le tissu dépend du tissu concerné, mais il convient qu’il soit d’au moins
[18]
10:1 (volume à volume) . Pour garantir que la fixation au formol de prélèvements de plus
grandes dimensions soit complète, il convient de procéder à une manipulation particulière du
tissu, telle que la réalisation d’une ou plusieurs incisions des organes solides ou l’ouverture des
organes creux;
Il peut être nécessaire de diviser en deux des prélèvements de plus grandes dimensions et de
sélectionner des parties appropriées pour assurer une pénétration adéquate du fixateur. Dans
pareil cas, la solution de formol tamponnée standard doit être changée régulièrement;
2) lors de l’utilisation de récipients préremplis avec une solution de formol tamponnée standard,
les instructions fournies par le fabricant du produit doivent être suivies;
3) le récipient doit pouvoir être fermé hermétiquement;
d) l’étiquetage du récipient (par exemple, en utilisant des étiquettes autocollantes, un marquage
manuscrit, un dispositif d’identification par radiofréquence [RFID], des récipients préétiquetés ou
des codes-barres) doit garantir la traçabilité adéquate des prélèvements ou des échantillons. Par
conséquent, l’étiquetage du récipient doit fournir au minimum les informations suivantes:
1) l’identifiant du patient/donneur, l’identifiant unique du prélèvement/de l’échantillon et la date
à laquelle l’échantillon a été prélevé, qui peuvent tous se présenter sous la forme d’un code
(unique pour chaque échantillon);
2) les informations de base du prélèvement portant notamment sur le type et l’état du tissu, ainsi
que des informations complémentaires telles que tissu affecté (par exemple, tumeur) ou tissu
non affecté, à moins qu’un système de suivi des échantillons puisse fournir ces informations
liées à l’identification du prélèvement ou de l’échantillon utilisé en 6.2 d) 1);
3) la numérotation unique de chaque récipient, qui peut être incluse dans le code de 6.2 d) 1);
e) la documentation des types, de la quantité et de la description des prélèvements ou échantillons.
Il convient de tenir compte du fait que dans certaines pathologies telles que des tumeurs, les
caractéristiques moléculaires peuvent ne pas être présentes de manière homogène dans le prélèvement
ou l’échantillon de tissu. Il importe donc que la partie du prélèvement ou de l’échantillon de tissu
effectivement utilisée pour l’analyse moléculaire soit évaluée par un professionnel de santé (par
exemple, un docteur en médecine détenteur d’un certificat de spécialiste en anatomopathologie)
(voir 6.3). Dans ce contexte, il convient de documenter quelles caractéristiques d’une pathologie sont
effectivement reflétées dans le prélèvement ou l’échantillon de tissu utilisé pour l’analyse moléculaire
(par exemple, différents mécanismes moléculaires peuvent être activés au centre de la tumeur et au
front d’invasion tumoral, de même que les tumeurs peuvent être composées de zones présentant divers
degrés de différenciation).
6.3 Évaluation de la pathologie du prélèvement et sélection du ou des échantillons
L’évaluation et la documentation de la pathologie du prélèvement, de même que la sélection du ou des
échantillons issus du prélèvement pour son/leur traitement supplémentaire, doivent être effectuées
par ou sous la supervision ou la responsabilité d’un professionnel de santé (par exemple, docteur en
médecine détenteur d’un certificat de spécialiste en anatomopathologie).
Des réglementations nationales, régionales ou locales peuvent s’appliquer.
Options de sélection du ou des échantillons pour l’analyse des protéines:
a) La sélection des pièces appropriées du prélèvement pour des analyses moléculaires et
histopathologiques, ainsi qu’à des fins de recherches complémentaires, doit être effectuée par
ou sous la supervision d’un professionnel de santé (par exemple, docteur en médecine détenteur
d’un certificat de spécialiste en anatomopathologie), afin de garantir que le prélèvement du ou
des échantillons destinés à l’analyse des protéines ne compromet pas l’analyse histopathologique.
Il convient de sélectionner des pièces de tissu appropriées pour l’analyse moléculaire et d’éviter
les pièces susceptibles de la compromettre le cas échéant, telles que les parties hémorragiques ou
nécrotiques. Il convient d’envisager la microdissection de tissu pour sélectionner ou compléter
certaines caractéristiques cellulaires d’une maladie.
NOTE 1 En fonction des procédures locales, la sélection des pièces appropriées du prélèvement peut
également être réalisée hors du laboratoire, par exemple dans le bloc opératoire (voir 5.1.3).
Dans le cadre de l’examen macroscopique du prélèvement chirurgical avant et/ou après la fixation
au formol, il convient de vérifier les informations cliniques (voir 5.1.2 et 5.1.3) du prélèvement (par
exemple, le type, la taille, le nombre), le numéro d’admission à l’hôpital et/ou le numéro de dossier
de pathologie et/ou l’identifiant du donneur/patient, le nom du patient, la date de naissance du
patient et le type de tissu. Le prélèvement chirurgical et tous les résultats doivent être décrits de
manière appropriée conformément aux lignes directrices des sociétés médicales respectives, telles
que les sociétés de pathologie, et en corrélation avec les informations et questions cliniques, telles
que le dossier médical du patient ou la prescription des analyses par le clinicien. Le site anatomique
représenté par le prélèvement doit être décrit, les limites marginales de résection et autres zones
importantes peuvent être marquées si nécessaire et s’avérer utiles pour un examen microscopique
ultérieur; des photographies peuvent être prises. Des échantillons représentatifs doivent être pris
(c’est-à-dire découpés en petites pièces) aux fins d’une évaluation microscopique conformément
aux lignes directrices spécifiques aux organes/pathologies, adoptées par les sociétés médicales
respectives.
NOTE 2 L’évaluation ou la documentation décrites ci-dessus peuvent également être réalisées hors du
laboratoire, par exemple dans le bloc opératoire.
b) Lorsque l’échantillon primaire de tissu a été prélevé sur l’organisme en absence d’une exigence
de diagnostic histopathologique, la documentation de ce prélèvement, ainsi que l’évaluation, la
sélection et la documentation des échantillons peuvent être effectuées par des personnes qualifiées
autres que des pathologistes.
La documentation peut inclure des photographies. La taille des échantillons doit être appropriée pour
la cassette d’inclusion (environ 3 cm × 2 cm × 0,5 cm au maximum). Si le prélèvement n’est pas encore
fixé de manière appropriée, une post-fixation peut être réalisée dans la cassette d’inclusion. Chaque
cassette d’i
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
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