ISO 10993-10:2021
(Main)Biological evaluation of medical devices — Part 10: Tests for skin sensitization
Biological evaluation of medical devices — Part 10: Tests for skin sensitization
This document specifies the procedure for the assessment of medical devices and their constituent materials with regard to their potential to induce skin sensitization. This document includes: — details of in vivo skin sensitization test procedures; — key factors for the interpretation of the results. NOTE Instructions for the preparation of materials specifically in relation to the above tests are given in Annex A.
Évaluation biologique des dispositifs médicaux — Partie 10: Essais de sensibilisation cutanée
Le présent document spécifie le mode opératoire pour l'évaluation du potentiel des dispositifs médicaux et de leurs matériaux constitutifs à provoquer une sensibilisation cutanée. Le présent document comprend: — des informations détaillées relatives aux modes opératoires d'essai de sensibilisation cutanée in vivo; — les facteurs clés pour l'interprétation des résultats. NOTE Des instructions pour la préparation des matériaux spécifiquement pour les essais ci-dessus sont données dans l'Annexe A.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10993-10
Fourth edition
2021-11
Biological evaluation of medical
devices —
Part 10:
Tests for skin sensitization
Évaluation biologique des dispositifs médicaux —
Partie 10: Essais de sensibilisation cutanée
Reference number
© ISO 2021
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on
the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below
or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: +41 22 749 01 11
Email: copyright@iso.org
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .v
Introduction . vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 General principles — Step-wise approach . 3
5 Pretest considerations.4
5.1 General . 4
5.2 Types of material . 4
5.2.1 Initial considerations . 4
5.2.2 Ceramics, metals and alloys . 4
5.2.3 Polymers . 4
5.2.4 Biologically derived materials . 4
5.3 Information on chemical composition . 4
5.3.1 General . 4
5.3.2 Existing data sources . 5
6 Skin sensitization tests . 5
6.1 Choice of test methods . 5
6.2 Murine local lymph node assay . 6
6.2.1 Principle . 6
6.2.2 Test sample preparation . 6
6.2.3 Animals and husbandry . 6
6.2.4 Test procedure. 7
6.2.5 Treatment groups . 8
6.2.6 Determination of cellular proliferation and tissue preparation . 8
6.2.7 Results and interpretation . 9
6.2.8 Test report . 9
6.3 Guinea pig assays for the detection of skin sensitization . 9
6.3.1 Principle . 9
6.3.2 Choice of test sample concentrations . 10
6.3.3 Induction . 10
6.3.4 Challenge . 10
6.4 Important factors affecting the outcome of the test . 10
6.5 Guinea pig maximization test . 11
6.5.1 Principle . 11
6.5.2 Test sample preparation . 11
6.5.3 Animals and husbandry . 11
6.5.4 Test procedure.12
6.5.5 Observation of animals . 14
6.5.6 E valuation of results . 14
6.5.7 Test report .15
6.6 Closed-patch test (Buehler test) . 15
6.6.1 Principle . 15
6.6.2 Test sample preparation . 15
6.6.3 Animals and husbandry . 15
6.6.4 Test procedure. 16
6.6.5 Observation of animals . 17
6.6.6 E valuation of results . 17
6.6.7 Test report . 17
7 Key factors in interpretation of test results .18
Annex A (normative) Preparation of materials for skin sensitization testing .19
iii
Annex B (informative) Method for the preparation of extracts from polymeric test
materials .21
Annex C (informative) Non-animal methods for skin sensitization .24
Annex D (informative) Background information on sensitization tests for skin sensitization .37
Bibliography .40
iv
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 194 Biological and clinical evaluation of
medical devices, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 206, Biological and clinical evaluation of medical devices, in accordance with the
Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This fourth edition cancels and replaces the third edition (ISO 10993-10:2010), which has been
technically revised.
The main changes compared to the previous edition are as follows:
— this document now contains a description of skin sensitization testing only;
— Annex C on non-animal methods for skin sensitization (formerly Annex D) has been updated;
— the testing for irritation is now described in ISO 10993-23.
A list of all parts in the ISO 10993 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
v
Introduction
This document assesses possible contact hazards from chemicals released from medical devices, which
may produce skin sensitization.
Some materials that are included in medical devices have been tested, and their skin sensitization
potential has been documented. Especially for dental materials, sensitizing properties were reported
—see Reference [51]. Other materials and their chemical components have not been tested and may
induce adverse effects when in contact with human tissue. The manufacturer is thus obliged to evaluate
each device for potential adverse effects prior to marketing.
Traditionally, small animal tests are performed prior to testing on humans to help predict human
response (background information is provided in Annex D). Since 2015, several in chemico and in vitro
assays have been validated and Organization for Economic Co-operation and Development (OECD) test
[75][79][104]
guidelines released to assess the skin sentization potential of chemicals. An overview of
available alternative skin sensitization tests for neat chemicals is given in Annex C. These test methods,
each developed to address a specific key event, can possibly not be sufficient alone to conclude on
the presence or absence of skin sensitization potential of chemicals and should be considered in the
context of integrated approaches such as integrated approaches to testing and assessment (IATA),
combining them with other complementary information. Note that the in vitro and in chemico tests for
skin sensitization in Annex C have thus far been validated only for neat chemicals and not for medical
devices. To confirm that they are applicable for evaluation of the skin sensitization potential of medical
devices, their assays need to be assessed and validated.
Where appropriate, the preliminary use of in vitro methods is encouraged for screening purposes prior
to animal testing. To reduce the number of animals used, this document presents a step-wise approach,
with review and analysis of test results at each stage. It is intended that, for regulatory submission, skin
sensitization studies be conducted using GLP or ISO/IEC 17025 as applicable to the respective country
and comply with regulations related to animal welfare. Statistical analyses of data are recommended
and used whenever appropriate. This document includes important tools for the development of safe
products and is intended for use by professionals, appropriately qualified by training and experience,
who can interpret its requirements and judge the outcomes of the evaluation for each medical device,
taking into consideration all the factors relevant to the device, its intended use and the current
knowledge of the medical device provided by review of the scientific literature and previous clinical
experience.
This document is based on numerous standards and guidelines, including OECD Guidelines,
US Pharmacopoeia and the European Pharmacopoeia. It is intended to be the basic document for the
selection and conduct of tests enabling the evaluation of dermal sensitization responses relevant to the
safety of medical materials and devices.
vi
INTERNATIONAL STANDARD ISO 10993-10:2021(E)
Biological evaluation of medical devices —
Part 10:
Tests for skin sensitization
1 Scope
This document specifies the procedure for the assessment of medical devices and their constituent
materials with regard to their potential to induce skin sensitization.
This document includes:
— details of in vivo skin sensitization test procedures;
— key factors for the interpretation of the results.
NOTE Instructions for the preparation of materials specifically in relation to the above tests are given in
Annex A.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 10993-1, Biological evaluation of medical devices — Part 1: Evaluation and testing within a risk
management process
ISO 10993-2, Biological evaluation of medical devices — Part 2: Animal welfare requirements
ISO 10993-12, Biological evaluation of medical devices — Part 12: Sample preparation and reference
materials
ISO 10993-18, Biological evaluation of medical devices — Part 18: Chemical characterization of medical
device materials within a risk management process
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 10993-1 and the following
apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
allergen
sensitizer
substance or material that is capable of inducing a specific hypersensitivity reaction upon repeated
contact with that substance or material
3.2
allergic contact dermatitis
clinical diagnosis based on an observed immunologically-mediated cutaneous reaction to a substance
3.3
blank
extraction vehicle (3.17) not containing the test material (3.15), retained in a vessel identical to that
which holds the test material and subjected to identical conditions to which the test material is
subjected during its extraction
Note 1 to entry: The purpose of the blank control is to evaluate possible confounding effects due to the extraction
vessel, vehicle and extraction process.
3.4
challenge
process following the induction (3.8) phase, in which the immunological effects of subsequent exposures
in an individual to the inducing material are examined
3.5
elicitation
immunological reaction to exposure to a sensitizer in a previously sensitized individual
3.6
erythema
reddening of the skin or mucous membrane
3.7
extract
liquid that results from extraction of the test sample (3.16) or control
[SOURCE: ISO 10993-12:2021, 3.6]
3.8
induction
process that leads to the de novo generation of an enhanced state of immunological activity in an
individual, after initial exposure to a specific material
3.9
irritant
agent that produces irritation (3.10)
3.10
irritation
localized non-specific inflammatory response to single, repeated or continuous application of a
substance/material
Note 1 to entry: Skin irritation is a reversible reaction and is mainly characterized by symptoms like local
erythema (3.6) (redness), swelling, itching, peeling, cracking and scaling of the skin.
3.11
negative control
well-characterized material or substance that, when evaluated by a specific test method, demonstrates
the suitability of the procedure to yield a reproducible, appropriately negative, non-reactive or minimal
response in the test system
Note 1 to entry: In practice, negative controls include blanks (3.3), vehicles (3.17)/solvents and reference
materials.
[SOURCE: ISO 10993-12:2021, 3.10, modified — Note 1 to entry has been replaced.]
3.12
oedema
swelling due to abnormal infiltration of fluid into the tissues
3.13
positive control
well-characterized material or substance that, when evaluated by a specific test method, demonstrates
the suitability of the test system to yield a reproducible, appropriately positive or reactive response in
the test system
3.14
skin sensitization
T-cell mediated delayed-type hypersensitivity reaction induced by low molecular weight reactive
chemicals (allergens) comprising two phases, induction and elicitation
Note 1 to entry: In humans, the responses can be characterized by pruritis, erythema (3.6), oedema (3.12),
papules, vesicles, bullae or a combination of these. In other species, the reactions can differ and only erythema
and oedema can be seen.
3.15
test material
material, device, device portion or component thereof that is sampled for biological or chemical testing
3.16
test sample
material, device, device portion, component, extract (3.7) or portion thereof that is subjected to
biological or chemical testing or evaluation
3.17
vehicle
liquid used to moisten, dilute, suspend, extract (3.7) or dissolve the test substance/material
4 General principles — Step-wise approach
The available methods for testing sensitization were developed specifically to detect skin sensitization
potential. Other types of adverse effects are generally not predicted by these tests.
This document requires a step-wise approach, considering that any stage can result in the conclusion
that further testing for skin sensitization is not necessary:
a) literature and supplier information review, including chemical and physical properties, and
information on the skin sensitization potential of any medical device constituent as well as
structurally-related chemicals and materials; refer to ISO 10993-1 for details; conduct risk
assessment based on existing information to determine whether skin sensitization risk is
acceptable or whether further testing is necessary;
b) additional characterization and risk assessment, if needed, of the device material, involving
chemical characterization and analysis of the test sample according to the general principles
described in ISO 10993-18;
c) in vitro tests shall be considered in preference to in vivo tests in accordance with ISO 10993-2,
and the replacement of the latter as new in vitro tests are scientifically validated and become
reasonably and practicably available;
NOTE There are currently a number of internationally validated and accepted in vitro tests to detect
the skin sensitization potential of chemicals; however, these in vitro tests are not yet validated for medical
devices. Work is ongoing for some of these tests to qualify them for use with medical devices.
d) in vivo animal tests are only appropriate when test materials cannot be characterized and risk
assessments cannot be undertaken using information obtained by the means set out in a), b) and c).
5 Pretest considerations
5.1 General
It is important to emphasize that pretest considerations can result in the conclusion that testing for
skin sensitization is not necessary.
The requirements given in ISO 10993-1:2018, Clause 5, and the following apply.
In vivo, non-sterile samples shall be investigated by topical investigation only, as the possibility of
microbial contamination of the test sample can confound the final assay interpretation. In cases where
the sterility of a test sample cannot be guaranteed, but the sample is still considered to be free from
microbial contamination, intradermal administration may be justified.
5.2 Types of material
5.2.1 Initial considerations
It shall be taken into consideration that during manufacture and assembly of medical devices, additional
chemical components may be used as processing aids, e.g. lubricants or mould-release agents. In addition
to the chemical components of the starting material and manufacturing process aids, adhesive/solvent
residues from assembly and also sterilant residues or reaction products resulting from the sterilization
process may be present in a finished product. Whether these components pose a risk depends on the
leaching or degradation characteristics of the finished products. Those chemical components which
have skin sensitization potential shall be identified.
5.2.2 Ceramics, metals and alloys
These materials are normally less complex than polymers and biologically derived materials in terms of
the number of chemical constituents.
5.2.3 Polymers
The chemical composition of these materials is typically more complex than those in 5.2.2. A number
of reaction products/impurities/additives/residual catalyst can be present and the degree or extent of
polymerization can vary.
5.2.4 Biologically derived materials
These materials are inherently complex in their composition. They often also contain process residues,
for example, cross-linkers and anti-microbial agents. Biological materials can be inconsistent from
sample to sample.
The methods in this document have not been designed for testing of biologically derived materials and
can therefore be less adequate. For example, the tests in this document do not consider cross-species
sensitization.
5.3 Information on chemical composition
5.3.1 General
Full qualitative data on the chemical constituents of the material shall be established. Quantitative data
on the chemical composition shall also be obtained. If quantitative data are not obtained, the rationale
shall be documented and justified.
5.3.2 Existing data sources
Qualitative and quantitative information on the composition shall be obtained where possible from the
supplier of the starting material.
For polymers, this often requires access to proprietary information; provision should be made for the
transfer and use of such confidential information.
Qualitative information about any additional processing additives (e.g. mould-release agents) shall
also be obtained from appropriate members of the manufacturing chain, including converters and
component manufacturers.
If information on composition is incomplete, a literature study to establish the likely nature of
the starting material and any additives is recommended, so as to assist in the selection of the most
appropriate methods of analysis for the material concerned.
The chemical composition of finalized products shall be determined in accordance with ISO 10993-18.
NOTE The composition of ceramics, metals and alloys can be specified in accordance with ISO or ASTM
international standards and/or can be specified by the user. However, in order to obtain full qualitative and
quantitative details on composition, it can be necessary to request these from the supplier or manufacturer of
the starting material and also from component manufacturers to ensure that processing aids are also identified.
Material master files held by regulatory authorities are another source of data, where they are accessible.
6 Skin sensitization tests
6.1 Choice of test methods
In vitro and in chemico alternative approaches have been developed for neat chemicals using a
combination of different assays to identify skin sensitizers. Several of these methods have been included
[75] [79] [104]
in the OECD test guidelines (TG 442C , TG 442D and TG 442E ) or in the OECD test guideline
[121]
program (see Annex C).
Together, the assays described in these test guidelines cover three key events of the now identified
adverse outcome pathway (AOP) for skin sensitization, including the molecular initiating event (protein
binding), induction of inflammation, and activation of dendritic cells. These test methods developed to
address a specific key event can possibly not alone be sufficient to conclude on the presence or absence
of skin sensitization potential of chemicals and should be considered in the context of integrated
approaches such as IATA, combining them with other complementary information.
In accordance with ISO 10993-2, such integrated approaches shall be taken into consideration for
assessing skin sensitization potential of neat chemicals. Whether these approaches are also applicable
for medical devices or medical device extracts is not yet known. An overview of available alternative
skin sensitization tests for neat chemicals is presented in Annex C.
There are currently three animal assays available for the determination of the skin sensitizing potential
of chemicals. These include two guinea pig assays and one murine assay. The two guinea pig assays are
the guinea pig maximization test (GPMT) and the closed-patch test (Buehler test). Of these two assays,
the maximization test is the most sensitive method. See Reference [9]. The closed-patch test is suitable
for topical products.
The murine local lymph node assay (LLNA) was internationally accepted as an OECD test guideline in
[33]
2010 for testing single chemicals as a stand-alone alternative to the guinea pig assays, and is now
the preferred in vivo assay for chemicals. See References [19] and [32]. In some instances, guinea pig
assays can be necessary for the evaluation of the sensitizing potential of certain test samples. Such can
be true for certain metals (see Reference [44]) that can give false negative findings in the LLNA or skin
irritants that can give false positive findings, as well as high molecular weight substances, which do not
penetrate the skin or substances that are not soluble in the recommended vehicles.
NOTE All three animal assays were developed for the detection of skin sensitizing potential of chemicals, i.e.
contact dermatitis, delayed type (type IV) hypersensitivity.
In view of the provisions laid down in ISO 10993-2 on animal welfare requirements, when an in
vivo assay is performed, the LLNA shall be taken into consideration. In addition to animal welfare
considerations, the LLNA has the advantage of providing objective quantitative data.
6.2 Murine local lymph node assay
6.2.1 Principle
Following topical treatment of a test sample on the dorsum of the ears, the extent of lymphocyte
proliferation is measured in the lymph nodes that drain the sites of application (ears). A response in
cellular proliferation of threefold or more compared with the activity of the controls is the threshold for
designating a test material as a sensitizer.
The LLNA shall be performed using a dose response approach when substances are used. For final
products/medical devices, it can be sufficient to test only the undiluted extract.
NOTE References [15] to [44] contain representative LLNA publications. Laboratories conducting this assay
are encouraged to review these and other relevant publications available.
6.2.2 Test sample preparation
The test sample shall be a liquid, suspension, gel or paste such that it can be applied to the ears of
the mice. Where possible, a series of doses (dilutions) shall be investigated. Otherwise, the highest
concentration prepared as a chemical solution or suspension or as an extract should be used. When a
strong response in the LLNA is detected with an extract, a follow-up study evaluating multiple doses
may be necessary to evaluate the possible skin sensitization potency of the extract. Systemic toxicity
and excessive local skin irritation can invalidate the test results; these reactions should therefore be
avoided. In certain circumstances, pre-testing can be necessary.
A commonly used vehicle for substances/chemicals is an acetone olive oil (AOO) 4:1 mixture. Liquid
samples that are hydrophilic and/or do not adequately adhere to the skin of the ear should be modified
to adhere to the test site. This can be obtained by adding a thickening agent like carboxy methyl
® 1)
cellulose or hydroxyethyl cellulose (with a density of 0,5 %) or by a surfactant such as Pluronic L92
with a volume fraction of 1 %. For water soluble chemicals, dimethyl sulfoxide (DMSO) or dimethyl
formamide (DMF) are preferred above the surfactant Pluronic® L92. See Reference [34]. Alternatively,
other extract vehicles can be used, as mentioned. See Reference [33]. The effect of additions to the
extract media and/or changes in vehicle composition shall be validated and documented. This can be
done by experiments using weak to moderate skin sensitizers as commonly used as positive controls.
In addition, spiking of the test sample with a positive control can be performed in order to demonstrate
that the LLNA is still able to detect the presence of potential skin sensitizers in the prepared extract.
Other fundamental aspects of test article extraction are specified in ISO 10993-12.
A separate extract shall be prepared for each daily application.
NOTE For polymeric materials, an optional extraction method is given in Annex B.
6.2.3 Animals and husbandry
Healthy female non-pregnant mice of the CBA/Ca, CBA/J or BALB/c strain shall be used, unless another
strain is validated. See References [33], [41] and [42]. Several mouse strains have been reported as
1) Pluronic® L92 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
acceptable (DBA/2, B6C3F1). See Reference [35]. The mice shall be 7 weeks to 12 weeks of age; the mice
in each study shall be matched in age (within a one-week age range).
Husbandry and selection of animals shall be in accordance with ISO 10993-2. The mice, routinely
acclimatized to the laboratory, shall be individually identified. For certain test samples, individual
housing can be necessary. This shall be justified and documented.
Animals shall be uniquely identified by methods not to include ear punches or ear tags.
When group housing is performed, cross contamination and unwanted oral intake should be taken into
consideration.
6.2.4 Test procedure
For chemicals, the LLNA is generally performed in a dose-response manner. For solid medical devices,
samples to be tested shall be extracts. In these cases, only a single dose is available for testing. In general,
the extract can be investigated undiluted. However, when the extract contains highly toxic components,
this can result in a negative response in the LLNA due to toxicity. It is therefore recommended, to
perform the LLNA in a dose-response manner and to dilute the extract when investigating cytotoxic
extracts (see ISO 10993-5). In addition, when a strong response is detected in the LLNA, a dose response
follow up can be conducted to evaluate the possible sensitization potency of the extract.
To ensure reproducibility and sensitivity, a test of a positive-control substance for skin sensitization
shall be included by the testing laboratory in order to validate the test system and demonstrate a
positive response. Well-known weak to moderate contact allergens (e.g. mercaptobenzothiazole,
hexyl cinnamic aldehyde, or benzocaine), shall be used as positive control. The examples mentioned
can possibly not be suitable for each vehicle used for sample preparation (e.g. water-based vehicle); in
such cases, another positive control can be selected. ASTM F2148 indicates that in such circumstances
formalin and 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB) should be used as positive controls. This shall be
justified and documented.
While inclusion of a concurrent positive control group is recommended, there may be situations in
which only periodic testing (i.e. at intervals ≤ 6 months) of the positive control test substance can
be adequate. This is the case for laboratories that conduct the LLNA regularly (i.e. conduct the LLNA
at a frequency of no less than once per month) and have an established historical positive control
database that demonstrates the laboratory’s ability to obtain reproducible and accurate results with
positive controls. Adequate proficiency with the LLNA can be successfully demonstrated by generating
consistent positive results with the positive control in at least 10 independent tests conducted within a
reasonable period of time (i.e. less than one year).
The individual body weights shall be recorded at initiation and at the end of the study. In order to detect
potential toxicity of the test sample, clinical observation shall be performed and recorded during the
study.
Using a positive control only once every six months can have consequences for the results obtained
in the previous six months period when this positive control shows a negative outcome. Reference
[33] states that periodic testing (i.e. at intervals ≤ 6 months) of the positive control substance can
be considered in laboratories that conduct the LLNA regularly (i.e. conduct the LLNA at a frequency
of no less than once per month), and that have a history and a documented proficiency for obtaining
consistent results with positive controls. It is important to realize that the decision to only include a
positive control periodically instead of concurrently can have ramifications on the adequacy and
acceptability of negative study results generated without a concurrent positive control during the
interval between each periodic positive control study. For example, if a false-negative result is obtained
in the periodic positive control test, all negative test substance results obtained in the interval between
the last acceptable periodic positive control test and the unacceptable periodic positive control test can
be questioned. In order to demonstrate that the prior negative test substance results are acceptable,
a laboratory can be expected to repeat all negative tests, which requires additional expenses and
increased animal use.
6.2.5 Treatment groups
When the LLNA is performed, the data of a minimum of five mice per group shall be available for
evaluation. Lymph node responses may be determined either by individual measurement or by
measurement of pooled lymph node samples. For statistical analysis, individual measurement is
preferred.
When only a single dose is available for evaluation, for example, an extract, a minimum of five mice
shall be used for each group, when individual responses are measured.
Treatment groups shall be assigned to:
— blank of each type of vehicle employed (see Annex A);
— when appropriate, positive control for each vehicle employed;
— test groups for each extract vehicle employed.
When testing a single chemical or substance, the LLNA shall be performed in a dose-response manner.
For other types of test and sample-like extracts, a dose-response evaluation can possibly not be feasible.
When only one test group is employed, this shall be justified and documented.
NOTE When sufficient data have been collected to demonstrate consistency for the dose response of the
positive control, a single dose can be included to demonstrate the sensitivity of the assay. See Reference [32].
The appropriate sample shall be applied to the dorsal side of both ears of designated mice at a dose of
25 µl/d for three consecutive days. Each day, observe the ears for signs of irritation that can interfere
with interpreting results. See References [23], [27] and [29].
6.2.6 Determination of cellular proliferation and tissue preparation
The proliferating cells in the draining lymph nodes can be labelled by either a radioactive or fluorescent
3 125
label. Radiolabels commonly used are H-methyl thymidine and I-iododeoxyuridine, while for
fluorescence, fluorodeoxyuridine can be used.
At (72 ± 2) h after the last treatment, record individual mouse weights and administer intravenously
the label for cell proliferation. Inject 0,25 ml of phosphate buffered saline (PBS) containing 740 KBq
(20 µCi) units of radioactivity of H-methyl thymidine into all test and control mice via the tail vein. For
I-iododexyuridine, inject 0,25 ml PBS containing 74 KBq (2 µCi), and for fluorodeoxyuridine inject
−5
0,25 ml containing 10 mol/l into the tail vein. See Reference [33].
Other alternative procedures not requiring radiolabelling are available and should be considered [e.g.
[122]
adenosine triphosphate (ATP) (OECD TG 442A ) determination (DA method), bromodeoxyuridide
[123]
BrdU (OECD TG 442B ) determination (ELISA or FCM method)].
NOTE 1 For more information, see References [33], [36], [42], [43] and [49].
Euthanize the mice (5 ± 0,75) h after the administration of the labelling solution according to ISO 10993-2.
Remove the draining auricular lymph node. Care shall be taken to avoid cross contamination of
the tissue samples. The lymph nodes of each group may be pooled, or pairs of lymph nodes of each
individual animal may be pooled. Data from each individual animal is preferred as it provides the
variability between each animal in a group. Single cell preparations are prepared by gently pressing
the lymph nodes through a 200 µm stainless steel wire mesh or nylon mesh over a container. Rinse the
strainer with chilled PBS into the container to remove cells from the mesh filter. The container now
contains the cell preparation. Cell preparations are washed twice by centrifugation and resuspended
in PBS. Cells are precipitated with 5 % trichloroacetic acid (TCA) at (4 ± 2) °C for (18 ± 1) h. After a
final centrifugation step, pellets are resuspended in 1 ml of TCA and transferred to scintillation vials
containing 10 ml of scintillation fluid for H-counting, or transferred directly to a gamma counter for
I-counting. See References [21], [35] and [36].
NOTE 2 Alternatively, labelling and determination of cellular proliferation can be performed ex vivo. See
References [37] and [38].
6.2.7 Results and interpretation
Measure the level of radioactivity in the lymph node cells in counts per minute per mouse (cpm/
mouse). Convert counts per minute (cpm) to disintegration per minute (dpm). Calculate the mean and
standard deviation of dpm for at least three counts for each animal or each group of mice. Subtract the
background value from each result.
When using the individual sampling method continue to calculate the mean and standard deviation
of the dpm for each group of five mice. Determine the stimulation index (SI) by dividing the mean test
dpm by the blank dpm. An SI o
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 10993-10
Quatrième édition
2021-11
Évaluation biologique des dispositifs
médicaux —
Partie 10:
Essais de sensibilisation cutanée
Biological evaluation of medical devices —
Part 10: Tests for skin sensitization
Numéro de référence
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2021
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction . vi
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 1
4 Principes généraux — Approche par étapes . 3
5 Considérations préalables aux essais . 4
5.1 Généralités . 4
5.2 Types de matériaux . 4
5.2.1 Considérations préliminaires . 4
5.2.2 Céramiques, métaux et alliages . 4
5.2.3 Polymères . 4
5.2.4 Matériaux d'origine biologique . 5
5.3 Informations sur la composition chimique . 5
5.3.1 Généralités . 5
5.3.2 Sources de données existantes . 5
6 Essais de sensibilisation cutanée . 5
6.1 Choix des méthodes d'essai . 5
6.2 Essai de stimulation locale des ganglions lymphatiques chez la souris . 6
6.2.1 Principe. 6
6.2.2 Préparation des échantillons pour essai . 6
6.2.3 Animaux et leur hébergement . 7
6.2.4 Mode opératoire d'essai . 7
6.2.5 Groupes de traitement . 8
6.2.6 Détermination de la prolifération cellulaire et préparation des tissus . 9
6.2.7 Résultats et interprétation . 9
6.2.8 Rapport d'essai. 10
6.3 Essais sur cobaye pour la détection d'une sensibilisation cutanée . 10
6.3.1 Principe. 10
6.3.2 Choix des concentrations du matériau d'essai . 10
6.3.3 Induction . 10
6.3.4 Application déclenchante . 10
6.4 Facteurs importants permettant d'influencer le résultat de l'essai . 11
6.5 Essai de maximalisation sur cobaye .12
6.5.1 Principe. 12
6.5.2 Préparation des échantillons pour essai .12
6.5.3 Animaux et leur hébergement .12
6.5.4 Mode opératoire d'essai .12
6.5.5 Observation des animaux . 15
6.5.6 Évaluation des résultats . 15
6.5.7 Rapport d'essai. 16
6.6 Essai épicutané occlusif (Essai de Buehler) . 16
6.6.1 Principe. 16
6.6.2 Préparation des échantillons pour essai . 16
6.6.3 Animaux et leur hébergement . 16
6.6.4 Mode opératoire d'essai . 17
6.6.5 Observation des animaux . 18
6.6.6 Évaluation des résultats . 18
6.6.7 Rapport d'essai. 18
7 Facteurs clés pour l'interprétation des résultats d'essai .19
Annexe A (normative) Préparation des matériaux pour les essais de sensibilisation cutanée .20
iii
Annexe B (informative) Méthode de préparation d'extraits à partir de matériaux d'essai
polymériques .22
Annexe C (informative) Méthodes non-animales pour la sensibilisation cutanée .25
Annexe D (informative) Informations générales sur les essais de sensibilisation permettant
de déterminer la sensibilisation cutanée .40
Bibliographie .43
iv
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO, participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l'intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www.iso.org/iso/fr/avant-propos.html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 194, Évaluation biologique et clinique
des dispositifs médicaux, en collaboration avec le Comité Technique CEN/TC 206, Évaluation biologique et
clinique des dispositifs médicaux, du Comité européen de normalisation (CEN), conformément à l'Accord
de coopération technique entre l'ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette quatrième édition annule et remplace la troisième édition (ISO 10993-10:2010), qui a fait l'objet
d'une révision technique.
Les principales modifications par rapport à l'édition précédente sont les suivantes:
— le présent document contient une description des essais de sensibilisation cutanée uniquement;
— l'Annexe C concernant les méthodes non-animales pour la sensibilisation cutanée (précédemment
Annexe D) a été mise à jour;
— les essais d'irritation sont maintenant décrits dans l'ISO 10993-23.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 10993 se trouve sur le site web de l'ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
v
Introduction
Le présent document évalue les dangers éventuels dus au contact avec des produits chimiques libérés
par des dispositifs médicaux pouvant provoquer une sensibilisation cutanée.
Certains matériaux contenus dans ces dispositifs médicaux ont fait l'objet d'essais, et le risque de
sensibilisation cutanée qu'ils présentent a été documenté. Les propriétés de sensibilisation pour les
matériaux dentaires en particulier ont été consignées, voir Référence [51]. D'autres matériaux et leurs
constituants chimiques n'ont pas fait l'objet d'essais et peuvent induire des effets indésirables lorsqu'ils
sont en contact avec des tissus humains. Le fabricant est donc tenu d'évaluer les effets indésirables
potentiels de chaque dispositif avant de le commercialiser.
Traditionnellement, des essais sur les petits animaux sont effectués avant les essais sur l'être humain
afin d'aider à prévoir la réaction chez l'homme (des informations contextuelles sont fournies à
l'Annexe D). Depuis 2015, plusieurs essais in chemico et in vitro ont été validés, et des lignes directrices
d'essai de l'Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) ont été publiées
[75][79][104]
pour évaluer le potentiel de sensibilisation cutanée des produits chimiques . Une vue
d'ensemble des essais alternatifs disponibles de sensibilisation pour les produits chimiques purs est
présentée dans l'Annexe C. Ces méthodes d'essai, chacune élaborée pour répondre à un événement clé
particulier, peuvent ne pas être suffisantes à elles seules pour déterminer la présence ou l'absence de
potentiel de sensibilisation cutanée des produits chimiques, et il convient qu'elles soient considérées
dans un contexte d'approches intégrées, telles que les approches intégrées en matière d'essai et
d'évaluation (IATA, integrated approach to testing and assessment), en les associant à des informations
complémentaires. Il est à noter que les essais in vitro et in chemico pour la sensibilisation cutanée
(voir Annexe C) ont jusqu'ici été validés uniquement pour des produits chimiques purs et non pour des
dispositifs médicaux. Pour confirmer qu'ils sont applicables pour l'évaluation des tests du potentiel de
sensibilisation cutanée des dispositifs médicaux, leurs besoins en matière d'applicabilité doivent être
vérifiés, évalués et validés.
Le cas échéant, le recours préliminaire à des méthodes in vitro est encouragé dans le but d'orienter
préalablement les essais sur les animaux. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, le présent
document utilise une approche par étapes, avec examen et analyse des résultats d'essais à chaque
stade. Il est prévu que, pour les soumissions aux autorités règlementaires, les études de sensibilisation
cutanée soient menées conformément aux principes des BPL ou de l'ISO/IEC 17025 selon les règles
applicables au pays concerné, et qu'elles soient conformes aux réglementations relatives à la protection
des animaux. L'analyse statistique de données est recommandée et doit être utilisée chaque fois que
cela s'avère nécessaire. Le présent document comprend des outils importants pour le développement
de produits sûrs et est destiné à être utilisé par les professionnels, qualifiés par une formation et une
expérience appropriées, capables d'interpréter ses exigences et de juger des conclusions de l'évaluation
pour chaque dispositif médical, en tenant compte de tous les facteurs concernant le dispositif, son
emploi prévu et les connaissances en cours sur le dispositif médical apportées par la consultation de la
littérature scientifique et des expériences cliniques antérieures.
Le présent document est fondé sur de nombreuses normes et directives, y compris les lignes directrices
de l'OCDE, la pharmacopée des États-Unis et la pharmacopée européenne. Il vise à constituer le
document de référence de base pour la sélection et la conduite des essais permettant d'évaluer les
réactions de sensibilisation dermique se rapportant à la sécurité des matériaux et des dispositifs
médicaux.
vi
NORME INTERNATIONALE ISO 10993-10:2021(F)
Évaluation biologique des dispositifs médicaux —
Partie 10:
Essais de sensibilisation cutanée
1 Domaine d'application
Le présent document spécifie le mode opératoire pour l'évaluation du potentiel des dispositifs médicaux
et de leurs matériaux constitutifs à provoquer une sensibilisation cutanée.
Le présent document comprend:
— des informations détaillées relatives aux modes opératoires d'essai de sensibilisation cutanée
in vivo;
— les facteurs clés pour l'interprétation des résultats.
NOTE Des instructions pour la préparation des matériaux spécifiquement pour les essais ci-dessus sont
données dans l'Annexe A.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 10993-1, Évaluation biologique des dispositifs médicaux — Partie 1: Évaluation et essais au sein d'un
processus de gestion du risque
ISO 10993-2, Évaluation biologique des dispositifs médicaux — Partie 2: Exigences relatives à la protection
des animaux
ISO 10993-12, Évaluation biologique des dispositifs médicaux — Partie 12: Préparation des échantillons et
matériaux de référence
ISO 10993-18, Évaluation biologique des dispositifs médicaux — Partie 18: Caractérisation chimique des
matériaux des dispositifs médicaux au sein d'un processus de gestion du risque
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l'ISO 10993-1 ainsi que les suivants,
s'appliquent.
L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l'adresse https:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l'adresse https:// www .iso .org/ obp.
3.1
allergène
sensibilisant
substance ou matériau capable d'induire une réaction d'hypersensibilité spécifique lors d'un contact
répété avec cette substance/ce matériau
3.2
dermatite allergique de contact
diagnostic clinique fondé sur l'observation d'une réaction cutanée à médiation immunitaire à une
substance
3.3
blanc
véhicule (3.17) d'extraction ne contenant pas le matériau d'essai (3.15), contenu dans un récipient
identique à celui contenant le matériau d'essai et soumis à des conditions identiques à celles auxquelles
est soumis le matériau d'essai au cours de son extraction
Note 1 à l'article: Le but du témoin blanc est d'évaluer les interférences possibles liées au récipient d'extraction,
au véhicule et au processus d'extraction.
3.4
application déclenchante
processus suivant la phase d'induction (3.8) au cours de laquelle on évalue les réponses immunologiques
d'un individu résultant d'expositions répétées au matériau inducteur
3.5
élicitation
réaction immunitaire suite à l'exposition à un sensibilisant chez une personne préalablement
sensibilisée
3.6
érythème
rougissement de la peau ou d'une muqueuse
3.7
extrait
liquide résultant de l'extraction de l'échantillon (3.16) ou du témoin soumis à essai
[SOURCE: ISO 10993-12:2012, 3.6]
3.8
induction
processus aboutissant à la génération de novo d'une réactivité accrue de la réponse immunitaire d'un
individu à un matériau spécifique après une exposition initiale
3.9
irritant
agent provoquant une irritation (3.10)
3.10
irritation
réaction inflammatoire non spécifique localisée à une application unique, répétée ou continue d'une
substance/d'un matériau
Note 1 à l'article: L'irritation de la peau est une réaction réversible et se caractérise principalement par des
symptômes comme un érythème (3.6) local (rougeur), gonflement, démangeaison, pelage, craquelure et squame
de la peau.
3.11
témoin négatif
matériau et/ou substance bien caractérisés qui, lors d'essais réalisés selon un mode opératoire
spécifique, démontrent l'aptitude du mode opératoire à fournir une réponse négative reproductible,
non réactive ou minimale lors de l'expérimentation
Note 1 à l'article: Dans la pratique, les témoins négatifs comprennent les blancs (3.3), les véhicules (3.17)/solvants
et les produits de référence.
[SOURCE: ISO 10993-12:2012, 3.6 — modifiée — La Note 1 à l'article a été remplacé.]
3.12
œdème
gonflement dû à l'infiltration anormale de fluide dans les tissus
3.13
témoin positif
matériau et/ou substance bien caractérisés qui, lors d'essais réalisés selon un mode opératoire
spécifique, démontrent l'aptitude du système à fournir une réponse positive reproductible ou réactive
lors de l'expérimentation
3.14
sensibilisation cutanée
réaction d'hypersensibilité retardée véhiculée par les lymphocytes T, induite par des substances
chimiques de faible poids moléculaire (allergènes). Elle comprend deux phases: l'induction et l'élicitation
Note 1 à l'article: Chez l'homme, les réactions peuvent être caractérisées par un prurit, un érythème (3.6), un
œdème (3.12), des papules, des vésicules, des bulles ou une combinaison de ceux-ci. Pour d'autres espèces, les
réactions peuvent être différentes et seuls l'érythème et l'œdème peuvent être visibles.
3.15
matériau d'essai
matériau, dispositif, partie ou composant de dispositif qui est échantillonné pour la conduite d'essais
biologiques ou chimiques
3.16
échantillon d'essai
matériau, dispositif, partie de dispositif, composant, extrait (3.7) ou partie de celui-ci qui est soumis à
des essais biologiques ou chimiques ou à une évaluation
3.17
véhicule
liquide utilisé pour humidifier, diluer, mettre en suspension, extraire ou dissoudre le matériau/la
substance d'essai
4 Principes généraux — Approche par étapes
Les méthodes de détermination de la sensibilisation ont été développées spécialement pour détecter le
potentiel de sensibilisation cutanée. Ces essais ne permettent généralement pas de prédire les autres
types d'effets indésirables.
Le présent document requiert une approche par étapes, considérant que toute étape peut aboutir à la
conclusion que des essais supplémentaires de sensibilisation cutanée ne sont pas nécessaires:
a) revue de la littérature et des informations du fournisseur, y compris les caractéristiques chimiques
et physiques, et les informations relatives au potentiel de sensibilisation cutanée de tout composant
d'un dispositif médical ainsi que des produits chimiques et des matériaux de structure apparentée;
se référer à l'ISO 10993-1 pour plus de détails. Effectuer une évaluation des risques sur la base des
informations existantes afin de déterminer si le risque de sensibilisation cutanée est acceptable ou
si des essais supplémentaires sont nécessaires;
b) le cas échéant, caractérisation supplémentaire et évaluation des risques du matériau du dispositif,
impliquant une caractérisation chimique et une analyse de l'échantillon d'essai selon les principes
généraux décrits dans l'ISO 10993-18;
c) conformément à l'ISO 10993-2, des essais in vitro doivent être envisagés de préférence aux essais
in vivo et ces derniers doivent être remplacés chaque fois que de nouveaux essais in vitro sont
validés scientifiquement et deviennent raisonnablement et pratiquement disponibles;
NOTE Il existe actuellement plusieurs essais in vitro validés et acceptés à l'échelle internationale
permettant de détecter le potentiel de sensibilisation cutanée des produits chimiques; toutefois, ces essais
in vitro n'ont encore été validés pour des dispositifs médicaux. Des travaux sont actuellement menés pour
certains de ces essais en vue de les qualifier pour une utilisation avec des dispositifs médicaux;
d) les essais in vivo sur l'animal sont appropriés uniquement lorsque les matériaux d'essai ne peuvent
pas être caractérisés et les évaluations du risque ne peuvent pas être entreprises en utilisant les
informations obtenues par les moyens indiqués en a), b) et c).
5 Considérations préalables aux essais
5.1 Généralités
Il est important de souligner que les considérations préalables aux essais peuvent amener à conclure
que les essais de sensibilisation cutanée ne sont pas nécessaires.
Les exigences données dans l'ISO 10993-1:2018, Article 5, et les exigences suivantes s'appliquent.
Les échantillons in vivo non stériles doivent être examinés par une investigation topique uniquement,
car la possibilité d'une contamination microbienne de l'échantillon d'essai est susceptible de nuire à
l'interprétation finale des essais. Lorsque la stérilité d'un échantillon d'essai ne peut être garantie alors
que l'échantillon est encore considéré comme exempt de contamination microbienne, l'administration
intradermique peut être justifiée.
5.2 Types de matériaux
5.2.1 Considérations préliminaires
Il doit être pris en considération que, pendant la fabrication et l'assemblage des dispositifs médicaux,
des composants chimiques supplémentaires peuvent être utilisés comme intermédiaires de fabrication,
par exemple des lubrifiants ou des agents de démoulage. En plus des composants chimiques du matériau
initial et des intermédiaires de fabrication, des résidus d'adhésif/de solvant provenant de l'assemblage
et également des résidus de stérilisation ou des produits résultant de réactions lors du procédé de
stérilisation peuvent être présents dans un produit fini. Le risque que constituent ces composants pour
la santé dépend des caractéristiques de relargage ou de dégradation des produits finis. Ces composants
chimiques qui présentent un potentiel de sensibilisation cutanée doivent être identifiés.
5.2.2 Céramiques, métaux et alliages
Ces matériaux sont normalement moins complexes que les polymères et les matériaux d'origine
biologique en termes de nombre de composants chimiques.
5.2.3 Polymères
La composition chimique de ces matériaux est d'ordinaire plus complexe que ceux décrits en 5.2.2.
Un certain nombre de produits réactionnels/impuretés/additifs/catalyseurs résiduels peuvent être
présents et le degré ou l'étendue de la polymérisation peut varier.
5.2.4 Matériaux d'origine biologique
Ces matériaux ont par essence une composition complexe. Ils contiennent souvent des résidus de
procédé, par exemple des agents de réticulation et des agents antimicrobiens. Les matériaux d'origine
biologique peuvent varier d'un échantillon à l'autre.
Les méthodes du présent document n'ont pas été conçues pour des essais sur des matériaux d'origine
biologique et peuvent donc être inappropriées. Par exemple, les essais du présent document ne prennent
pas en considération la sensibilisation inter-espèces.
5.3 Informations sur la composition chimique
5.3.1 Généralités
Des données qualitatives complètes sur les composants chimiques du matériau doivent être établies. Des
données quantitatives sur la composition chimique doivent également être obtenues. Si des données
quantitatives ne sont pas obtenues, la justification doit être documentée et établie.
5.3.2 Sources de données existantes
Lorsque cela est possible, les informations relatives à la composition qualitative et quantitative doivent
être obtenues auprès du fournisseur du matériau d'origine.
Pour les polymères, cette étape requiert souvent l'accès à des informations confidentielles et il convient
de prendre des mesures appropriées pour le transfert et l'utilisation de telles informations.
Les informations qualitatives sur les additifs de fabrication supplémentaires (par exemple les produits
de démoulage) doivent également être obtenues auprès des acteurs appropriés de la chaîne de
fabrication, incluant les transformateurs et les fabricants de composants.
Si les informations relatives à la composition sont incomplètes, une étude documentaire est
recommandée pour établir la nature probable du matériau de départ et de tout additif afin d'aider au
choix des méthodes d'analyse les plus appropriées pour le matériau concerné.
La composition chimique des produits finalisés doit être déterminée conformément à l'ISO 10993-18.
NOTE La composition des céramiques, des métaux et des alliages peut être spécifiée conformément à
des normes internes de l'ISO ou de l'ASTM et/ou peut être spécifiée par l'utilisateur. Toutefois, afin d'obtenir
des détails complets sur la composition qualitative et quantitative, il peut être nécessaire de les demander au
fournisseur ou au fabricant du matériau de départ ainsi qu'aux fabricants de composants afin de s'assurer que les
intermédiaires de fabrication sont également identifiés. S'ils sont accessibles, les fichiers sur le matériau détenus
par les autorités règlementaires représentent une autre source de données.
6 Essais de sensibilisation cutanée
6.1 Choix des méthodes d'essai
Les approches alternatives in vitro et in chemico ont été développées pour des produits chimiques purs
basées sur une combinaison de différents essais afin d'identifier un sensibilisant cutané. Plusieurs de
[75] [79]
ces méthodes ont été incluses dans les lignes directrices d'essai de l'OCDE (TG 442C , TG 442D et
[104] [121]
TG 442E ) ou dans le programme de lignes directrices d'essais de l'OCDE (voir Annexe C).
Ensemble, les essais décrits dans ces lignes directrices d'essai couvrent trois événements clés de
l'Adverse Outcome Pathway (AOP) à présent identifiés pour la sensibilisation cutanée, y compris
l'événement initiateur moléculaire (liaison protéinique), l'induction de l'inflammation et l'activation des
cellules dendritiques. Ces méthodes d'essai, élaborées pour faire face à un événement clé particulier,
peuvent ne pas être suffisantes à elles-seules pour déterminer la présence ou l'absence de potentiel
de sensibilisation cutanée des produits chimiques, et il convient qu'elles soient considérées dans un
contexte d'approches intégrées, telles que l'IATA, en les associant à des informations complémentaires.
Conformément à l'ISO 10993-2, ces approches intégrées doivent être prises en considération lors de
l'évaluation du potentiel de sensibilisation cutanée des produits chimiques purs. On ignore encore si ces
approches sont également applicables aux dispositifs médicaux ou aux extraits de dispositifs médicaux.
Une vue d'ensemble des essais alternatifs disponibles de sensibilisation cutanée pour les produits
chimiques purs est présentée dans l'Annexe C.
Il existe actuellement trois essais sur les animaux pour déterminer le risque de sensibilisation cutanée
par les produits chimiques. Il s'agit de deux essais chez le cobaye et d'un essai chez la souris. Les deux
essais chez le cobaye sont l'essai de maximalisation sur le cobaye (GPMT, guinea pig maximization
test) et l'essai avec système occlusif (essai de Buehler). Sur ces deux essais, l'essai de maximalisation
est la méthode la plus sensible. Voir référence [9]. L'essai avec système occlusif convient aux produits
topiques.
L'essai de stimulation locale des ganglions lymphatiques chez la souris (LLNA) a été internationalement
[33]
accepté en tant que ligne directrice d'essai de l'OCDE en 2010 pour tester des produits chimiques
simples en remplacement des méthodes d'essais sur les cobayes; il est actuellement l'essai in vivo
préféré pour les produits chimiques. Voir Références [19] et [32]. Dans certains cas, les essais sur
cobaye peuvent être nécessaires pour évaluer le potentiel de sensibilisation de certains échantillons
d'essai. Il pourrait en être ainsi dans le cas de certains métaux (voir Référence [44]) qui peuvent donner
des résultats faux-négatifs dans le LLNA ou des irritants de la peau qui peuvent donner des résultats
faux-positifs, ainsi que pour des substances de poids moléculaire élevé qui ne pénètrent pas dans la
peau, ou des substances non solubles dans les véhicules recommandés.
NOTE Les trois essais sur les animaux ont tous été mis au point pour la détection du potentiel de
sensibilisation cutanée par des produits chimiques, c'est-à-dire dermatite par contact, hypersensibilité retardée
(type IV).
Eu égard aux dispositions de l'ISO 10993-2 sur les exigences relatives à la protection des animaux,
lorsqu'un essai in vivo est réalisé, le LLNA doit être envisagé. En plus des considérations relatives à la
protection des animaux, le LLNA a l'avantage de fournir des données quantitatives objectives.
6.2 Essai de stimulation locale des ganglions lymphatiques chez la souris
6.2.1 Principe
À la suite de l'application topique d'un échantillon d'essai sur le dos des oreilles, on mesure le niveau de
la prolifération des lymphocytes dans les ganglions lymphatiques qui drainent les sites d'application
(oreilles). Pour déclarer un matériau d'essai comme étant un sensibilisant, le seuil est une réponse en
prolifération cellulaire au moins égale au triple de celle correspondant à l'activité des témoins.
Le LLNA doit être réalisé par une approche dose-réponse lorsque des substances sont utilisées. Pour les
produits/dispositifs médicaux finaux, un essai sur l'extrait non dilué uniquement peut suffire.
NOTE Les références [15] à [44] contiennent des publications représentatives de LLNA. Les laboratoires
menant cet essai sont invités à consulter ces publications et d'autres publications pertinentes disponibles.
6.2.2 Préparation des échantillons pour essai
L'échantillon d'essai doit être un liquide, une suspension, un gel ou une pâte pouvant être appliqué
sur les oreilles des souris. Dans la mesure du possible, une série de doses (dilutions) doit être étudiée.
Autrement, il convient d'utiliser la plus forte concentration préparée sous forme d'une solution ou
suspension chimique ou sous forme d'extrait. Lorsqu'une réaction forte est détectée dans le LLNA avec
un extrait, une étude complémentaire évaluant plusieurs doses peut être nécessaire pour évaluer la
puissance de sensibilisation cutanée possible de l'extrait. La toxicité systémique et une irritation locale
excessive de la peau pouvant invalider les résultats d'essai, il convient d'éviter ces réactions. Dans
certaines circonstances, des essais préalables peuvent s'avérer nécessaires.
Un véhicule couramment utilisé pour les substances/produits chimiques est le mélange acétone-huile
d'olive (AOO) 4:1. Il convient de modifier les échantillons liquides qui sont hydrophiles et/ou n'adhèrent
pas correctement à la peau de l'oreille afin qu'ils adhèrent au site d'essai. Cela peut être obtenu en
ajoutant un épaississant comme la carboxyméthylcellulose ou l'hydroxyéthylcellulose (avec une densité
® 1
de 0,5 %) ou avec un agent tensioactif comme le Pluronic L92 avec une fraction volumique de 1 %.
Pour les produits chimiques solubles dans l'eau, le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou le diméthylformamide
1)
(DMF) sont préférés à l'agent tensioactif Pluronic® L92 . Voir référence [34]. En alternative, d'autres
véhicules d'extraction peuvent être utilisés, comme indiqué. Voir référence [33]. L'effet des ajouts aux
milieux d'extraction et/ou des variations de composition du véhicule doit être validé et documenté.
Cela peut être réalisé par des expérimentations sur des sensibilisants cutanés faibles à msodérés tels
qu'utilisés couramment comme témoin positif. De plus, l'enrichissement de l'échantillon d'essai avec
un témoin positif pourrait être réalisé afin de démontrer que le LLNA reste capable de détecter la
présence de sensibilisants cutané potentiels dans l'extrait préparé. D'autres aspects fondamentaux de
l'extraction d'articles d'essai sont spécifiés dans l'ISO 10993-12.
Un extrait distinct doit être préparé pour chaque application quotidienne.
NOTE Pour les matériaux polymères, une méthode d'extraction optionnelle est indiquée à l'Annexe B.
6.2.3 Animaux et leur hébergement
Des souris femelles saines et non gravides de la souche CBA/Ca, CBA/J ou BALB/c doivent être utilisées,
à moins qu'une autre souche n'ait été validée. Voir Références [33], [41] et [42]. Plusieurs souches de
souris ont été identifiées comme étant acceptables (DBA/2, B6C3F1). Voir référence [35]. Les souris
doivent être âgées de 7 semaines à 12 semaines; les âges des souris dans chaque étude doivent être en
correspondance (dans une plage d'âge d'une semaine).
L'hébergement et la sélection des animaux doivent être conformes à l'ISO 10993-2. Les souris,
régulièrement acclimatées au laboratoire, doivent être identifiées individuellement. Pour certains
échantillons d'essai, un logement individuel peut s'avérer nécessaire. Cela doit être justifié et documenté.
Les animaux doivent être identifiés de manière unique à l'aide de méthodes qui ne doivent pas inclure
les étiquettes d'oreille ou les poinçons d'oreille.
En cas d’hébergement en groupe, il convient de prendre en considération la contamination croisée et la
prise orale intempestive.
6.2.4 Mode opératoire d'essai
Pour les produits chimiques, le LLNA est en général réalisé par dose-réponse. Pour les dispositifs
médicaux solides, les échantillons à soumettre à essai doivent être des extraits. Dans ce cas, une seule
dose est disponible pour les essais. En général, l'extrait peut être étudié non dilué. Cependant, si l'extrait
contient des composants hautement toxiques, cela peut conduire à une réaction négative dans l'essai
LLNA en raison de la toxicité. Il est donc recommandé de réaliser le LLNA par dose-réponse et de diluer
l'extrait lors de l'examen des extraits cytotoxiques (voir l'ISO 10993-5). En outre, quand une réaction
forte est détectée dans le LLNA, un suivi de dose-réponse peut être effectué pour évaluer la puissance
de sensibilisation possible de l'extrait.
Pour garantir la reproductibilité et la sensibilité, un essai de substance témoin positive pour la
sensibilisation cutanée doit être inclus par le laboratoire d'essai afin de valider le système d'essai et
de démontrer une réaction positive. Des allergènes par contact faibles à modérés bien connus (par
exemple le mercaptobenzothiazole, l'aldéhyde cinnamique d'hexyle ou la benzocaïne), doivent être
utilisés comme témoin positif. Les exemples mentionnés peuvent ne pas être adaptés à chaque véhicule
utilisé pour la préparation de l'échantillon (par exemple véhicule aqueux); dans ce cas, un autre témoin
positif pourrait être choisi. Selon l'ASTM F2148, dans ces circonstances, il convient que le formol et
le 2,4-dinitrochlorobenzène (DNCB) soient utilisés comme témoins positifs. Cela doit être justifié et
documenté.
1) Pluronic® L92 est un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée
à l'attention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve l'emploi du produit
ainsi désigné.
Même si l'inclusion d'un groupe de témoins positifs en simultané est recommandée, il peut y avoir
des situations dans lesquelles seuls des essais périodiques (à savoir à des intervalles ≤ 6 mois) de la
substance d'essai témoin positive peuvent être adéquats. C'est le cas pour des laboratoires qui réalisent
les LLNA régulièrement (c'est-à-dire qui réalisent les LLNA à une fréquence qui ne soit pas inférieure
à une fois par mois) et disposent d'une base de données historique établie sur témoin positif qui
démontre la capacité du laboratoire à obtenir des résultats reproductibles et exacts avec des témoins
positifs. Une maîtrise adéquate du LLNA peut être démontrée avec succès en générant des résultats
positifs systématiques avec les témoins positifs lors d'au moins 10 essais indépendants effectués sur
une période raisonnable (moins d'un an).
Le poids corporel de chaque individu doit être consigné au début et à la fin de l'étude. Afin de détecter
la toxicité potentielle de l'échantillon d'essai, une observation clinique doit être menée et enregistrée au
cours de l'étude.
Lorsqu'un témoin positif n'est utilisé qu'une fois tous les six mois, si celui-ci présente un résultat
négatif, cela peut avoir des conséquences sur les résultats obtenus au cours de la période des six mois
précédents. La référence [33] stipule que des essais périodiques (c'est-à-dire à intervalles ≤ 6 mois)
de la substance témoin positive peuvent être envisagés dans les laboratoires réalisant régulièrement
le LLNA (c'est-à-dire à une fréquence qui ne soit pas inférieure à une fois par mois) et disposant d'un
historique et d'une maîtrise documentée, afin d'obtenir des résultats cohérents avec les témoins
positifs. Il est important de réaliser que la décision d'inclure un témoin positif périodiquement, et pas
simultanément, pourrait avoir une influence sur l'adéquation et l'acceptabilité des résultats d'étude
négatifs générés sans témoin positif concomitant dans l'intervalle entre deux études périodiques du
témoin positif. Par exemple, si un résultat faux négatif est obtenu au cours de l'essai périodique du
témoin positif, tous les résultats négatifs obtenus pour la substance d'essai dans l'intervalle entre le
dernier essai périodique acceptable du témoin positif et l'essai périodique inacceptable du témoin
positif pourraient être douteux. Pour démontrer que les résultats négatifs précédents pour la substance
d'essai sont acceptables, un laboratoire pourrait être c
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.