ISO 17993:2002

NORME ISO
INTERNATIONALE 17993
Première édition
2002-08-15
Qualité de l'eau — Dosage de 15
hydrocarbures aromatiques polycycliques
(HAP) dans l'eau par HPLC avec détection
par fluorescence après extraction
liquide-liquide
Water quality — Determination of 15 polycyclic aromatic hydrocarbons
(PAH) in water by HPLC with fluorescence detection after liquid-liquid
extraction
Numéro de référence
©
ISO 2002
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier peut
être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence autorisant
l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées acceptent de fait la
responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute responsabilité en la
matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info du
fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir l'exploitation de
ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation, veuillez en informer le
Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.

©  ISO 2002
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l’ISO à
l’adresse ci-après ou du comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax. + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.ch
Web www.iso.ch
Imprimé en Suisse
ii © ISO 2002 – Tous droits réservés

Sommaire Page
Avant-propos . iv
Introduction. v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives. 1
3 Principe. 3
4 Interférences. 3
5 Réactifs. 4
6 Appareillage. 6
7 Échantillonnage. 7
8 Mode opératoire. 7
9 Calcul. 12
10 Fidélité et exactitude. 12
11 Rapport d'essai. 12
Annexe A (informative) Exemples de conditions chromatographiques et de colonnes. 15
Annexe B (informative) Exemples pour la construction d’appareils spécifiques. 19

Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 3.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments de la présente Norme internationale peuvent faire
l'objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 17993 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 2, Méthodes
physiques, chimiques et biochimiques.
Les annexes A et B de la présente Norme internationale sont données uniquement à titre d’information.

iv © ISO 2002 – Tous droits réservés

Introduction
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont présents dans presque toutes les eaux, adsorbés sur
des solides (sédiments, matières en suspension) ou bien dissous dans l’eau.
Certains HAP sont réputés cancérigènes ou suspectés de l’être. La Directive du Conseil 98/83/CE sur la qualité de
l’eau destinée à la consommation humaine a fixé le niveau maximal admissible à 0,010 µg/l pour le benzo(a)-
pyrène et à 0,100 µg/l pour la somme de quatre HAP spécifiés [benzo(b)fluoranthène, benzo(k)fluoranthène,
benzo(ghi)pérylène, indéno(1,2,3-cd)pyrène].

NORME INTERNATIONALE ISO 17993:2002(F)

Qualité de l'eau — Dosage de 15 hydrocarbures aromatiques
polycycliques (HAP) dans l'eau par HPLC avec détection par
fluorescence après extraction liquide-liquide
AVERTISSEMENT — Certains composés mesurés sont supposés être cancérigènes. L’acétonitrile et
l’hexane sont toxiques.
Il convient que les personnes utilisant la présente Norme internationale soient familières des pratiques
courantes de laboratoire. La présente Norme internationale ne prétend pas aborder tous les problèmes
éventuels de sécurité liés à son utilisation. Il est de la responsabilité de l’utilisateur d’établir des pratiques
de santé et de sécurité appropriées et de s’assurer de la conformité aux exigences réglementaires
nationales.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode pour le dosage, par chromatographie en phase liquide à
haute performance (HPLC) avec détection par fluorescence après extraction liquide-liquide, de 15 HAP
sélectionnés (voir Tableau 1) dans l’eau potable et dans les eaux souterraines à des concentrations en masse
supérieures à 0,005 µg/l (pour chaque composé individuel), et dans les eaux de surface à des concentrations en
masse supérieures à 0,01 µg/l.
Cette méthode est également appropriée, avec certaines modifications, pour l’analyse des eaux usées. Elle peut
être appliquée à d’autres HAP, sous réserve de valider la méthode dans chaque cas.
2 Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente Norme internationale. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
aux accords fondés sur la présente Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les
éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s’applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur.
ISO 5667-2, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 2: Guide général sur les techniques d’échantillonnage
ISO 5667-3, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 3: Guide général pour la conservation et la manipulation
des échantillons.
ISO 8466-1, Qualité de l’eau — Étalonnage et évaluation des méthodes d’analyse et estimation des caractères de
performance — Partie 1: Évaluation statistique de la fonction linéaire d’étalonnage
Tableau 1 — Hydrocarbures aromatiques polycycliques pouvant être déterminés par la présente méthode
Formule Pourcentage
Nom Masse molaire Numéro CAS Structure
chimique de carbone
C H
Naphtalène 128,17 g/mol 93,75 % C 091-20-3
10 8
C H
Acénaphtène 154,21 g/mol 93,05 % C 083-32-9
12 10
C H
Phénanthrène 178,23 g/mol 94,05 % C 085-01-8
14 10
C H
Fluoranthène 202,26 g/mol 95,0 % C 206-44-0
16 10
C H
Benzo(a)anthracène 228,29 g/mol 94,45 % C 056-55-3
18 12
a
C H
252,32 g/mol 95,2 % C 205-99-2
Benzo(b)fluoranthène
20 12
a
C H
252,32 g/mol 95,2 % C 050-32-8
Benzo(a)pyrène
20 12
C H
Dibenzo(a,h)anthracène 278,35 g/mol 94,7 % C 053-70-3
22 14
C H
Fluorène 166,22 g/mol 93,59 % C 086-73-7
13 10
C H
Anthracène 178,23 g/mol 94,05 % C 120-12-7
14 10
C H
Pyrène 202,26 g/mol 95,0 % C 129-00-0
16 10
2 © ISO 2002 – Tous droits réservés

Tableau 1 (suite)
Formule Pourcentage
Nom Masse molaire Numéro CAS Structure
chimique de carbone
C H
Chrysène 228,29 g/mol 94,45 % C 218-01-9
18 12
a
C H
252,32 g/mol 95,2 % C 207-08-9
Benzo(k)fluoranthène
20 12
a
C H
Indéno(1,2,3-cd)pyrène 276,34 g/mol 95,6 % C 193-39-5
22 12
a
C H
276,34 g/mol 95,6 % C 191-24-2
Benzo(ghi)pérylène
22 12
NOTE Les 15 HAP sélectionnés pour le dosage par la présente méthode correspondent à ceux de la liste EPA US, à l’exception de
l’acénaphtylène. Ce dernier ne peut pas être dosé par la présente méthode, car il n’est pas actif en fluorescence.
a
Composés spécifiés dans la Directive du Conseil 98/83/CE.

3 Principe
Les HAP présents dans l’échantillon aqueux sont extraits de l’échantillon d’eau à l’aide d'hexane. L’extrait est
concentré par évaporation, et le résidu est repris dans un solvant approprié pour l’analyse par HPLC.
Si nécessaire, les extraits d’eaux de surface et autres échantillons d’eau contaminés sont purifiés par
chromatographie sur silice avant l’analyse.
Les HAP sont séparés par HPLC à l’aide d’une phase stationnaire appropriée, en utilisant un gradient d’élution.
L’identification et la quantification sont effectuées au moyen de la détection par fluorescence avec programmation
de longueurs d’onde pour les longueurs d’onde d’excitation et d’émission.
NOTE Si seulement un nombre limité de HAP doivent être déterminés, la séparation peut également être réalisée en
conditions isocratiques.
4 Interférences
4.1 Interférences lors de l’échantillonnage et de l’extraction
Utiliser des récipients d’échantillonnage constitués de matériaux (de préférence en acier ou en verre) qui ne
modifient pas l’échantillon pendant la période de contact. Ne pas utiliser de matières plastiques ou d’autres
matières organiques durant l’échantillonnage, le stockage de l’échantillon ou l’extraction.
Si des échantillonneurs automatiques sont utilisés, éviter l’utilisation de tubes en silicone ou en caoutchouc; le cas
échéant, s’assurer qu’ils sont le plus court possible. Rincer la ligne d’échantillonnage avec l’eau à échantillonner
avant le prélèvement de l’échantillon. Se référer à l’ISO 5667-2 et à l’ISO 5667-3 à titre de lignes directrices.
Protéger les échantillons de la lumière directe du soleil et éviter l’exposition prolongée à la lumière.
Au cours du stockage des échantillons, des pertes de HAP peuvent se produire du fait de l’adsorption sur les
parois des récipients. L’importance des pertes dépend du temps de stockage.
4.2 Interférences lors de la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC)
Les composés qui sont fluorescents ou qui diminuent la fluorescence et ont des propriétés chromatographiques
similaires aux HAP à déterminer peuvent interférer avec le dosage. Ces interférences peuvent conduire à des
signaux incomplètement résolus conduisant à un chevauchement de pics et peuvent, selon leur amplitude, affecter
l’exactitude et la fidélité des résultats analytiques. Les pics asymétriques et les pics plus larges que les pics
respectifs du composé de référence peuvent indiquer des interférences. Ce problème peut se produire pour le
naphtalène et le phénanthrène selon la sélectivité des phases utilisées.
Une élimination incomplète des solvants employés pour le prétraitement de l’échantillon (hexane, acétone,
dichlorométhane) peut conduire à une faible reproductibilité des temps de rétention et à un élargissement des pics
ou à des pics doubles, particulièrement avec les HAP à 2 et à 3 noyaux.
La séparation entre le dibenzo(ah)anthracène et l’indéno(1,2,3-cd)pyrène peut être critique. Lorsqu’une résolution
incomplète est constatée, l’intégration des pics doit être vérifiée et, si nécessaire, corrigée.
Généralement, le pérylène est incomplètement résolu du benzo(b)fluoranthène, mais en choisissant une longueur
d’onde adéquate (voir Tableau A.1), le pic de pérylène peut être supprimé.
Étant donné que le pérylène peut être détecté dans les conditions données dans la méthode isocratique pour les
HAP, lesquelles sont applicables à l’eau potable (voir Figure A.3), il convient de l’inclure dans l’étape d’étalonnage.
5 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue, tels que «pour analyse de résidus» ou «pour
analyse HPLC», dans la mesure où ils sont disponibles, et uniquement de l’eau distillée ou de pureté équivalente,
de fluorescence aussi faible que possible.
Effectuer un contrôle à blanc pour s’assurer que les réactifs ne contiennent pas de HAP en concentrations
détectables (voir 8.9).
5.1 Solvants.
5.1.1 Solvants pour extraction, comme suit:
 hexane, C H ;
6 14
 d’autres solvants volatils peuvent être utilisés, s’il est prouvé que le rendement est équivalent ou meilleur.
5.1.2 Solvants pour la purification de l’extrait, comme suit:
 dichlorométhane, CH Cl ;
2 2
 hexane, C H ;
6 14
 N,N-diméthylformamide, (CH ) NCHO;
3 2
 acétone, C H O.
3 6
4 © ISO 2002 – Tous droits réservés

NOTE Le dichlorométhane contient souvent des stabilisants, tels que l’éthanol ou l’amylène, qui peuvent influer sur la
capacité d’élution de l’éluant. Sans stabilisant, des radicaux peuvent se développer, qui peuvent conduire à la dégradation des
HAP. La présence de chlorure d’hydrogène indique la présence de radicaux. Il peut être déterminé en extrayant le
dichlorométhane avec de l’eau et en mesurant la valeur du pH.
5.1.3 Solvants pour l’HPLC, comme suit:
 acétonitrile, CH CN;
 méthanol, CH OH.
5.2 Thiosulfate de sodium pentahydraté, Na S O ,5H O.
2 2 3 2
5.3 Sulfate de sodium, Na SO , anhydre, purifié par chauffage à 500 °C.
2 4
5.4 Azote, ayant une concentration minimale par volume de 99,999 %.
5.5 Silice, ayant une taille moyenne des particules d'environ 40 µm, stockée dans un dessiccateur pour garantir
une activité optimale.
NOTE Des cartouches de silice préremplies sont disponibles dans le commerce.
5.6 Tamis moléculaire en perles, complètement activé et ayant un diamètre de pore de 0,4 nm.
5.7 Composés de référence (répertoriés dans le Tableau 1).
En raison de la nature dangereuse de ces composés, il est vivement recommandé d’utiliser des solutions étalons
disponibles dans le commerce, de préférence certifiées. Éviter tout contact avec la peau.
5.8 Solutions mères.
Les solutions spécifiées en 5.8.1 et 5.8.2 sont stables pendant au moins 12 mois si elles sont conservées dans
l’obscurité à température ambiante et protégées contre l’évaporation.
5.8.1 Solutions mères de composés individuels, de ceux répertoriés dans le Tableau 1, diluées dans de
l’acétonitrile (5.1.3) jusqu'à obtention d'une concentration en masse de 10 µg/ml par exemple.
Ces solutions sont nécessaires pour la confirmation et l’identification des HAP individuels dans le
chromatogramme.
5.8.2 Solution mère de composés multiples, certifiée, diluée dans de l’acétonitrile (5.1.3) jusqu'à obtention
d'une concentration en masse, par exemple de 10 µg/ml, des composés individuels respectifs.
5.9 Solutions de référence.
Préparer au moins 5 solutions d’étalonnage par dilution appropriée de la solution mère (5.8.2), en utilisant du
méthanol (5.1.3) ou de l’acétonitrile (5.1.3) comme solvant. Le choix du solvant dépend de la composition de la
phase mobile.
Transférer, par exemple, 50 µl de la solution mère dans une fiole jaugée de 5 ml, et compléter au volume avec de
l’acétonitrile. 1 µl de cette solution de référence contient 100 pg des composés individuels respectifs.
Ces solutions restent stables pendant au moins une année lorsqu’elles sont stockées dans un endroit sombre à
température ambiante et protégées de l’évaporation.
Contrôler régulièrement la stabilité des solutions de référence au moyen de mesurages dans le cadre du système
interne d’assurance qualité.
Le contrôle de la concentration en masse de HAP dans la solution mère ne peut se faire que par comparaison
avec une solution étalon indépendante, de préférence certifiée.
6 Appareillage
Verrerie courante de laboratoire, nettoyée pour éliminer toutes les interférences.
La verrerie peut être nettoyée, par exemple en la rinçant avec un détergent et de l’eau chaude, et en la séchant
pendant environ 15 min à 30 min à 120 °C environ. Après refroidissement, rincer avec de l’acétone, boucher
hermétiquement et stocker dans un environnement propre.
Ne pas réutiliser pour l’analyse d’eau potable la verrerie qui a été en contact avec des échantillons d’eaux usées
ou avec des échantillons à fortes concentrations en HAP.
6.1 Flacons en verre brun, à col étroit et à fond plat, de 1 000 ml de capacité, avec bouchon en verre, de
préférence de masse connue.
6.2 Agitateur magnétique, avec barreaux d’agitation, revêtus de verre ou de polytétrafluoroéthylène (PTFE),
pour agiter le solvant utilisé pour l’extraction.
6.3 Ampoule de séparation, de 1 000 ml de capacité, avec robinet d’arrêt en PTFE et bouchon en verre.
6.4 Fioles coniques, de 100 ml et 250 ml de capacité, avec bouchon en verre.
6.5 Seringues microlitres, de 500 µl et 1 000 µl de capacité.
6.6 Fiole de réduction, de 100 ml de capacité (voir Figure B.1).
6.7 Centrifugeuse avec rotor, pouvant accommoder des tubes à centrifuger à fond conique, de 50 ml de
capacité (voir Figure B.2).
6.8 Pipettes Pasteur.
6.9 Dispositif d’évaporation, par exemple évaporateur rotatif avec stabilisateur de vide et bain d’eau.
6.10 Dispositif d’agitation, avec vitesse de rotation réglable.
6.11 Microfiltre, avec membrane hydrophile résistant aux solvants et ayant une taille de pore 0,45 µm.
6.12 Fioles en verre, capacité d’environ 2 ml, avec bouchon inerte, par exemple septum revêtu de PTFE.
6.13 Cartouches en polypropylène ou en verre, remplies d’au moins 0,5 g de silice (voir 5.5).
NOTE Ces cartouches sont disponibles dans le commerce.
6.14 Fioles en verre, par exemple tubes à centrifuger gradués (intervalle de graduation de 0,1 ml), d’une
capacité nominale de 10 ml, avec bouchons en verre.
6.15 Chromatographe en phase liquide à haute performance, avec détecteur de fluorescence et système de
traitement des données, comprenant notamment les éléments suivants.
6.15.1 Ensemble de dégazage, par exemple pour le dégazage sous vide ou à l’hélium.
6.15.2 Pompes analytiques, permettant de réaliser un gradient d’élution binaire.
6.15.3 Thermostat de colonne, capable de maintenir une température constante à ±††† 0,5 °C près.
6.15.4 Détecteur de fluorescence, capable de programmer au moins 6 paires de longueurs d’onde, y compris
amortissement/amplification, muni de préférence de monochromateur(s).
6.16 Colonne de séparation analytique, satisfaisant aux exigences de séparation stipulées en 8.5.2 (pour des
exemples, voir annexe A).
6 © ISO 2002 – Tous droits réservés

7 Échantillonnage
Lors de l’échantillonnage d’eau potable depuis un robinet d’une alimentation en eau, prélever l’échantillon avant
que le robinet ne soit stérilisé pour échantillonnage bactériologique.
Prélever l’échantillon pour essai dans un flacon en verre brun (6.1). Déchlorer les échantillons d’eau contenant du
chlore en ajoutant immédiatement environ 50 mg de thiosulfate de sodium (5.2).
Remplir le flacon jusqu’à l’épaulement (1 000 ml environ) et stocker l’échantillon pour essai à environ + 4 °C en
veillant à le protéger de la lumière jusqu’à la phase d’extraction. S’assurer que l’extraction est effectuée dans un
délai de 24 h après l’échantillonnage afin d’éviter les pertes dues à l’adsorption. Si l’analyse complète ne peut pas
être effectuée dans les 24 h, utiliser la procédure suivante dans ce même délai. Prélever une partie de l’échantillon
du récipient d’échantillonnage pour ne laisser qu’un volume d’échantillon de 1 000 ml ±††† 10 ml et déterminer, par
pesée du flacon, le volume de l’échantillon pour essai. Ajouter 25 ml d’hexane (5.1.2) et agiter vigoureusement.
L’échantillon pour essai prétraité peut être conservé pendant 72 h à environ + 4 °C, à l’abri de la lumière.
8 Mode opératoire
8.1 Extraction
Homogénéiser l’échantillon pour essai, par exemple à l’aide d’un agitateur magnétique. Prélever une partie de
l’échantillon pour essai du récipient d’échantillonnage pour ne laisser qu’un volume d’échantillon de
1 000 ml ±††† 10 ml. Déterminer le volume de l’échantillon par pesée du flacon, ajouter 25 ml d’hexane (5.1.2) et
agiter. D’autres solvants volatils peuvent être utilisés pour l’extraction s’il est prouvé que le rendement est
équivalent ou meilleur.
Ajouter un barreau d’agitation et placer le couvercle sur le flacon. Mélanger ensuite vigoureusement l’échantillon
−1
pour essai à l’aide de l’agitateur magnétique (6.2) à vitesse maximale (1 000 min ) pendant 60 min. Transférer
l’échantillon pour essai dans une ampoule de séparation (6.3) et laisser les phases se séparer pendant au moins
5 min. La séparation des phases peut également être réalisée à l’aide d’un microséparateur (un exemple est
présenté à la Figure B.3).
Si une émulsion stable se forme durant l’extraction, la recueillir dans un tube à centrifuger (6.14) et centrifuger
−1
pendant 10 min à environ 3 000 min . Éliminer l’eau séparée à l’aide d’une pipette Pasteur (6.8), transférer
l’extrait dans une fiole conique de 100 ml (6.4). Sécher l’extrait conformément à 8.2.
Pour l’extraction d’échantillons d’eaux usées ou d’échantillons d’eau à fortes concentrations en HAP, seuls 10 ml à
100 ml de l’échantillon pour essai homogène sont transférés dans une fiole conique de 250 ml (6.4) à l’aide d’une
pipette, puis dilués à 200 ml avec de l’eau. Après avoir ajouté 25 ml d’hexane (5.1.2), procéder comme décrit
ci-dessus.
8.2 Séchage de l’extrait
Transférer la phase hexane obtenue selon 8.1 dans une fiole conique de 100 ml (6.4). Ri
...