ISO 13646:2025
(Main)Water quality — Determination of selected estrogens in whole water samples — Method using solid phase extraction (SPE) followed by liquid chromatography (LC) or gas chromatography (GC) coupled to mass spectrometry (MS) detection
Water quality — Determination of selected estrogens in whole water samples — Method using solid phase extraction (SPE) followed by liquid chromatography (LC) or gas chromatography (GC) coupled to mass spectrometry (MS) detection
This document specifies methods for the determination of five selected estrogens in whole water samples listed in Table 1 (see REF Section_sec_4 \r \h Clause 4 08D0C9EA79F9BACE118C8200AA004BA90B02000000080000000E000000530065006300740069006F006E005F007300650063005F0034000000 ). The methods are based on solid-phase extraction (SPE; disk or cartridge) followed by liquid or gas chromatography-mass spectrometry detection (tandem mass spectrometry or high resolution mass spectrometry). Depending on the sample preparation chosen, the sample preparation can be applicable to the analysis of selected estrogens in drinking water, groundwater and surface water containing suspended particulate matter (SPM) up to 500 mg/l, dissolved organic carbon (DOC) content up to 14 mg/l (whole water samples). The lower application range defined as verified limit of quantification can vary depending on the methods, the sensitivity of the equipment used and the matrix of the sample. The range is 0,006 ng/l to 1 ng/l for 17alpha-ethinylestradiol (EE2) and 0,038 ng/l to 1 ng/l for the other estrogens in drinking water, ground water and surface water. The upper limit of the working range is approximately tens of nanograms per litre. For application that targets the measurements of very low level concentrations (between the lowest LOQ and 0,1 ng/l), every single step of the procedure becomes critical. The methods can be used to determine further estrogens or hormones in other types of water, for example treated wastewater, if accuracy has been tested and verified for each case as well as storage conditions of both samples and reference solutions have been validated.
Qualité de l’eau — Dosage d’œstrogènes sélectionnés dans des échantillons d’eau totale — Méthode par extraction en phase solide (SPE) suivie d’une détection par chromatographie en phase liquide (CL) ou en phase gazeuse (CG) couplée à la spectrométrie de masse (SM)
Le présent document spécifie des méthodes pour le dosage de cinq œstrogènes sélectionnés dans les échantillons d’eau totale, qui sont répertoriés dans le Tableau 1 (voir REF Section_sec_4 \r \h l’Article 4 08D0C9EA79F9BACE118C8200AA004BA90B02000000080000000E000000530065006300740069006F006E005F007300650063005F0034000000 ). Les méthodes reposent sur une extraction en phase solide (SPE sur disque et/ou cartouche) suivie d’une détection par chromatographie en phase liquide ou gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (spectrométrie de masse en tandem et/ou spectrométrie de masse haute résolution). Selon la préparation des échantillons choisie, la préparation de l’échantillon peut être appliquée à l’analyse des œstrogènes sélectionnés dans l’eau potable, les eaux souterraines et les eaux de surface contenant une teneur en matières en suspension (MES) jusqu’à 500 mg/l et une teneur en carbone organique dissous (COD) jusqu’à 14 mg/l (échantillons d’eau totale). La gamme d’application basse définie en tant que limite de quantification vérifiée peut varier selon les méthodes, la sensibilité de l’équipement utilisé et la matrice de l’échantillon. La gamme s’étend de 0,006 ng/l à 1 ng/l pour le 17alpha-éthinylestradiol (EE2) et de 0,038 ng/l à 1 ng/l pour les autres œstrogènes dans l’eau potable, les eaux souterraines et les eaux de surface. La limite supérieure du domaine d’application est de l’ordre de la dizaine de nanogrammes par litre. Pour une application qui vise à mesurer de très faibles niveaux de concentration (entre la plus faible LQ et 0,1 ng/l), chaque étape individuelle des modes opératoires revêt une importance critique. Les méthodes peuvent être utilisées pour doser d’autres œstrogènes ou hormones dans d’autres types d’eau, par exemple les eaux usées traitées, sous réserve que l’exactitude ait été soumise à essai et démontrée pour chaque cas et que les conditions de conservation des échantillons et des solutions de référence aient été validées.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
International
Standard
ISO 13646
First edition
Water quality — Determination of
2025-10
selected estrogens in whole water
samples — Method using solid
phase extraction (SPE) followed by
liquid chromatography (LC) or gas
chromatography (GC) coupled to
mass spectrometry (MS) detection
Qualité de l’eau — Dosage d’œstrogènes sélectionnés dans des
échantillons d’eau totale — Méthode par extraction en phase
solide (SPE) suivie d’une détection par chromatographie en phase
liquide (CL) ou en phase gazeuse (CG) couplée à la spectrométrie
de masse (SM)
Reference number
© ISO 2025
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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on
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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .v
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms, definitions and subscripts . 2
3.1 Terms and definitions .2
3.2 Subscripts . .4
4 Principle . 4
5 Interferences . 5
5.1 General .5
5.2 Interferences with sampling, extraction and concentration . .5
5.3 Interferences during high performance liquid chromatography and mass spectrometry .6
5.4 Interferences during gas phase chromatography and mass spectrometry .7
5.5 Interferences from internal standards .8
6 Reagents . 8
7 Apparatus . 14
8 Sampling . 16
9 Procedure . 17
9.1 General .17
9.2 Sample preparation and extraction .18
9.2.1 General .18
9.2.2 Sample preparation .18
9.2.3 SPE cartridge extraction .19
9.2.4 SPE disk Extraction . 20
9.3 Sample clean-up (purification) . 20
9.3.1 General . 20
9.3.2 Principle .21
9.3.3 Procedure .21
9.4 Reconcentration .21
9.5 Liquid chromatography coupled to mass spectrometry . 22
9.5.1 High performance liquid chromatography (LC) . 22
9.5.2 Detection . 22
9.5.3 Derivatization . 23
9.6 Gas chromatography coupled to mass spectrometry .24
9.6.1 Derivatization .24
9.6.2 Gas chromatography (GC) . 25
9.6.3 Detection . 25
10 Calibration .26
10.1 General . 26
10.2 Calibration by isotope dilution . 26
10.3 Calibration check .27
11 Quality assurance and quality control (QA/QC) .27
11.1 Identification of the substances .27
11.2 Blanks .27
12 Limit of quantification (LOQ) .28
13 Calculation of recovery .28
13.1 General . 28
13.2 Calculation of analyte recovery using samples . 28
13.3 Recovery rates from internal standards . 29
iii
14 Calculation of the concentration in the sample .29
15 Expression of results .30
16 Test report .30
17 Performance data .31
Annex A (informative) Performance data .32
Annex B (informative) Examples of SPE cartridge extraction protocols .35
Annex C (informative) Examples of SPE disk extraction protocols .37
Annex D (informative) Examples of SPE clean-up protocols .39
Annex E (informative) Examples of LC-MS/MS protocols . 41
Annex F (informative) Example of LC-HRMS protocol .52
Annex G (informative) Examples of GC-MS/MS protocols .56
Annex H (informative) Example of GC-HRMS protocol . 61
Bibliography .62
iv
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 2, Physical,
chemical and biochemical methods,in collaboration with the European Committee for Standardization
(CEN) Technical Committee CEN/TC 230, Water analysis, in accordance with the Agreement on technical
cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
v
Introduction
Natural and synthetic estrogens are widely used worldwide, e.g. for contraception. Through application or
improper disposal, these estrogens can enter the water cycle unchanged or transformed. They can therefore
be detected in surface and groundwater, as well as in treated wastewater. It is known that estrogens can
end up in surface waters via wastewater, and due to their physicochemical properties, they can partition in
the different compartments [water and suspended particulate matter (SPM)] of water systems. They are of
rising concern, due to their high estrogenic activity even at the measured ultra-trace levels (far below ng/l).
Besides feminised fish and other endocrine disruptive effects in water ecosystems, they can also be a factor
[16]
in biodiversity loss. Therefore, appropriate measurement methods are required to monitor estrogen
levels below their ecotoxicological level [e.g. predicted no effect concentration (PNEC) or environmental
quality standard (EQS)] and accordingly demonstrate if a water body is at risk.
This document specifies validated methods for analysing water samples in monitoring programs aiming at
qualifying the quality of the water environment with respects to the selected estrogens.
vi
International Standard ISO 13646:2025(en)
Water quality — Determination of selected estrogens in
whole water samples — Method using solid phase extraction
(SPE) followed by liquid chromatography (LC) or gas
chromatography (GC) coupled to mass spectrometry (MS)
detection
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice. This
document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its use. It is
the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document be
carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This document specifies methods for the determination of five selected estrogens in whole water samples
listed in Table 1 (see Clause 4). The methods are based on solid-phase extraction (SPE; disk or cartridge)
followed by liquid or gas chromatography-mass spectrometry detection (tandem mass spectrometry or
high resolution mass spectrometry). Depending on the sample preparation chosen, the sample preparation
can be applicable to the analysis of selected estrogens in drinking water, groundwater and surface water
containing suspended particulate matter (SPM) up to 500 mg/l, dissolved organic carbon (DOC) content up
to 14 mg/l (whole water samples).
The lower application range defined as verified limit of quantification can vary depending on the methods,
the sensitivity of the equipment used and the matrix of the sample. The range is 0,006 ng/l to 1 ng/l for
17alpha-ethinylestradiol (EE2) and 0,038 ng/l to 1 ng/l for the other estrogens in drinking water, ground
water and surface water. The upper limit of the working range is approximately tens of nanograms per litre.
For application that targets the measurements of very low level concentrations (between the lowest LOQ
and 0,1 ng/l), every single step of the procedure becomes critical.
The methods can be used to determine further estrogens or hormones in other types of water, for example
treated wastewater, if accuracy has been tested and verified for each case as well as storage conditions of
both samples and reference solutions have been validated.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content constitutes
requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 8466-1:2021, Water quality — Calibration and evaluation of analytical methods — Part 1: Linear calibration
function
ISO 21253-1:2019, Water quality — Multi-compound class methods — Part 1: Criteria for the identification of
target compounds by gas and liquid chromatography and mass spectrometry
ISO 11352:2025, Water quality — Estimation of measurement uncertainty based on validation and quality
control data
3 Terms, definitions and subscripts
3.1 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1.1
accuracy
closeness of agreement between a measured quantity value and a true quantity value of a measurand
[SOURCE: ISO/IEC Guide 99:2007, 2.13, modified — the terms “measurement accuracy” and “accuracy of
measurement” and Notes 1, 2 and 3 to entry have been deleted.]
3.1.2
analyte
substance to be analyzed
[SOURCE: ISO 6107:2021, 3.31, modified — the domain and Notes 1 and 2 to entry have been deleted.]
3.1.3
blank
aliquot of reagent water (reagent blank) or of a matrix in which the analyte (3.1.2) is absent (matrix blank)
that is treated exactly as a sample through the complete analytical procedure including extraction, clean-up,
identification and quantification including all the relevant reagents and materials
Note 1 to entry: It is crucial that the laboratory specifies which blank is considered.
[SOURCE: ISO 21253-2:2019, 3.2]
3.1.4
calibration
operation that, under specified conditions, in a first step, establishes a relation between the quantity values
with measurement uncertainties provided by measurement standards and corresponding indications with
associated measurement uncertainties and, in a second step, uses this information to establish a relation for
obtaining a measurement result from an indication
Note 1 to entry: A calibration may be expressed by a statement, calibration function, calibration diagram, calibration
curve, or calibration table. In some cases, it may consist of an additive or multiplicative correction of the indication
with associated measurement uncertainty.
Note 2 to entry: Calibration should not be confused with adjustment of a measuring system, often mistakenly called
“self-calibration”, nor with verification of calibration.
[SOURCE: ISO/IEC Guide 99:2007, 2.39, modified — Note 1 to entry has been deleted.]
3.1.5
certified reference material
CRM
reference material, accompanied by documentation issued by an authoritative body and providing one or
more specified property values with associated uncertainties and traceabilities, using valid procedures
[SOURCE: ISO/IEC Guide 99:2007, 5.14, modified — Notes 1, 2, 3, 4 and 5 to entry have been deleted.]
3.1.6
integrity
property of the parameter(s) of interest, information or content of a sample stored in a container that has
not been altered or lost in an unauthorized manner or that has been subject to loss of representativeness
[SOURCE: ISO 5667-3:2024, 3.2]
3.1.7
isotope dilution quantification
process where isotopically labelled standards (e.g. deuterium- or carbon 13-labeled), which are chemically
similar isotopic analogs of the target analytes (3.1.2), are added to all environmental and quality control and
quality assurance samples before extraction and that follow the analytical procedure
Note 1 to entry: Isotope dilution quantification improves quantitative accuracy (3.1.1) by accounting for sample-
specific procedural losses in the determined analyte concentration
3.1.8
limit of quantification
LOQ
lowest value of a determinand that can be determined with an acceptable level of accuracy (3.1.1), which
could be estimated by different means and verified in the intended matrix
[SOURCE: ISO 21253-2:2019, 3.4]
3.1.9
recovery
relative recovery
extent to which a known, added quantity of determinant in a sample can be measured by an analytical system
Note 1 to entry: Recovery is calculated from the difference between results obtained from a spiked and an unspiked
aliquot of sample and is usually expressed as a percentage.
[SOURCE: ISO 5667-14:2014, 3.8]
3.1.10
traceability
property of a measurement result whereby the result can be related to a reference through a documented
unbroken chain of calibrations (3.1.4), each contributing to the measurement uncertainty
[SOURCE: ISO/IEC Guide 99:2007, 2.41, modified — Notes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8 to entry have been deleted.]
3.1.11
yield
absolute recovery
amount of analyte (3.1.2) added in the test sample corrected by the relative recovery of the internal standard
(analyte-to-internal standard ratio)
Note 1 to entry: Yield is a value that accounts for both sample matrix effect and compound recovery.
[SOURCE: ISO 21253-2:2019, 3.11]
3.2 Subscripts
a measuring variables for addition
A addition
e measuring variables for the calibration
i identity of the substance
I internal standard
j consecutive number for value pairs
g found value
v default value
M measuring solution
P sample
R reference
4 Principle
A water sample is spiked with an appropriate amount of isotopic labelled standard analogous of each
targeted estrogen, before the sample is extracted by solid phase extraction (SPE) cartridge or disk and
then cleaned up by SPE. The separation of the substances is achieved by liquid chromatography (LC) or
gas chromatography (GC) with an identification and quantification based on mass spectrometry [tandem
mass spectrometry (MS/MS) or high-resolution mass spectrometry (HRMS)]. The result is calculated by
implementing isotope dilution calibration.
Table 1 — Characteristics of the five selected estrogens
a
Name Structure CAS RN Formula Molecular log K
ow
weight
g/mol
17alpha-ethinylestradiol (EE2)
IUPAC name: (13R,17S)-17-ethynyl-13-me-
57-63-6 C H O 296,40 4,52
20 24 2
thyl-7,8,9,11,12,14,15,16-octahydro-6H-cyclopenta[a]
phenanthrene-3,17-diol
17alpha-estradiol (17αE2)
IUPAC name: (8R,9S,13S,14S,17R)-13-me-
57-91-0 C H O 272,38 4,13
18 24 2
thyl-6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-decahydrocyclopenta[a]
phenanthrene-3,17-diol
17beta-estradiol (17βE2)
IUPAC name: (8R,9S,13S,14S,17S)-13-me-
50-28-2 C H O 272,38 4,13
18 24 2
thyl-6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-decahydrocyclopenta[a]
phenanthrene-3,17-diol
Estriol (E3)
IUPAC name: (8R,9S,13S,14S,16R,17R)-13-me-
50-27-1 C H O 288,38 2,94
18 24 3
thyl-6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-decahydrocyclopenta[a]
phenanthrene-3,16,17-triol
Estrone (E1)
IUPAC name: (8R,9S,13S,14S)-3-hydroxy-13-methyl-
53-16-7 C H O 270,37 3,69
18 22 2
7,8,9,11,12,14,15,16-octahydro-6H-cyclopenta[a]phenan-
threne-17-one
a
CAS Registry Number® is a trademark of the American Chemical Society (ACS). This information is given for the convenience of users of
this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products may be used if they can be shown to
lead to the same results.
5 Interferences
5.1 General
Solvents, reagents, glassware and other sample processing hardware can yield artefacts, elevated baselines
or lock-mass suppression causing misinterpretation of chromatograms.
Proper cleaning of glassware is extremely important, because glassware cannot only contaminate the
samples but can also remove the analytes of interest by adsorption on the glass surface.
Glassware should be rinsed with solvent and washed with a detergent solution as soon after use as is
practical. Sonication of glassware containing a detergent solution for 30 s can aid in cleaning. After detergent
washing, glassware should be rinsed first with solvent (e.g. methanol) and then with ultrapure water (6.1).
Baking of glassware in an oven, programmable and capable of heating to at least 450 °C for 2 h can be
warranted.
Sample contamination is a concern because estrogenic substances are biogenic and can be present on human
skin or can be used as pharmaceuticals or personal care products. It is important that field and laboratory
personnel exercise care to avoid contamination of the samples by avoiding consumption or contact with
such materials immediately before and during sample collection and processing procedures. Exercising
care is important for both the acquisition and subsequent handling of samples and sample extracts to avoid
contamination.
5.2 Interferences with sampling, extraction and concentration
Use sampling containers of materials (7.1) that do not affect the analyte content during the contact time,
preferably glass. Avoid plastics and organic materials during sampling, sample storage at (5 ± 3) °C or
extraction especially if very low level of concentrations are targeted. High-density polyethylene (HDPE) or
polytetrafluoroethylene (PTFE) may be used but are not recommended if very low concentration levels
(< 0,1 ng/l) are to be measured.
If automatic samplers are used, avoid the use of silicone or rubber material for the tubes. If these materials
are present, ensure that the contact time is minimized. Rinse the sampling line with the water to be sampled
before taking the test sample. ISO 5667-1 and ISO 5667-3 provide guidance.
The storage temperature is (5 ± 3) °C. For sampling and sample preservation, see Clause 8.
During storage of the test samples, losses of components can occur due to adsorption on the walls of the
containers. The extent of the losses depends on the storage time.
Commercially available solid-phase extraction (SPE cartridge or disk) can differ in quality. Variations in
the selectivity of the materials also frequently occur from batch to batch, thus possibly causing significant
deviations in extraction yield. This does not basically impair their suitability, apart from a resulting higher
quantification limit for individual substances.
Avoid major fluctuations in the extraction times and elution procedures within one sample sequence when
analyzing the samples.
Water samples containing high content of SPM or DOC can lead to clogging in case of SPE cartridge use
(see 9.2.2) that can be prejudicial to extraction recovery. To overcome this, a reduction of sample volume or
switching to SPE disk (see 9.2.3) extraction can be implemented. Another solution is the application of glass
wool or sand to the cartridge (filling height 1 cm to 2 cm) to achieve the extraction of higher sample volumes.
Repeated uses and cleaning procedures of glassware can cause active sites on the glass surface that can
irreversibly adsorb the selected estrogens and also be responsible of cross contamination.
To prevent cross contamination between series, SPE apparatus, tubing and items in contact with samples
shall be cleaned with successively, for example, (hot) water with detergents, solvents (e.g. methanol, acetone,
ethanol) then rinsed with water and dried.
Interferences co-extracted from samples will vary considerably from source to source, depending on the
diversity of the site being sampled. Interfering substances can be present at concentrations several orders
of magnitude higher than the selected estrogens. The most frequently encountered interferences are humic
and other acids. Given that very low levels of estrogens can be measured by this method, elimination of
interferences is essential (implementation of clean-up, see 9.3).
5.3 Interferences during high performance liquid chromatography and mass spectrometry
Substances with similar retention times and masses as the target estrogens can lead to interferences and
overlapping or incompletely resolved peaks in the chromatogram. Depending on their intensity, those co-
eluents can affect the trueness of the analysis.
17αE2 and 17βE2 are epi-isomers and as consequence have the same transitions in MS/MS. It is critical
to separate both substances. A minimal chromatographic resolution of R ≥ 1,2 must be achieved. If the
criterion cannot be achieved, a suitable column shall be chosen to meet the required resolution (see Annex E
and Annex F for examples).
The chromatographic resolution is calculated according to Figure 1 and Formula (1).
Key
X time
Y intensity
t , t retention time of eluting substances 1 and 2 in seconds (s)
R1 R2
w , w peak width at the base of each peak in seconds (s)
b1 b2
Figure 1 — Resolution of chromatographic peaks
()tt−
RR21
R=2 (1)
ww+
bb12
where
R is the resolution;
t , t is the retention time of eluting substances 1 and 2 in seconds (s);
R1 R2
w , w is the peak width at the base of each peak in seconds (s).
b1 b2
NOTE Alternative calculation methods for R are also possible.
For some targeted estrogens, some sensitive transitions have shown a lack of selectivity or specificity
leading to possibly false positive and overestimation of results.
Accompanying substances (matrix) can affect the ionization of the target substances (e.g. ion suppression
or signal enhancement). This can result in underestimation or overestimation of concentration during
quantification and significantly affect the sensitivity of the method. These interferences can be detected and
corrected by implementing a clean-up step (see 9.3) and isotope dilution quantification.
5.4 Interferences during gas phase chromatography and mass spectrometry
Substances with similar retention times and masses as the target estrogens can lead to interferences and
overlapping or incompletely resolved peaks in the chromatogram. Depending on their intensity, those co-
eluents can affect the trueness of the analysis.
17αE2 and 17βE2 are epi-isomers and as consequence have the same transitions in MS. It is critical to
separate both substances. A minimal chromatographic resolution of R ≥ 1,2 is suitable. If the criterion cannot
be reached, a suitable column shall be chosen to meet the required resolution (see Annex G and Annex H for
an example).
Interferences from accompanying substances (matrix) can occur depending on methods applied.
5.5 Interferences from internal standards
For mass spectrometric detection, it is recommended to use a stable isotopically labelled analogue as an
13 15
internal standard; C or N-labelled compounds are preferred rather than deuterated compounds. There
is generally an observable drift in retention time compared to the natural compound when working with
isotopically labelled standards (isotope effect).
Only a stable part of the molecule shall be labelled, and degree of labelling shall not change over the course
of analysis. Exchanges can take place, via tautomerization processes for example, and so this type of
mechanism shall be experimentally verified in the event that the abundance of internal standard is shown
to vary.
Spectral overlapping between labelled analogue and native substances shall be avoided. Consequently, for
the majority of applications, the labelled analogue should preferably have a mass difference of at least 3 Da
to the native target substance.
The isotopic purity of the internal standards shall be checked. It is not a critical factor provided that
its impurities, including unlabelled analogue, have preferably zero contribution on target compounds of
the analytical method. In the event that this is not possible, the contribution of the labelled analogue to the
unlabelled analogue should be negligible at LOQ level.
If internal standards with less than 3 Da are implemented, the above criteria shall be checked and
documented to prevent from false positive and misquantification.
6 Reagents
As far as available, analytical grade or residue-analytical grade reagents shall be used. The content of
impurities contributing to blank values or causing interfering signals shall be negligible (below 1/3 LOQ).
This shall be checked in regular intervals.
Reagents, solvents and water used as eluents shall be suitable for LC or respectively GC and mass
spectrometry.
When very low level of estrogens are to be measured (below 0,1 ng/l) and the lowest LOQ shall be reached
the quality of reagents and materials become highly critical and shall be routinely monitored to prevent
cross contamination and false positive results.
6.1 Water, H O.
Ultrapure water without any interfering blank values. The quality of water is checked by the same procedure
as the sample to be measured.
Commercially available mineral water in glass bottles can also be used to determine method blank when
ultrapure water has significant background interference.
6.2 Sodium thiosulfate pentahydrate,w(Na S O ·5H O) of at least 99 %.
2 2 3 2
6.3 Disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA), (ρ ≈ 0,025 g/ml), (C H N Na O ⋅2H O),
10 14 2 2 8 2
at least 99 %.
Dissolve 25 g EDTA in 1 000 ml of water.
6.4 Methanol(MeOH), (CH OH), for extraction, purification, mobile phase and preparation of reference
solutions.
6.5 Acetonitrile (ACN), (CH CN), for extraction, purification, mobile phase and preparation of reference
solutions.
6.6 Ethyl acetate(EA), (C H O ), for extraction and purification.
4 8 2
6.7 Acetone, (C H O), for extraction and purification and derivatization (GC).
3 6
6.8 n-hexane, (C H ), for extraction and purification.
6 14
6.9 Methyl tert-butyl ether (MTBE), (C H O), for extraction and purification.
5 12
6.10 Acetone extra dry, (C H O), for derivatization.
3 6
6.11 Acetic acid,w(CH COOH) of at least 99 %, for mobile phase (LC).
6.12 Formic acid,w(HCOOH) of at least 98 %, for mobile phase (LC).
6.13 Hydrochloric acid,w(HCl) of at least 36 %, for pH adjustment of water sample.
6.14 Sulphuric acid,w(H SO ) of at least 98 %, for pH adjustment of water sample.
2 4
6.15 Sodium chloride,w(NaCl) of at least 98 %, for preservation of analytes in water sample.
6.16 Ascorbic acid,w(C H O ) of at least 98 %, for preservation of analytes in water sample.
6 8 6
6.17 Ammonium fluoride, (NH F), at least 98 %, for mobile phase (LC).
6.18 Pyridine, (C H N), for derivatization (GC).
5 5
6.19 N-trimethylsilylimidazole (TMSI), (C H N Si), for derivatization (GC).
6 12 2
6.20 5-(dimethylamino)naphthalene-1-sulfonyl chloride, dansyl chloride(DNSCl), (C H ClNO S), LC
12 12 2
grade for dansylation (LC).
6.21 Pyridine-3-sulfonyl chloride(PS-Cl), (C H ClNO S), for derivatization (LC).
5 4 2
6.22 Sodium carbonate concentrate (0,1 mol/l, pH = 10,5), (Na CO ), in water, for derivatization (LC).
2 3
6.23 Sodium bicarbonate concentrate, 0,1 mol/l, for derivatization (LC).
6.24 Sodium hydroxide solution, 10 mol/l, for derivatization (LC) and pH adjustment of water sample.
6.25 Dansyl reagent solution, for dansylation (LC).
The volume of dansyl reagent to be prepared shall be calculated beforehand because it depends on the
number of samples to be dansyled. To do this, weigh 0,783 mg of dansyl chloride (6.20) for 1 ml of extra dry
acetone (6.10) in an amber glass bottle of suitable volume, then mix well. The dansyl reagent thus prepared
cannot be stored for more than 24 h. The vial of dansyl chloride, once opened, can be stored for one week at
a controlled temperature 5 °C ± 3 °C.
6.26 Pyridine-3-sulfonyl chloride solution, for derivatization (LC).
Weigh 10 mg to 40 mg of pyridine-3-sulfonyl chloride (PS-Cl) (6.21) and add 10 ml to 40 ml of acetone (6.7)
into a glass vial so that a solution of 1 mg/ml is formed. Transfer PS-Cl with a glass pipette. Mix well. PS-Cl
is a reactive, moisture-sensitive and turbid liquid. It is recommended to add some nitrogen into the PS-Cl
reagent vial after usage and into the PS-Cl solution vial after preparation and usage. If this is done, the
opened PS-Cl reagent vial can be used at least for four months. Discard the PS-Cl reagent if it turns clearly
more solid. Store both at (5 ± 3) °C.
6.27 Bicarbonate buffer 100 mmol/ml, pH = 10,5, for dansylation.
Weigh 1,68 g of sodium bicarbonate into a 200 ml volumetric flask, then adjust the volume with laboratory
grade water (6.1). Transfer the solution obtained into a 250 ml glass bottle. Using a pH meter, adjust the
pH of the solution to 10,5 ± 0,1 with a 10 mol/l of sodium hydroxide solution (6.24) (e.g. about 1 ml) and
homogenize. The buffer thus prepared can then be stored for one month, at a controlled temperature
(5 ± 3) °C.
6.28 Bicarbonate buffer 100 mmol/l, pH = 10,5, for derivatization.
Mix 80 ml of sodium carbonate concentrate (6.22) and 20 ml of sodium bicarbonate concentrate (6.23).
Using a pH meter, adjust the pH of the solution to 10,5 ± 0,1, if needed, by adding either sodium carbonate
concentrate (if pH is below 10,5) or sodium bicarbonate concentrate (if the pH is above 10,5) and homogenize.
The buffer thus prepared can be stored for one month, at a controlled temperature of (5 ± 3) °C.
6.29 Operating gases for the gas chromatography or liquid chromatography mass spectrometry, of
high purity and in accordance with the manufacturer's specifications.
6.30 Standards.
6.30.1 Reference substances, see Table 1 for list of substances.
High purity standards shall be implemented.
Ensure and check that the single reference substance does not contain detectable concentrations of the
other substances (see Table 1) to be determined.
NOTE 1 Solutions of single reference substances or mixed solutions of various combinations are commercially
available.
NOTE 2 Certified reference materials to establish traceability to SI measurements are available.
6.30.2 Internal standards, as given in Table 2.
High purity standards shall be implemented (see 5.5).
NOTE Solutions are commercially available.
The degree of labelling shall not change over the course of analysis. Exchanges can take place, via
tautomerization processes for example, and so this type of mechanism shall be experimentally verified in
the event that the abundance of internal standard is shown to vary.
Table 2 — Names, acronyms and CAS numbers of isotopically labelled estrogens
Substance CAS RN Substance CAS RN
13 13
Estrone 2,4 D2 (E1-D2) Estrone 2,3,4- C (E1- C )
3 3
56588-58-0 1241684-29-6
Estrone 2,4,16,16-D4 (E1-D4)
53866-34-5 / /
17α-ethinylestradiol 20,21- C
17α-ethinylestradiol 2,4,16,16-D4 (EE2- D4)
(EE2- C )
350820-06-3 2483735-63-1
17β-estradiol 2,3,4-13C3 (17βE2-
17β-estradiol 2,4,16,16,17-D5 (17βE2- D5)
C )
221093-45-4 1261254-48-1
17β-estradiol-16,16,17-D3 (17βE2- D3)
79037-37-9 / /
17β-estradiol-2,4,16,16-D4 (17βE2- D4)
66789-03-5 / /
TTabablele 2 2 ((ccoonnttiinnueuedd))
Substance CAS RN Substance CAS RN
13 13
17α-estradiol 2,4-D2 (17αE2- D2) 17α-estradiol 3,4- C (17αE2- C )
2 2
81586-94-9 82938-05-4
13 13
Estriol 2,4-D2 (E3-D2) Estriol- 2,3,4- C (E3- C )
3 3
53866-32-3 1255639-56-5
Estriol 2,4,16,17-D4 (E3-D4)
2111805-38-8 / /
Estriol 2,4,17-D3 (E3-D3)
79037-36-8 / /
Some of the labelled standards can be used as an injection standard.
6.31 Preparation of solutions.
6.31.1 General.
Solutions of the reference substances (6.30.1) and of the interna
...
Norme
internationale
ISO 13646
Première édition
Qualité de l’eau — Dosage
2025-10
d’œstrogènes sélectionnés dans
des échantillons d’eau totale —
Méthode par extraction en phase
solide (SPE) suivie d’une détection
par chromatographie en phase
liquide (CL) ou en phase gazeuse
(CG) couplée à la spectrométrie de
masse (SM)
Water quality — Determination of selected estrogens in whole
water samples — Method using solid phase extraction (SPE)
followed by liquid chromatography (LC) or gas chromatography
(GC) coupled to mass spectrometry (MS) detection
Numéro de référence
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes, définitions et indices . 2
3.1 Termes et définitions .2
3.2 Indices .4
4 Principe. 4
5 Interférences . 5
5.1 Généralités .5
5.2 Interférences liées à l’échantillonnage, l’extraction et la concentration .6
5.3 Interférences lors de l’analyse par chromatographie en phase liquide haute
performance et spectrométrie de masse .6
5.4 Interférences lors de l’analyse par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie
de masse .7
5.5 Interférences des étalons internes .8
6 Réactifs . 8
7 Appareillage . 14
8 Échantillonnage .16
9 Mode opératoire . 17
9.1 Généralités .17
9.2 Préparation de l’échantillon et extraction .18
9.2.1 Généralités .18
9.2.2 Préparation de l’échantillon .18
9.2.3 Extraction SPE sur cartouche .19
9.2.4 Extraction SPE sur disque . 20
9.3 Purification de l’échantillon . .21
9.3.1 Généralités .21
9.3.2 Principe.21
9.3.3 Mode opératoire . .21
9.4 Reconcentration . 22
9.5 Chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse . 22
9.5.1 Chromatographie en phase liquide haute performance (CL) . 22
9.5.2 Détection . 22
9.5.3 Dérivation . 23
9.6 Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse . 25
9.6.1 Dérivation . 25
9.6.2 Chromatographie en phase gazeuse (CG) . 25
9.6.3 Détection . 25
10 Étalonnage .26
10.1 Généralités . 26
10.2 Étalonnage par dilution isotopique .27
10.3 Contrôle de l’étalonnage .27
11 Programme d’assurance qualité et de contrôle qualité (AQ/CQ) .28
11.1 Identification des composés . 28
11.2 Blancs . 28
12 Limite de quantification (LQ) .28
13 Calcul du taux de récupération .29
13.1 Généralités . 29
iii
13.2 Calcul du taux de récupération des analytes à l’aide d’échantillons . 29
13.3 Taux de récupération des étalons internes . 30
14 Calcul de la concentration dans l’échantillon .30
15 Expression des résultats .31
16 Rapport d’essai .31
17 Données de performance .31
Annexe A (informative) Données de performance .32
Annexe B (informative) Exemples de protocoles d’extraction SPE sur cartouche .36
Annexe C (informative) Exemples de protocoles d’extraction SPE sur disque .38
Annexe D (informative) Exemples de protocoles de purification par SPE .40
Annexe E (informative) Exemples de protocoles de CL-SM/SM .42
Annexe F (informative) Exemples de protocoles de CL-SMHR .53
Annexe G (informative) Exemples de protocoles de CG-SM/SM .57
Annexe H (informative) Exemple de protocoles de CG-SMHR .62
Bibliographie .63
iv
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité
de tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISOn'avait
pasreçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application.
Toutefois, il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des
informations plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à
l'adresse www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou
partie de tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion de
l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 2,
Méthodes physiques, chimiques et biochimiques,en collaboration avec le comité technique CEN/TC 230, Analyse
de l'eau, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération technique
entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
v
Introduction
Les œstrogènes naturels et de synthèse sont largement utilisés dans le monde entier, par exemple à des
fins de contraception. En conséquence de leur application ou d’une mauvaise élimination, ces œstrogènes
peuvent entrer dans le cycle de l’eau sous forme inchangée ou modifiée. Ils peuvent donc être détectés dans
les eaux de surface et les eaux souterraines, ainsi que dans les eaux usées traitées. Il est reconnu que les
œstrogènes peuvent se retrouver dans les eaux de surface via les eaux usées, et du fait de leurs propriétés
physicochimiques, ils peuvent se répartir dans les différents compartiments (eau et matières particulaires
en suspension [MES]) des systèmes aquatiques. Ils constituent un problème de plus en plus préoccupant,
en raison de leur activité œstrogénique élevée même aux niveaux ultra-trace (bien en dessous des ng/l).
Outre les effets de féminisation des poissons et les autres effets de perturbation endocrinienne dans les
[16]
écosystèmes aquatiques, ils peuvent aussi participer à la perte de biodiversité . Des méthodes de mesure
appropriées sont donc nécessaires afin de surveiller des niveaux d’œstrogènes inférieurs à leur niveau
écotoxicologique (par exemple, concentration prédite sans effet [PNEC, de l’anglais «predicted no effect
concentration»] ou norme de qualité environnementale [NQE]) et ainsi de démontrer si une masse d’eau est
à risque.
Le présent document spécifie des méthodes validées pour l’analyse des échantillons d’eau dans le cadre
de programmes de surveillance destinés à qualifier la qualité des environnements aquatiques en ce qui
concerne les œstrogènes sélectionnés.
vi
Norme internationale ISO 13646:2025(fr)
Qualité de l’eau — Dosage d’œstrogènes sélectionnés
dans des échantillons d’eau totale — Méthode par
extraction en phase solide (SPE) suivie d’une détection par
chromatographie en phase liquide (CL) ou en phase gazeuse
(CG) couplée à la spectrométrie de masse (SM)
AVERTISSEMENT — Il convient que les utilisateurs du présent document maîtrisent les pratiques
courantes de laboratoire. Le présent document ne prétend pas aborder tous les problèmes de sécurité
éventuellement associés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur de mettre en place des pratiques
de santé et de sécurité appropriées.
IMPORTANT — Il est absolument indispensable que les essais menés conformément au présent
document le soient par du personnel dûment qualifié.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie des méthodes pour le dosage de cinq œstrogènes sélectionnés dans les
échantillons d’eau totale, qui sont répertoriés dans le Tableau 1 (voir l’Article 4). Les méthodes reposent sur
une extraction en phase solide (SPE sur disque et/ou cartouche) suivie d’une détection par chromatographie
en phase liquide ou gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (spectrométrie de masse en tandem et/
ou spectrométrie de masse haute résolution). Selon la préparation des échantillons choisie, la préparation
de l’échantillon peut être appliquée à l’analyse des œstrogènes sélectionnés dans l’eau potable, les eaux
souterraines et les eaux de surface contenant une teneur en matières en suspension (MES) jusqu’à 500 mg/l
et une teneur en carbone organique dissous (COD) jusqu’à 14 mg/l (échantillons d’eau totale).
La gamme d’application basse définie en tant que limite de quantification vérifiée peut varier selon les
méthodes, la sensibilité de l’équipement utilisé et la matrice de l’échantillon. La gamme s’étend de 0,006 ng/l
à 1 ng/l pour le 17alpha-éthinylestradiol (EE2) et de 0,038 ng/l à 1 ng/l pour les autres œstrogènes dans
l’eau potable, les eaux souterraines et les eaux de surface. La limite supérieure du domaine d’application est
de l’ordre de la dizaine de nanogrammes par litre.
Pour une application qui vise à mesurer de très faibles niveaux de concentration (entre la plus faible LQ
et 0,1 ng/l), chaque étape individuelle des modes opératoires revêt une importance critique.
Les méthodes peuvent être utilisées pour doser d’autres œstrogènes ou hormones dans d’autres types d’eau,
par exemple les eaux usées traitées, sous réserve que l’exactitude ait été soumise à essai et démontrée pour
chaque cas et que les conditions de conservation des échantillons et des solutions de référence aient été
validées.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 8466-1:2021, Qualité de l'eau — Étalonnage et évaluation des méthodes d'analyse — Partie 1: Fonction
linéaire d'étalonnage
ISO 21253-1:2019, Qualité de l'eau — Méthodes d'analyse de composés multi-classes — Partie 1: Critères pour
l'identification de composés cibles par chromatographie en phase gazeuse ou liquide et spectrométrie de masse
ISO 11352:2025, Qualité de l'eau — Estimation de l'incertitude de mesure basée sur des données de validation et
de contrôle qualité
3 Termes, définitions et indices
3.1 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1.1
exactitude
étroitesse de l’accord entre une valeur mesurée et une valeur vraie d’un mesurande
[SOURCE: Guide ISO/IEC 99:2007, 2.13, modifiée — le terme «exactitude de mesure» et les Notes 1, 2 et 3 à
l’article ont été supprimés.]
3.1.2
analyte
composé à déterminer
[SOURCE: ISO 6107:2021, 3.31, modifiée — le domaine et les Notes 1 et 2 à l’article ont été supprimés.]
3.1.3
blanc
aliquote d’eau de laboratoire (blanc réactif) ou d’une matrice qui ne contient pas l’analyte (3.1.2) (blanc de
matrice), traitée exactement comme un échantillon selon la totalité du mode opératoire comprenant
l’extraction, la purification, l’identification et la quantification, et impliquant tous les réactifs et matériels de
laboratoire nécessaires
Note 1 à l'article: Il est essentiel que le laboratoire spécifie le blanc à prendre en compte.
[SOURCE: ISO 21253-2:2019, 3.2]
3.1.4
étalonnage
opération qui, dans des conditions spécifiées, établit en une première étape une relation entre les valeurs
et les incertitudes de mesure associées qui sont fournies par des étalons et les indications correspondantes
avec les incertitudes associées, puis utilise en une seconde étape cette information pour établir une relation
permettant d’obtenir un résultat de mesure à partir d’une indication
Note 1 à l'article: Un étalonnage peut être exprimé sous la forme d’un énoncé, d’une fonction d’étalonnage,
d’un diagramme d’étalonnage, d’une courbe d’étalonnage ou d’une table d’étalonnage. Dans certains cas, il peut
consister en une correction additive ou multiplicative de l’indication avec une incertitude de mesure associée.
Note 2 à l'article: Il convient de ne pas confondre l’étalonnage avec l’ajustage d’un système de mesure, souvent appelé
improprement «auto-étalonnage», ni avec la vérification de l’étalonnage.
[SOURCE: Guide ISO/IEC 99:2007, 2.39, modifiée — La Note 1 à l’article a été supprimée.]
3.1.5
matériau de référence certifié
MRC
matériau de référence, accompagné d’une documentation délivrée par un organisme faisant autorité
et fournissant une ou plusieurs valeurs de propriétés spécifiées avec les incertitudes et les traçabilités
associées, en utilisant des procédures valables
[SOURCE: Guide ISO/IEC 99:2007, 5.14, modifiée — Les Notes 1, 2, 3, 4 et 5 à l’article ont été supprimées.]
3.1.6
intégrité
état d’un échantillon stocké dans un récipient dont le ou les paramètres étudiés, les informations ou la
propriété n’ont pas été altérés ou perdus d’une manière non autorisée et qui est toujours représentatif
[SOURCE: ISO 5667-3:2024, 3.2]
3.1.7
quantification par dilution isotopique
procédé où des étalons marqués par un isotope (par exemple, marqués au deutérium ou au carbone 13),
qui sont chimiquement similaires aux analytes (3.1.2) cibles, sont ajoutés à tous les échantillons
environnementaux, de contrôle qualité et d’assurance qualité avant l’extraction et sont soumis à l’ensemble
du mode opératoire d’analyse
Note 1 à l'article: La quantification par dilution isotopique permet d’améliorer l’exactitude (3.1.1) de la quantification
en prenant en compte toutes les pertes propres à un échantillon survenant au cours du mode opératoire dans la
détermination de la concentration d’analyte
3.1.8
limite de quantification
LQ
valeur la plus basse d’une caractéristique pouvant être déterminée avec un niveau de précision (3.1.1)
acceptable, qui peut être estimée par différents moyens et qui doit être vérifiée dans la matrice prévue
[SOURCE: ISO 21253-2:2019, 3.4]
3.1.9
récupération
rendement relatif
opération au moyen de laquelle un système analytique peut mesurer une quantité ajoutée, connue,
d’un élément à doser dans un échantillon
Note 1 à l'article: La récupération est calculée à partir de la différence entre les résultats obtenus à partir d’une
aliquote dopée et d’une autre aliquote non dopée de l’échantillon, généralement exprimée en pourcentage.
[SOURCE: ISO 5667-14:2014, 3.8]
3.1.10
traçabilité
propriété d’un résultat de mesure selon laquelle ce résultat peut être relié à une référence par l’intermédiaire
d’une chaîne ininterrompue et documentée d’étalonnages (3.1.4) dont chacun contribue à l’incertitude de mesure
[SOURCE: Guide ISO/IEC 99:2007, 2.41, modifiée — Les Notes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 et 8 à l’article ont été
supprimées.]
3.1.11
rendement
rendement absolu
quantité d’analyte (3.1.2) ajoutée dans l’échantillon pour essai, corrigée par le rendement relatif de l’étalon
interne (rapport analyte/étalon interne)
Note 1 à l'article: Le rendement est une valeur qui tient compte à la fois de l’effet de matrice de l’échantillon et de la
récupération du composé.
[SOURCE: ISO 21253-2:2019, 3.11]
3.2 Indices
a variables de mesure pour l’ajout
A ajout
e variables de mesure pour l’étalonnage
i identité du composé
I étalon interne
j numéro successif pour les paires de valeurs
g valeur obtenue
v valeur par défaut
M solution de mesure
P échantillon
R référence
4 Principe
Un échantillon d’eau est tout d’abord dopé avec une quantité appropriée d’étalons marqués par un isotope
homologue de chaque œstrogène cible. Il est ensuite extrait par extraction en phase solide (SPE) sur
cartouche ou disque, puis purifié par SPE. La séparation des composés est réalisée par chromatographie
en phase liquide (CL) ou chromatographie en phase gazeuse (CG) avec identification et quantification par
spectrométrie de masse (spectrométrie de masse en tandem [SM/SM] ou spectrométrie de masse haute
résolution [SMHR]). Le résultat est calculé en appliquant l’étalonnage de la dilution isotopique.
Tableau 1 — Caractéristiques des cinq œstrogènes sélectionnés
a
Désignation Structure CAS-RN Formule Masse molé- log K
ow
culaire
g/mol
17alpha-éthinylestradiol (EE2)
Nom de l’IUPAC: (13R,17S)-17-éthynyl-13-méthyl-
57-63-6 C H O 296,40 4,52
20 24 2
7,8,9,11,12,14,15,16-octahydro-6H-cyclopenta[a]
phénanthrène-3,17-diol
17alpha-œstradiol (17αE2)
Nom de l’IUPAC: (8R,9S,13S,14S,17R)-13-méthyl-
57-91-0 C H O 272,38 4,13
18 24 2
6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-décahydrocyclopenta[a]
phénanthrène-3,17-diol
17beta-œstradiol (17βE2)
Nom de l’IUPAC: (8R,9S,13S,14S,17S)-13-méthyl-
50-28-2 C H O 272,38 4,13
18 24 2
6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-décahydrocyclopenta[a]
phénanthrène-3,17-diol
Estriol (E3)
Nom de l’IUPAC: (8R,9S,13S,14S,16R,17R)-13-méthyl-
50-27-1 C H O 288,38 2,94
18 24 3
6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-décahydrocyclopenta[a]
phénanthrène-3,16,17-triol
Œstrone (E1)
Nom de l’IUPAC: (8R,9S,13S,14S)-3-hydroxy-13-mé-
53-16-7 C H O 270,37 3,69
18 22 2
thyl-7,8,9,11,12,14,15,16-octahydro-6H-cyclopenta[a]
phénanthrène-17-one
a
CAS Registry Number® est une marque déposée de l’American Chemical Society (ACS). Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve l’emploi du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent
être utilisés s’il est démontré qu’ils aboutissent aux mêmes résultats.
5 Interférences
5.1 Généralités
Les solvants, les réactifs, la verrerie et autre matériel de traitement des échantillons peuvent produire des
artéfacts, des lignes de base élevées ou une suppression d’ions entraînant une interprétation erronée des
chromatogrammes.
Il est extrêmement important de nettoyer la verrerie convenablement. En effet, celle-ci peut non seulement
contaminer les échantillons, mais aussi engendrer une perte des analytes à mesurer par adsorption sur la
surface en verre.
Il convient de rincer la verrerie avec un solvant et de la laver avec un détergent aussitôt que possible après
son utilisation. La sonification pendant 30 s de la verrerie contenant un détergent peut contribuer à son
nettoyage. Après le lavage, il convient de rincer la verrerie tout d’abord avec un solvant (par exemple,
du méthanol), puis avec de l’eau ultrapure (6.1). Le traitement thermique de la verrerie dans une étuve
programmable et pouvant atteindre au moins 450 °C, pendant 2 h peut être nécessaire.
La contamination des échantillons est un point critique, car les composés œstrogéniques sont biogéniques
et peuvent être présents sur la peau humaine ou être utilisés comme produits pharmaceutiques ou produits
de soins personnels. Il est important que le personnel de terrain et de laboratoire veille à ne pas contaminer
les échantillons en évitant de consommer ou d’être en contact avec de tels produits immédiatement avant
et pendant les procédures de prélèvement et de traitement des échantillons. Il est important de prendre des
précautions lors de l’acquisition et de la manipulation ultérieure des échantillons et des extraits afin d’éviter
toute contamination.
5.2 Interférences liées à l’échantillonnage, l’extraction et la concentration
Utiliser des récipients d’échantillonnage en matériaux (7.1) qui n’influencent pas la teneur en analyte
pendant le temps de contact, de préférence en verre. Éviter les matières plastiques et organiques pendant
l’échantillonnage, le stockage des échantillons à (5 ± 3) °C ou l’extraction, en particulier si des concentrations
très faibles sont ciblées. Le polyéthylène haute densité (PEHD) ou le polytétrafluoroéthylène (PTFE) peuvent
être utilisés, mais ne sont pas recommandés si de très faibles niveaux de concentration (<0,1 ng/l) doivent
être mesurés.
Si des échantillonneurs automatiques sont utilisés, éviter l’utilisation de matériaux en silicone ou en
caoutchouc pour les tubes. Si ces matériaux sont présents, s’assurer que le temps de contact est réduit au
minimum. Rincer la ligne d’échantillonnage avec l’eau à échantillonner avant de prélever l’échantillon pour
essai. L’ISO 5667-1 et l’ISO 5667-3 donnent des recommandations.
La température de conservation est de (5 ± 3) °C. Pour le prélèvement et la préservation des échantillons,
voir l’Article 8.
Lors de la conservation des échantillons pour essai, des pertes de composés peuvent survenir sous l’effet de
l’adsorption sur les parois des récipients. L’ampleur de ces pertes peut dépendre de la durée de conservation.
Les matériels d’extraction en phase solide disponibles sur le marché (cartouche ou disque) peuvent être
de qualité différente. Des variations de sélectivité des matériaux se produisent également fréquemment
d’un lot à l’autre, ce qui peut entraîner des écarts significatifs du rendement d’extraction. Cela n’affecte pas
fondamentalement leur aptitude à l’emploi, à l’exception d’une augmentation de la limite de quantification
pour les composés individuels.
Lors de l’analyse des échantillons, éviter toute fluctuation importante des temps d’extraction et des modes
opératoires d’élution au sein d’une même séquence d’échantillons.
Les échantillons d’eau contenant une teneur élevée en MES ou en COD peuvent entraîner un colmatage en
cas d’emploi d’une cartouche SPE (voir 9.2.2) qui pourrait être préjudiciable au rendement d’extraction.
Pour surmonter ce problème, une réduction du volume de l’échantillon ou une extraction SPE sur disque
(voir 9.2.3) peut être mise en œuvre. Une autre solution consiste à appliquer de la laine de verre ou du
sable sur la cartouche (hauteur de remplissage de 1 cm à 2 cm) pour permettre l’extraction de volumes
d’échantillon plus importants.
Les utilisations répétées et les modes opératoires de nettoyage de la verrerie peuvent être à l’origine de la
formation de sites actifs sur la surface du verre qui peuvent favoriser l’adsorption, de manière irréversible,
des œstrogènes sélectionnés et de contamination croisée.
Pour éviter toute contamination croisée entre les séries, l’appareillage de SPE, les tubes et les éléments en
contact avec les échantillons doivent être nettoyés, par exemple, à l’eau (chaude) avec des détergents puis
avec des solvants (méthanol, acétone, éthanol, par exemple), puis rincés à l’eau et séchés.
Les composés interférents se trouvant dans les échantillons et qui sont co-extraits varieront de manière
considérable d’une source à l’autre selon la variabilité du site échantillonné. Les composés interférents
peuvent être présents à des concentrations bien supérieures à celles des œstrogènes sélectionnés.
Les composés interférents les plus fréquents sont l’acide humique et d’autres acides. Étant donné que de
très faibles niveaux d’œstrogènes peuvent être mesurés par cette méthode, l’élimination des composés
interférents est essentielle (réalisation d’une purification, voir 9.3).
5.3 Interférences lors de l’analyse par chromatographie en phase liquide haute
performance et spectrométrie de masse
Des composés ayant des temps de rétention et des masses similaires à ceux des œstrogènes cibles peuvent
entraîner des interférences et des pics se chevauchant ou mal résolus sur le chromatogramme. Selon leur
intensité, ces co-éluants peuvent affecter la justesse de l’analyse.
Le 17αE2 et le 17βE2 sont des épi-isomères et ont donc les mêmes transitions en SM/SM. Il est essentiel de
séparer les deux composés. Une résolution chromatographique minimale R ≥ 1,2 doit être atteint. Si le critère
ne peut pas être atteint, une colonne appropriée doit être choisie pour satisfaire à la résolution requise (voir
Annexe E et Annexe F pour des exemples).
La résolution chromatographique est calculée conformément à la Figure 1 et à la Formule (1).
Légende
X temps
Y intensité
t , t temps de rétention des composés élués 1 et 2 en secondes (s)
R1 R2
w , w largeur de chaque pic, en secondes (s), à sa base
b1 b2
Figure 1 — Résolution des pics chromatographiques
tt−
()
RR21
R=2 (1)
ww+
bb12
où
R est la résolution;
t , t est le temps de rétention des composés élués 1 et 2 en secondes (s);
R1 R2
w , w est la largeur de chaque pic, en secondes (s), à sa base.
b1 b2
NOTE D’autres méthodes de calcul pour R sont également possibles.
Pour certains œstrogènes cibles, certaines transitions sensibles ont montré un manque de sélectivité ou de
spécificité conduisant à de faux positifs et à une surestimation des résultats.
Les autres composés constitutifs (matrice) peuvent avoir une incidence sur l’ionisation des composés cibles
(par exemple suppression d’ions ou exaltation du signal). Cela peut entraîner une sous-estimation ou une
surestimation de la concentration lors de la quantification et diminuer de manière significative la sensibilité
de la méthode. Ces interférences peuvent être détectées et corrigées en mettant en œuvre une étape de
purification (voir 9.3) et une quantification par dilution isotopique.
5.4 Interférences lors de l’analyse par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie
de masse
Des composés ayant des temps de rétention et des masses similaires à ceux des œstrogènes cibles peuvent
entraîner des interférences et des pics se chevauchant ou mal résolus sur le chromatogramme. Selon leur
intensité, ces co-éluants peuvent affecter la justesse de l’analyse.
Le 17αE2 et le 17βE2 sont des épi-isomères et ont donc les mêmes transitions en SM. Il est essentiel de
séparer les deux composés. Une résolution chromatographique minimale R ≥ 1,2 convient. Si le critère ne
peut pas être atteint, une colonne appropriée doit être choisie pour satisfaire à la résolution requise (voir
Annexe E et Annexe D pour un exemple).
Des interférences dues aux autres composés constitutifs (matrice) peuvent survenir en fonction des
méthodes appliquées.
5.5 Interférences des étalons internes
Pour la détection par spectrométrie de masse, il est recommandé d’utiliser un homologue marqué par un
13 15
isotope stable comme étalon interne; les composés marqués au C ou au N sont préférables aux composés
deutérés. Un décalage de temps de rétention est généralement observé par rapport au composé natif lorsque
des étalons marqués par un isotope sont utilisés (effet isotopique).
Seule une portion stable de la molécule doit être marquée et le degré de marquage ne doit pas changer
pendant l’analyse. Des échanges peuvent intervenir, par exemple via des processus de tautomérisation, c’est
pourquoi ce type de mécanisme doit être vérifié par des moyens expérimentaux si l’abondance de l’étalon
interne est amenée à varier.
Le chevauchement spectral entre les homologues marqués et les composés natifs doit être évité.
Par conséquent, pour la majorité des applications, il convient que l’homologue marqué présente de préférence
une différence de masse d’au moins 3 Da par rapport au composé cible natif.
La pureté isotopique des étalons internes doit être vérifiée. Il ne s’agit pas d’un facteur critique tant que
ses impuretés (y compris l’homologue non marqué) n’ont aucune contribution sur les composés cibles de
la méthode d’analyse. Si cela est impossible, il convient que la contribution de l’homologue marqué sur
l’homologue non marqué soit négligeable au niveau de la LQ.
Si des étalons internes de masse monoisotopique inférieure à 3 Da sont mis en œuvre, les critères ci-dessus
doivent être vérifiés et documentés pour éviter les faux positifs et les erreurs de quantification.
6 Réactifs
Dans la mesure du possible, des réactifs de qualité pour analyse ou de qualité pour analyse de résidus
doivent être utilisés. La teneur en impuretés contribuant aux valeurs de blanc ou provoquant des signaux
interférents doit être négligeable (inférieure à 1/3 de la LQ). Cela doit être vérifié à intervalles réguliers.
Les réactifs, les solvants et l’eau utilisés comme éluants doivent être adaptés à la CL ou à la CG et à la
spectrométrie de masse.
Lorsque des niveaux très faibles d’œstrogènes doivent être mesurés (inférieurs à 0,1 ng/l) et que la LQ la
plus faible doit être atteinte, la qualité des réactifs et des matériaux devient très importante et doit être
régulièrement surveillée afin d’éviter toute contamination croisée et des résultats faussement positifs.
6.1 Eau, H O.
Eau ultrapure ne présentant pas de valeur de blanc significative. La qualité de l’eau est vérifiée par le même
mode opératoire que celui de l’échantillon à mesurer.
L’eau minérale en bouteilles en verre disponible sur le marché peut également être utilisée pour déterminer
le blanc de la méthode lorsque l’eau ultrapure présente des interférences liées à un bruit de fond significatif.
6.2 Thiosulfate de sodium pentahydraté, w(Na S O ·5H O) d’au moins 99 %.
2 2 3 2
6.3 Sel disodique d’acide éthylènediaminetétraacétique, EDTA (ρ ≈ 0,025 g/ml), (C H N Na O ⋅2H O),
10 14 2 2 8 2
d’au moins 99 %.
Dissoudre 25 g d’EDTA dans 1 000 ml d’eau.
6.4 Méthanol (MeOH), (CH OH), pour l’extraction, la purification, la phase mobile et la préparation des
solutions de référence
6.5 Acétonitrile (ACN), (CH CN), pour l’extraction, la purification, la phase mobile et la préparation des
solutions de référence.
6.6 Acétate d’éthyle (AE), (C H O ), pour l’extraction et la purification.
4 8 2
6.7 Acétone, (C H O), pour l’extraction, la purification et la dérivation (CG).
3 6
6.8 n-hexane, (C H ), pour l’extraction et la purification.
6 14
6.9 Méthyl tert-butyl éther(MTBE), (C H O), pour l’extraction et la purification.
5 12
6.10 Acétone extra-anhydre, (C H O), pour la dérivation.
3 6
6.11 Acide acétique,w(CH COOH) d’au moins 99 %, pour la phase mobile (CL).
6.12 Acide formique, w(HCOOH) d’au moins 98 %, pour la phase mobile (CL).
6.13 Acide chlorhydrique, w(HCl) d’au moins 36 %, pour l’ajustement du pH de l’échantillon d’eau.
6.14 Acide sulfurique, w(H SO ) d’au moins 98 %, pour l’ajustement du pH de l’échantillon d’eau.
2 4
6.15 Chlorure de sodium, w(NaCl) d’au moins 98 %, pour la conservation des analytes dans l’échantillon d’eau.
6.16 Acide ascorbique, w(C H O ) d’au moins 98 %, pour la conservation des analytes dans l’échantillon d’eau.
6 8 6
6.17 Fluorure d’ammonium, (NH F), d’au moins 98 %, pour la phase mobile (CL).
6.18 Pyridine, (C H N), pour la dérivation (CG).
5 5
6.19 N-triméthylsilylimidazole (TMSI), (C H N Si), pour la dérivation (CG).
6 12 2
6.20 Chlorure de 5-(diméthylamino)naphtalène-1-sulfonyle, chlorure de dansyle
(DNSCl), (C H ClNO S), de qualité CL pour la dansylation (CL).
12 12 2
6.21 Chlorure de pyridine-3-sulfonyle (PS-Cl), (C H ClNO S), pour la dérivation (CL).
5 4 2
6.22 Solution aqueuse concentrée de carbonate de sodium (0,1 mol/l, pH = 10,5), (Na CO ), pour la
2 3
dérivation (CL).
6.23 Solution concentrée de bicarbonate de sodium, 0,1 mol/l, pour la dérivation (CL).
6.24 Solution d’hydroxyde de sodium, 10 mol/l, pour la dérivation (CL) et l’ajustement du pH de
l’échantillon d’eau.
6.25 Solution de réactif de dansyle, pour la dansylation (CL).
Le volume de réactif de dansyle à préparer doit être calculé à l’avance, car il dépend du nombre d’échantillons
à dansyler. Pour le préparer, peser 0,783 mg de chlorure de dansyle (6.20) pour 1 ml d’acétone extra-anhydre
(6.10) dans un flacon en verre ambré de volume approprié, puis bien mélanger. Le réactif de dansyle ainsi
préparé ne peut pas être conservé plus de 24 h. Une fois ouvert, le flacon de chlorure de dansyle peut être
conservé pendant une semaine à une température contrôlée de 5 °C ± 3 °
...
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