ISO 15174:2002
(Main)Milk and milk products — Microbial coagulants — Determination of total milk-clotting activity
Milk and milk products — Microbial coagulants — Determination of total milk-clotting activity
ISO 15174|IDF 176:2002 describes a method to compare the total milk-clotting activity of a microbial coagulant sample with the milk-clotting activity of an international microbial coagulant reference standard on a standard milk substrate prepared with a calcium chloride solution containing 0,5 g/l of calcium chloride (pH approximately 6,5).
Lait et produits laitiers — Coagulants microbiens — Détermination de l'activité totale de coagulation du lait
La présente Norme internationale décrit une méthode permettant de comparer l'activité totale de coagulation du lait d'un échantillon de coagulant microbien à l'activité coagulante d'un étalon de référence de coagulant microbien reconnu à l'échelle internationale, sur un substrat de lait étalon préparé avec une solution de chlorure de calcium à 0,5 g de chlorure de calcium par litre de solution (pH approximativement 6,5).
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15174
IDF
176
First edition
2002-09-01
Milk and milk products — Microbial
coagulants — Determination of total
milk-clotting activity
Lait et produits laitiers — Coagulants microbiens — Détermination de
l'activité totale de coagulation du lait
Reference numbers
ISO 15174:2002(E)
IDF 176:2002(E)
©
ISO and IDF 2002
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IDF 176:2002(E)
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IDF 176:2002(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards adopted
by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 15174IDF 176 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk
and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with AOAC International. It is being
published jointly by ISO and IDF and separately by AOAC International.
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ISO 15174:2002(E)
IDF 176:2002(E)
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a worldwide federation of the dairy sector with a National Committee in
every member country. Every National Committee has the right to be represented on the IDF Standing Committees
carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO and AOAC International in the development of standard
methods of analysis and sampling for milk and milk products.
Draft International Standards adopted by the Action Teams and Standing Committees are circulated to the National
Committees for voting. Publication as an International Standard requires approval by at least 50 % of National
Committees casting a vote.
ISO 15174IDF 176 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk
and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with AOAC International. It is being
published jointly by ISO and IDF and separately by AOAC International.
All work was carried out by the Joint ISO/IDF/AOAC Action Team, Enzymes in cheesemaking, of the Standing
Committee on Milk components and characterization of physical properties, under the aegis of its project leaders,
Mrs M. Harboe (DK) and Mr C. Repelius (NL).
This second edition cancels and replaces the first edition of IDF 176.
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ISO 15174:2002(E)
IDF 176:2002(E)
Introduction
Microbial coagulants are derived from various microbial sources, the most common sources being Rhizomucor
miehei (EC 3.4.23.23), Rhizomucor pusillus (EC 3.4.23.23) and Cryphonectria parasitica (EC 3.4.23.22, formerly
named Endothia parasitica). Each of these enzymes has its own characteristics as far as milk-clotting activity and
cheese-making properties are concerned. These are differences in temperature sensitivity, pH sensitivity,
sensitivity to calcium ions, and the effect on the rheology of the milk-gel formed. The microbial coagulants are
produced by a limited number of manufacturers, each having their own reference standard for measuring the
milk-clotting activity of their product. No internationally recognized reference standard to enable the
characterization of samples of these microbial products relative to a standard with known milk-clotting activity has
been available up to now. For economic reasons a method for the determination of the total milk-clotting activity of
microbial coagulants with respect to an internationally recognized reference standard is therefore highly desirable.
For practical reasons it was decided to use the Rhizomucor miehei enzyme as a microbial coagulant reference
standard for all types of microbial coagulants.
The method is in accordance with the relative milk-clotting activity test for bovine rennets as described in IDF 157.
A qualitative determination of the microbial coagulants in a sample is given in IDF 110B:1997, appendix A. In the
case of mixtures of different clotting enzymes, no correct determination of the total milk-clotting activity for the
sample can be obtained.
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ISO 15174:2002(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 176:2002(E)
Milk and milk products — Microbial coagulants — Determination of
total milk-clotting activity
1 Scope
This International Standard describes a method to compare the total milk-clotting activity of a microbial coagulant
sample with the milk-clotting activity of an international microbial coagulant reference standard on a standard milk
substrate prepared with a calcium chloride solution containing 0,5 g/l of calcium chloride (pH ≈ 6,5).
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For
undated references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC
maintain registers of currently valid International Standards.
ISO 648, Laboratory glassware — One-mark pipettes
ISO 1042, Laboratory glassware — One-mark volumetric flasks
3 Term and definition
For the purposes of this International Standard, the following term and definition applies.
3.1
total milk-clotting activity of the international microbial coagulant reference standard powder (Rhizomucor
miehei)
amount of activity set relative to the international calf rennet reference standard powder
NOTE 1 For the first batch, this was defined as 1 000 International Milk-Clotting Units per gram (IMCU/g) relative to a
standard milk substrate at pH 6,5 (see IDF 157). Future preparations of reference standards will be set relative to the previous
reference standards.
NOTE 2 The total milk clotting activity of the microbial coagulant reference standard powder is approximately 1 000 IMCU/g,
but the real activity with respect to the international calf rennet control powder is labelled on the glass ampoules.
NOTE 3 The total proteolytic (milk-clotting) activity of the microbial coagulant reference standard powder is checked on a
1)
synthetic hexapeptide substrate every second year by NIZO .
1) Netherlands Institute for Dairy Research (NIZO), PO Box 20, 6710 BA Ede, The Netherlands.
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ISO 15174:2002(E)
IDF 176:2002(E)
4 Principle
The time needed for visual flocculation of renneted milk is determined. The total milk-clotting activity of a microbial
coagulant sample is compared to the microbial coagulant reference standard powder on a standard milk substrate
prepared with a calcium chloride solution containing 0,5 g/l of calcium chloride (pH ≈ 6,5).
5 Reagents and materials
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled water or demineralized
water or water of equivalent purity.
5.1 Buffer solution, pH 5,5
Using a pipette (6.1), add 10,0 ml of 1 mol/l acetic acid (CH COOH) to 10,0 g of sodium acetate trihydrate
3
(CH COONa◊3H O) and mix. Dilute with water to 1 000 ml. Adjust the pH to 5,5 if necessary.
3 2
5.2 Calcium chloride stock solution, c(CaCl ) = 500 g/l
2
Calcium chloride solutions with the required accurate concentration of 500 g/l of calcium chloride and with the
2)
actual density stated are commercially available . Store the solution as described by the manufacturer.
Prior to use, bring the calcium chloride stock solution to room temperature (18 °C to 22 °C). Check the
concentration of the calcium chloride solution by titration with EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) every year.
5.3 Calcium chloride working solution, c(CaCl ) = 0,5 g/l
2
Use the density of the calcium chloride stock solution (5.2) to calculate the mass of calcium chloride needed to
obtain a final amount of 0,5 g/l of calcium chloride in the calcium chloride working solution. (The mass of the
solution should be equivalent to the addition of 2,00 ml of the stock solution with exact concentration of
c(CaCl ) = 500 g/l; in that case the solution mass is ≈ 2,70 g.)
2
Weighing of the calcium chloride stock solution (5.2) is recommended in order to prepare the calcium chloride
working solution, as the viscous solution is difficult to pipette.
Weigh, to the nearest 0,01 g, about 2,70 g of the calcium chloride stock solution (5.2) of exact known
concentration at room temperature (18 °C to 2 °C) in a 2 000 ml one-mark volumetric flask. Dilute with water to the
mark and mix. The calcium chloride solution shall be freshly prepared on the day of its use.
Alternatively, an intermediate calcium chloride solution of 50 g/l may be prepared and further diluted before use.
5.4 Low-heat, low-fat spray-dried milk powders, of good renneting and bacteriological quality
1), 2), 3)
NOTE Low-heat, low-fat spray-dried milk powders meeting the requirements are commercially available .
5.5 Microbial coagulant reference standard powder (Rhizomucor miehei), in glass ampoules containing 2,7 g.
The exact total milk-clotting activity is labelled on the ampoules (≈ 1 000 IMCU/g).
Store the microbial coagulant reference standard powder in the dark at −18 °C, protected against moisture. For
short periods, for example during transport, the powder may be kept at ambient temperatures.
2) Chr. Hansen's A/S, 1-27 Jernholmen, 2650 Hvidovre, Denmark.
3) DSM Food Specialities, Dairy Ingredients Group, P.O. Box 1, 2600 MA Delft, Netherlands.
This information is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by
ISO or IDF of these products.
2 © ISO and IDF 2002 – All rights reserved
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IDF 176:2002(E)
The total proteolytic activity of the microbial coagulant reference standard powder is checked on a synthetic
1)
hexapeptide every second year by the NIZO .
The microbial coagulant reference standard powder is a primary reference standard; a secondary liquid standard
may be made and used if it is assured that the same result is obtained.
The international microbial coagulant reference standard powder is commercially available from DSM Food
3)
Specialities .
6 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
6.1 Micropipette or any other pipette, capable of delivering 0,5 ml in less than 1 s with a repeatability of 0,2 % or
better.
6.2 One-mark pipettes, conforming to ISO 648, to deliver appropriate amounts.
Alternatively a dilutor (e.g. a Ham
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 15174
FIL
176
Première édition
2002-09-01
Lait et produits laitiers — Coagulants
microbiens — Détermination de l'activité
totale de coagulation du lait
Milk and milk products — Microbial coagulants — Determination of total
milk-clotting activity
Numéros de référence
ISO 15174:2002(F)
FIL 176:2002(F)
©
ISO et FIL 2002
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FIL 176:2002(F)
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© ISO et FIL 2002
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Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Version française parue en 2003
Publié en Suisse
ii © ISO et FIL 2002 – Tous droits réservés
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ISO 15174:2002(F)
FIL 176:2002(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 3.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 15174FIL 176 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL), en collaboration avec l'AOAC
International. Elle est publiée conjointement par l'ISO et la FIL, et séparément par l'AOAC International.
© ISO et FIL 2002 – Tous droits réservés iii
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ISO 15174:2002(F)
FIL 176:2002(F)
Avant-propos
La FIL (Fédération internationale de laiterie) est une fédération mondiale du secteur laitier avec un Comité
National dans chacun de ses pays membres. Chaque Comité National a le droit de faire partie des Comités
permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux techniques. La FIL collabore avec l'ISO et avec
l'AOAC International pour l'élaboration de méthodes normalisées d'analyse et d'échantillonnage pour le lait et
les produits laitiers.
Les projets de Normes internationales adoptés par les Équipes d'Action et les Comités permanents sont
soumis aux Comités Nationaux pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert
l'approbation de 50 % au moins des Comités Nationaux votants.
L'ISO 15174FIL 176 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL), en collaboration avec l'AOAC
International. Elle est publiée conjointement par l'ISO et la FIL et séparément par l'AOAC International.
L'ensemble des travaux a été confié à l'Équipe d'Action mixte ISO/FIL/AOAC, Enzymes en fromagerie, du
Comité permanent chargé des Composants principaux du lait et de la caractérisation des propriétés
physiques, sous la conduite de ses chefs de projet, Mme M. Harboe (DK) et M. C. Repelius (NL).
Cette seconde édition annule et remplace la première édition de la FIL 176.
iv © ISO et FIL 2002 – Tous droits réservés
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ISO 15174:2002(F)
FIL 176:2002(F)
Introduction
Les coagulants microbiens proviennent de différentes sources microbiennes, dont les plus courantes sont le
Rhizomucor miehei (CE 3.4.23.23), le Rhizomucor pusillus (CE 3.4.23.23) et la Cryphonectria parasitica
(CE 3.4.23.22, autrefois appelée Endothia parasitica). Chacune de ces enzymes présente des
caractéristiques spécifiques sous l'angle de son activité de coagulation du lait et de ses propriétés lors de la
fabrication du fromage. Il existe des différences de sensibilité à la chaleur, de sensibilité au pH, de sensibilité
aux ions de calcium et un effet sur la rhéologie du gel de lait formé. Les coagulants microbiens sont produits
par un nombre limité de fabricants, chacun d'entre eux ayant son propre étalon de référence pour le
mesurage de l'activité de coagulation du lait de ses produits. Jusqu'à présent, il n'existait pour ces enzymes
aucun étalon de référence reconnu à l'échelle internationale et permettant la caractérisation d'échantillons de
ces produits microbiens par rapport à un étalon possédant une activité de coagulation du lait connue. Pour
des raisons économiques, il est donc hautemement souhaitable de définir une méthode de détermination de
l'activité totale de coagulation du lait des coagulants microbiens par rapport à un étalon de référence reconnu
à l'échelle internationale. Pour des raisons pratiques, il a été décidé d'utiliser l'enzyme Rhizomucor miehei
comme étalon de référence pour tous les types de coagulants microbiens.
Cette méthode est conforme à l'essai d'activité de coagulation relative pour présures bovines décrit dans la
norme FIL 157.
Une détermination qualitative des coagulants microbiens présents dans un échantillon est donnée à
l'Annexe A de la norme FIL 110B:1997. En présence de mélanges de différentes enzymes de coagulation du
lait, il est impossible de déterminer correctement l'activité totale de coagulation du lait pour l'échantillon en
question.
© ISO et FIL 2002 – Tous droits réservés v
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ISO 15174:2002(F)
NORME INTERNATIONALE
FIL 176:2002(F)
Lait et produits laitiers — Coagulants microbiens —
Détermination de l'activité totale de coagulation du lait
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale décrit une méthode permettant de comparer l'activité totale de coagulation
du lait d'un échantillon de coagulant microbien à l'activité coagulante d'un étalon de référence de coagulant
microbien reconnu à l'échelle internationale, sur un substrat de lait étalon préparé avec une solution de
chlorure de calcium à 0,5 g de chlorure de calcium par litre de solution (pH ≈ 6,5).
2 Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente Norme internationale. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s'appliquent pas. Toutefois, les parties
prenantes aux accords fondés sur la présente Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité
d'appliquer les éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non
datées, la dernière édition du document normatif en référence s'applique. Les membres de l'ISO et de la CEI
possèdent le registre des Normes internationales en vigueur.
ISO 648, Verrerie de laboratoire — Pipettes à un trait
ISO 1042, Verrerie de laboratoire — Fioles jaugées à un trait
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
activité totale de coagulation du lait de la poudre étalon de référence de coagulant microbien
reconnue à l'échelle internationale (Rhizomucor miehei)
quantité d'activité établie par rapport à la poudre étalon de référence de présure de veau reconnue à l'échelle
internationale
NOTE 1 Pour le premier lot, elle a été définie à 1 000 Unités Internationales de Coagulation du Lait par gramme
(IMCU/g) par rapport à un substrat de lait étalon au pH de 6,5 (voir FIL 157). De futures préparations d'étalons de
référence seront réalisées par rapport aux étalons de référence antérieurs
NOTE 2 L'activité totale de coagulation du lait de la poudre étalon de référence de coagulant microbien est d'environ
1 000 IMCU/g, mais l'activité réelle par rapport à celle de la poudre de contrôle de présure bovine reconnue à l'échelle
internationale est mentionnée sur les étiquettes des ampoules en verre.
NOTE 3 L'activité protéolytique totale (coagulation du lait) de la poudre étalon de référence de coagulant microbien est
1)
vérifiée sur un substrat à base d'hexapeptide synthétique, tous les deux ans, par le NIZO .
1) Netherlands Institute for Dairy Research (NIZO), P.O. Box 20, NL-6710 BA Ede, Pays-Bas.
© ISO et FIL 2002 – Tous droits réservés 1
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ISO 15174:2002(F)
FIL 176:2002(F)
4 Principe
Le temps requis pour observer visuellement l'apparition d'une floculation du lait emprésuré est déterminé.
L'activité totale de coagulation du lait d'un échantillon de coagulant microbien est comparée avec celle de la
poudre étalon de référence de coagulant microbien sur un substrat de lait étalon préparé avec une solution de
chlorure de calcium à 0,5 g de chlorure de calcium par litre de solution (pH ≈ 6,5).
5 Réactifs et produits
Sauf indication contraire, n'utiliser que des réactifs de qualité analytique reconnue, de l'eau distillée ou
déminéralisée ou de l'eau d'une pureté équivalente.
5.1 Solution tampon à pH 5,5.
À l'aide d'une pipette (6.1), ajouter 10,0 ml d'acide acétique (CH COOH) à 1 mol/l à 10,0 g d'acétate de
3
sodium trihydraté (CH COONa,3H O) et mélanger. Compléter à 1 000 ml avec de l'eau. Au besoin, ajuster le
3 2
pH à 5,5.
5.2 Solution mère de chlorure de calcium, c(CaCl ) = 500 g/l.
2
Des solutions de chlorure de calcium à la concentration exacte requise de 500 g de chlorure de calcium par
2)
litre de solution et avec l'indication de la densité effective sont disponibles dans le commerce . Conserver la
solution selon les instructions du fabricant.
Avant utilisation, porter la solution mère de chlorure de calcium à température ambiante (18 °C à 22 °C).
Vérifier tous les ans sa concentration par titration à l'aide d'EDTA (acide éthylène diamine tétracétique).
5.3 Solution d'essai de chlorure de calcium, c(CaCl ) = 0,5 g/l.
2
Utiliser la masse volumique de la solution mère de chlorure de calcium (5.2) pour calculer la masse de
chlorure de calcium nécessaire pour obtenir une quantité finale de 0,5 g de chlorure de calcium par litre de
solution d'essai. [Il convient que la masse de la solution soit équivalente à l'addition de 2,00 ml de solution
mère avec une concentration exacte de c(CaCl ) = 500 g/l, auquel cas la masse de la solution est ≈ 2,70 g.]
2
Il est recommandé de peser la solution mère de chlorure de calcium (5.2) pour pouvoir préparer la solution
d'essai, car la solution visqueuse est difficile à pipetter.
Dans une fiole jaugée à un trait de 2 000 ml de capacité, peser, à 0,01 g près, 2,70 g de solution mère de
chlorure de calcium (5.2) à concentration connue avec précision, à température ambiante (18 °C à 22 °C).
Compléter jusqu'au trait avec de l'eau et mélanger. La solution de chlorure de calcium doit être fraîchement
préparée le jour même de son utilisation.
En alternative, une solution intermédiaire de chlorure de calcium à 50 g/l peut être préparée et diluée
davantage avant emploi.
5.4 Poudres de lait à faible teneur en matière grasse, séchées par atomisation à basse température,
présentant une bonne coagulation et une bonne qualité bactériologique.
NOTE Des poudres de lait à faible teneur en matière grasse, séchées par atomisation à basse température et
1), 2), 3)
conformes à ces exigences sont disponibles dans le commerce .
2) Chr. Hansen's A/S, 1-27 Jernholmen, DK-2650 Hvidovre, Danemark.
3) DSM Food Specialities, Dairy Ingredients Group, P.O. Box 1, NL-2600 MA Delft, Pays-Bas.
Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que
l’ISO ou la FIL approuvent ou recommandent l’emploi exclusif des produits ainsi désignés.
2 © ISO et FIL 2002 – Tous droits réservés
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ISO 15174:2002(F)
FIL 176:2002(F)
5.5 Poudre étalon de référence de coagulant microbien (Rhizomucor miehei), contenue dans des
ampoules en verre de 2,7 g.
L'activité totale de coagulation du lait est indiquée avec exactitude sur les étiquettes des ampoules
(≈ 1 000 IMCU/g).
Conserver la poudre étalon de référence de coagulant microbien à une température de −18 °C, à l'abri de la
lumière et de l'humidité. Pour de courtes périodes, par exemple pendant le transport, la poudre peut être
conservée à température ambiante.
L'activité protéolytique totale de la poudre étalon de référence de coagulant microbien est vérifiée tous les
1)
deux ans par le NIZO , sur un substrat à base d'hexapeptide synthétique.
La poudre étalon de référence de coagulant microbien est un étalon de référence primaire; un étalon liquide
secondaire peut être réalisé et utilisé si l'obtention du même résultat est garantie.
La poudre étalon de référence de coagulant microbien, reconnue à l'échelle internationale, est
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commercialement disponible chez DSM Food Specialities .
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Micropipette, ou toute autre pipette permettant l'écoulement de 0,5 ml en moins de 1 s avec une
répétabilité de 0,2 % ou mieux.
6.2 Pipettes à un trait, conformes à l'ISO 648, permettant l'écoulement de quanti
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Questions, Comments and Discussion
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