ISO 14797:1999
(Main)Animal feeding stuffs — Determination of furazolidone content — Method using high-performance liquid chromatography
Animal feeding stuffs — Determination of furazolidone content — Method using high-performance liquid chromatography
This International Standard specifies a high-performance liquid chromatographic (HPLC) method for the determination of the furazolidone content of premixtures and animal feeding stuffs. The method is applicable to animal feeding stuffs with a furazolidone content of 25 mg/kg to 5 000 mg/kg and to premixtures with a mass fraction of furazolidone of up to 20 % [formerly written as 20 % (m/m)]. NOTE 1 For animal feeding stuffs, the furazolidone content is expressed in milligrams per kilogram; for premixtures, as a mass fraction in percent [% (m/m)]. NOTE 2 Furazolidone is a chemotherapeuticum belonging to the group of nitrofuranes. Nitrofuranes are bacteriostatic or bactericidal against Gram-positive and Gram-negative microorganisms and against some moulds and protozoa.
Aliments des animaux — Dosage de la furazolidone — Méthode par chromatographie liquide à haute performance
La présente Norme internationale spécifie une méthode de chromatographie liquide à haute performance (CLHP) pour la détermination de la teneur en furazolidone dans les prémix et dans les aliments des animaux. La méthode est applicable aux aliments pour animaux dont la teneur en furazolidone va de 25 mg/kg à 5 000 mg/kg, ainsi qu'aux prémix dont la teneur en furazolidone peut aller jusqu'à une fraction massique de 20 % [auparavant écrit comme 20 % (m/m)]. NOTE 1 Pour les aliments des animaux, la teneur en furazolidone est exprimée en milligrammes par kilogramme, et pour les prémix comme fraction massique en pour cent [% (m/m)]. NOTE 2 La furazolidone est une substance chimiothérapique de la famille des nitrofuranes. Les nitrofuranes sont bactériostatiques et bactéricides, actifs contre les micro-organismes Gram positifs et Gram négatifs, et contre certaines moisissures et certains protozoaires.
General Information
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14797
First edition
1999-03-15
Animal feeding stuffs — Determination
of furazolidone content — Method using
high-performance liquid chromatography
Aliments des animaux — Dosage de la furazolidone — Méthode par
chromatographie liquide à haute performance
A
Reference number
ISO 14797:1999(E)
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ISO 14797:1999(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard ISO 14797 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Agricultural food products,
Subcommittee SC 10, Animal feeding stuffs.
Annexes A to C of this International Standard are for information only.
© ISO 1999
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Printed in Switzerland
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Animal feeding stuffs — Determination of furazolidone content —
Method using high-performance liquid chromatography
1 Scope
This International Standard specifies a high-performance liquid chromatographic (HPLC) method for the
determination of the furazolidone content of premixtures and animal feeding stuffs.
The method is applicable to animal feeding stuffs with a furazolidone content of 25 mg/kg to 5 000 mg/kg and to
premixtures with a mass fraction of furazolidone of up to 20 % [formerly written as 20 % (m/m)].
NOTE 1 For animal feeding stuffs, the furazolidone content is expressed in milligrams per kilogram; for premixtures, as a
mass fraction in percent [% (m/m)].
NOTE 2 Furazolidone is a chemotherapeuticum belonging to the group of nitrofuranes. Nitrofuranes are bacteriostatic or
bactericidal against Gram-positive and Gram-negative microorganisms and against some moulds and protozoa.
2 Normative reference
The following standard contains provisions which, through reference in this text, constitute provisions of this
International Standard. At the time of publication, the edition indicated was valid. All standards are subject to
revision, and parties to agreements based on this International Standard are encouraged to investigate the
possibility of applying the most recent edition of the standard indicated below. Members of IEC and ISO maintain
registers of currently valid International Standards.
ISO 6498:1998, Animal feeding stuffs — Preparation of test sample.
3 Principle
Furazolidone is extracted from the sample with a mixture of acetonitrile and methanol. Animal feeds are pre-wetted
with water. The extract of animal feeds is purified through a short aluminum oxide column and subsequently diluted
with water. The extract of premixtures is directly diluted with a mixture of water, acetonitrile and methanol. The final
extract is analysed by reverse-phase HPLC with UV detection at a wavelength of 365 nm (see references [1] to [3]).
4 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade.
, demineralized or deionized, with resistivity of at least 10 M cm, or water of at least equivalent purity.
4.1 Water Ω⋅
4.2 Extraction solvent: mixture of acetonitrile and methanol (1:1 by volume).
Combine equal volumes of acetonitrile and methanol. Mix well and allow to adjust to room temperature before use.
4.3 Dilution solvent: mixture of extraction solvent (4.2) and water (4.1) (35:65 by volume).
Mix 350 ml of extraction solvent (4.2) with 650 ml of water (4.1).
1
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4.4 Acetic acid (CH CO H), volume fraction of 10 % [10 % (V/V)].
3 2
Dilute 10 ml of glacial acetic acid to 100 ml with water (4.1).
4.5 Sodium acetate buffer solution, c(CH CO Na) = 0,01 mol/l, pH = 6,0.
3 2
Weigh 0,82 g of sodium acetate into a 1 000 ml one-mark volumetric flask. Dissolve in 700 ml of water. Adjust the
pH to 6,0 with acetic acid (4.4). Dilute to the mark with water and mix.
4.6 Mobile phase for HPLC.
Combine 800 ml of sodium acetate buffer solution (4.5) and 200 ml of acetonitrile and mix. Filter the eluent through
a 0,22 μm filter using a solvent filtration system (5.2), and degas for 10 min in an ultrasonic bath (5.3) before use.
4.7 Furazolidone standard material: N-(5-nitro-2-furfurylidene)-3-amino-2-oxazolidone; CAS number 67-45-8
according to Chemical Abstracts Registry.
WARNING — Because of the sensitivity of furazolidone to light, conduct all operations in the absence of
daylight or artificial white light. Avoid inhalation of and exposure to the toxic furazolidone standard
material and solutions thereof. Work in a fumehood when handling the solvents and solutions. Wear safety
glasses and protective clothing.
4.8 Furazolidone stock solution (approximately 250 μg/ml).
Weigh 25 mg – 1 mg of furazolidone (4.7) to the nearest 0,1 mg into a 100 ml one-mark volumetric flask. Dissolve in
extraction solvent (4.2), dilute to the mark and mix. Calculate the concentration taking into account the purity of the
standard material. Prepare fresh every month. Store in the dark at 0 °C to 8 °C.
4.9 Furazolidone working solutions (approximately 5 μg/ml and 12,5 μg/ml).
Pipette 2,0 ml and 5,0 ml respectively of the furazolidone stock solution (4.8) into separate 100 ml one-mark
volumetric flasks. Add 65 ml of water, dilute to the mark with extraction solvent (4.2) and mix. Prepare fresh for each
series of samples.
4.10 Neutral aluminum oxide, activity 1.
NOTE 0 % to 1 % of water is necessary for total de-activation.
5 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
5.1 pH-meter.
5.2 Solvent filtration system, all-glass apparatus suitable for 0,22 μm filters.
5.3 Ultrasonic bath.
–1 –1
5.4 Rotary shaker, horizontal rotation, rotation frequency 250 min to 300 min .
5.5 Glass microfibre filter, of diameter 15 cm.
.
5.6 Glass wool
5.7 Glass column for chromatography, of length 30 cm, internal diameter 10 mm, restricted at the end and fitted
with a wad of glass wool (5.6).
5.8 Filtration system, equipped with poly(vinylidene difluoride) (PVDF) filters or polytetrafluorethylene (PTFE)
filters of pore size 0,45 μm.
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5.9 HPLC system, comprising the following.
5.9.1 Pump, pulse free, capable of maintaining a volume flow rate of 0,1 ml/min to 2,0 ml/min.
5.9.2 Injection system with loop suitable for 20 μl to 50 μl injections.
5.9.3 UV detector, suitable for measurements at a wavelength of 365 nm.
If available, a diode array detector may be used for confirmation purposes.
5.9.4 Recorder.
5.9.5 Guard column: silica bonded C packing with particle size 37 μm to 100 μm, of length 20 mm, internal
18
diameter 3,9 mm, or a guard column of equivalent quality.
5.9.6 Analytical column: silica bonded C packing with particle size 5 μm, of length 200 mm, internal diameter
18
3,0 mm, or an analytical column of equivalent quality.
For furazolidone a capacity factor (K¢ ) of at least 1,0 shall be obtained.
NOTE The capacity factor is defined as:
t
R
K′= −1
t
0
where
K¢ is the capacity factor;
t is the retention time, in minutes, of furazolidone;
R
t is the retention time, in minutes, of the unretained furazolidone peak.
0
5.10 Disposable syringe, of capacity 5 ml.
6 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method is
given in ISO 6497 [4].
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
7 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with ISO 6498.
Grind the laboratory sample (usually 500 g) so that it passes completely through a sieve with 1 mm apertures. Mix
thoroughly.
8 Procedure
8.1 General
In conjunction with the analysis of the test sample (or a series of test samples), analyse a blank sample, a spiked
blank sample and, if available, a reference sample.
3
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NOTE Blank samples are homogenates of comparable feeds with a furazolidone content of less than 10 mg/kg. Spiked
blank samples are blank feed samples to which furazolidone is added. Blank samples and reference samples can be kept for a
year, if stored at a temperature of 0 °C to 8 °C.
The analysis should be repeated when the recovery is lower than 94 % or higher than 106 %.
8.2 Preparation of a spiked sample
The furazolidone content of the spiked sample should be approximately equal to the expected furazolidone content
of the sample. For a spiked sample with a furazolidone content of 250 mg/kg, use the following procedure.
Pipette 5,0 ml of the furazolidone stock solution (4.8) into a 250 ml conical flask. Under a flow of nitrogen, evaporate
to a volume of approximately 0,5 ml and add 5 g of blank feed. Mix thoroughly and allow to stand for at least 10 min
before proceeding with the extraction (8.3).
8.3 Extraction
8.3.1 Feeding stuffs with a furazolidone content of 25 mg/kg to 2 500 mg/kg
Weigh 5,0 g of the prepared test sample to the nearest 0,05 g in a 250 ml conical flask. Add 15,0 ml of water, mix
and allow to stand for 5 min. Add 35,0 ml of extraction solvent (4.2), stopper and shake vigorously for 30 min on the
rotary shaker (5.4). Filter the solution through a glass microfibre filter (5.5) and use the filtrate for column
chromatography according to 8.4.
8.3.2 Feeding stuffs with a furazolidone content of 2 500 mg/kg to 5 000 mg/kg
Weigh 5,0 g of the prepared test sample to the nearest 0,1 g in a 250 ml conical flask. Add 30,0 ml of water, mix
and allow to stand for 5 min. Add 70,0 ml of extraction solvent (4.2), stopper and shake vigorously for 30 min on the
rotary shaker (5.4). Filter the solution through a glass microfibre filter (5.5) and use the filtrate for column
chromatography according to 8.4.
8.3.3 Premixtures with a mass fraction of furazolidone of 0,5 % to 7 % [0,5 % (m/m) to 7 % (m/m)]
Weigh 1,0 g of the prepared test sample to the nearest 0,01 g in a 250 ml conical flask. Add 100,0 ml of extraction
solvent (4.2), stopper and shake vigorously for 30 min on the rotary shaker (5.4). Filter the solution through a glass
microfibre filter (5.5).
Dilute the fitrate with dilution solvent (4.3) to obtain a final solution with a furazolidone content between 5 μg/ml and
10 μg/ml. The dilution factor is f.
Mix well and filter the solution using the filtration system (5.8). Use the filtrate for HPLC analysis according to 8.5.
NOTE The required dilution factor ( f ) can be estimated by using the equation:
mw⋅
exp
f =
e
⋅ r
V
r
where
f is the estimated required dilution factor of the sample extract;
e
m is the mass, in grams, of the test portion;
w is the expected furazolidone content, in milligrams per kilogram, of the sample;
exp
r is the required furazolidone content, in micrograms per millilitre, of the final solution;
r
V is the total volume, in millilitres, of extraction solvent added to the test portion (see also note in 8.5.2).
8.3.4 Premixtures with a mass fraction of furazolidone of 7 % to 10 % [7 % (m/m) to 10 % (m/m)]
Weigh 1,0 g of the prepared test sample to the nearest 0,01 g in a 500 ml conical flask. Add 200,0 ml of extraction
solvent (4.2), stopper and shake vigorously for 30 min on the rotary shaker (5.4). Filter the solution through a glass
microfibre filter (5.5).
4
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ISO 14797:1999(E)
Dilute the fitrate with dilution solvent (4.3) to obtain a final solution with a furazolidone content between 5 μg/ml and
10 μg/ml. The dilution factor is f.
Mix well and filter the solution using the filtration system (5.8). Use the filtrate for HPLC analysis according to 8.5.
NOTE See the note in 8.3.3 for the calculation of the dilution factor.
8.3.5 Premixtures with a mass fraction of furazolidone of 10 % to 20 % [10 % (m/m) to 20 % (m/m)]
Weigh 0,5 g of the prepared test sample to the nearest 5 mg in a 500 ml conical flask. Add 200,0 ml of extraction
solvent (4.2), stopper and shake vigorously for 30 min on the rotary shaker (5.4). Filter the solution through a glass
microfibre filter (5.5).
Dilute the fitrate with dilution solvent (4.3) to obtain a final solution with a furazolidone content between 5 μg/ml and
10 μg/ml. The dilution factor is f.
Mix well and filter the solution using the filtration system (5.8). Use the filtrate for HPLC analysis according to 8.5.
NOTE See the note in 8.3.3 for the calculation of the dilution factor.
8.4 Column chromatography
For each sample extract, dry-pack a glass column (5.7), fitted at the bottom with a plug of glass wool (5.6), with 4 g
of aluminium oxide (4.10). Apply 20 ml of extract, prepared according to 8.3.1 or 8.3.2, to the column and discard
the first 4 ml of eluate. Collect the following 8 ml of eluate in a small graduated cylinder.
Pipette 5,0 ml of eluate in a 5 ml one-mark volumetric flask and dilute to the mark with water. Mix well.
If necessary, dilute the solution with dilution solvent (4.3) to obtain a final solution with a furazolidone content
between 5 μg/ml and 10 μg/ml. The dilution factor is f.
Filter the diluted solutions using the filtration system (5.8) and use the filtrate for HPLC analysis according to 8.5.
8.5 HPLC analysis
8.5.1 HPLC conditions
Use the following conditions:
mobile phase (4.6) volume flow rate: 0,6 ml/min;
injection volume: 20 μl;
wavelength: 365 nm;
recorder: 10 mV;
chart speed: 0,5 cm/min.
8.5.2 Procedure
8.5.2.1 Inject the furazolidone working solutions (4.9) until a stable baseline and reproducible peak heights or peak
areas are obtained.
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 14797
First édition
1999-03-15
Aliments des animaux — Dosage
de la furazolidone — Méthode par
chromatographie liquide à haute
performance
Animal feeding stuffs — Determination of furazolidone content —
Method using high-performance liquid chromatography
A
Numéro de référence
ISO 14797:1999(F)
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ISO 14797:1999(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 14797 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits agricoles
alimentaires, sous-comité SC 10, Aliments des animaux.
Les annexes A, B et C de la présente Norme internationale sont données uniquement à titre d’information.
© ISO 1999
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
Internet iso@iso.ch
Imprimé en Suisse
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NORME INTERNATIONALE © ISO ISO 14797:1999(F)
Aliments des animaux — Dosage de la furazolidone — Méthode
par chromatographie liquide à haute performance
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de chromatographie liquide à haute performance (CLHP)
pour la détermination de la teneur en furazolidone dans les prémix et dans les aliments des animaux.
La méthode est applicable aux aliments pour animaux dont la teneur en furazolidone va de 25 mg/kg à 5 000 mg/kg,
ainsi qu'aux prémix dont la teneur en furazolidone peut aller jusqu'à une fraction massique de 20 % [auparavant écrit
comme 20 % (m/m)].
NOTE 1 Pour les aliments des animaux, la teneur en furazolidone est exprimée en milligrammes par kilogramme, et pour les
prémix comme fraction massique en pour cent [% (m/m)].
NOTE 2 La furazolidone est une substance chimiothérapique de la famille des nitrofuranes. Les nitrofuranes sont
bactériostatiques et bactéricides, actifs contre les micro-organismes Gram positifs et Gram négatifs, et contre certaines
moisissures et certains protozoaires.
2 Référence normative
La norme suivante contient des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme internationale. Au moment de la publication, l’édition indiquée était en
vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente Norme
internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer l’édition la plus récente de la norme indiquée ci-
après. Les membres de la CEI et de l'ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur à un
moment donné.
ISO 6498:1998, Aliments des animaux — Préparation des échantillons pour essai.
3 Principe
Extraction de la furazolidone d'un échantillon à l'aide d'un mélange d'acétonitrile et de méthanol. Humidification
préalable des aliments pour animaux dans de l'eau. Purification de l'extrait d'aliments pour animaux sur une colonne
d'oxyde d'aluminium courte puis dilution dans de l'eau. Dilution de l'extrait de prémix avec un mélange d'eau,
d'acétonitrile et de méthanol. Analyse de l'extrait final par chromatographie à polarité de phases inversée avec
détection UV à 365 nm (voir références 1 à 3 ).
[ ] [ ]
4 Réactifs
Sauf indication différente, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
4.1 Eau, déminéralisée ou déionisée, d'une résistivité au moins égale à 10 MΩ·cm ou de l’eau d'une pureté au
moins équivalente.
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ISO 14797:1999(F)
4.2 Solvant d’extraction: mélange d'acétonitrile et de méthanol (1:1 par volume).
Mélanger des volumes égaux d’acétonitrile et de méthanol. Bien mélanger et laisser le mélange atteindre la
température ambiante avant de l'utiliser.
4.3 Solvant pour dilution: mélange de solvant d’extraction (4.2) et d’eau (4.1) (35:65 par volume).
Mélanger 350 ml de solvant d’extraction (4.2) et 650 ml d’eau (4.1).
4.4 Acide acétique (CH CO H), fraction volumique de 10 % [10 % (V/V )].
3 2
Diluer 10 ml d'acide acétique glacial à 100 ml avec de l'eau (4.1).
4.5 Solution tampon d’acétate de sodium, c(CH CO Na) = 0,01 mol/l, pH = 6,0.
3 2
Peser 0,82 g d'acétate de sodium dans une fiole jaugée de 1 000 ml. Dissoudre dans 700 ml d'eau. Ajuster le pH à
6,0 à l'aide d'acide acétique (4.4). Compléter au volume avec de l'eau et mélanger.
4.6 Phase mobile pour CLHP.
Réunir 800 ml de la solution tampon d'acétate de sodium (4.5) et 200 ml d'acétonitrile puis mélanger. Filtrer l'éluant
sur un filtre de porosité égale à 0,22 μm en utilisant un système de filtration de solvant (5.2), puis dégazer pendant
10 min dans le bain à ultrasons (5.3) avant l'emploi.
4.7 Étalon de furazolidone: N-(5-nitro-2-furfurylidène)-3-amino-2-oxazolidone); numéro CAS 67-45-8 selon le
catalogue Chemical Abstracts.
AVERTISSEMENT — La furazolidone étant très sensible à la lumière, les opérations doivent être menées à
l'abri de la lumière du jour et de toute source lumineuse artificielle blanche. Éviter d'inhaler la furazolidone
et les solutions en contenant et de s'y exposer. Il s'agit en effet d'une substance toxique. Travailler sous
une hotte pour manipuler les solvants et les solutions. Porter des lunettes de sécurité et des vêtements de
protection.
4.8 Solution mère de furazolidone (environ 250 μg/ml).
Peser 25 mg – 1 mg de furazolidone (4.7) à 0,1 mg près dans une fiole jaugée de 100 ml. Dissoudre dans le solvant
d'extraction (4.2), et compléter à la marque avec ce même solvant et mélanger. Calculer la concentration en tenant
compte de la pureté du matériau. Préparer une nouvelle solution tous les mois. Conserver à l'abri de la lumière
entre 0 °C et 8 °C.
4.9 Solutions de travail de furazolidone (environ 5 μg/ml et 12,5 μg/ml).
Pipetter respectivement 2,0 ml et 5,0 ml de la solution mère de furazolidone (4.8) dans deux fioles jaugées de
100 ml. Ajouter 65 ml d'eau, compléter à la marque avec le solvant d'extraction (4.2) et mélanger. Préparer de
nouvelles solutions pour chaque série d'échantillons.
, activité 1.
4.10 Oxyde d’aluminium neutre
NOTE 0 % à 1 % d’eau est nécessaire pour une désactivation totale.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
5.1 pH mètre.
, appareillage tout en verre pouvant recevoir des filtres d'une porosité de
5.2 Système de filtration de solvant
0,22 μm.
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5.3 Bain à ultrasons.
5.4 Agitateur rotatif, permettant une rotation horizontale et ayant une fréquence de rotation comprise entre
–1 –1
250 min et 300 min .
5.5 Filtre en microfibres de verre, d'un diamètre égal à 15 cm.
5.6 Laine de verre.
5.7 Colonne de verre pour chromatographie, de 30 cm de longueur et de 10 mm de diamètre intérieur,
rétrécissant à une extrémité et raccordée à un tampon en laine de verre (5.6).
5.8 Système de filtration, équipé de filtres en polyvinylidène difluorure (PVDF) ou en polytétrafluoréthylène
(PTFE) d'une porosité de 0,45 μm.
5.9 Appareil CLHP.
5.9.1 Pompe, sans pulsations, capable de maintenir un débit compris entre 0,1 ml/min et 2,0 ml/min.
5.9.2 Boucle d'injection, adaptée à des injections de 20 μl à 50 μl.
5.9.3 Détecteur UV, capable de mesurages sur une longueur d'onde de 365 nm.
Si disponible, un détecteur à barrette de diodes peut être utilisé pour confirmation.
5.9.4 Enregistreur.
5.9.5 Colonne de garde: silice greffée C , granulométrie comprise entre 37 μm et 100 μm, longueur 20 mm,
18
diamètre intérieur 3,9 mm, ou toute autre colonne de protection de qualité équivalente.
5.9.6 Colonne analytique: silice greffée C , taille de particules 5 μm, longueur 200 mm, diamètre interne
18
3,0 mm, ou toute colonne analytique de qualité équivalente.
Pour la furazolidone, un facteur de capacité (K¢) d’au moins 1,0 doit être obtenu.
NOTE Le facteur de capacité est défini comme:
t
R
K′=−1
t
0
où
K¢ est le facteur de capacité;
t est le temps de rétention de la furazolidone, en minutes;
R
t est le temps de rétention du pic de la furazolidone non retenue, en minutes.
0
5.10 Seringue jetable, de 5 ml de capacité.
6 Échantillonnage
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une méthode
d'échantillonnage recommandée est donnée dans l’ISO 6497 [4].
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié lors
du transport et de l'entreposage.
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7 Préparation de l'échantillon pour essai
Préparer l'échantillon pour essai conformément à l'ISO 6498.
Broyer l'échantillon de laboratoire (habituellement 500 g) de façon qu’il passe à travers un tamis à mailles de 1 mm.
Mélanger soigneusement.
8 Mode opératoire
8.1 Généralités
Parallèlement à l'analyse de l'échantillon pour essai (ou d'une série d'échantillons pour essai), analyser un
échantillon à blanc, un échantillon à blanc dopé, et, si possible, un échantillon de référence.
NOTE Les échantillons à blanc sont des mélanges homogènes d'aliments comparables ayant une teneur en furazolidone
inférieure à 10 mg/kg. Les échantillons à blancs dopés sont des échantillons d'aliments à blanc dans lesquels de la
furazolidone a été ajoutée. Les échantillons à blanc et les échantillons de référence peuvent être conservés pendant 1 an s'ils
sont entreposés à une température comprise entre 0 °C et 8 °C.
Il y a lieu de procéder à une nouvelle analyse lorsque le taux de récupération est inférieur à 94 % ou supérieur à
106 %.
8.2 Préparation d'un échantillon dopé
Il convient que la teneur en furazolidone de l'échantillon dopé soit pratiquement égale à la teneur prévue en
furazolidone de l'échantillon. Pour un échantillon dopé dont la teneur en furazolidone est égale à 250 mg/kg, suivre
la procédure suivante.
Pipetter 5,0 ml de la solution mère (4.8) dans une fiole conique de 250 ml. Évaporer sous flux d'azote jusqu'à
obtention d'un volume égal à 0,5 ml environ et ajouter 5 g d'aliment témoin. Mélanger soigneusement et laisser
reposer pendant 10 min au moins avant de procéder à l'extraction (8.3).
8.3 Extraction
8.3.1 Aliments ayant une teneur en furazolidone allant de 25 mg/kg à 2 500 mg/kg
Peser 5,0 g de l'échantillon pour essai préparé à 0,05 g près dans une fiole conique de 250 ml. Ajouter 15,0 ml
d'eau, mélanger et laisser reposer pendant 5 min. Ajouter 35,0 ml de solvant d'extraction (4.2), boucher et agiter
vigoureusement pendant 30 min sur l'agitateur rotatif (5.4). Filtrer la solution sur un filtre en microfibres de verre
(5.5) et utiliser le filtrat pour une analyse chromatographique sur colonne conformément à 8.4.
8.3.2 Aliments ayant une teneur en furazolidone allant de 2 500 mg/kg à 5 000 mg/kg
Peser 5,0 g de l'échantillon pour essai préparé à 0,1 mg près dans une fiole conique de 250 ml. Ajouter 30,0 ml
d'eau, mélanger et laisser reposer pendant 5 min. Ajouter 70,0 ml de solvant d'extraction (4.2), boucher et agiter
vigoureusement pendant 30 min sur l'agitateur rotatif (5.4). Filtrer la solution sur un filtre en microfibres de verre
(5.5) et utiliser le filtrat pour une analyse chromatographique sur colonne conformément à 8.4.
8.3.3 Prémix ayant une fraction massique de furazolidone allant de 0,5 % à 7 % [0,5 % (m/m) à 7 % (m/m)]
Peser 1,0 g de l'échantillon pour essai préparé à 0,01 g près dans une fiole conique de 250 ml. Ajouter 100,0 ml de
solvant d'extraction (4.2), boucher et agiter vigoureusement pendant 30 min sur l'agitateur rotatif (5.4). Filtrer la
solution sur un filtre en microfibres de verre (5.5).
Diluer le filtrat avec du solvant pour dilution (4.3), de façon que la solution finale obtenue ait une teneur en
furazolidone comprise entre 5 μg/ml à 10 μg/ml. Le facteur de dilution est f.
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Mélanger soigneusement et filtrer la solution sur le système de filtration (5.8). Utiliser le filtrat pour une analyse
HPLC conformément à 8.5.
NOTE Le facteur de dilution requis (f ) peut être estimé en utilisant l’équation suivante:
mw⋅
exp
f =
e
V ⋅ r
r
où
f est le facteur de dilution requis estimé de l’extrait d’échantillon;
e
est la masse de la prise d’essai, en grammes;
m
w est la teneur prévue en furazolidone de l’échantillon, en milligrammes par kilogramme;
exp
ρ est la teneur requise en furazolidone de la solution finale, en microgrammes par millilitre;
r
V est le volume total de solvant d’extraction, en millilitres, ajouté à la prise d’essai (voir aussi la note en 8.5.2).
8.3.4 Prémix ayant une fraction massique de furazolidone allant de 7 % à 10 % [7 % (m/m) à 10 % (m/m)]
Peser 1,0 g de l'échantillon pour essai préparé à 0,01 g près dans une fiole conique de 500 ml. Ajouter 200,0 ml de
solvant d'extraction (4.2), boucher et agiter vigoureusement pendant 30 min sur l'agitateur rotatif (5.4). Filtrer la
solution sur un filtre en microfibres de verre (5.5).
Diluer le filtrat avec du solvant pour dilution (4.3), de façon que la solution finale obtenue aie une teneur en
furazolidone comprise entre 5 μg/ml à 10 μg/ml. Le facteur de dilution est f.
Mélanger soigneusement et filtrer la solution sur le système de filtration (5.8). Utiliser le filtrat pour une analyse
CLHP conformément à 8.5.
NOTE Voir la note en 8.3.3 pour le calcul du facteur de dilution.
8.3.5 Prémix ayant une fraction massique de furazolidone allant de 10 % à 20 % [10 % (m/m) à 20 % (m/m)]
Peser 0,5 g de l'échantillon pour essai préparé à 5 mg près dans une fiole conique de 500 ml. Ajouter 200,0 ml de
solvant d'extraction (4.2), boucher et agiter vigoureusement pendant 30 min sur l'agitateur rotatif (5.4). Filtrer la
solution sur un filtre en microfibres de verre (5.5).
Diluer le filtrat avec du solvant pour dilution (4.3), de façon que la solution finale obtenue aie une teneur en
furazolidone comprise entre 5 μg/ml à 10 μg/ml. Le facteur de dilution est f.
Mélanger soigneusement et filtrer la solution sur le système de filtration (5.8). Utiliser le filtrat pour une analyse
CLHP conformément à 8.5.
NOTE Voir la note en 8.3.3 pour le calcul du facteur de dilution.
8.4 Chromatographie sur colonne
Pour chaque extrait d'échantillon, conditionner à sec une colonne en verre (5.7), bouchée à l'extrémité inférieure
par un tampon de laine de verre (5.6), avec 4 g d'oxyde d'aluminium (4.10). Appliquer 20 ml de l'extrait, préparé
conformément à 8.3.1 ou 8.3.2, à la colonne et jeter les premiers 4 ml de l'éluat. Recueillir les 8 ml suivants dans un
petit récipient rond gradué.
Pipetter 5,0 ml d'éluat dans une fiole jaugée de 5 ml et compléter au volume avec de l'eau. Bien mélanger.
Si nécessaire, diluer la solution avec le solvant de dilution (4.3) de manière que la solution finale obtenue ait une
teneur en furazolidone comprise entre 5 μg/ml et 10 μg/ml. Le facteur de dilution est f.
Filtrer les solutions diluées à l'aide du système de filtration (5.8) et utiliser le filtrat pour une analyse CLHP
conformément à 8.5.
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8.5 Analyse CLHP
8.5.1 Paramètres de l'analyse CLHP
Utiliser les paramètres suivants:
débit de la phase mobile (4.6): 0,6 ml/min;
volume d'injection: 20 μl;
longueur d'onde: 365 nm;
enregistreur: 10 mV;
vitesse d'ent
...
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