ISO 30024:2024
(Main)Animal feeding stuffs — Determination of phytase activity
Animal feeding stuffs — Determination of phytase activity
This document specifies the determination of phytase activity in feeding stuff samples, including feed raw materials from plant origin, compound feeds (complete, complementary, mineral feeds), premixtures and feed additives. The method is applicable to, and is collaboratively validated for, the determination of phytase activity in complete feed, complementary feed including mineral feed, premixtures and feed additives. The method does not distinguish between phytase added as a feed additive and endogenous phytase already present in the feed materials. Therefore, the method is also applicable for feed materials from plant origin. The method does not apply to evaluating or comparing the in vivo efficacy of the phytase product. It is not a predictive method of the in vivo efficacy of phytases present on the market as they can develop different in vivo efficacy per unit of activity.
Alimentation animale — Détermination de l'activité phytasique
Le présent document spécifie la détermination de l’activité phytasique dans les échantillons d’aliments pour animaux, y compris dans les matières premières d’origine végétale, aliments composés (complets, complémentaires et minéraux), prémélanges et additifs destinés à l’alimentation animale. La méthode est applicable et validée de manière collaborative pour la détermination de l’activité phytasique dans les aliments complets, les aliments complémentaires, y compris les aliments minéraux, les prémélanges et les additifs, destinés à l’alimentation animale. La méthode ne fait pas la distinction entre la phytase ajoutée en tant qu’additif destiné à l’alimentation animale et la phytase endogène déjà présente dans les matières premières pour l’alimentation animale. Par conséquent, la méthode est également applicable aux matières premières d’origine végétale pour l’alimentation animale. La méthode ne s’applique pas pour évaluer ou comparer l’efficacité in vivo des phytases. Il ne s’agit pas d’une méthode prédictive de l’efficacité in vivo des phytases disponibles sur le marché, car celles-ci peuvent développer une efficacité in vivo différente par unité d’activité.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
International
Standard
ISO 30024
Second edition
Animal feeding stuffs —
2024-04
Determination of phytase activity
Alimentation animale — Détermination de l'activité phytasique
Reference number
© ISO 2024
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Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents . 3
6 Apparatus . 5
7 Sampling and sample preparation . 5
8 Sample extractions . 6
8.1 For compound feeds (excluding mineral feeds) .6
8.2 For mineral feeds and premixtures .6
8.3 For feed additives .6
9 Procedure . 7
9.1 General .7
9.2 Blank solution .7
9.3 Standards .7
9.3.1 Phosphate standard solution.7
9.3.2 Phytase level control.7
9.4 Standard curve .7
9.5 Phytase level control .8
9.6 For compound feed (excluding mineral feeds) .9
9.7 For mineral feeds and premixtures .10
9.8 For feed additives .10
10 Calculations .11
10.1 Formulation of standard curve .11
10.2 Calculation of phytase activity. 12
10.3 Correction for phytic acid purity and water content . 13
10.4 Interference with blank values .14
11 Precision . 14
11.1 Limit of detection and limit of quantification .14
11.2 Interlaboratory tests .14
11.3 Repeatability .14
11.4 Reproducibility . 15
12 Test report .15
Annex A (informative) Interlaboratory study results for compound feeds (excluding mineral
feeds) . 16
Annex B (informative) Interlaboratory study results for mineral feeds and premixtures . 19
Annex C (informative) Interlaboratory study results for feed additives .20
Bibliography .22
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 10,
Animal feeding stuffs, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 327, Animal feeding stuffs - Methods of sampling and analysis, in accordance with the
Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 30024:2009), which has been technically
revised.
The main changes are as follows:
— the scope has been extended to include complementary compound feeds, mineral feeds, premixtures and
feed additives;
— phytic acid (phytate substrate) specifications have been added.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
This document quantifies phytase products in feeding stuff samples to control the phytase content of animal
feed products. However, the method cannot be used to evaluate the in vivo efficacy of the phytase products.
v
International Standard ISO 30024:2024(en)
Animal feeding stuffs — Determination of phytase activity
1 Scope
This document specifies the determination of phytase activity in feeding stuff samples, including feed raw
materials from plant origin, compound feeds (complete, complementary, mineral feeds), premixtures and
feed additives.
The method is applicable to, and is collaboratively validated for, the determination of phytase activity in
complete feed, complementary feed including mineral feed, premixtures and feed additives.
The method does not distinguish between phytase added as a feed additive and endogenous phytase already
present in the feed materials. Therefore, the method is also applicable for feed materials from plant origin.
The method does not apply to evaluating or comparing the in vivo efficacy of the phytase product. It is not a
predictive method of the in vivo efficacy of phytases present on the market as they can develop different in
vivo efficacy per unit of activity.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
phytase unit
U
amount of enzyme that releases 1 µmol of inorganic phosphate from phytate per minute in acetate buffer at
pH 5,5 and 37 °C
Note 1 to entry: This is determined by the reaction conditions specified in this document.
3.2
premixture
premix
uniform mixture of one or more micro-ingredients/feed additives (3.4) with a diluent and/or carrier, and
that is not intended for direct feeding to animals
Note 1 to entry: Premixtures are used to facilitate the uniform dispersion of the micro-ingredients/additives in a
larger mix.
[SOURCE: ISO 20588:2019, 3.2.39]
3.3
mineral feed
mineral mix
mineral supplement
feed that mainly consists of mineral elements, which is as an entire mix free-flowing
Note 1 to entry: In European legislation, a mineral feed contains at least 40 % of crude ash.
Note 2 to entry: to entry : Mineral feed is a form of compound feed (3.5) and of complementary feed (see Note 1 to entry
of 3.5).
[SOURCE: ISO 20588:2019, 3.2.37, modified — "mineral feed" replaced "mineral mix" as the preferred term.
Notes to entry added.]
3.4
feed additive
substance intentionally added to feed and/or water, not consumed as feed by itself, whether or not it has a
nutritional value, that affects the characteristics of feed including organoleptic properties, animal products,
animal production or performance or welfare, or the environment
Note 1 to entry: Microorganisms, enzymes, acidity regulators, trace elements, vitamins and other products fall within
the scope of this definition, depending on the purpose of use and the method of administration.
Note 2 to entry: Coccidiostats and histomonostats are a category of feed additives.
Note 3 to entry: Feed additive does not include feed materials (3.6) and premixtures (3.2).
[SOURCE: ISO 20588:2019, 3.2.18]
3.5
compound feed
formula feed
feed mixture
mixture of at least two feed materials (3.6), whether or not containing feed additives (3.4), for oral animal
feeding in the form of a complementary feed or a complete feed
Note 1 to entry: Complementary feed is a form of compound feed as defined in ISO 20588:2019, 3.2.9.
Note 2 to entry: Complete feed is a form of compound feed as defined in ISO 20588:2019, 3.2.10.
[SOURCE: ISO 20588:2019, 3.2.11]
3.6
feed materials
products of vegetable or animal origin, whether or not containing feed additives (3.4), that are intended for
use in oral animal feeding to meet animals’ nutritional needs
Note 1 to entry: Feed materials can be in their natural state, fresh or preserved, or products derived from industrial
processing, either organic or inorganic substances.
Note 2 to entry: Feed materials may be fed to animals either directly as such, or after processing, or in the preparation
of compound feed (3.5), or as carrier of premixtures (3.2).
[SOURCE: ISO 20588:2019, 3.2.23, modified — "and products derived from industrial processing, either
organic or inorganic substances" moved from the definition to Note 1 to entry.]
4 Principle
Phytase releases phosphate from the substrate myo-inositol hexakisphosphate (phytate). The released
inorganic phosphate is determined by forming a yellow complex with an acidic molybdate/vanadate reagent.
The optical density (OD) of the yellow complex is measured at a wavelength of 415 nm and the inorganic
phosphate released is quantified from a phosphate standard calibration curve.
5 Reagents
During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and distilled
or demineralized water or water of equivalent purity.
WARNING — This method requires the handling of hazardous substances. It is the responsibility of
the user of this document to establish appropriate safety and health practices and determine the
applicability of regulatory limitations prior to use.
5.1 Ammonia solution, 25 % mass fraction; NH .
5.2 Ammonium heptamolybdate tetrahydrate, (NH ) Mo O ·4H O.
4 6 7 24 2
5.3 Ammonium monovanadate, NH VO .
4 3
5.4 Hydrochloric acid, 25 % mass fraction; HCl.
5.5 Nitric acid, 65 % mass fraction; HNO .
5.6 Potassium dihydrogenphosphate, KH PO .
2 4
5.7 Phytate (anionic form of phytic acid), phytic acid:
— all forms of phytate or phytic acid are may be used, e.g. phytic acid (PA), phytic acid dodecasodium salt
(Na-PA), phytic acid dodecapotassium salt (K-PA), phytic acid hexamagnesium salt n-hydrate (Mg-PA);
— ≤ 0,1 % mass fraction of inorganic phosphorus;
— assay ≥ 90 % phosphorus (P) basis (dry basis);
— the substrate should have a percentage of IP6 (= hexaphosphate inositol containing six phosphate groups)
of more than 95.
Information about IP6 ratio or percentage should be available from the supplier upon request.
As phytic acid salt hydrates are supplied with different contents of crystallization water, ensure that the
crystallization water is in the stoichiometric range of 10 mol to 13 mol. In cases of deviation, see 10.3.
For control of the phytate, the blank OD from the standard curve (see 9.4) shall be lower than 0,2. A higher
OD value indicates phosphate or phytase contamination of used reagents.
5.8 Sodium acetate trihydrate, CH COONa·3H O.
3 2
1)
5.9 Polysorbate 20 .
5.10 Diluted nitric acid.
Dilute one volume of nitric acid 65 % mass fraction (5.5) with two volumes water. Store at room temperature.
The maximum storage time is two years.
5.11 Ammonium heptamolybdate reagent.
Dissolve 100,0 g of ammonium heptamolybdate tetrahydrate (5.2) in approximately 800 ml water (hot water
at 50 °C to 60 °C may be used to facilitate salt dissolution). Add 10 ml 25 % mass fraction ammonia solution
1) Tween® 20 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience
of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
(5.1) and make up with water to 1 000 ml. Store at room temperature in the dark. The maximum storage
time is two months.
5.12 Ammonium vanadate reagent.
Dissolve completely 2,35 g of ammonium monovanadate (5.3) in approximately 400 ml of water (hot water
at 50 °C to 60 °C may be used to facilitate salt dissolution). Add 20 ml diluted nitric acid (5.10) and make up
with water to 1 000 ml. Store at room temperature in the dark. The maximum storage time is two months.
5.13 Molybdate/vanadate STOP reagent.
Mix one volume of ammonium vanadate reagent (5.12) with one volume of ammonium heptamolybdate
reagent (5.11) and add two volumes diluted nitric acid (5.10). Mix and store at room temperature. The
maximum storage time is one day.
5.14 Polysorbate 20, 10 % mass fraction.
Dissolve 10,0 g of polysorbate 20 (5.9) with water and make up to 100 ml. Store at room temperature. The
maximum storage time is six months.
5.15 Acetate buffer, pH 5,5; 0,25 mol/l.
Dissolve 34,0 g of sodium acetate trihydrate (5.8) in approximately 900 ml water. Adjust the pH with 25 %
mass fraction hydrochloric acid (5.4) to 5,50 ± 0,02 and make up to 1 000 ml with water. Store at room
temperature. The maximum storage time is two weeks.
5.16 Acetate buffer with 0,01 % mass fraction polysorbate 20, pH 5,5; 0,25 mol/l.
Dissolve 34,0 g of sodium acetate trihydrate (5.8) in approximately 900 ml water. Adjust the pH with 25 %
mass fraction hydrochloric acid (5.4) to 5,50 ± 0,02. Add 1 ml 10 % mass fraction polysorbate 20 (5.14) and
make up to 1 000 ml with water. Store at room temperature. The maximum storage time is two weeks.
5.17 Acetate buffer with 0,01 % mass fraction polysorbate 20, pH 5,5; 0,50 mol/l.
Dissolve 68,0 g of sodium acetate trihydrate (5.8) in approximately 900 ml water. Adjust the pH with 25 %
mass fraction hydrochloric acid (5.4) to 5,50 ± 0,02. Add 1 ml 10 % mass fraction polysorbate 20 (5.14) and
make up to 1 000 ml with water. Store at room temperature. The maximum storage time is two weeks.
5.18 Phytate substrate solution, 7,5 mmol/l (3 mmol/l end-concentration in the reaction).
Dissolve 2,00 g of phytate (5.7) in approximately 200 ml acetate buffer (5.15). Depending of the purity and/
or the water content of phytic acid (see 10.3), if necessary, adjust slightly the 2,00 g mass. Adjust the pH to
5,50 ± 0,02, e.g. with 25 % mass fraction hydrochloric acid (5.4), and make up with acetate buffer (5.15) to
250 ml. The maximum storage time is two weeks at 4 °C.
5.19 Phosphate stock standard solution, 50 mmol/l.
Dry approximately 10 g of potassium dihydrogenphosphate (5.6) at 105 °C for 2 h and store it in a desiccator.
Weigh approximately 682 mg of dried potassium dihydrogenphosphate, transfer it quantitatively to a
100 ml volumetric flask and make up to 100 ml with 0,25 mol/l acetate buffer with 0,01 % mass fraction
polysorbate 20 (5.16). Calculate the exact concentration of the phosphate stock standard solution. Store at
4 °C. The maximum storage time is two weeks.
5.20 Phytase standard, as a quality control sample, with phytase activity not less than 3 500 U/g.
5.21 Phytase stock standard solution.
Weigh 100,0 mg to 300,0 mg of a phytase standard (5.20), transfer it quantitatively to a 100 ml volumetric
flask and dissolve it in approximately 80 ml 0,25 mol/l acetate buffer with 0,01 % mass fraction polysorbate
20 (5.16). Stir it for 15 min to 45 min. After removing the magnetic stirrer, fill up to the mark with 0,25 mol/l
acetate buffer with 0,01 % mass fraction polysorbate 20 (5.16). The maximum storage time is one day at
room temperature, or if aliquoted, the maximum storage time at –18 °C is six months.
5.22 Maize meal
Unprocessed maize grain/broken maize is ground smaller than 1 mm or 2 mm and used as a dilution matrix
for the analysis of mineral feeds and premixtures (see 8.2). Conventional maize flour can also be used.
The phytase activity in maize meal/flour is in itself negligible, but to exclude it completely and to prevent
a significant influence by multiplying the dilutions in the result calculation, heating the meal overnight at
130 °C is recommended.
Equivalent matrix to maize, such as soy protein concentrate, without phytase activity, is possible but should
be validated in-house.
6 Apparatus
Usual laboratory apparatus, in particular, the following shall be used.
6.1 Water bath, thermostatically controlled at 37 °C ± 0,2 °C (with inserts for 2 ml tubes).
6.2 pH-meter, capable of being read to at least two decimal places.
6.3 Magnetic stirrers (≥ 20 W power).
6.4 Egg-shaped stirring bars (40 mm × 20 mm) or cylindrical stirring bars (60 mm × 10 mm) or
equivalent.
6.5 Analytical balance, capable of being read to at least 0,1 mg.
6.6 Balance, capable of being read to at least 0,01 g.
6.7 Vortex mixer.
6.8 Centrifuge, for microcentrifuge tubes (6.12), capable of 11 000g to 20 000g.
6.9 Electronic dispenser or mechanical dispenser.
6.10 Pipettes (electronic and manual), in the range 10 µl to 2 000 µl.
6.11 Spectrophotometer, double beam or microplate reader.
6.12 Microcentrifuge tubes, capacity 2 ml.
7 Sampling and sample preparation
A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this document. A recommended sampling procedure is given
in ISO 6497.
Sample preparation is not part of the method specified in this document. A recommended sample procedure
is given in ISO 6498 with the following clarifications:
— grinding of compound feed and feed raw materials < 1 mm if the C is too high;
V,r
— grinding of mineral compound feed and premixture samples < 0,5 mm (see Reference [8]);
— coated feed additive products or products with a larger particle size can be pestled (see Reference [9]).
8 Sample extractions
8.1 For compound feeds (excluding mineral feeds)
Perform two weighings for each sample.
Weigh two portions of pellets or mash compound feed, of about 50 g each, into containers (500 ml conical
flasks or 800 ml beakers or equivalent). Add 500 ml water and 0,5 ml of 10 % mass fraction polysorbate 20
(5.14) to the compound feed and mix vigorously for 45 min on a magnetic stirrer (6.3) with stirring bars (6.4).
Inhomogeneity, among other causes, in the sample can lead to high coefficients of variation of repeatability
(C , see 11.3). For compound feed samples showing high C , such inhomogeneity can derive from
V,r V,r
inhomogeneous particle size distribution in products or inhomogeneous compound feed preparation. If
compound feed samples show high C , grind the compound feed samples as described in ISO 6498 or by
V,r
2)
using an Ultra Centrifugal Mill with a sieve of nominal size of openings 1 mm. Grind 150 g of compound
feed. Repeat the extraction with the ground samples as described in this clause.
8.2 For mineral feeds and premixtures
For phytase activities higher than 10 000 U/kg, in mineral feeds and premixtures, but lower than
2 000 000 U/kg:
— weigh 0,5 g ± 0,001 g of ground sample (which should be ground smaller than 0,5 mm) and 50 g ± 0,5 g of
maize meal (5.22) in duplicate into containers (500 ml conical flasks or 800 ml beakers or equivalent);
— add 500 ml acetate buffer (5.16) in each container and mix vigorously for 1 h on a magnetic stirrer (6.3).
NOTE Ratio of mixture: In practice, mineral feed is added to complete feed at a rate of 1 % to 4 %, whereas
premixtures are added at a rate of 0,2 % to 1 %. The sample mass of 0,5 g and 50 g maize correspond to a mixture rate
of 1 %. This mixture rate is used as a convention for the comparability of the results of different laboratories, even if
the declared mixture rate of mineral feed/premixture is lower or higher.
8.3 For feed additives
For phytase activities higher than 2 000 U/g (2 000 000 U/kg), in solid or liquid feed additives:
— for liquid feed additives samples:
— weigh the samples (0,5 g or 1 g ± 0,001 g according to Table 6) in duplicate into a 100 ml volumetric flask;
— add approximately 80 ml acetate buffer (5.16) into each flask and mix for 30 min on a magnetic
stirrer (6.3);
— remove the magnetic stirrer and fill up to 100,0 ml with acetate buffer (5.16);
— for solid feed additives samples:
— weigh the samples (0,5 g or 1 g ± 0,001 g according to Table 6) in duplicate into a 250 ml beaker;
2) Ultra Centrifugal Mill is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
— add accurately 100,0 ml acetate buffer (5.16) in each beaker and mix for 30 min on a magnetic
stirrer (6.3).
NOTE If inhomogeneities or poor repeatabilities occur, an increase of sample mass and adequate adaptation of
the extraction volume can be made.
9 Procedure
9.1 General
The volumes of reaction described in this clause can be multiplied if a photometer with a 1 cm cuvette or
flow cell is used. For feeding stuff samples, a correspondingly larger volume of suspension (e.g. 10 ml) shall
be centrifuged for 15 min at near 3 000g or 3 500g using a conventional laboratory centrifuge. Alternatively,
larger sample volumes can also be filtered through folded filter. The first 5 ml should be then rejected. The
supernatant, filtrate, phosphate standard solutions or phytase level control solution is then used with larger
volumes of acetate buffer, phytate substrate solution and stop reagent.
For sample extracts and phytase level control, if the net measured absorption (absorption minus blank) is
not within the calibration range (absorption/phosphate concentration) the determination shall be repeated
with a suitable dilution.
Products containing phytase feed additives which were not included in the validation studies in the annexes
shall be checked, especially on their linearity of response (release of phosphorus),
9.2 Blank solution
Inorganic phosphate in the sample contributes to colour formation. Therefore, blanks are included for each
sample. For calculation of phytase activity, subtract blank values from the test values.
9.3 Standards
9.3.1 Phosphate standard solution
The phosphate stock standard solution (5.19) shall be diluted with 0,25 mol/l acetate buffer containing
0,01 % mass fraction polysorbate 20 (5.16) according to Table 1.
Table 1 — Dilution steps to obtain stand
...
Norme
internationale
ISO 30024
Deuxième édition
Alimentation animale —
2024-04
Détermination de l'activité
phytasique
Animal feeding stuffs — Determination of phytase activity
Numéro de référence
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CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 3
5 Réactifs . 3
6 Appareillage . 5
7 Échantillonnage et préparation des échantillons . 6
8 Extraction des échantillons . 6
8.1 Pour les aliments composés (hors aliments minéraux) .6
8.2 Pour les aliments minéraux et les prémélanges .7
8.3 Pour les additifs .7
9 Mode opératoire . 7
9.1 Généralités .7
9.2 Solution à blanc .8
9.3 Étalons .8
9.3.1 Solution étalon de phosphate .8
9.3.2 Témoin de niveau d’activité phytasique .8
9.4 Courbe d’étalonnage .8
9.5 Témoin de niveau d’activité phytasique.9
9.6 Pour les aliments composés (hors aliments minéraux) .10
9.7 Pour les aliments minéraux et les prémélanges .11
9.8 Pour les additifs .11
10 Calculs .12
10.1 Formule de la courbe d’étalonnage . 12
10.2 Calcul de l’activité phytasique . 13
10.3 Correction relative à la pureté et à la teneur en eau de l’acide phytique . 13
10.4 Interférence avec les valeurs de blanc .14
11 Fidélité . 14
11.1 Limite de détection et limite de quantification .14
11.2 Essais interlaboratoires . 15
11.3 Répétabilité . 15
11.4 Reproductibilité . 15
12 Rapport d’essai .15
Annexe A (informative) Résultats des études interlaboratoires pour les aliments composés
(hors aliments minéraux) . 17
Annexe B (informative) Résultats de l’étude interlaboratoires pour les aliments minéraux et
les prémélanges .21
Annexe C (informative) Résultats des études interlaboratoires pour les additifs .22
Bibliographie .24
iii
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n'avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l'adresse
www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou partie de
tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion de
l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 10, Aliments des animaux, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 327, Alimentation animale -
Méthodes d’échantillonnage et d’analyse, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à
l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 30024:2009), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— le domaine d’application a été élargi aux aliments composés complémentaires, aliments minéraux,
prémélanges et additifs destinés à l’alimentation animale;
— les spécifications de l’acide phytique (substrat de phytate) ont été ajoutées.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
Le présent document a été élaboré en vue de quantifier les préparations commerciales de phytases dans les
échantillons de l’alimentation animale afin d’y contrôler la teneur en phytase. Toutefois, la méthode ne peut
pas être utilisée pour évaluer l’efficacité in vivo des phytases.
v
Norme internationale ISO 30024:2024(fr)
Alimentation animale — Détermination de l'activité
phytasique
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie la détermination de l’activité phytasique dans les échantillons d’aliments
pour animaux, y compris dans les matières premières d’origine végétale, aliments composés (complets,
complémentaires et minéraux), prémélanges et additifs destinés à l’alimentation animale.
La méthode est applicable et validée de manière collaborative pour la détermination de l’activité phytasique
dans les aliments complets, les aliments complémentaires, y compris les aliments minéraux, les prémélanges
et les additifs, destinés à l’alimentation animale.
La méthode ne fait pas la distinction entre la phytase ajoutée en tant qu’additif destiné à l’alimentation
animale et la phytase endogène déjà présente dans les matières premières pour l’alimentation animale.
Par conséquent, la méthode est également applicable aux matières premières d’origine végétale pour
l’alimentation animale.
La méthode ne s’applique pas pour évaluer ou comparer l’efficacité in vivo des phytases. Il ne s’agit pas
d’une méthode prédictive de l’efficacité in vivo des phytases disponibles sur le marché, car celles-ci peuvent
développer une efficacité in vivo différente par unité d’activité.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
unité de phytase
U
quantité d’enzyme qui libère 1 µmol de phosphate inorganique par minute à partir de phytate dans un
tampon acétate de pH 5,5 à 37 °C
Note 1 à l'article: Cette valeur est déterminée par les conditions de réaction spécifiées dans le présent document.
3.2
prémélange
prémélange
mélange homogène d’un ou de plusieurs micro-ingrédients/additifs (3.4) avec un diluant et/ou un support,
qui n’est pas destiné à l’alimentation directe des animaux
Note 1 à l'article: Les prémélanges sont utilisés pour faciliter l’homogénéisation des micro-ingrédients/additifs dans
un mélange de volume plus important.
[SOURCE: ISO 20588:2019, 3.2.39]
3.3
aliment minéral
mélange de minéraux
supplément de minéraux
aliment composé essentiellement d’éléments minéraux, sous forme de mélange s’écoulant librement
Note 1 à l'article: Dans la législation européenne, un aliment minéral contient au moins 40 % de cendres brutes.
Note 2 à l'article: L’aliment minéral est une forme d’aliment composé (3.5) et d’aliment complémentaire (voir Note 1 à
l’article du 3.5).
[SOURCE: ISO 20588:2019, 3.2.37, modifiée — «aliment minéral» remplace «mélange de minéraux» en tant
que terme privilégié. Notes à l’article ajoutées.]
3.4
additif
substance délibérément ajoutée à l’alimentation animale et/ou à l’eau, non consommée comme aliment en tant
que tel, avec ou sans valeur nutritionnelle, qui influe sur les caractéristiques, notamment organoleptiques,
des aliments pour animaux, les produits animaux, la production animale, la performance, le bien-être animal
ou l’environnement
Note 1 à l'article: Les micro-organismes, les enzymes, les régulateurs d’acidité, les oligo-éléments, les vitamines et
d’autres produits relèvent du domaine d’application de cette définition, en fonction de l’usage prévu et de la méthode
d’administration.
Note 2 à l'article: Les coccidiostatiques et les histomonostatiques constituent une catégorie d’additifs.
Note 3 à l'article: Les matières premières (3.6) et les prémélanges (3.2) ne font pas partie des additifs.
[SOURCE: ISO 20588:2019, 3.2.18]
3.5
aliment composé
formulation d’alimentation animale
mélange d’alimentation animale
mélange d’au moins deux matières premières (3.6), comprenant ou non des additifs (3.4), qui est destiné à
l’alimentation animale par voie orale, sous la forme d’un aliment complémentaire pour animaux ou d’un
aliment complet pour animaux
Note 1 à l'article: Un aliment complémentaire pour animaux est une forme d’aliment composé tel que défini dans
l’ISO 20588:2019, 3.2.9.
Note 2 à l'article: Un aliment complet pour animaux est une forme d’aliment composé tel que défini dans
l’ISO 20588:2019, 3.2.10.
[SOURCE: ISO 20588:2019, 3.2.11]
3.6
matières premières
produits d’origine végétale ou animale, comprenant ou non des additifs (3.4), qui sont destinés à l’alimentation
des animaux par voie orale afin de répondre à leurs besoins nutritionnels
Note 1 à l'article: Les matières premières peuvent être à l’état naturel, fraîches ou conservées, être des dérivés de leur
transformation industrielle ou des substances organiques ou inorganiques.
Note 2 à l'article: Les matières premières peuvent être utilisées pour l’alimentation des animaux, soit directement
en l’état, soit après transformation, ou pour la préparation d’aliments composés (3.5), ou en tant que supports des
prémélanges (3.2).
[SOURCE: ISO 20588:2019, 3.2.23, modifiée — «et les dérivés de leur transformation industrielle, ainsi que
les substances organiques ou inorganiques» déplacé de la définition à la Note 1 à l’article.]
4 Principe
La phytase libère du phosphate à partir du substrat hexakisphosphate de myo-inositol (phytate). Le
phosphate inorganique libéré est révélé en formant un complexe jaune avec un réactif acide vanado-
molybdique. La densité optique du complexe jaune est mesurée à une longueur d’onde de 415 nm et le
phosphate inorganique libéré est quantifié à l’aide d’une courbe d’étalonnage du phosphate.
5 Réactifs
Au cours de l’analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique
reconnue et de l’eau distillée ou déminéralisée ou de l’eau de pureté équivalente.
AVERTISSEMENT — Cette méthode nécessite la manipulation de substances dangereuses. Il incombe
à l’utilisateur du présent document d’établir, avant de l’utiliser, des pratiques d’hygiène, de santé et
de sécurité appropriées et de déterminer l’applicabilité des restrictions réglementaires.
5.1 Ammoniaque, solution à 25 % (fraction massique); NH .
5.2 Heptamolybdate d’ammonium tétrahydraté, (NH ) Mo O ·4H O.
4 6 7 24 2
5.3 Monovanadate d’ammonium, NH VO .
4 3
5.4 Acide chlorhydrique, 25 % (fraction massique); HCl.
5.5 Acide nitrique, 65 % (fraction massique); HNO .
5.6 Dihydrogénophosphate de potassium, KH PO .
2 4
5.7 Phytate (forme anionique de l’acide phytique), acide phytique:
— toutes les formes de phytate ou d’acide phytique peuvent être utilisées, par exemple l’acide phytique (PA),
l’hydrate de dodécasodium d’acide phytique (Na-PA), l’hydrate de dodécapotassium d’acide phytique (K-
PA) et le n-hydrate d’hexamagnésium d’acide phytique (Mg-PA);
— ≤ 0,1 % en fraction massique de phosphore inorganique;
— titre ≥ à 90 % par rapport à la teneur théorique en phosphore (P) (sur sec);
— il convient que le substrat présente un pourcentage d’IP6 (= hexaphosphate d’inositol comprenant six
groupes phosphate) supérieur à 95.
Le taux ou le pourcentage d’IP6 peut être obtenu sur demande auprès du fournisseur.
Les hydrates d’acide phytique étant proposés avec différentes teneurs en eau de cristallisation, s’assurer que
cette teneur correspond à une quantité stœchiométrique comprise entre 10 mol et 13 mol. En cas d’écart,
voir 10.3.
Pour le contrôle du phytate, la densité optique du blanc, obtenue à partir de la courbe d’étalonnage (voir 9.4),
doit être inférieure à 0,2. Une densité optique plus élevée indique que les réactifs utilisés ont été contaminés
par du phosphate ou de la phytase.
5.8 Acétate de sodium trihydraté, CH COONa·3H O.
3 2
1)
5.9 Polysorbate 20 .
1) Tween® 20 est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention
des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve l’emploi du produit ainsi désigné.
5.10 Acide nitrique dilué.
Diluer un volume d’acide nitrique à 65 % en fraction massique (5.5) avec deux volumes d’eau. Conserver à
température ambiante. La durée de conservation maximale est de deux ans.
5.11 Solution d’heptamolybdate d’ammonium.
Dissoudre 100,0 g d’heptamolybdate d’ammonium tétrahydraté (5.2) dans environ 800 ml d’eau (de l’eau
chaude à une température comprise entre 50 °C et 60 °C peut être utilisée pour faciliter la dissolution du
sel). Ajouter 10 ml de solution d’ammoniaque à 25 % en fraction massique (5.1) et compléter à 1 000 ml avec
de l’eau. Conserver à température ambiante à l’abri de la lumière. La durée de conservation maximale est de
deux mois.
5.12 Solution de vanadate d’ammonium.
Dissoudre complètement 2,35 g de monovanadate d’ammonium (5.3) dans environ 400 ml d’eau (de l’eau
chaude à une température de 50 °C à 60 °C peut être utilisée pour faciliter la dissolution du sel). Ajouter
20 ml d’acide nitrique dilué (5.10) et compléter à 1 000 ml avec de l’eau. Conserver à température ambiante à
l’abri de la lumière. La durée de conservation maximale est de deux mois.
5.13 Réactif d’arrêt vanado-molybdique.
Mélanger un volume de solution de vanadate d’ammonium (5.12) avec un volume de solution
d’heptamolybdate d’ammonium (5.11) et ajouter deux volumes d’acide nitrique dilué (5.10). Mélanger et
conserver à température ambiante. La durée de conservation maximale est d’une journée.
5.14 Polysorbate 20, 10 % (fraction massique).
Dissoudre 10,0 g de polysorbate 20 (5.9) avec de l’eau et compléter à 100 ml. Conserver à température
ambiante. La durée de conservation maximale est de six mois.
5.15 Tampon acétate, pH 5,5; 0,25 mol/l.
Dissoudre 34,0 g d’acétate de sodium trihydraté (5.8) dans environ 900 ml d’eau. Ajuster le pH à 5,50 ± 0,02
avec de l’acide chlorhydrique à 25 % en fraction massique (5.4) et compléter à 1 000 ml avec de l’eau.
Conserver à température ambiante. La durée de conservation maximale est de deux semaines.
5.16 Tampon acétate additionné de polysorbate 20 à 0,01 % en fraction massique, pH 5,5; 0,25 mol/l.
Dissoudre 34,0 g d’acétate de sodium trihydraté (5.8) dans environ 900 ml d’eau. Ajuster le pH à 5,50 ± 0,02
avec de l’acide chlorhydrique à 25 % en fraction massique (5.4). Ajouter 1 ml de polysorbate 20 à 10 % en
fraction massique (5.14) et compléter à 1 000 ml avec de l’eau. Conserver à température ambiante. La durée
de conservation maximale est de deux semaines.
5.17 Tampon acétate additionné de polysorbate 20 à 0,01 % en fraction massique, pH 5,5; 0,50 mol/l.
Dissoudre 68,0 g d’acétate de sodium trihydraté (5.8) dans environ 900 ml d’eau. Ajuster le pH à 5,50 ± 0,02
avec de l’acide chlorhydrique à 25 % en fraction massique (5.4). Ajouter 1 ml de polysorbate 20 à 10 % en
fraction massique (5.14) et compléter à 1 000 ml avec de l’eau. Conserver à température ambiante. La durée
de conservation maximale est de deux semaines.
5.18 Solution de substrat de phytate, 7,5 mmol/l (concentration finale de 3 mmol/l dans la réaction).
Dissoudre 2,00 g de phytate (5.7) dans environ 200 ml de tampon acétate (5.15). En fonction de la pureté et/ou
de la teneur en eau de l’acide phytique (voir 10.3), si nécessaire, ajuster légèrement la masse de 2,00 g. Ajuster
le pH à 5,50 ± 0,02, par exemple avec de l’acide chlorhydrique à 25 % en fraction massique (5.4), et compléter à
250 ml avec le tampon acétate (5.15). La durée de conservation maximale est de deux semaines à 4 °C.
5.19 Solution mère étalon de phosphate, 50 mmol/l.
Sécher environ 10 g de dihydrogénophosphate de potassium (5.6) à 105 °C pendant 2 h et les conserver
dans un dessiccateur. Peser environ 682 mg de dihydrogénophosphate de potassium séché, les transférer
quantitativement dans une fiole jaugée de 100 ml et compléter à 100 ml avec le tampon acétate additionné
de polysorbate 20 à 0,01 % en fraction massique à 0,25 mol/l (5.16). Calculer la concentration exacte de
la solution mère étalon de phosphate. Conserver à 4 °C. La durée de conservation maximale est de deux
semaines.
5.20 Phytase de référence, servant d’échantillon de contrôle qualité, avec activité phytasique d’au moins
3 500 U/g.
5.21 Solution mère de phytase de référence.
Peser 100,0 mg à 300,0 mg de phytase de référence (5.20), les transférer quantitativement dans une fiole
jaugée de 100 ml et les dissoudre dans environ 80 ml de tampon acétate additionné de polysorbate 20 à
0,01 % en fraction massique à 0,25 mol/l (5.16). Agiter pendant 15 min à 45 min. Retirer le barreau d’agitateur
et compléter au volume avec du tampon acétate additionné de polysorbate 20 à 0,01 % en fraction massique
à 0,25 mol/l (5.16). La durée de conservation maximale est d’une journée à température ambiante ou, si elle
est stockée en parties aliquotes, la durée de conservation maximale à −18 °C est de six mois.
5.22 Farine de maïs.
Broyer du maïs en grains non transformé ou du maïs concassé jusqu’à obtention d’une farine de granulométrie
inférieure à 1 mm ou 2 mm et l’utiliser comme matrice de dilution pour l’analyse des aliments minéraux et
des prémélanges (voir 8.2). De la farine de maïs ordinaire peut également être utilisée. L’activité phytasique
dans la farine de maïs est en soi négligeable. Toutefois, afin de l’exclure complètement et d’empêcher une
influence significative par la multiplication des dilutions dans le résultat du calcul, il est recommandé de
chauffer la farine pendant une nuit à 130 °C.
Il est possible d’utiliser une matrice équivalente au maïs telle que le concentré protéique de soja, sans activité
phytasique, mais il convient alors de la valider en interne.
6 Appareillage
Utiliser le matériel courant de laboratoire et, en particulier, le matériel ci-dessous doit être utilisé.
6.1 Bain-marie, thermorégulé à 37 °C ± 0,2 °C (muni d’inserts pour des tubes de 2 ml).
6.2 pH-mètre, pouvant être lu jusqu’à au moins deux décimales.
6.3 Agitateurs magnétiques (puissance ≥ 20 W).
6.4 Barreaux d’agitateur de forme ovale (40 mm × 20 mm) ou barreaux d’agitateur cylindriques
(60 mm × 10 mm) ou équivalent.
6.5 Balance analytique, avec une précision de lecture d’au moins 0,1 mg.
6.6 Balance, avec une précision de lecture d’au moins 0,01 g.
6.7 Agitateur vortex.
6.8 Centrifugeuse, pour microtubes à centrifuger (6.12), capable d’une accélération de 11 000 g à
20 000 g.
6.9 Distributeur électronique ou distributeur mécanique.
6.10 Pipettes (électroniques et manuelles), de capacité 10 µl à 2 000 µl.
6.11 Spectrophotomètre, double faisceau ou lecteur de microplaque.
6.12 Microtubes à centrifuger, de capacité 2 ml.
7 Échantillonnage et préparation des échantillons
Il convient qu’un échantillon représentatif ait été envoyé au laboratoire. Il convient qu’il n’ait été ni
endommagé ni modifié au cours du transport ou du stockage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Une procédure
d’échantillonnage recommandée est indiquée dans l’ISO 6497.
La préparation des échantillons ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Une
procédure de préparation des échantillons recommandée est indiquée dans l’ISO 6498 avec les clarifications
suivantes:
— broyage des aliments composés et des matières premières < 1 mm si le C est trop élevé;
V,r
— broyage des échantillons d’aliments composés minéraux et de prémélanges < 0,5 mm (voir Référence [8]);
— les additifs enrobés ou les produits dont la granulométrie est plus importante peuvent être broyés au
pilon (voir Référence [9]).
8 Extraction des échantillons
8.1 Pour les aliments composés (hors aliments minéraux)
Effectuer deux pesées pour chaque échantillon.
Peser deux portions d’aliment composé sous forme granulée ou non granulée (mash), chacune de 50 g
environ, dans des récipients (fioles coniques de 500 ml ou béchers de 800 ml ou équivalent). Ajouter 500 ml
d’eau et 0,5 ml de polysorbate 20 à 10 % en fraction massique (5.14) à l’aliment composé et mélanger
vigoureusement sur un agitateur magnétique (6.3) pendant 45 min avec des barreaux d’agitateur (6.4).
Le manque d’homogénéité dans l’échantillon, entre autres causes, peut entraîner des coefficients de variation
de la répétabilité élevés (C , voir 11.3). En ce qui concerne les échantillons d’aliments composés présentant
V,r
un C élevé, une telle hétérogénéité peut provenir d’une distribution non homogène de la taille des particules
V,r
dans le produit ou d’une préparation non homogène des aliments composés. Si les échantillons d’aliments
composés présentent un C élevé, broyer ces échantillons conformément aux indications de l’ISO 6498 ou
V,r
2)
au moyen d’un broyeur Ultra centrifuge muni d’un tamis de dimension nominale d’ouvertures de 1 mm.
Broyer 150 g d’aliments composés. Répéter l’extraction avec les échantillons broyés comme décrit dans le
présent article.
2) Le broyeur Ultra centrifuge est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est
donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve l’emploi du produit
ainsi désigné.
8.2 Pour les aliments minéraux et les prémélanges
Pour les activités phytasiques supérieures à 10 000 U/kg, dans les aliments minéraux et les prémélanges,
mais inférieures à 2 000 000 U/kg:
— peser, en double, 0,5 g ± 0,001 g d’échantillon broyé (il convient que la granulométrie soit inférieure à
0,5 mm) et 50 g ± 0,5 g de farine de maïs (5.22) dans des récipients (fioles coniques de 500 ml ou béchers
de 800 ml ou équivalent);
— ajouter 500 ml de tampon acétate (5.16) dans chaque récipient et mélanger vigoureusement pendant 1 h
sur un agitateur magnétique (6.3).
NOTE Rapport de mélange: en pratique, l’aliment minéral est ajouté à l’aliment complet selon un rapport de 1 %
à 4 %, tandis que les prémélanges sont ajoutés selon un rapport de 0,2 % à 1 %. Une masse d’échantillon de 0,5 g
et 50 g de maïs correspondent à un rapport de mélange de 1 %. Ce rapport est utilisé par convention pour pouvoir
comparer les résultats de différents laboratoires, même si le rapport déclaré entre l’aliment minéral et le prémélange
est inférieur ou supérieur.
8.3 Pour les additifs
Pour les activités phytasiques supérieures à 2 000 U/g (2 000 000 U/kg), dans les additifs solides ou liquides:
— pour les échantillons d’additifs liquides:
— peser, en double, les échantillons (0,5 g ou 1 g ± 0,001 g selon le Tableau 6) dans deux fioles jaugées
de 100 ml;
— ajouter environ 80 ml de tampon acétate (5.16) dans chaque fiole et mélanger pendant 30 min sur un
agitateur magnétique (6.3);
— retirer l’agitateur magnétique et compléter à 100,0 ml avec du tampon acétate (5.16);
— pour les échantillons d’additifs solides:
— peser, en double, les échantillons (0,5 g ou 1 g ± 0,001 g selon le Tableau 6) dans deux béchers de 250 ml;
— ajouter exactement 100,0 ml de tampon acétate (5.16) dans chaque bécher et mélanger pendant
30 min sur un agitateur magnétique (6.3).
NOTE En cas d’hétérogénéité ou de répétabilité insuffisante, on peut augmenter la masse des échantillons et
adapter proportionnellement le volume d’extraction.
9 Mode opératoire
9.1 Généralités
Les volumes de réaction décrits dans le présent article peuvent être multipliés si un photomètre muni d’une
cuvette de 1 cm ou d’une cellule pour mesure à flux continu est utilisé. Pour les échantillons d’alimentation
animale, un plus grand volume de suspension correspondant (10 ml, par exemple) doit être centrifugé
pendant 15 min à près de 3 000 g ou 3 500 g à l’aide d’une centrifugeuse classique de laboratoire. Les volumes
d’échantillons plus importants peuvent également être filtrés au moyen d’un filtre plissé. Il convient alors de
rejeter les premiers 5 ml. Le surnageant, le filtrat, les solutions étalons de phosphate ou la solution du témoin
de niveau d’activité phytasique sont alors utilisés avec des volumes plus importants de tampon acétate, de
solution de substrat de phytate et de réactif d’arrêt.
Pour les extraits d’échantillons et la solution du témoin de niveau d’activité phytasique, si l’absorption
nette mesurée (absorption moins valeur à blanc) ne se trouve pas dans la plage d’étalonnage (absorption/
concentration de phosphate), la détermination doit être répétée avec une dilution adaptée.
Les produits contenant des additifs à base de phytase qui n’étaient pas couverts par les études de validation
des annexes doivent être notamment vérifiés en ce qui concerne la linéarité de la réponse (libération de
phosphore).
9.2 Solution à blanc
Le phosphate inorganique présent dans l’échantillon induit une coloration. Des blancs sont donc réalisés
pour chaque échantillon. Pour le calcul de l’activité phytasique, les valeurs de blanc sont soustraites des
valeurs obtenues à partir des échantillons.
9.3 Étalons
9.3.1 Solution étalon de phosphate
La solution mère étalon de phosphate (5.19) doit être diluée avec du tampon acétate additionné de
polysorbate 20 à 0,01 % en fraction massique à 0,25 mol/l (5.16) conformément au Tableau 1.
Tableau 1 — Gamme de dilution pour obtenir les solutions étalons colorimétriques de la courbe
d’étalonnage du phosphate
Volume de tampon acétate
Concentration
Solution Volume de solution mère éta- additionné de polysorbate 20 à Facteur de
a
étalon lon de phosphate (5.19) 0,01 % en fraction massique à dilution
µmol/ml
0,25 mol/l (5.16)
A 1 1 2 25
B 1 3 4 12,5
C 1 7 8 6,25
D 1 15 16 3,125
a
Calculer les concentrations exactes (5.19).
9.3.2 Témoin de niveau d’activité phytasique
Un témoin de niveau d’activité phytasique est inclus pour chaque incubation des échantillons. Une solution
mère de phytase de référence (5.21) d’activité connue est diluée à une activité finale comprise entre 0,15 U/
ml et 0,25 U/ml et l’activité exacte est déterminée comme spécifié en 9.5.
9.4 Courbe d’étalonnage
Réaliser trois déterminations pour chaque dilution de phosphate et deux essais à blanc, et calculer la
moyenne des résultats. Le mode opératoire est spécifié dans le Tableau 2.
L’écart entre la valeur maximale et la valeur minimale de densité optique, observé pour les trois
déterminations de chaque dilution de phosphate, exprimé comme étant le rapport (valeur maximale - valeur
minimale)/valeur minimale, ne dépasse pas 15 %. Dans le cas contraire, il est possible d’écarter l’une des
trois valeurs. Si l’écart entre la valeur maximale et la valeur minimale des deux valeurs de densité optique
restantes est toujours supérieur à 15 %, effectuer trois nouvelles déterminations.
Pour maintenir les extraits phytasiques sur une plage linéaire, la courbe d’étalonnage ne doit pas couvrir
une densité optique supérieure à 0,5.
Pour les solutions étalons de phosphate, pipetter 360 µl de tampon acétate additionné de polysorbate 20 à
0,01 % en fraction massique à 0,25 mol/l (5.16) dans un tube de 2 ml (6.12). Ajouter 40 µl de solution étalon
de phosphate (voir Tableau 2).
Pour les solutions étalons à blanc de phosphate, pipetter 400 µl de tampon acétate additionné de
polysorbate 20 à 0,01 % en fraction massique à 0,25 mol/l (5.16) dans un tube de 2 ml (6.12).
Dans les deux cas, ajouter 0,8 ml de solution de substrat de phytate (5.18) et 0,8 ml de réactif d’arrêt (5.13).
Homogénéiser le contenu des tubes et le maintenir à température ambiante pendant 10 min. Centrifuger
(6.8) les tubes pendant 3 min entre 11 000 g et 20 000 g et mesurer la densité optique du surnageant clarifié
à 415 nm, D(415).
Tableau 2 — Mode opératoire pour l’obtention de la courbe d’étalonnage
Étape de l’essai Solutions étalons colorimétriques Blanc
Tampon acétate additionné de polysor-
bate 20 à 0,01 % en fraction massique à 360 µl 400 µl
0,25 mol/l (5.16)
Solution étalon de phosphate (9.3.1) 40 µl 0 µl
Solution de substrat de phytate (5.18) 0,8 ml 0,8 ml
Réactif d’arrêt (5.13) 0,8 ml 0,8 ml
Homogénéisation Oui Oui
Temps à température ambiante 10 min 10 min
Centrifugation 3 min entre 11 000 g et 20 000 g 3 min entre 11 000 g et 20 000 g
Spectrophotomètre (6.11) 415 nm (lecture par rapport à l’eau) 415 nm (lecture par rapport à l’eau)
9.5 Témoin de niveau d’activité phytasique
Réaliser trois déterminations et deux essais à blanc, et calculer la moyenne des résultats. Le mode opératoire
est spécifié dans le Tableau 3.
Pour les solutions permettant la détermination du niveau d’activité phytasique, pipetter 360 µl de tampon
acétate additionné de polysorbate 20 à 0,01 % en fraction massique à 0,25 mol/l (5.16) dans un tube de 2 ml
(6.12). Ajouter 40 µl de solution de phytase témoin de niveau diluée (voir 9.3.2). Homogénéiser l’échantillon.
Préincuber les solutions pendant 5 min à 37 °C. Ajouter 0,8 ml de solution de substrat de phytate (5.18)
préchauffée à 37 °C. Incuber pendant 30 min exactement à 37 °C. Après 30 min, ajouter 0,8 ml de réactif
d’arrêt (5.13) et homogénéiser. Maintenir les solutions à température ambiante pendant 10 min, puis les
centrifuger pendant 3 min entre 11 000 g et 20 000 g. Mesurer le D(415) du surnageant clarifié.
Pour les solutions à blanc de phytase témoin de niveau, pipetter 360 µl de tampon acétate (5.15) dans un
tube de 2 ml (6.12). Ajouter 40 µl de solution de phytase témoin de niveau diluée (voir 9.3.2). L’ordre d’ajout
des solutions diffère de celui des déterminations. Préincuber les blancs pendant 5 min à 37 °C. Ensuite, en
étape 1, ajouter le réactif d’arrêt (5.13). Puis, en étape 2, ajouter la solution de substrat de phytate (5.18)
préchauffée à 37 °C. Procéder ensuite selon le Tableau 3, à partir de la colonne 3, ligne 9.
Tableau 3 — Mode opératoire pour le témoin de niveau
Étape de l’essai Échantillon témoin de niveau Blanc
Tampon acétate additionné de polysor-
bate 20 à 0,01 % en fraction massique à 360 µl 360 µl
0,25 mol/l (5.16)
Solution de phytase témoin de niveau
40 µl 40 µl
diluée (voir 9.3.2)
Homogénéisation Oui Oui
Préincubation à 37 °C 5 min 5 min
Solution de substrat de phytate (5.18) à
0,8 ml 0,8 ml: étape 2
37 °C
Homogénéisation Non Non
Incubation à 37 °C 30 min Non
Réactif d’arrêt (5.13) 0,8 ml 0,8 ml: étape 1
Homogénéisation Oui Oui
TTabableleaauu 3 3 ((ssuuiitte)e)
Étape de l’essai Échantillon témoin de niveau Blanc
Temps à température ambiante 10 min 10 min
Centrifugation 3 min entre 11 000 g et 20 000 g 3 min entre 11 000 g et 20 000 g
Spectrophotomètre (6.11) 415 nm (lecture par rapport à l’eau) 415 nm (lecture par rapport à l’eau)
9.6 Pour les aliments composés (hors aliments minéraux)
Transférer 2 ml de l’extrait d’aliment composé dans un microtube à centrifuger (6.12) et centrifuger (6.8)
pendant 3 min à une accélération de 11 000 g à 20 000 g.
Réaliser trois déterminations pour chaque extraction (voir Article 8) et deux essais à blanc, et calculer la
moyenne des résultats. Le mode opératoire est spécifié dans le Tableau 4.
Pour les déterminations, pipetter 300 µl de tampon acétate additionné de polysorbate 20 à 0,01 % en
fraction massique à 0,25 mol/l (5.16) dans un tube de 2 ml (6.12). Ajouter 100 µl d’extrait d’aliment (voir
8.1) comme prise d’essai. Homogénéiser le contenu du tube. Préincuber pendant 5 min à 37 °C. Ajouter 0,8 ml
de solution de substrat de phytate (5.18) préchauffée à 37 °C. Incuber pendant exactement 30 min à 37 °C.
Après 30 min, ajouter 0,8 ml de réactif d’arrêt (5.13) et homogénéiser. Maintenir le tube et son contenu à
température ambiante pendant 10 min, puis centrifuger pendant 3 min entre 11 000 g et 20 000 g. Mesurer
le D(415) du surnageant clarifié.
Pour les blancs, pipetter 300 µl de tampon acétate additionné de polysorbate 20 à 0,01 % en fraction
massique à 0,25 mol/l (5.16) dans un tube de 2 ml (6.12). Ajouter 100 µl d’extrait d’aliment (voir 8.1). L’ordre
d’ajout des solutions diffère de celui de la détermination sur la prise d’essai. Préincuber les blancs pendant
5 min à 37 °C. Ensuite, en étape 1, ajouter le réactif d’arrêt (5.13). Puis, en étape 2, ajouter la solution de
substrat de phytate (5.18) préchauffée à 37 °C. Procéder ensuite selon le Tableau 4, à partir de la colonne 3,
ligne 9.
Tableau 4 — Mode opératoire pour les aliments composés (hors aliments minéraux)
Étape de l’essai Échantillon d’aliment Blanc
Tampon acétate additionné de polysor-
bate 20 à 0,01 % en fraction massique à 300 µl 300 µl
0,25 mol/l (5.16)
Prise d’essai 100 µl 100 µl
Homogénéisation Oui Oui
Préincubation à 37 °C 5 min 5 min
Solution de substrat de phytate (5.18) à
0,8 ml 0,8 ml: étape 2
37 °C
Homogénéisation Non Non
Incubation à 37 °C 30 min Non
Réactif d’arrêt (5.13) 0,8 ml 0,8 ml: étape 1
Homogénéisation Oui Oui
Temps à température ambiante 10 min 10 min
Centrifugation 3 min entre 11 000 g et 20 000 g 3 min entre 11 000 g et 20 000 g
Spectrophotomètre (6.11) 415 nm (lecture par rapport à l’eau) 415 nm (lecture par rapport à l’eau)
Pour les prises d’essai contenant une quantité ≤ 200 U de phytase par kilogramme d’aliment composé, on
prélève 200 µl d’extrait d’échantillon et 200 µl de tampon acétate additionné de polysorbate 20 à 0,01 % en
fraction massique à 0,50 mol/l (5.17) pour l’essai (dilution 1:2).
Les échantillons contenant une quantité > 2 000 U de phytase par kilogramme d’aliment composé sont à
diluer de façon appropriée avec le tampon acétate additionné de polysorbate 20 à 0,01 % en fraction
massique à 0,25 mol/l (5.16).
9.7 Pour les aliments minéraux et les prémélanges
Pour les activités phytasiques supérieures à 10 000 U/kg, dans les aliments minéraux et les prémélanges,
mais inférieures à 2 000 000 U/kg:
— centrifuger (6.8) 2 ml de l’extrait issu de 8.2 pendant 3 min entre 11 000 g et 20 000 g.
— le surnageant est utilisé conformément au Tableau 5.
Tableau 5 — Volumes pour aliments minéraux et prémélanges
Activité attendue de Volume d’extrait Volume de tampon Activité dans la Facteur de dilution
l’échantillon pour la réaction dans la réaction D pour le
réaction calcul
U/kg µl µl U
a
10 000 à 25 000 300 100 0,003 à 0,007 5 1,33
25 000 à 50 000 200 200 0,005 à 0,01 2
50 000 à 200 000 100 300 0,005 à 0,02 4
> 200 000 100 300 Dilution adaptée
a
Pour augmenter la différence d’absorption, du fait de concentrations en phosphate élevées dans l’échantillon, sur l’intervalle
compris entre 10 000 U/kg et 25 000 U/kg, le volume
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
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