ISO 17180:2013
(Main)Animal feeding stuffs — Determination of lysine, methionine and threonine in commercial amino acid products and premixtures
Animal feeding stuffs — Determination of lysine, methionine and threonine in commercial amino acid products and premixtures
ISO 17180:2013 specifies a method for the quantitative determination of free (non-protein-bound) lysine, methionine, and threonine in commercial products and premixtures containing more than about 10 % mass fraction of the respective amino acid. It does not distinguish between d- and l-forms.
Aliments des animaux — Détermination de la teneur en lysine, méthionine et thréonine dans les acides aminés industriels et les pré-mélanges
L'ISO 17180:2013 spécifie une méthode de détermination quantitative de la lysine, la méthionine et la thréonine libres (non liées aux protéines) dans les produits industriels et les pré-mélanges contenant plus de 10 % (fraction massique) environ de l'acide aminé considéré. Elle ne fait pas de distinction entre les formes D et L.
General Information
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 17180
First edition
2013-04-15
Animal feeding stuffs —
Determination of lysine, methionine
and threonine in commercial amino
acid products and premixtures
Aliments des animaux — Détermination de la teneur en lysine,
méthionine et thréonine dans les acides aminés industriels et les pré-
mélanges
Reference number
©
ISO 2013
© ISO 2013
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Principle . 1
3 Reagents and materials . 1
4 Apparatus . 3
5 Procedure. 4
5.1 Preparation of samples . 4
5.2 Number of prepared extracts . 4
5.3 Extraction using dilution by weighing . 4
5.4 Extraction using volumetric dilution . 5
5.5 Chromatography . 5
6 Calculation of results . 5
6.1 Principle of the method and control of the calibration . 5
6.2 Calculation if dilution by weighing is applied . 6
6.3 Calculation if volumetric dilution is applied . 6
7 Precision . 7
7.1 Interlaboratory test. 7
7.2 Repeatability . 7
7.3 Reproducibility . 8
8 Test report . 8
Annex A (informative) Data gathered from collaborative study . 9
Bibliography .11
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International
Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies
casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 17180 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 10, Animal
feeding stuffs.
iv © ISO 2013 – All rights reserved
INTERNATIONAL STANDARD ISO 17180:2013(E)
Animal feeding stuffs — Determination of lysine,
methionine and threonine in commercial amino acid
products and premixtures
WARNING — This document can involve the use of hazardous materials, operations, and
equipment. This document does not purport to address all the safety risks associated with its use.
It is the responsibility of the user of this document to establish appropriate safety and healthy
practices and determine the applicability of local regulatory limitations prior to use.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the quantitative determination of free (non-protein-
bound) lysine, methionine, and threonine in commercial products and premixtures containing more than
about 10 % mass fraction of the respective amino acid. It does not distinguish between d- and l-forms.
NOTE For the purposes of this International Standard, the term “amino acids” used in Clause 2 onwards
refers to lysine, methionine, and threonine.
2 Principle
The samples are treated in dilute hydrochloric acid and then diluted with sodium citrate buffer. Norleucine
internal standard is added and the amino acids are separated by an amino acid analyser or high performance
liquid chromatography (HPLC), using a cation exchange resin and sodium citrate buffer eluent solutions.
The amino acids are measured colourimetrically following post-column reaction with ninhydrin reagent
or by fluorescence detection after post-column reaction with ortho-phthaldialdehyde (OPA).
3 Reagents and materials
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
3.1 Water, double distilled water or equivalent purity (conductivity <10 µS/cm).
3.2 Standard substances.
3.2.1 Lysine·HCl crystals, purity superior to 99 % mass fraction dried under vacuum in a desiccator
for 2 days over P O prior to use.
2 5
3.2.2 Threonine crystals, purity superior to 99 % mass fraction dried under vacuum in a desiccator
for 2 days over P O prior to use.
2 5
3.2.3 Methionine crystals, purity superior to 99 % mass fraction dried under vacuum in a desiccator
for 2 days over P O prior to use.
2 5
3.3 Norleucine crystals, for use as internal standard, purity superior to 99 % dried under vacuum in a
desiccator for 2 days over P O prior to use.
2 5
3.4 Sodium hydroxide solution, c(NaOH) = 7,5 mol/l, for pH adjustment of sodium citrate buffer.
Carefully dissolve 300 g sodium hydroxide in water (3.1) and make up to 1 l.
3.5 Hydrochloric acid, γ(HCl) = 370 g/kg.
3.6 Sodium citrate dihydrate.
3.7 2,2’–Thiodiethanol (thiodiglycol).
3.8 Phenol crystals, purity superior to 98,5 % mass fraction.
3.9 Sodium citrate buffer, pH 2,20.
Dissolve 19,61 g of sodium citrate dihydrate (3.6), 5 ml of thiodiglycol (3.7), 1 g of phenol (3.8) and
16,5 ml of HCl (3.5) in 800 ml of water. Adjust the pH to 2,2 with a few drops of HCl (3.5) or NaOH
solution (3.4). The phenol acts to preserve the buffer solution.
Sodium citrate buffer can be also prepared from citric acid and sodium chloride.
3.10 Hydrochloric acid solution, c(HCl) = 0,1mol/l.
Take 8,2 ml of HCl (3.5), dilute with approximately 900 ml of water (3.1). Mix thoroughly and make up
to 1 l with water.
3.11 Standard solutions of amino acids.
3.11.1 Internal standard substance norleucine stock solution, c(Nle) = 2,5 mmol/l.
Dissolve 0,328 g norleucine (3.3) and transfer quantitatively with 0,1 mol/l HCl (3.10) into a 1 l
volumetric flask.
Store below 5 °C for no more than 6 months.
3.11.2 Amino acids standard stock solutions, c = 2,5 mmol/l.
Prepare a standard stock solution for each molecule.
Standard solutions shall contain only the amino acid being analysed, i.e. lysine, threonine or methionine.
Commercially available mixed standard solutions, e.g. containing 18 amino acids, do not give optimal results.
Transfer 0,456 g lysine·HCl (3.2.1), 0,297 g threonine (3.2.2), and 0,373 g methionine (3.2.3) into a 1 l
volumetric flask and make up to the mark with 0,1 mol/l HCl (3.10).
Store below 5 °C for no more than 6 months.
3.11.3 Amino acids calibration solution.
3.11.3.1 Weight dilution. Weigh 2,5ml of each amino acid stock solution m (3.11.2) and 2,5 ml of
aa
norleucine stock solution m (3.11.1) into a 50 ml volumetric flask. Make up to volume with sodium
Nle
citrate buffer (3.9).
Store the solution below 5 °C for not more than 1 week.
3.11.3.2 Volume dilution. Using a pipette (4.4) or dilutor (4.7), dilute equal volumes of amino acid stock
solution (3.11.2) and norleucine solution (3.11.1) with sodium citrate buffer (3.9), e.g. 50 µl norleucine
solution and 50 µl amino acid stock solution are diluted by the dilutor to 1 000 µl with sodium citrate
buffer (3.9).
3.12 Elution buffers for cation exchanger column. Use commercially available buffers or prepare
them according to the requirements specified by the analyser manufacturer. Typically three to five
2 © ISO 2013 – All rights reserved
buffer solutions are used containing sodium citrate or carbonate and small quantities of additives and
preservatives.
3.13 Ninhydrin or OPA reagent. Use commercially available reagents or prepare them according to the
requirements specified by the analyser manufacturer.
4 Apparatus
Usual laboratory apparatus and in particular the following.
4.1 Glass beakers, of capacity 1 000 ml.
4.2 Volumetric flask, of volume 50 ml, 100 ml, 500 ml, 1 000 ml.
4.3 Graduated measuring cylinders, of volume 100 ml, 1 000 ml.
4.4 Graduated pipettes, of volume 5 ml and 10 ml.
4.5 Magnetic stirring plates or mechanical shaker.
4.6 Membrane filters 0,2 µm consisting of cellulose acetate or PVDF.
4.7 Dilutor, optional for volumetric dilution.
If derivatization is done with ninhydrin, use a volume dilution ratio of 1→20. Use a higher ratio for OPA
derivatization. Check the coefficient of variation (CV) of the dilution regularly with a balance; the CV
shall be less than 1 %.
4.8 pH meter.
4.9 Analytical balance, readability 0,1 mg.
4.10 Amino acid analyser or equivalent high performance liquid chromatography (HPLC) equipment.
4.10.1 Cation exchange resin column placed in an oven.
4.10.2 Guard column.
4.10.3 Automatic or manual injection system, able to inject volumes from 10 µl to 100 µl.
4.10.4 HPLC pumps for buffers.
4.10.5 Ninhydrin or OPA post- column derivatization pump.
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 17180
Première édition
2013-04-15
Aliments des animaux —
Détermination de la teneur en lysine,
méthionine et thréonine dans les acides
aminés industriels et les pré-mélanges
Animal feeding stuffs — Determination of lysine, methionine and
threonine in commercial amino acid products and premixtures
Numéro de référence
©
ISO 2013
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2013
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2013 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Principe . 1
3 Réactifs et matériaux . 1
4 Appareillage . 3
5 Mode opératoire. 4
5.1 Préparation des échantillons . 4
5.2 Nombre d’extraits préparés . 4
5.3 Extraction utilisant une dilution par pesée . 4
5.4 Extraction par dilution volumétrique . 5
5.5 Chromatographie . 5
6 Calcul des résultats . 5
6.1 Principe de la méthode et contrôle de l’étalonnage . 5
6.2 Calcul en cas de dilution par pesée. 6
6.3 Calcul en cas de dilution volumétrique . 7
7 Fidélité . 7
7.1 Essai interlaboratoires . 7
7.2 Répétabilité . 7
7.3 Reproductibilité . 8
8 Rapport d’essai . 8
Annexe A (informative) Résultats d’une étude interlaboratoires . 9
Bibliographie .11
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives
ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de
Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote.
Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 17180 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 10,
Aliments des animaux.
iv © ISO 2013 – Tous droits réservés
NORME INTERNATIONALE ISO 17180:2013(F)
Aliments des animaux — Détermination de la teneur en
lysine, méthionine et thréonine dans les acides aminés
industriels et les pré-mélanges
AVERTISSEMENT — Le présent document peut impliquer l’emploi de produits et la mise en œuvre
de modes opératoires et d’appareillages à caractère dangereux. Le présent document n’a pas pour
but d’aborder tous les problèmes de sécurité liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur du
présent document d’établir, avant de l’utiliser, des pratiques d’hygiène et de sécurité appropriées
et de déterminer l’applicabilité des restrictions réglementaires.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination quantitative de la lysine,
la méthionine et la thréonine libres (non liées aux protéines) dans les produits industriels et les pré-
mélanges contenant plus de 10 % (fraction massique) environ de l’acide aminé considéré. Elle ne fait pas
de distinction entre les formes d et l.
NOTE Pour les besoins de la présente Norme internationale, le terme «acides aminés» utilisé à partir de
l’Article 2 désigne la lysine, la méthionine et la thréonine.
2 Principe
Les échantillons sont traités dans de l’acide chlorhydrique dilué, puis dilués dans du tampon citrate de
sodium. La norleucine, étalon interne, est ajoutée et les acides aminés sont séparés par un analyseur
d’acides aminés ou un équipement de chromatographie liquide haute performance (CLHP), par élution
avec des solutions tampons de citrate de sodium sur une résine échangeuse de cations. Les acides aminés
sont dosés par détection photométrique après réaction post-colonne avec la ninhydrine ou par détection
fluorimétrique après réaction post-colonne avec de l’ortho-phtaldialdéhyde (OPA).
3 Réactifs et matériaux
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
3.1 Eau, eau bidistillée ou de pureté équivalente (conductivité <10 µS/cm).
3.2 Substances-étalons.
3.2.1 Cristaux de lysine·HCl, de pureté supérieure à 99 % (fraction massique) séchés en dessiccateur
sous vide pendant 2 jours sur P 0 avant utilisation.
2 5
3.2.2 Cristaux de thréonine, de pureté supérieure à 99 % (fraction massique) séchés en dessiccateur
sous vide pendant 2 jours sur P 0 avant utilisation.
2 5
3.2.3 Cristaux de méthionine, de pureté supérieure à 99 % (fraction massique) séchés en dessiccateur
sous vide pendant 2 jours sur P 0 avant utilisation.
2 5
3.3 Cristaux de norleucine, pour utilisation comme substance étalon interne, de pureté supérieure à
99 % (fraction massique) séchés en dessiccateur sous vide pendant 2 jours sur P 0 avant utilisation.
2 5
3.4 Solution d’hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 7,5 mol/l pour l’ajustement du pH du tampon
citrate de sodium.
Dissoudre avec précaution 300 g d’hydroxyde de sodium dans de l’eau (3.1) et ajuster à 1 l.
3.5 Acide chlorhydrique, γ(HCl) = 370 g/kg.
3.6 Citrate de sodium dihydraté.
3.7 2,2’ –Thiodiéthanol (thiodiglycol).
3.8 Cristaux de phénol, de pureté supérieure à 98,5 % (fraction massique).
3.9 Solution tampon citrate de sodium, pH = 2,20.
Dissoudre 19,61 g de citrate de sodium dihydraté (3.6), 5 ml de thiodiglycol (3.7), 1 g de phénol (3.8) et
16,5 ml d’HCl (3.5) dans 800 ml d’eau. Ajuster le pH à 2,2 avec quelques gouttes d’HCl (3.5) ou de solution
de NaOH (3.4). Le phénol permet la conservation de la solution tampon.
La solution tampon de citrate de sodium peut aussi être préparée à partir d’acide citrique et de
chlorure de sodium.
3.10 Solution d’acide chlorhydrique, c(HCl) = 0,1 mol/l.
Diluer 8,2 ml d’HCl (3.5) dans environ 900 ml d’eau (3.1). Bien mélanger et ajuster à 1 l avec de l’eau.
3.11 Solution étalon mère des acides aminés.
3.11.1 Solution mère de norleucine substance étalon interne, c(Nle) = 2,5 mmol/l.
Dissoudre 0,328 g de norleucine (3.3) et transférer quantitativement avec de l’HCl à 0,1 mol/l (3.10) dans
une fiole jaugée de 1 l.
Conserver à une température inférieure à 5 °C pendant au maximum 6 mois.
3.11.2 Solutions mères d’acides aminés, c = 2,5 mmol/l.
Préparer une solution mère étalon pour chaque molécule.
Les solutions étalons ne doivent contenir que l’acide aminé à analyser, c’est-à-dire la lysine, la thréonine
ou la méthionine. Les solutions étalons vendues dans le commerce, contenant par exemple 18 acides
aminés, ne donnent pas de résultats optimaux.
Transférer 0,456 g de lysine·HCl (3.2.1), 0,297 g de thréonine (3.2.2) et 0,373 g de méthionine (3.2.3)
dans une fiole jaugée de 1 l et ajuster au trait avec de l’HCl à 0,1 mol/l (3.10).
Conserver à une température inférieure à 5 °C pendant au maximum 6 mois.
3.11.3 Solution d’étalonnage d’acides aminés.
3.11.3.1 Dilution par pesée. Peser 2,5 ml de chaque solution étalon mère d’acides aminés m (3.11.2)
aa
et 2,5 ml de solution mère de norleucine m (3.11.1) et transférer dans une fiole jaugée de 50 ml. Ajuster
Nle
au volume avec le tampon citrate de sodium (3.9).
Conserver la solution à une température inférieure à 5 °C pendant au maximum une semaine.
2 © ISO 2013 – Tous droits réservés
3.11.3.2 Dilution volumétrique. Au moyen d’une pipette (4.4) ou d’un diluteur (4.7), diluer des volumes
égaux de solution étalon mère d’acides aminés (3.11.2) et de solution de norleucine (3.11.1) avec du
tampon citrate de sodium (3.9), par exemple 50 μl de solution de norleucine et 50 μl de solution mère
d’acides aminés sont dilués par le diluteur à 1 000 μl avec la solution tampon de citrate de sodium (3.9).
3.12 Tampons d’élution pour colonne échangeuse de cations. Utiliser des tampons disponibles dans
le commerce ou les préparer conformément aux spécifications du fabricant de l’analyseur. En principe,
on utilise 3 à 5 solutions tampons contenant du citrate ou du carbonate de sodium et une faible quantité
d’additifs et de conservateurs.
3.13 Ninhydrine ou réactif OPA. Utiliser des réactifs disponibles dans le commerce ou les préparer
conformément aux spécifications du fabricant de l’analyseur.
4 Appareillage
Appareillage courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
4.1 Béchers en verre, d’une capacité de 1 000 ml.
4.2 Fioles jaugées, de 50 ml, 100 ml, 500 ml et 1 000 ml.
4.3 Éprouvettes graduées, de 100 ml et 1000 ml.
4.4 Pipettes graduées, de 5 ml et 10 ml.
4.5 Agitateur mécanique ou magnétique.
4.6 Filtres à membrane de 0,2 μm en acétate de cellulose ou en PVDF.
4.7 Diluteur, facultatif (utilisé pour la dilution volumétrique).
En cas d’utilisation de ninhydrine pour la dérivatisation, utiliser un rapport de dilution volumétrique de
1→20. Utiliser un rapport plus élevé pour la dérivatisation avec OPA. Vérifier régulièrement à l’aide d’une
balance le coefficient de variation (CV) de la dilution; ce coefficient de variation doit être inférieur à 1 %.
4.8 pH-mètre.
4.9 Balance analytique, ayant une précision de lecture de 0,1 mg.
4.10 Analyseur d’acides aminés ou équipement équivalent de chromatographie liquide haute
performance (CLHP).
4.10.1 Colonne à résine échangeuse de cations placée dans un four.
4.10.2 Pré-colonne.
4.10.3 Système d’injection automatique ou manuel, permettant d’injecter des volumes compris entre
10 μl et 100 μl.
4.10.4 Pompes CLHP pour solutions tampons.
4.10.5 Pompe pour les réactifs de dérivatisation post-colonne, ninhydrine ou OPA.
4.10.6 Détecteur UV réglé à 440 nm et 570 nm pour la réaction post-colonne en présence de ninhydrine
ou détecteur à fluorescence réglé à une longueur d’onde d’excitation de 330 nm et à une longueur
d’onde d’émission de 460 nm pour la réaction post-colonne en présence d’OPA.
4.10.7 Système de collecte et de traitement de données pour l’intégra
...
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 17180
Первое издание
2013-04-15
Корма для животных.
Определение содержания лизина,
метионина и треонина в коммерческих
аминокислотных продуктах и
премиксах
Aliments des animaux — Determination of lysine,
methionine and threonine in commercial amino acid
products and premixtures
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
©
ISO 2013
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO по адресу ниже или членов ISO в стране регистрации пребывания.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii
Содержание Страница
Предисловие . iv
1 Область применения . 1
2 Принцип . 1
3 Реактивы и материалы . 1
4 Аппаратура . 3
5 Процедура . 4
5.1 Подготовка проб . 4
5.2 Количество подготовленных экстрактов . 4
5.3 Экстракции с использованием разведения путем взвешивания . 4
5.4 Экстракция с использованием объемного разведения . 5
5.5 Хроматография . 5
6 Обработка результатов . 5
6.1 Принцип метода и контроль градуировки . 5
6.2 Расчет, если применяется весовое разведение . 6
6.3 Расчет, если применяется объемное разведение . 6
7 Прецизионность . 7
7.1 Межлабораторные испытания . 7
7.2 Повторяемость . 7
7.3 Воспроизводимость . 8
8 Протокол испытаний . 8
Приложение А (информативное) Данные совместных исследований . 9
Библиография . 11
iii
Предисловие
ISO (Международная организация по стандартизации) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый член организации, заинтересованный
в деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в
этом комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие
связи с ISO, также принимают участие в этих работах. ISO тесно сотрудничает с Международной
электротехнической комиссией (IEC) по всем вопросам стандартизации в области электротехники.
Международные стандарты разрабатываются в соответствии с правилами, указанными в Директивах
ISO/IEC, Часть 2.
Основная задача технических комитетов состоит в подготовке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, одобренные техническими комитетами, рассылаются членам организации
на голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения не
менее 75 % членов организации, принимающих участие в голосовании.
Следует иметь в виду, что некоторые элементы настоящего международного стандарта могут быть
объектом патентных прав. ISO не должна нести ответственность за идентификацию какого-либо
одного или всех таких патентных прав.
ISO 17180 был подготовлен Техническим комитетом ISO/ТC 34, Пищевые продукты, Подкомитетом
SC 10, Корма для животных.
iv
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 17180:2013(R)
Корма для животных.
Определение содержания лизина, метионина и треонина в
коммерческих аминокислотных продуктах и премиксах
ВНИМАНИЕ — Настоящий стандарт может включать использование опасных материалов,
операций и оборудования. Этот документ не претендует на полноту описания всех рисков для
безопасности, связанных с его использованием. Установление соответствующих правил
техники безопасности для здорового образа жизни является обязанностью пользователя
данного документа, поэтому следует определить применимость локальных нормативных
ограничений перед его использованием.
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает метод количественного определения свободных (не
входящих в состав белков) лизина, метионина и треонина в коммерческих продуктах и премиксах,
содержащих более 10 % массовой доли соответствующей аминокислоты. Он не различает D-и L-формы.
ПРИМЕЧАНИЕ Для целей настоящего международного стандарта термин "аминокислота", используемый в
пункте 2 и далее, относится к лизину, метионину и треонину.
2 Принцип
Пробы обрабатывают раствором соляной кислоты, затем разбавляют буфером цитрата натрия.
Добавляется внутренний стандарт норлейцина, аминокислоты разделяют на аминокислотном
анализаторе или высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с использованием
катионообменной смолы и буфера цитрата натрия в качестве элюента. Аминокислоты определяются
колорометрически с последующим постколоночным взаимодействием с нингидрином или по
флуоресцентному детектору после постколоночного взаимодействия с орто-фталдиальдегидом (OPA).
3 Реактивы и материалы
Используют только реактивы признанной аналитической чистоты, если не указано иное.
3.1 Вода, дважды дистиллированная или эквивалентная по чистоте (проводимость
< 10 мкСименс/см).
3.2 Стандартные вещества
3.2.1 Лизин НCl кристаллический с массовой долей основного вещества не менее 99 %,
высушенный под вакуумом в эксикаторе в течение 2 дней над P O перед использованием.
2 5
3.2.2 Треонин кристаллический с массовой долей основного вещества не менее 99 %, высушенный
под вакуумом в эксикаторе в течение 2 дней над P O перед использованием.
2 5
3.2.3 Метионин кристаллический с массовой долей основного вещества не менее 99 %,
высушенный под вакуумом в эксикаторе в течение 2 дней над P O перед использованием.
2 5
3.3 Норлейцин кристаллический для использования в качестве внутреннего стандарта чистоты не
менее 99 %, высушенный под вакуумом в эксикаторе в течение 2 дней над P O перед использованием.
2 5
3.4 Натрия гидроксида раствор, c(NaOH) = 7,5 моль/л, для корректировки рН буфера цитрата
натрия. Тщательно растворить 300 г гидроксида натрия в воде (3.1) и додоводят до1 л.
3.5 Соляная кислота, γ (HCl) = 370 г/кг.
3.6 Натрия цитрат дигидрат.
3.7 2,2′-Тиодитанол (тиодигликоль).
3.8 Фенол кристаллический с массовой долей основного вещества не менее 98,5 %.
3.9 Натрий лимоннокислый буфер, рН 2,20.
Растворить 19,61 г натрия цитрата дигидрат (3.6), 5 мл тиодигликоля (3.7), 1 г фенола (3.8) и 16,5 мл
соляной кислоты (3.5) в 800 мл воды. Регулировать рН 2,2 несколькими каплями HCl (3.5) или
раствора NaOH (3.4). Для сохранения буферного раствора используют кристаллы фенола.
Буфер цитрата натрия может быть также подготовлен с помощью лимонной кислоты и хлорида натрия.
3.10 Раствор соляной кислоты, c(HCl) = 0,1 моль/л.
Берут 8,2 мл соляной кислоты (3.5), разбавляют около 900 мл воды (3.1). Тщательно перемешивают
и доводят до 1 л водой.
3.11 Стандартные растворы аминокислот.
3.11.1 Внутренний стандартный раствор норлейцина, c(Nle) = 2,5 ммоль/л.
Растворяют 0,328 г норлейцина (3.3) и количественно переносят с 0,1 моль/л HCl (3.10) в мерную колбу 1 л.
Хранят при температуре ниже 5 °C в течение не более 6 месяцев.
3.11.2 Основные стандартные растворы аминокислот, c = 2,5 ммоль/л.
Готовят основной стандартный раствор для каждой аминокислоты
Стандартные растворы должны содержать только анализируемые аминокислоты, т.е. лизин, треонин
или метионин. Коммерчески доступны смешанные стандартные растводоводятры, например,
содержащие 18 аминокислот, но они не дают оптимальных результатов.
Переносят 0,456 г лизина·HCl (3.2.1), 0,297 г треонина (3.2.2) и 0,373 г метионина (3.2.3) в
1 л мерную колбу и доводят объем до метки 0,1 моль/л HCl (3.10).
Хранят при температуре ниже 5 C в течение не более 6 месяцев.
3.11.3 Градуировочные растворы аминокислот.
3.11.3.1 Весовое разведение. Взвешивают 2,5 мл основного стандартного раствора каждой
аминокислоты m (3.11.2) и 2,5 мл основного стандартного раствора норлейцина m (3.11.1) в
aa Nle
50 мл мерной колбе. Доводят объем до метки буфером натрия цитрата (3.9).
Хранят раствор при температуре ниже 5 °C в течение не более 1 недели.
3.11.3.2 Объемное разведение. С помощью пипетки (4.4) или дилютора (4.7), растворяют в равных
объемах основные стандартные растворы аминокислот (3.11.2) и внутренний стандартный раствор
норлейцина (3.11.1) в буфере цитрата натрия (3.9), например: 50 мкл раствора норлейцина и 50 мкл
раствора аминокислот разбавляют в дилюторе буфером цитрата натрия (3.9) до 1 000 мкл.
3.12 Элюирующие буферы для катионнообменной колонки. Используют коммерчески
доступные буферы или готовят их в соответствии с требованиями, установленными производителем
анализатора. Обычно используют от трех до пяти буферных растворов, содержащих карбонат или
цитрат натрия и небольшие количества добавок или консервантов.
3.13 Нингидрин или OPA. Используют имеющиеся в продаже реагенты или готовят их в
соответствии с требования, установленные производителем анализатора.
4 Аппаратура
Обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее.
4.1 Стеклянные стаканы, вместимостью 1 000 мл.
4.2 Мерные колбы, объемом 50 мл, 100 мл, 500 мл, 1000 мл.
4.3 Мерные цилиндры, объемом 100 мл, 1 000 мл.
4.4 Градуированные пипетки, объемом 5 мл и 10 мл.
4.5 Магнитная мешалка или механический блендер.
4.6 Мембранные фильтры 0,2 мкм, состоящие из ацетата целлюлозы или PVDF.
4.7 Дилютор, дополнительно для объемного разведения.
Если дериватизация делается нингидрином, используют его водный раствор в соотношени 1:20 по
объему. Для OPA дериватизации используют более высокое разведение. Регулярно проверяют
коэффициент вариации (CV) разведеения; CVдолжно быть меньше, чем 1 %.
4.8 рН-метр.
4.9 Весы аналитические, с точностью до 0,1 мг.
4.10 Аминокислотный анализатор или аналогичное оборудование
высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
4.10.1 Колонка с катионнобменной смолой.
4.10.2 Предколонка.
4.10.3 Автоматический или ручной инжектор с объемом впрыскивания от 10 мкл до 100 мкл.
4.10.4 ВЭЖХ насосы для буферов.
4.10.5 Нингидрин или OPA постколоночный насос для дериватизации.
4.10.6 Канальный УФ-детектор, установленный на 440 нм и 570 нм для постколоночного
взаимодействия с нингидрином, или флуоресцентный детектор с длиной волны возбуждения 330 нм
и длиной волны излучения 460 нм для постколоночного взаимодействия с OPA.
4.10.7 Система регистрации и обработки данных для интеграции пиков.
5 Процедура
5.1 Подготовка проб
Пробу измельчают (в мельнице или ступке) до прохода через сито с отверстиями 0,25 мм.
Тщательно перемешивают.
5.2 Количество подготовленных экстрактов
Приготовить два разных экстракта для каждой пробы.
5.3 Экстракции с использовани
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
Loading comments...