ISO 13904:2016

DRAFT INTERNATIONAL STANDARD
ISO/DIS 13904
ISO/TC 34/SC 10 Secretariat: ISIRI
Voting begins on: Voting terminates on:
2014-12-04 2015-05-04
Animal feeding stuffs — Determination of tryptophan
content
Aliments des animaux — Détermination de la teneur en tryptophane
ICS: 65.120
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This draft has been developed within the International Organization for
Standardization (ISO), and processed under the ISO lead mode of collaboration
as defined in the Vienna Agreement.
This draft is hereby submitted to the ISO member bodies and to the CEN member
bodies for a parallel five month enquiry.
Should this draft be accepted, a final draft, established on the basis of comments
received, will be submitted to a parallel two-month approval vote in ISO and
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THEREFORE SUBJECT TO CHANGE AND MAY
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STANDARD UNTIL PUBLISHED AS SUCH.
To expedite distribution, this document is circulated as received from the
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
committee secretariat. ISO Central Secretariat work of editing and text
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL,
composition will be undertaken at publication stage.
TECHNOLOGICAL, COMMERCIAL AND
USER PURPOSES, DRAFT INTERNATIONAL
STANDARDS MAY ON OCCASION HAVE TO
BE CONSIDERED IN THE LIGHT OF THEIR
POTENTIAL TO BECOME STANDARDS TO
WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
Reference number
NATIONAL REGULATIONS.
ISO/DIS 13904:2014(E)
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TO SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS,
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RIGHTS OF WHICH THEY ARE AWARE AND TO
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ISO/DIS 13904:2014(E)

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This ISO document is a Draft International Standard and is copyright-protected by ISO. Except as
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ISO/DIS 13904
Contents Page
Foreword . iv
1 Scope . 1
2 Principle. 1
3 Reagents and materials . 1
4 Apparatus . 3
5 Procedure . 4
5.1 Preparation of samples . 4
5.2 Determination of free tryptophan (extract) . 4
5.3 Determination of total tryptophan (hydrolysates) . 5
5.4 HPLC determination . 6
6 Calculation of results . 6
6.1 Feeding stuffs . 6
6.2 Commercial pure products and premixtures containing more than 2 % of tryptophan . 7
7 Precision. 7
7.1 Interlaboratory test . 7
7.2 Repeatability . 8
7.3 Reproducibility . 8
8 Test report . 8
Annex A (informative) Results of an interlaboratory test . 9
Annex B (informative) Observations on the method . 11
Annex C (informative) Table of sample preparation : example for analyses in pure products and
premixtures . 12
Annex D Results of an interlaboratory test for tryptophan in pure products and premixtures
containing more than 2 % of tryptophan . 13
Bibliography . 14


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ISO/DIS 13904
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 13904 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 10, Animal
feeding stuffs.
This second/third/. edition cancels and replaces the first/second/. edition (), [clause(s) / subclause(s) /
table(s) / figure(s) / annex(es)] of which [has / have] been technically revised.
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DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/DIS 13904

Animal feeding stuffs — Determination of tryptophan content
1 Scope
This International Standard describes a method for determination of the total and free tryptophan (Trp) content
in feeding stuffs (e.g. complete and complementary feeds, supplementary feeds, raw materials, ingredients,
and concentrates) and determination of free tryptophan in commercial pure substances and premixtures
containing more than 2 % of tryptophan.
It does not distinguish between D- and L-forms.
2 Principle
For the determination of the total tryptophan, the sample is hydrolysed under alkaline conditions with
saturated barium hydroxide solution and heated to 110 C for 20 h. After hydrolysis, an internal standard is
added.
For the determination of free tryptophan, the sample is extracted under mild acidic conditions in the presence
of an internal standard. For commercial pure substances and premixtures containing more than 2 % of
tryptophan, it is possible to add the internal standard after the extraction because if it is added before, a large
volume of a large is necessary.
The tryptophan and the internal standard in the hydrolysate or in the extract are determined by reversed
phase C HPLC with fluorescence detection.
18
3 Reagents and materials
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
3.1 Double-distilled water, or water of equivalent purity (conductivity < 10 S/cm).
3.2 Standard substance and control substance: tryptophan (purity/content w  99 %) dried under
vacuum over phosphorus pentoxide. The product is considered as 100 % pure.
NOTE The control of the purity of the standard substance can be performed by measuring the absorbance of a
solution of tryptophan at 280 nm. Prepare a solution of about 5 mg/l in HCl 10-3 N from a stock solution and measure the
OD at 280 nm versus HCl 10-3 N. Then, the concentration of tryptophan is: C = OD/5630 * 10exp06 where:
 5630 is the molar extinction coefficient of tryptophan in water à 280 nm;
 C is expressed in mole/ l.
The standard substance purity is then: (C/C )*100 where C is the theoretical concentration of the diluted, expressed in
0 0
mole/l, about 25 mole/l.
The control of the purity is performed every 6 months of use; it shall be  99 %.
3.3 Internal standard substance: -methyltryptophan (purity/content w  99 %), dried under vacuum
over phosphorus pentoxide.
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1

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ISO/DIS 13904
3.4 Barium hydroxide octahydrate.
Care should be taken not to expose the Ba(OH) 8H O excessively to air in order to avoid formation of
2 2
BaCO , which could disturb the determination (see observation in B.3).
3
3.5 Sodium hydroxide.
3.6 Orthophosphoric acid, w = 85 %.
3.7 Concentrated hydrochloric acid,  = 1,19 g/ml.
20
3.8 Methanol, HPLC grade.
3.9 Light petroleum, boiling range 40 C to 60 C.
3.10 Sodium hydroxide solution, c = 1 mol/l.
Dissolve 40,0 g of NaOH (3.5) in water (3.1) and make up to 1 l with water (3.1).
3.11 Hydrochloric acid, c = 6 mol/l.
Take 492 ml of HCl (3.7) and make up to 1 l with water (3.1).
3.12 Hydrochloric acid, c = 1 mol/l.
Take 82 ml of HCl (3.7) and make up to 1 l with water (3.1).
3.13 Hydrochloric acid, c = 0,1 mol/l.
Take 8,2 ml of HCl (3.7) and make up to 1 l with water (3.1).
3.14 Orthophosphoric acid, c = 0,5 mol/l.
Take 34 ml of orthophosphoric acid (3.6) and make up to 1 l with water (3.1).
3.15 Concentrated tryptophan solutions (3.2), c = 0,50 g/l.
In a 500 ml volumetric flask, dissolve 0,25 g of tryptophan (3.2) (weighed to the nearest 0,1 mg) in
hydrochloric acid (3.13) and make up to the mark with hydrochloric acid (3.13). Store at approximately - 18 C
for a maximum of four weeks.
3.16 Concentrated internal standard solution, c = 0,54 g/l.
In a 500 ml volumetric flask, dissolve 0,27 g of -methyltryptophan (3.3) (weighed to the nearest 0,1 mg) in
hydrochloric acid (3.13) and make up to the mark with hydrochloric acid (3.13). Store at approximately - 18 C
for a maximum of four weeks.
3.17 Calibration standard solutions of tryptophan and internal standard.
3.17.1 Calibration standard solution for the analysis of tryptophan in feeding stuffs (c = 0,010 g/l)
Take 2,00 ml of the concentrated tryptophan solution (3.15) and 2,00 ml of concentrated internal standard
solution (-methyltryptophan) (3.16). Dilute with water (3.1) and methanol (3.8) to approximately the same
volume and to approximately the same concentration of methanol (10 % to 30 %) as the finished hydrolysate.
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2

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ISO/DIS 13904
This solution shall be prepared freshly before use.
Protect from direct sunlight during preparation.
3.17.2 Calibration standard solution of tryptophan for the analysis of tryptophan in commercial pure
substances and premixtures containing more than 2 % of tryptophan (c = 0,010 g/l)
Take 2,00 ml of the concentrated tryptophan solution (3.15) and 2,00 ml of concentrated internal standard
solution (-methyltryptophan) (3.16).
Dilute it with hydrochloric acid 0,1 mol/l (3.13) in a 100 ml volumetric flask. Fill up to the mark.
This solution shall be prepared freshly before use
Protect from direct sunlight during preparation
NOTE For verification of the calibration standard solution it is possible to use a control solution of tryptophan. This
control solution is prepared and analysed as it is described for the calibration standard solution but shall come from
another manufacturer than the standard substance (3.2). The recovery of tryptophan in the control solution sample shall
between 99 % to 101 %.
3.18 Ethanolamine  98 %.
3.19 1,1,1-Trichloro-2-methyl-2-propanol solution.
Add 1 g of 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol to 100 ml of methanol (3.8).
3.20 Mobile phase for HPLC.
Dissolve 3,00 g of acetic acid in 900 ml of water (3.1) and add 50,0 ml of 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol
solution (3.19). Adjust the pH to 5,00 using ethanolamine (3.18). Make up to 1 000 ml with water (3.1).
4 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
4.1 HPLC equipment with a spectrofluorimetric detector.
4.2 Liquid chromatographic column, 125 mm  4 mm, with C , 3 m packing, or equivalent.
18
4.3 pH-meter.
4.4 Polypropylene flask, of capacity 125 ml, with wide neck and screw cap.
4.5 Membrane filter consisting of cellulose acetate (0,45 m or 0,22 m pore size).
4.6 Autoclave, capable of being maintained at (110  2) C, [(140  10) kPa (1,4  0,1) bar].
A pressure-tight covered dish that may be put into a drying oven adjustable to (110  2) C may be used.
4.7 Mechanical shaker or magnetic stirrer.
4.8 Vortex mixer
4.9 Glassware – filters
4.10 Graduated Erlen meyers flasks: 200 ml, 250 ml, 600ml
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3

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ISO/DIS 13904
4.11 Volumetric : 100 ml, 500 ml, 1000 ml (all class A).
5 Procedure
5.1 Preparation of samples
5.1.1 Feeding stuffs
Grind the sample to pass through a 0,5 mm sieve. Samples high in moisture shall be either air-dried at a
temperature not exceeding 50 °C or freeze-dried prior to grinding. Samples with high fat content shall be
extracted with light petroleum (3.9) prior to grinding.
5.1.2 Commercial pure substances and premixtures containing more than 2 % of tryptophan
Grind the sample to pass through to a 0,25 mm sieve and homogenize it well.
5.2 Determination of free tryptophan (extract)
5.2.1 Feeding stuffs
Weigh, to the nearest 1 mg, an appropriate amount (1 g to 5 g) of the prepared sample (5.1.1) into a conical
flask. Add 100,0 ml of hydrochloric acid, (3.13) and 5,00 ml of concentrated internal standard solution (3.16).
Shake or mix for 60 min using a mechanical shaker or a magnetic stirrer (4.7). Allow the sediment to settle
and pipette 10,0 ml of the supernatant solution into a beaker. Add 5 ml of orthophosphoric acid (3.14). Adjust
the pH to 3,0 using sodium hydroxide (3.10). Add sufficient methanol (3.8) to give a concentration of between
10 % and 30 % of methanol in the final volume. Transfer to a volumetric flask of appropriate volume and dilute
with water (3.1) to a volume necessary for the chromatography [approximately the same volume as the
calibration standard solution (3.17.1)].
Filter a few millilitres of the solution through a 0,45 m membrane filter (4.5) before injection on the HPLC
column. Proceed to the chromatography step according to 5.4.
Protect the standard solution and extracts against direct sunlight. If it is not possible to analyse the
hydrolysates the same day, they may be stored at 5 C for a maximum of three days
5.2.2 Commercial pure substances and premixtures containing more than 2 % of tryptophan
Weigh to the nearest of 0,1 mg, 0,5 g to 5 g of well homogenized sample (5.1.2), depending on the expected
concentration of tryptophan in the sample (in accordance with Table 1) into a 1000 ml volumetric flask.
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4

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ISO/DIS 13904
Table 1 — Sample weight according to the expected value of free Tryptop
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 13904
Deuxième édition
2016-02-15
Aliments des animaux — Dosage du
tryptophane
Animal feeding stuffs — Determination of tryptophan content
Numéro de référence
ISO 13904:2016(F)
©
ISO 2016

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ISO 13904:2016(F)

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ISO 13904:2016(F)

Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Principe . 1
3 Réactifs et matériaux . 1
4 Appareillage . 3
5 Mode opératoire. 4
5.1 Préparation des échantillons . 4
5.1.1 Aliments . 4
5.1.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 %
de tryptophane . 4
5.2 Dosage du tryptophane libre (extrait) . 4
5.2.1 Aliments . 4
5.2.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 %
de tryptophane . 4
5.3 Dosage du tryptophane total (hydrolysats) . 5
5.4 Dosage par CLHP . 5
6 Calcul des résultats . 6
6.1 Aliments . 6
6.2 Produits purs du commerce et prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane . 6
6.2.1 Contrôle de l’étalonnage . 6
6.2.2 Calcul . 7
7 Fidélité . 7
7.1 Essai interlaboratoires . 7
7.1.1 Aliments . 7
7.1.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 %
de tryptophane . 7
7.2 Répétabilité . 7
7.2.1 Aliments . 7
7.2.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 %
de tryptophane . 7
7.3 Reproductibilité . 8
7.3.1 Aliments . 8
7.3.2 Substances pures et prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane . 8
8 Rapport d’essai . 8
Annexe A (informative) Résultats d’un essai interlaboratoires . 9
Annexe B (informative) Observations sur la méthode .11
Annexe C (informative) Préparation des échantillons: Exemples portant sur des analyses
dans des produits purs et des prémélanges .12
Annexe D (informative) Résultats d’un essai interlaboratoires portant sur le tryptophane
dans les produits purs et les prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane .13
Bibliographie .15
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ISO 13904:2016(F)

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer
un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 10, Aliments des animaux.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 13904:2005), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
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NORME INTERNATIONALE ISO 13904:2016(F)
Aliments des animaux — Dosage du tryptophane
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale décrit une méthode de dosage du tryptophane total et libre (Trp)
dans les aliments pour animaux (par exemple aliments complets et complémentaires, compléments
alimentaires, matières premières, ingrédients et concentrés) et une méthode de dosage du tryptophane
libre dans les substances pures du commerce et les prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane.
Elle ne fait pas la distinction entre les formes D et L.
2 Principe
Pour le dosage du tryptophane total, l’échantillon est hydrolysé en milieu alcalin avec une solution
d’hydroxyde de baryum saturé et il est chauffé à 110 °C pendant 20 h. Après l’hydrolyse, un étalon
interne est ajouté.
Pour le dosage du tryptophane libre, l’échantillon est extrait en milieu légèrement acide en présence
d’un étalon interne. Pour les substances pures du commerce et les prémélanges contenant plus de 2 %
de tryptophane, il est possible d’ajouter l’étalon interne après l’extraction.
Le tryptophane et l’étalon interne dans l’hydrolysat ou l’extrait sont déterminés par CLHP avec une
séparation en phase inverse sur colonne C et détection fluorimétrique.
18
3 Réactifs et matériaux
Sauf spécification contraire, n’utiliser que des réactifs de qualité analytique reconnue.
3.1 Eau bidistillée, ou de pureté équivalente (conductivité < 10 µS/cm).
3.2 Substance étalon et substance de contrôle: tryptophane (pureté/teneur w ≥ 99 %) séché sous
vide sur du pentoxyde de phosphore. Le produit est considéré comme pur à 100 %.
Les deux produits sont considérés comme purs à 100 %. La substance de contrôle doit provenir d’un
autre fabricant que celui de la substance étalon (voir 3.17.2).
NOTE Le contrôle de pureté de la substance étalon peut être réalisé en mesurant l’absorbance d’une solution de
-3
tryptophane à 280 nm. Préparer une solution d’environ 5 mg/l dans de l’HCl à 10 N à partir d’une solution mère et
-3
mesurer l’absorbance OD à 280 nm par rapport à de l’HCl à 10 N. La concentration du tryptophane est alors:
+06
C = OD/5 630 * 10
où
5 630 est le coefficient d’extinction molaire du tryptophane dans l’eau à 280 nm;
C    est exprimée en μmol/l.
La pureté de la substance étalon est alors (C/C )*100 où C est la concentration théorique de la solution diluée,
0 0
exprimée en μmol/l, égale à environ 25 μmol/l.
Le contrôle de pureté est réalisé tous les six mois; la pureté doit être ≥ 99 %.
3.3 Substance étalon interne: α-méthyl-tryptophane (pureté ≥ 99 %), séché sous vide sur du
pentoxyde de phosphore.
© ISO 2016 – Tous droits réservés 1

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ISO 13904:2016(F)

3.4 Hydroxyde de baryum octahydraté.
Il convient de veiller à ne pas exposer excessivement le Ba(OH) ⋅8H O à l’air afin d’éviter la formation de
2 2
BaCO , qui peut perturber le dosage (voir l’observation en B.3).
3
3.5 Hydroxyde de sodium.
3.6 Acide orthophosphorique, w = 85 %.
3.7 Acide chlorhydrique concentré, ρ = 1,19 g/ml.
20
3.8 Méthanol, qualité CLHP.
3.9 Éther de pétrole, plage d’ébullition entre 40 °C et 60 °C.
3.10 Solution d’hydroxyde de sodium, c = 1 mol/l.
Dissoudre 40,0 g de NaOH (3.5) dans de l’eau (3.1) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).
3.11 Acide chlorhydrique, c = 6 mol/l.
Prélever 492 ml de HCl (3.7) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).
3.12 Acide chlorhydrique, c = 1 mol/l.
Prélever 82 ml de HCl (3.7) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).
3.13 Acide chlorhydrique, c = 0,1 mol/l.
Prélever 8,2 ml de HCl (3.7) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).
3.14 Acide orthophosphorique, c = 0,5 mol/l.
Prélever 34 ml d’acide orthophosphorique (3.6) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).
3.15 Solution mère étalon de tryptophane et solution de contrôle (3.2), c = 0,50 g/l.
Dans une fiole jaugée de 500 ml, dissoudre 0,25 g de tryptophane (3.2) (pesé à 0,1 mg près) dans de
l’acide chlorhydrique (3.13) et compléter jusqu’au trait avec de l’acide chlorhydrique (3.13). Conserver à
environ -18 °C pendant quatre semaines maximum.
3.16 Solution mère d’étalon interne, c = 0,54 g/l.
Dans une fiole jaugée de 500 ml, dissoudre 0,27 g de α-méthyl-tryptophane (3.3) (pesé à 0,1 mg près)
dans de l’acide chlorhydrique (3.13) et ajuster au trait avec de l’acide chlorhydrique (3.13). Conserver à
environ -18 °C pendant quatre semaines maximum.
3.17 Solutions d’étalonnage de tryptophane et étalon interne
3.17.1 Solution d’étalonnage pour l’analyse du tryptophane dans les aliments pour animaux,
(c = 0,010 g/l).
Prélever 2,00 ml de solution mère de tryptophane (3.15) et 2,00 ml de solution mère d’étalon interne (α
méthyl-tryptophane) (3.16). Diluer avec de l’eau (3.1) et du méthanol (3.8) approximativement au même
volume et approximativement à la même concentration de méthanol (10 % à 30 %) que l’hydrolysat final.
2 © ISO 2016 – Tous droits réservés

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ISO 13904:2016(F)

Cette solution doit être préparée avant chaque utilisation.
La protéger de l’exposition directe au soleil au cours de la préparation.
3.17.2 Solution d’étalonnage pour l’analyse du tryptophane dans les substances pures du
commerce et les prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane, (c = 0,010 g/l).
Prélever 2,00 ml de solution mère de tryptophane (3.15) et 2,00 ml de solution mère d’étalon interne
(α-méthyl-tryptophane) (3.16).
Diluer avec de l’acide chlorhydrique à 0,1 mol/l (3.13) dans une fiole jaugée de 100 ml. Compléter
jusqu’au trait.
Cette solution doit être préparée avant chaque utilisation.
La protéger de l’exposition directe au soleil au cours de la préparation.
Pour la vérification de la solution d’étalonnage, il est possible d’utiliser une solution de contrôle
de tryptophane. Cette solution de contrôle est préparée et analysée comme décrit pour la solution
d’étalonnage, mais elle doit provenir d’un autre fabricant que celui de la substance étalon (3.2). La
concentration en tryptophane dans l’échantillon de contrôle doit être comprise entre 99 % et101 %.
3.18 Éthanolamine > 98 %.
3.19 Solution de 1,1,1-trichloro-2-méthyl-2-propanol.
Ajouter 1 g de 1,1,1-trichloro-2-méthyl-2-propanol à 100 ml de méthanol (3.8).
NOTE La solution de 1,1,1-trichloro-2-méthyl-2-propanol (3.19) pourrait être considérée dangereuse pour
des raisons environnementales et peut nécessiter des dispositions particulières pour son élimination.
3.20 Phase mobile pour CLHP.
Dissoudre 3,00 g d’acide acétique dans 900 ml d’eau (3.1) puis ajouter 50,0 ml de solution de 1,1,1
trichloro-2-méthyl-2-propanol (3.19). Ajuster le pH à 5,00 à l’aide d’éthanolamine (3.18). Compléter à
1 000 ml avec de l’eau (3.1).
La durée de conservation de la phase mobile (en particulier la stabilité du mélange d’acide acétique et
d’éthanolamine) doit être contrôlée par les temps de rétention.
Voir également l’Annexe B pour une phase mobile alternative: le mélange de tampon phosphate et
de méthanol est moins onéreux et sans danger et il n’est pas nécessaire d’ajuster le pH. Le mélange
est très stable.
4 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
4.1 Équipement pour CLHP avec détecteur spectrofluorimétrique.
4.2 Colonne de chromatographie en phase liquide, 125 mm × 4 mm, avec C , particules de 3 μm,
18
ou équivalent.
4.3 pH-mètre.
4.4 Flacon en polypropylène, d’une capacité de 125 ml, à large col et bouchon à vis.
4.5 Membrane filtrante en acétate de cellulose (de 0,45 µm ou 0,22 µm de porosité).
© ISO 2016 – Tous droits réservés 3

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ISO 13904:2016(F)

4.6 Autoclave, pouvant être maintenu à (110 ± 2) °C, [(140 ± 10) kPa (1,4 ± 0,1) bar].
Un boîtier fermé étanche à la pression placé dans une étuve de séchage réglable à (110 ± 2) °C peut
être utilisé.
4.7 Agitateur mécanique ou magnétique.
4.8 Mélangeur vortex.
4.9 Verrerie – filtres.
4.10 Erlenmeyers gradués: 200 ml, 250 ml, 600 ml.
4.11 Fioles jaugées: 100 ml, 500 ml, 1 000 ml (toutes de classe A).
5 Mode opératoire
5.1 Préparation des échantillons
5.1.1 Aliments
Broyer l’échantillon pour le réduire à une granulométrie de 0,5 mm. Les échantillons à fort taux
d’humidité doivent être séchés à l’air à une température maximale de 50 °C ou par lyophilisation avant
broyage. Les échantillons à forte teneur en matières grasses doivent subir une extraction par de l’éther
de pétrole (3.9) avant broyage.
5.1.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane
Broyer l’échantillon pour le réduire à une granulométrie de 0,25 mm et bien l’homogénéiser.
5.2 Dosage du tryptophane libre (extrait)
5.2.1 Aliments
Peser, à 1 mg près, une quantité appropriée (de 1 g à 5 g) de l’échantillon préparé (5.1.1) dans un
erlenmeyer. Ajouter 100,0 ml d’acide chlorhydrique (3.13) et 5,00 ml de la solution mère d’étalon interne
(3.16). Agiter ou mélanger pendant 60 min avec un agitateur mécanique ou magnétique (4.7). Laisser
décanter le sédiment et prélever à la pipette 10,0 ml de surnageant dans un bécher. Ajouter 5 ml d’acide
orthophosphorique (3.14). Ajuster le pH à 3,0 avec l’hydroxyde de sodium (3.10). Ajouter assez de
méthanol (3.8) pour obtenir une concentration comprise entre 10 % et 30 % de méthanol dans le volume
final. Transférer dans une fiole jaugée de volume approprié et diluer avec de l’eau (3.1) j
...

PROJET
NORME ISO/FDIS
FINAL
INTERNATIONALE 13904
ISO/TC 34/SC 10
Aliments des animaux — Dosage du
Secrétariat: ISIRI
tryptophane
Début de vote:
2015-10-29
Animal feeding stuffs — Determination of tryptophan content
Vote clos le:
2015-12-29
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT
INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSER-
Veuillez consulter les notes administratives en page iii
VATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT
CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMEN-
TATION EXPLICATIVE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS
INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET COM-
Numéro de référence
MERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
ISO/FDIS 13904:2015(F)
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR POSSI-
BILITÉ DE DEVENIR DES NORMES POUVANT
SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA RÉGLEMENTA-
©
TION NATIONALE. ISO 2015

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ISO/FDIS 13904:2015(F)

TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
Le présent projet final a été élaboré dans le cadre de l’Organisation internationale de normalisation (ISO) et
soumis selon le mode de collaboration sous la direction de l’ISO, tel que défini dans l’Accord de Vienne. Le
projet final a été établi sur la base des observations reçues lors de l’enquête parallèle sur le projet.
Le projet final est par conséquent soumis aux comités membres de l’ISO et aux comités membres du CEN en
parallèle à un vote d’approbation de deux mois au sein de l’ISO et à un vote formel au sein du CEN.
Les votes positifs ne doivent pas être accompagnés d’observations.
Les votes négatifs doivent être accompagnés des arguments techniques pertinents.
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ii © ISO 2015 – Tous droits réservés

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ISO/FDIS 13904:2015(F)

Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Principe . 1
3 Réactifs et matériaux . 1
4 Appareillage . 3
5 Mode opératoire. 4
5.1 Préparation des échantillons . 4
5.1.1 Aliments . 4
5.1.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 %
de tryptophane . 4
5.2 Dosage du tryptophane libre (extrait) . 4
5.2.1 Aliments . 4
5.2.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 %
de tryptophane . 4
5.3 Dosage du tryptophane total (hydrolysats) . 5
5.4 Dosage par CLHP . 5
6 Calcul des résultats . 6
6.1 Aliments . 6
6.2 Produits purs du commerce et prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane . 6
6.2.1 Contrôle de l’étalonnage . 6
6.2.2 Calcul . 7
7 Fidélité . 7
7.1 Essai interlaboratoires . 7
7.1.1 Aliments . 7
7.1.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 %
de tryptophane . 7
7.2 Répétabilité . 7
7.2.1 Aliments . 7
7.2.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 %
de tryptophane . 7
7.3 Reproductibilité . 8
7.3.1 Aliments . 8
7.3.2 Substances pures et prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane . 8
8 Rapport d’essai . 8
Annexe A (informative) Résultats d’un essai interlaboratoires . 9
Annexe B (informative) Observations sur la méthode .11
Annexe C (informative) Préparation des échantillons: Exemples portant sur des analyses
dans des produits purs et des prémélanges .12
Annexe D (informative) Résultats d’un essai interlaboratoires portant sur le tryptophane
dans les produits purs et les prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane .13
Bibliographie .15
© ISO 2015 – Tous droits réservés iii

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ISO/FDIS 13904:2015(F)

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer
un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 10, Aliments des animaux.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 13904:2005), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
iv © ISO 2015 – Tous droits réservés

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PROJET FINAL DE NORME INTERNATIONALE ISO/FDIS 13904:2015(F)
Aliments des animaux — Dosage du tryptophane
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale décrit une méthode de dosage du tryptophane total et libre (Trp)
dans les aliments pour animaux (par exemple aliments complets et complémentaires, compléments
alimentaires, matières premières, ingrédients et concentrés) et une méthode de dosage du tryptophane
libre dans les substances pures du commerce et les prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane.
Elle ne fait pas la distinction entre les formes D et L.
2 Principe
Pour le dosage du tryptophane total, l’échantillon est hydrolysé en milieu alcalin avec une solution
d’hydroxyde de baryum saturé et il est chauffé à 110 °C pendant 20 h. Après l’hydrolyse, un étalon
interne est ajouté.
Pour le dosage du tryptophane libre, l’échantillon est extrait en milieu légèrement acide en présence
d’un étalon interne. Pour les substances pures du commerce et les prémélanges contenant plus de 2 %
de tryptophane, il est possible d’ajouter l’étalon interne après l’extraction.
Le tryptophane et l’étalon interne dans l’hydrolysat ou l’extrait sont déterminés par CLHP avec une
séparation en phase inverse sur colonne C et détection fluorimétrique.
18
3 Réactifs et matériaux
Sauf spécification contraire, n’utiliser que des réactifs de qualité analytique reconnue.
3.1 Eau bidistillée, ou de pureté équivalente (conductivité < 10 µS/cm).
3.2 Substance étalon et substance de contrôle: tryptophane (pureté/teneur w ≥ 99 %) séché sous
vide sur du pentoxyde de phosphore. Le produit est considéré comme pur à 100 %.
Les deux produits sont considérés comme purs à 100 %. La substance de contrôle doit provenir d’un
autre fabricant que celui de la substance étalon (voir 3.17.2).
NOTE Le contrôle de pureté de la substance étalon peut être réalisé en mesurant l’absorbance d’une solution de
-3
tryptophane à 280 nm. Préparer une solution d’environ 5 mg/l dans de l’HCl à 10 N à partir d’une solution mère et
-3
mesurer l’absorbance OD à 280 nm par rapport à de l’HCl à 10 N. La concentration du tryptophane est alors:
+06
C = OD/5 630 * 10
où
5 630 est le coefficient d’extinction molaire du tryptophane dans l’eau à 280 nm;
C    est exprimée en μmol/l.
La pureté de la substance étalon est alors (C/C )*100 où C est la concentration théorique de la solution diluée,
0 0
exprimée en μmol/l, égale à environ 25 μmol/l.
Le contrôle de pureté est réalisé tous les six mois; la pureté doit être ≥ 99 %.
3.3 Substance étalon interne: α-méthyl-tryptophane (pureté ≥ 99 %), séché sous vide sur du
pentoxyde de phosphore.
© ISO 2015 – Tous droits réservés 1

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ISO/FDIS 13904:2015(F)

3.4 Hydroxyde de baryum octahydraté.
Il convient de veiller à ne pas exposer excessivement le Ba(OH) ⋅8H O à l’air afin d’éviter la formation de
2 2
BaCO , qui peut perturber le dosage (voir l’observation en B.3).
3
3.5 Hydroxyde de sodium.
3.6 Acide orthophosphorique, w = 85 %.
3.7 Acide chlorhydrique concentré, ρ = 1,19 g/ml.
20
3.8 Méthanol, qualité CLHP.
3.9 Éther de pétrole, plage d’ébullition entre 40 °C et 60 °C.
3.10 Solution d’hydroxyde de sodium, c = 1 mol/l.
Dissoudre 40,0 g de NaOH (3.5) dans de l’eau (3.1) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).
3.11 Acide chlorhydrique, c = 6 mol/l.
Prélever 492 ml de HCl (3.7) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).
3.12 Acide chlorhydrique, c = 1 mol/l.
Prélever 82 ml de HCl (3.7) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).
3.13 Acide chlorhydrique, c = 0,1 mol/l.
Prélever 8,2 ml de HCl (3.7) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).
3.14 Acide orthophosphorique, c = 0,5 mol/l.
Prélever 34 ml d’acide orthophosphorique (3.6) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).
3.15 Solution mère étalon de tryptophane et solution de contrôle (3.2), c = 0,50 g/l.
Dans une fiole jaugée de 500 ml, dissoudre 0,25 g de tryptophane (3.2) (pesé à 0,1 mg près) dans de
l’acide chlorhydrique (3.13) et compléter jusqu’au trait avec de l’acide chlorhydrique (3.13). Conserver à
environ -18 °C pendant quatre semaines maximum.
3.16 Solution mère d’étalon interne, c = 0,54 g/l.
Dans une fiole jaugée de 500 ml, dissoudre 0,27 g de α-méthyl-tryptophane (3.3) (pesé à 0,1 mg près)
dans de l’acide chlorhydrique (3.13) et ajuster au trait avec de l’acide chlorhydrique (3.13). Conserver à
environ -18 °C pendant quatre semaines maximum.
3.17 Solutions d’étalonnage de tryptophane et étalon interne
3.17.1 Solution d’étalonnage pour l’analyse du tryptophane dans les aliments pour animaux,
(c = 0,010 g/l).
Prélever 2,00 ml de solution mère de tryptophane (3.15) et 2,00 ml de solution mère d’étalon interne (α
méthyl-tryptophane) (3.16). Diluer avec de l’eau (3.1) et du méthanol (3.8) approximativement au même
volume et approximativement à la même concentration de méthanol (10 % à 30 %) que l’hydrolysat final.
2 © ISO 2015 – Tous droits réservés

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ISO/FDIS 13904:2015(F)

Cette solution doit être préparée avant chaque utilisation.
La protéger de l’exposition directe au soleil au cours de la préparation.
3.17.2 Solution d’étalonnage pour l’analyse du tryptophane dans les substances pures du
commerce et les prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane, (c = 0,010 g/l).
Prélever 2,00 ml de solution mère de tryptophane (3.15) et 2,00 ml de solution mère d’étalon interne
(α-méthyl-tryptophane) (3.16).
Diluer avec de l’acide chlorhydrique à 0,1 mol/l (3.13) dans une fiole jaugée de 100 ml. Compléter
jusqu’au trait.
Cette solution doit être préparée avant chaque utilisation.
La protéger de l’exposition directe au soleil au cours de la préparation.
Pour la vérification de la solution d’étalonnage, il est possible d’utiliser une solution de contrôle
de tryptophane. Cette solution de contrôle est préparée et analysée comme décrit pour la solution
d’étalonnage, mais elle doit provenir d’un autre fabricant que celui de la substance étalon (3.2). La
concentration en tryptophane dans l’échantillon de contrôle doit être comprise entre 99 % et101 %.
3.18 Éthanolamine > 98 %.
3.19 Solution de 1,1,1-trichloro-2-méthyl-2-propanol.
Ajouter 1 g de 1,1,1-trichloro-2-méthyl-2-propanol à 100 ml de méthanol (3.8).
NOTE La solution de 1,1,1-trichloro-2-méthyl-2-propanol (3.19) pourrait être considérée dangereuse pour
des raisons environnementales et peut nécessiter des dispositions particulières pour son élimination.
3.20 Phase mobile pour CLHP.
Dissoudre 3,00 g d’acide acétique dans 900 ml d’eau (3.1) puis ajouter 50,0 ml de solution de 1,1,1
trichloro-2-méthyl-2-propanol (3.19). Ajuster le pH à 5,00 à l’aide d’éthanolamine (3.18). Compléter à
1 000 ml avec de l’eau (3.1).
La durée de conservation de la phase mobile (en particulier la stabilité du mélange d’acide acétique et
d’éthanolamine) doit être contrôlée par les temps de rétention.
Voir également l’Annexe B pour une phase mobile alternative: le mélange de tampon phosphate et
de méthanol est moins onéreux et sans danger et il n’est pas nécessaire d’ajuster le pH. Le mélange
est très stable.
4 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
4.1 Équipement pour CLHP avec détecteur spectrofluorimétrique.
4.2 Colonne de chromatographie en phase liquide, 125 mm × 4 mm, avec C , particules de 3 μm,
18
ou équivalent.
4.3 pH-mètre.
4.4 Flacon en polypropylène, d’une capacité de 125 ml, à large col et bouchon à vis.
4.5 Membrane filtrante en acétate de cellulose (de 0,45 µm ou 0,22 µm de porosité).
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ISO/FDIS 13904:2015(F)

4.6 Autoclave, pouvant être maintenu à (110 ± 2) °C, [(140 ± 10) kPa (1,4 ± 0,1) bar].
Un boîtier fermé étanche à la pression placé dans une étuve de séchage réglable à (110 ± 2) °C peut
être utilisé.
4.7 Agitateur mécanique ou magnétique.
4.8 Mélangeur vortex.
4.9 Verrerie – filtres.
4.10 Erlenmeyers gradués: 200 ml, 250 ml, 600 ml.
4.11 Fioles jaugées: 100 ml, 500 ml, 1 000 ml (toutes de classe A).
5 Mode opératoire
5.1 Préparation des échantillons
5.1.1 Aliments
Broyer l’échantillon pour le réduire à une granulométrie de 0,5 mm. Les échantillons à fort taux
d’humidité doivent être séchés à l’air à une température maximale de 50 °C ou par lyophilisation avant
broyage. Les échantillons à forte teneur en matières grasses doivent subir une extraction par de l’éther
de pétrole (3.9) avant broyage.
5.1.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane
Broyer l’échantillon pour le réduire à une granulométrie de 0,25 mm et bien l’homogénéiser.
5.2 Dosage du tryptophane libre (extrait)
5.2.1 Aliments
Peser, à 1 mg près, une quantité appropriée (de 1 g à 5 g) de l’échantillon préparé (5.1.1) dans un
erlenmeyer. Ajouter 100,
...