ISO 20184-1:2018
(Main)Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-examination processes for frozen tissue — Part 1: Isolated RNA
Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-examination processes for frozen tissue — Part 1: Isolated RNA
This document gives guidelines on the handling, documentation, storage and processing of frozen tissue specimens intended for RNA examination during the pre-examination phase before a molecular assay is performed. This document is applicable to any molecular in vitro diagnostic examination performed by medical laboratories and molecular pathology laboratories that evaluate RNA extracted from frozen tissue. It is also intended to be used by laboratory customers, in vitro diagnostics developers and manufacturers, biobanks, institutions and commercial organisations performing biomedical research, and regulatory authorities. Tissues that have undergone chemical stabilization pre-treatment before freezing are not covered in this document. NOTE International, national or regional regulations or requirements can also apply to specific topics covered in this document.
Analyses de diagnostic moléculaire in vitro — Spécifications relatives aux processus préanalytiques pour les tissus congelés — Partie 1: ARN extrait
Le présent document fournit des lignes directrices pour la manipulation, la documentation, le stockage et le traitement de prélèvements de tissus congelés destinés à l'analyse de l'ARN durant la phase préanalytique précédant la réalisation d'un essai moléculaire. Le présent document s'applique aux analyses de diagnostic moléculaire in vitro réalisées par des laboratoires de biologie médicale et des laboratoires de pathologie moléculaire qui évaluent l'ARN extrait de tissus congelés. Il est également destiné à être utilisé par des clients de laboratoires, des développeurs et fabricants de l'industrie du diagnostic in vitro, ainsi que par des biobanques, des institutions et des organismes commerciaux spécialisés en recherche biomédicale, de même que des autorités de réglementation. Le cas des tissus ayant subi un prétraitement de stabilisation chimique avant la congélation n'est pas couvert par le présent document. NOTE Des réglementations ou exigences internationales, nationales ou régionales peuvent également s'appliquer à des sujets spécifiques traités dans le présent document.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20184-1
First edition
2018-11
Molecular in vitro diagnostic
examinations — Specifications for
pre-examination processes for frozen
tissue —
Part 1:
Isolated RNA
Analyses de diagnostic moléculaire in vitro — Spécifications relatives
aux processus préanalytiques pour les tissus congelés —
Partie 1: ARN extrait
Reference number
©
ISO 2018
© ISO 2018
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Fax: +41 22 749 09 47
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Published in Switzerland
ii © ISO 2018 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 General considerations . 5
5 Outside the laboratory . 5
5.1 Specimen collection . 5
5.1.1 General. 5
5.1.2 Information about the specimen donor/patient . 6
5.1.3 Information about the specimen . 6
5.1.4 Specimen processing . 6
5.2 Fresh tissue transport requirements . 7
5.2.1 General. 7
5.2.2 Preparations for the transport . 7
5.2.3 During transport . 7
6 Inside the laboratory . 7
6.1 Information about the reception of the specimen . 7
6.2 Evaluation of the pathology of the specimen and selection of the sample(s) . 8
6.3 Freezing of the specimen or sample(s) . 8
6.4 Storage requirements .10
6.5 Isolation of RNA .11
6.5.1 General.11
6.5.2 Requirements and recommendations .11
6.5.3 Using commercial kits .12
6.5.4 Using the laboratories own protocols .12
6.6 Quantity and quality assessment of isolated RNA .12
6.7 Storage of isolated RNA .12
6.7.1 General.12
6.7.2 Using commercially available kits for RNA isolation .13
6.7.3 Using the laboratory's own protocols for RNA isolation .13
Annex A (informative) Impact of pre-examination variables on RNA profiles obtained from
frozen liver tissue samples collected during and after routine surgery .14
Bibliography .18
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso
.org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 212, Clinical laboratory testing and in
vitro diagnostic test systems.
A list of all parts in the ISO 20184 can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
iv © ISO 2018 – All rights reserved
Introduction
Molecular in vitro diagnostics, including molecular pathology, has enabled a significant progress in
medicine. Further progress is expected with new technologies analysing nucleic acids, proteins, and
metabolites in human tissues and body fluids. However, the profiles and/or integrity of these molecules
can change drastically during specimen collection, transport, storage, and processing thus making
the outcome from diagnostics or research unreliable or even impossible because the subsequent
examination assay will not determine the situation in the patient but an artificial profile generated
during the pre-examination process.
Therefore, a standardization of the entire process from specimen collection to the RNA examination is
needed. Studies have been undertaken to determine the important influencing factors. This document
draws upon such work to codify and standardize the steps for frozen tissue with regard to RNA
examination in what is referred to as the pre-examination phase.
RNA profiles in tissues can change drastically before, during and after collection (due to e.g. gene
induction or gene down regulation). RNA species can change differently in different donor's patients’
tissues.
Therefore, it is essential to take special measures to minimize the described RNA profile changes and
modifications within the tissue for subsequent examination.
In this document, the following verbal forms are used:
— "shall" indicates a requirement;
— "should" indicates a recommendation;
— "may" indicates a permission;
— "can" indicates a possibility or a capability.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 20184-1:2018(E)
Molecular in vitro diagnostic examinations —
Specifications for pre-examination processes for frozen
tissue —
Part 1:
Isolated RNA
1 Scope
This document gives guidelines on the handling, documentation, storage and processing of frozen
tissue specimens intended for RNA examination during the pre-examination phase before a molecular
assay is performed.
This document is applicable to any molecular in vitro diagnostic examination performed by medical
laboratories and molecular pathology laboratories that evaluate RNA extracted from frozen tissue. It is
also intended to be used by laboratory customers, in vitro diagnostics developers and manufacturers,
biobanks, institutions and commercial organisations performing biomedical research, and regulatory
authorities.
Tissues that have undergone chemical stabilization pre-treatment before freezing are not covered in
this document.
NOTE International, national or regional regulations or requirements can also apply to specific topics
covered in this document.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 15189:2012, Medical laboratories — Requirements for quality and competence
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 15189 and the following
terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
aliquot
portion of a larger amount of homogenous material, assumed to be taken with negligible sampling error
Note 1 to entry: The term is usually applied to fluids. Tissues are heterogeneous and therefore cannot be
aliquoted.
Note 2 to entry: The definition is derived from References [22], [23] and [24].
3.2
ambient temperature
unregulated temperature of the surrounding air
3.3
analyte
component represented in the name of a measurable quantity
[SOURCE: ISO 17511:2003, 3.2]
3.4
analytical test performance
accuracy, precision, and sensitivity of a test to measure the analyte of interest
Note 1 to entry: Other test performance characteristics such as robustness, repeatability can apply as well.
3.5
cold ischemia
condition after removal of the tissue from the body until stabilization or fixation
3.6
diagnosis
identification of a health or disease state from its signs and/or symptoms, where the diagnostic process
can involve examinations and tests for classification of an individual's condition into separate and
distinct categories or subclasses that allow medical decisions about treatment and prognosis to be made
3.7
DNA
deoxyribonucleic acid
polymer of deoxyribonucleotides occurring in a double-stranded (dsDNA) or single-stranded
(ssDNA) form
[SOURCE: ISO 22174:2005, 3.1.2]
3.8
DNase
deoxyribonuclease
enzyme that catalyzes the degradation of DNA into smaller components
3.9
examination
analytical test
set of operations having the object of determining the value or characteristics of a property
Note 1 to entry: Processes that start with the isolated analyte and include all kinds of parameter testing or
chemical manipulation for quantitative or qualitative examination.
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.7, modified — Notes to entry 1 to 3 have been removed, Note 1 to entry has
been added and “analytical test” has been added as a preferred term.]
3.10
grossing
gross examination
inspection of pathology specimens with the bare eye to obtain diagnostic information, while being
processed for further microscopic examination
3.11
homogeneous
uniform in structure and composition
2 © ISO 2018 – All rights reserved
3.12
interfering substances
endogenous substances of a specimen/sample or exogenous substances (e.g. stabilization solution) that
can alter an examination result
3.13
pre-examination processes
preanalytical phase
preanalytical workflow
processes that start, in chronological order, from the clinician’s request and include the examination
request, preparation and identification of the patient, collection of the primary sample(s), transportation
to and within the medical or pathology laboratory, isolation of analytes, and end when the analytical
examination begins
Note 1 to entry: The pre-examination phase includes preparative processes that influence the outcome of the
intended examination.
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.15, modified — “pre-analytical workflow” has been added as a preferred
term, Note 1 to entry has been added and the definition has been extended.]
3.14
primary sample
specimen
discrete portion of a body fluid, breath, hair or tissue taken for examination, study or analysis of one or
more quantities or properties assumed to apply for the whole
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.16, modified — Notes to entry 1 to 3 have been removed.]
3.15
proficiency test
evaluation of participant performance against pre-established criteria by means of inter-laboratory
comparisons
[SOURCE: ISO 17043:2010, 3.7, modified — Notes to entry 1 and 2 have been removed.]
3.16
RNA profile
amounts of the individual RNA molecules that are present in a sample and that can be measured in the
absence of any losses, inhibition and interference
3.17
RNA
ribonucleic acid
polymer of ribonucleotides occurring in a double-stranded or single-stranded form
[SOURCE: ISO 22174:2005, 3.1.3]
3.18
RNase
ribonuclease
enzyme that catalyses the degradation of RNA into smaller components
3.19
room temperature
for the purposes of this document, temperature in the range of 18 °C to 25 °C
Note 1 to entry: Local or national regulations can have different definitions.
3.20
sample
one or more parts taken from a primary sample
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.24, modified — EXAMPLE has been removed.]
3.21
stability
characteristic of a sample material, when stored under specified conditions, to maintain a specified
property value within specified limits for a specified period of time
Note 1 to entry: The analyte for the purpose of this document is isolated RNA.
[SOURCE: ISO Guide 30:2015, 2.1.15, modified — “reference material” has been replaced by “sample
material”, “characteristic” has been replaced by “ability” and Note 1 to entry has been changed.]
3.22
storage
prolonged interruption of the pre-analytical workflow of a sample or analyte respectively, or of their
derivatives e.g., stained sections or tissue blocks, under appropriate conditions in order to preserve
their properties
Note 1 to entry: Long-term storage typically occurs in laboratory archives or in biobanks.
3.23
validation
confirmation, throughout the provision of objective evidence, that the requirements for a specific
intended use or application have been fulfilled
Note 1 to entry: The term “validated” is used to designate the corresponding status.
[SOURCE: ISO 9000:2015, 3.8.13, modified — Notes to entry 1 and 3 have been removed.]
3.24
verification
confirmation, through provision of objective evidence, that specified requirements have been fulfilled
Note 1 to entry: The term “verified” is used to designate the corresponding status.
[SOURCE: ISO 9000:2015, 3.8.12, modified — Note 1 and Note 2 where not taken over.]
Note 2 to entry: Confirmation can comprise activities such as:
— performing alternative calculations;
— comparing a new design specification with a similar proven design specification;
— undertaking tests and demonstrations;
— reviewing documents prior to issue.
3.25
warm ischemia
condition before the tissue is removed from the body, but where it is deprived of its normal blood supply
3.26
workflow
series of activities necessary to complete a task
4 © ISO 2018 – All rights reserved
4 General considerations
For general statements on medical laboratory quality management systems and in particular on
specimen collection, reception and handling (including avoidance of cross contaminations) see
ISO 15189:2012, 4.2, 5.4.4, 5.4.6 or ISO/IEC 17020:2012, Clause 8 and 7.2. The requirements on
laboratory equipment, reagents, and consumables in accordance with ISO 15189:2012, 5.3 shall be
followed; ISO 15189:2012, 5.5.1.2 and 5.5.1.3, and ISO/IEC 17020:2012, 6.2 can also apply.
All steps of a diagnostic workflow can influence the final analytical test result. Thus, the entire
workflow including biomolecule stability and sample storage conditions shall be verified and validated.
Workflow steps which cannot always be controlled (e.g. warm ischemia) shall be documented. A risk
assessment of non-controllable workflow steps including their potential impact on the analytical test
performance shall be performed and mitigation measures shall be established to enable the required
analytical test performance.
Before or during the design of an analytical test, it should therefore be investigated and assured that the
RNA profile(s) intended to be analysed is/are not compromised in a manner impacting the analytical
test performance (e.g. by performing a time course experiment or study; see also Annex A).
Before tissues are stabilized by freezing, the RNA profile(s) can change e.g. by gene induction, gene
down regulation and RNA degradation. These effects depend on the warm and cold ischemia duration
and the ambient temperature before freezing. In addition, the described effects can vary in different
donors'/patients' tissues.
Generally, the longer the duration of warm and cold ischemia and the higher the ambient temperature
before freezing the tissue specimen, the higher is the risk that changes in the RNA profile can occur.
NOTE Intraoperative warm ischemia can result in more pronounced changes of RNA profiles than during
[7][8]
postoperative cold ischemia . RNA profiles can also vary, depending on the origin and type of tissue, the
underlying disease, the surgical procedure, the drug regimen, and drugs administered for anaesthesia or
treatment of concomitant disease and on the different environmental conditions after the tissue removal from
the body.
As warm ischemia cannot be easily standardized, its duration shall be documented. When it is not
possible to avoid cold ischemia, duration shall be documented and temperatures of the specimen
container's surroundings should be documented. Where the specimen is transported to another facility
for freezing, the transport duration shall be documented and the ambient conditions should also be
documented.
Safety instructions on transport and handling shall be considered (see ISO 15189:2012, 5.2.3 and 5.4.5
and ISO 15190).
During the whole pre-examination process precautions shall be taken to avoid cross contamination
between different specimens/samples, e.g. by using single-use material whenever feasible or
appropriate cleaning procedures between processing of different specimens/samples.
If a commercial product is not used in accordance with the manufacturer’s instructions, responsibility
for its use and performance lies with the user.
5 Outside the laboratory
5.1 Specimen collection
5.1.1 General
For the collection of the specimen, the requirements (e.g. disease condition, specimen size) for the
intended molecular examination (see also Clause 6) should be considered.
See also ISO 15189:2012, 5.4.4.
5.1.2 Information about the specimen donor/patient
The documentation shall include the ID of the specimen donor/patient, which can be in the form of a code.
The documentation should include, but is not limited to:
a) the relevant health status of the specimen donor/patient (e.g. healthy, disease type, concomitant
disease, demographics [e.g. age and gender]);
b) the information about routine medical treatment and special treatment prior to tissue collection
(e.g. anaesthetics, medications, surgical or diagnostic procedures);
c) the appropriate consent from the specimen donor/patient.
5.1.3 Information about the specimen
The documentation shall include, but is not limited to:
a) the start of ischemia within the body (warm ischemia) by documentation of the ischemia-relevant
vessel ligation/clamping time point (usually arterial clamping time);
NOTE Not needed where small tissue biopsy resection for freezing is performed.
b) the time and date when tissue is removed from the body and the method of removal (e.g. core-
needle biopsy, resection, biopsy device used for the collection);
c) the description of tissue type and origin, tissue condition (e.g. diseased, unaffected by the disease),
including references to any marking applied in or outside the operating theatre made by surgeon,
radiologist or pathologist.
If the freezing of the tissue is performed outside the laboratory, the documentation of steps described
under 6.2, where pathology evaluation is required, and 6.3 has to be performed.
The documentation should also include the ID of the responsible person collecting the specimen.
5.1.4 Specimen processing
Tissues that need to be frozen for diagnostic purposes can originate from a large tissue specimen or
can be a small tissue specimen like biopsies e.g. taken by endoscopy or taken from patients during a
surgical procedure where fast frozen section diagnosis is required.
Post-mortem tissues can be frozen for diagnostic purposes. However, preservation of RNA is dependent
on the time interval between death and autopsy and the temperature of storage of the body after death.
Any additions or modifications to the specimen after removal from the body (e.g. labelling for the
orientation of the specimen [e.g. ink-marking, stitches, incision(s)]) shall be documented.
Where a pathology diagnosis is required on the specimen, sampling shall be performed by or under
supervision or guidance of a medically qualified (e.g. board certified) pathologist (see 6.2).
Where the specimen was removed without the requirement of pathology diagnosis, the evaluation,
selection and documentation of specimens may be done by other qualified persons than pathologists.
The freezing of the specimen or samples taken from the specimen can be performed outside the
laboratory or inside the laboratory.
Cold ischemia can influence the RNA profile; therefore direct freezing should be preferred.
a) In case the specimen or sample is frozen outside the laboratory, proceed with 6.2 without delay.
6 © ISO 2018 – All rights reserved
b) In case the specimen or sample is frozen inside the laboratory, fresh tissue specimens need to be
transported to the laboratory. The steps described under 5.2 for fresh tissue transport shall be
performed without delay.
5.2 Fresh tissue transport requirements
5.2.1 General
Where transport of the specimen or sample to the laboratory is required for freezing, the laboratory
in collaboration with the clinical or surgery department shall establish a protocol for the transport
procedure of the specimen.
5.2.2 Preparations for the transport
The following steps shall be performed:
a) the selection and use of containers and packages (e.g. cooling box, box for storing and transportation,
vacuum packaging) according to applicable transport regulations;
b) the selection and use of stabilization procedures (e.g. cooling methods) for transport;
NOTE Accidentally freezing the tissue (e.g. by using cool packs in a wrong manner) will lead to RNA
degradation when the tissue thaws. It can also impact the morphological characterization.
c) the labelling of the container (e.g. registration-number, barcode, specimen type, quantity, and
organ tissue of origin) and additional documentation [information as specified in 5.1.2, 5.1.3, and
5.1.4 and 5.2.2 a) and b)].
Several specimens from the same patient/donor sharing similar features (macroscopic appearance,
tissue type, disease status, anatomical location) may be put into a single container/container
compartment.
Specimens should be transferred without delay into the container after the removal from the body. The
container should then be kept on wet-ice or at 2 °C to 8 °C in order to minimize RNA profile changes.
The temperatures of the container's surroundings during cold ischemia (e.g. temperatures in different
rooms, transport) should be documented. If the temperature is not measured, the temperature range
should be estimated by classification as ambient temperature, room temperature, or at 2 °C to 8 °C.
5.2.3 During transport
Temperature monitoring should be applied in a suitable manner.
If the specimen is not already frozen, it should be transported on wet-ice or at 2 °C to 8 °C without delay
in order to minimize changes to the RNA profile.
NOTE There is evidence that RNA in tissues can be stabilized in plastic bags under vacuum when kept at 0 °C
[9]
to 4 C° during transport before the samples are archived for biobanks or used for histopathological evaluation .
The compliance with the protocol for the transport procedure shall be documented. Any deviations
from the protocol shall be described and documented.
6 Inside the laboratory
6.1 Information about the reception of the specimen
The name of the person receiving the specimen shall be documented. The specimen arrival date
and time, and conditions (e.g. labelling, transport conditions including temperature, tissue type
and quantity of the specimen, leaking/breaking of the container) of the received specimens shall be
ISO 2
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 20184-1
Première édition
2018-11
Analyses de diagnostic moléculaire in
vitro — Spécifications relatives aux
processus préanalytiques pour les
tissus congelés —
Partie 1:
ARN extrait
Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-
examination processes for frozen tissue —
Part 1: Isolated RNA
Numéro de référence
©
ISO 2018
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2018 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Considérations générales . 5
5 Hors du laboratoire . 6
5.1 Recueil des prélèvements . 6
5.1.1 Généralités . 6
5.1.2 Informations relatives au donneur/patient . 6
5.1.3 Informations relatives au prélèvement . 6
5.1.4 Traitement du prélèvement . . 6
5.2 Exigences relatives au transport de tissus frais . 7
5.2.1 Généralités . 7
5.2.2 Préparation pour le transport . 7
5.2.3 Au cours du transport . 8
6 Dans le laboratoire . 8
6.1 Informations relatives à la réception du prélèvement . 8
6.2 Évaluation de la pathologie du prélèvement et sélection du ou des échantillons . 8
6.3 Congélation du prélèvement, du ou des échantillons . 9
6.4 Exigences relatives au stockage .11
6.5 Extraction de l’ARN .12
6.5.1 Généralités .12
6.5.2 Exigences et recommandations. .12
6.5.3 Utilisation de kits commerciaux .13
6.5.4 Utilisation des protocoles propres aux laboratoires .13
6.6 Évaluation quantitative et qualitative de l’ARN extrait .13
6.7 Stockage de l’ARN extrait .14
6.7.1 Généralités .14
6.7.2 Utilisation de kits disponibles dans le commerce pour l’extraction de l’ARN .14
6.7.3 Utilisation des protocoles propres au laboratoire pour l’extraction de l’ARN .14
Annexe A (informative) Impact des variables préanalytiques sur les profils d’ARN obtenus
à partir d’échantillons de tissus hépatiques congelés prélevés pendant et après des
interventions chirurgicales de routine .15
Bibliographie .19
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 212, Laboratoires d’analyses de
biologie médicale et systèmes de diagnostic in vitro.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 20184 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
iv © ISO 2018 – Tous droits réservés
Introduction
Le diagnostic moléculaire in vitro, y compris la pathologie moléculaire, a permis de faire
considérablement progresser la médecine. D’autres avancées sont attendues avec les nouvelles
technologies d’analyse des acides nucléiques, des protéines et des métabolites dans les tissus
humains et les fluides corporels. Toutefois, les profils et/ou l’intégrité de ces molécules peuvent varier
considérablement au cours du prélèvement des échantillons primaires, du transport, du stockage et du
traitement, et engendrer ainsi un résultat de diagnostic ou de recherche peu fiable, voire impossible,
car l’essai analytique subséquent ne déterminera pas l’état du patient, mais un profil artificiel généré
pendant le processus préanalytique.
Par conséquent, une normalisation de l’ensemble du processus, allant du prélèvement des échantillons
primaires jusqu’à l’analyse de l’ARN, est nécessaire. Des études ont été réalisées afin de définir les
facteurs ayant un impact important. Le présent document se fonde sur ces travaux pour codifier et
normaliser les étapes des processus dits de la phase préanalytique pour tissus congelés au regard de
l’analyse de l’ARN.
Les profils d’ARN dans les tissus peuvent changer considérablement avant, pendant et après le
prélèvement (par exemple en raison de l’induction de gènes ou de la régulation à la baisse de l’expression
de gènes). Les espèces d’ARN peuvent varier différemment dans les tissus de différents donneurs/
patients.
Il est donc essentiel de prendre des mesures particulières afin de réduire le plus possible, au sein des
tissus, les changements et modifications de profil d’ARN décrits, pour l’analyse ultérieure.
Dans le présent document, les formes verbales suivantes sont utilisées:
— «doit» indique une exigence;
— «il convient de/que» indique une recommandation;
— «peut/il est admis/permis» indique une autorisation;
— «peut/il est possible» indique une possibilité ou une capacité.
NORME INTERNATIONALE ISO 20184-1:2018(F)
Analyses de diagnostic moléculaire in vitro —
Spécifications relatives aux processus préanalytiques pour
les tissus congelés —
Partie 1:
ARN extrait
1 Domaine d’application
Le présent document fournit des lignes directrices pour la manipulation, la documentation, le stockage
et le traitement de prélèvements de tissus congelés destinés à l’analyse de l’ARN durant la phase
préanalytique précédant la réalisation d’un essai moléculaire.
Le présent document s’applique aux analyses de diagnostic moléculaire in vitro réalisées par des
laboratoires de biologie médicale et des laboratoires de pathologie moléculaire qui évaluent l’ARN
extrait de tissus congelés. Il est également destiné à être utilisé par des clients de laboratoires, des
développeurs et fabricants de l’industrie du diagnostic in vitro, ainsi que par des biobanques, des
institutions et des organismes commerciaux spécialisés en recherche biomédicale, de même que des
autorités de réglementation.
Le cas des tissus ayant subi un prétraitement de stabilisation chimique avant la congélation n’est pas
couvert par le présent document.
NOTE Des réglementations ou exigences internationales, nationales ou régionales peuvent également
s’appliquer à des sujets spécifiques traités dans le présent document.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 15189:2012, Laboratoires de biologie médicale — Exigences concernant la qualité et la compétence
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l’ISO 15189 ainsi que les suivants,
s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/.
3.1
aliquote
partie d’une quantité plus importante d’un matériau homogène, prélevée avec une erreur
d’échantillonnage supposée négligeable
Note 1 à l'article: Le terme s’applique généralement à des fluides. Les tissus sont hétérogènes et ne peuvent donc
pas être aliquotés.
Note 2 à l'article: La définition est issue des Références [22],[23] et [24].
3.2
température ambiante
température non régulée de l’air environnant
3.3
analyte
composant indiqué dans le nom d’une grandeur mesurable
[SOURCE: ISO 17511:2003, 3.2]
3.4
performance analytique
l’exactitude, la précision et la sensibilité d’un essai pour mesurer l’analyte concerné
Note 1 à l'article: D’autres caractéristiques de performance d’essai, telles que la robustesse ou la répétabilité,
peuvent également s’appliquer.
3.5
ischémie froide
état d’un tissu suite à son prélèvement de l’organisme jusqu’à sa stabilisation ou sa fixation
3.6
diagnostic
identification d’un état de santé sain ou pathologique à partir de ses signes et/ou symptômes, dans
laquelle le processus de diagnostic peut impliquer des analyses et essais pour la classification de l’état
d’un individu en catégories ou sous-classes distinctes, laquelle permet la prise de décisions médicales
concernant le traitement et le pronostic à établir
3.7
ADN
acide désoxyribonucléique
polymère de désoxyribonucléotides se présentant sous la forme de double brin (ADNdb) ou de simple
brin (ADNsb)
[SOURCE: ISO 22174:2005, 3.1.2]
3.8
DNase
désoxyribonucléase
enzyme catalysant la dégradation de l’ADN en composants plus petits
3.9
analyse
phase analytique
ensemble des opérations destinées à déterminer la valeur ou les caractéristiques d’une propriété
Note 1 à l'article: Les processus débutent avec l’analyte extrait et comprennent toutes sortes d’essais
paramétriques ou une manipulation chimique en vue de réaliser l’analyse quantitative ou qualitative.
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.7, modifiée — Les Notes à l’Article 1 à 3 ont été supprimées, la Note 1 à
l’article a été ajoutée, le terme «examen» a été remplacé par «analyse» et «phase analytique» a été
ajouté comme terme privilégié.]
2 © ISO 2018 – Tous droits réservés
3.10
macroscopie
analyse macroscopique
contrôle de prélèvements pathologiques à l’œil nu, au cours de leur traitement à des fins d’analyse
microscopique ultérieure, en vue d’obtenir des informations de diagnostic
3.11
homogène
de structure et de composition uniformes
3.12
substances interférentes
substances endogènes d’un prélèvement/échantillon ou substances exogènes (par exemple solution de
stabilisation) susceptibles d’altérer le résultat d’une analyse
3.13
processus préanalytiques
phase préanalytique
flux de travail préanalytique
processus commençant chronologiquement par la prescription des analyses par le clinicien, comprenant
la demande d’analyse, la préparation et l’identification du patient, le prélèvement de l’échantillon
primaire, son acheminement jusqu’au laboratoire et au sein du laboratoire médical ou de pathologie,
l’extraction des analytes, et finissant au début de l’analyse
Note 1 à l'article: La phase préanalytique comprend des processus de préparation qui influencent le résultat de
l’analyse prévue.
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.15, modifiée — «Flux de travail préanalytique» a été ajouté comme terme
privilégié, la Note 1 à l’article a été ajoutée et la définition a été complétée.]
3.14
échantillon primaire
prélèvement
spécimen
partie discrète d’un liquide corporel, d’une haleine, d’un cheveu ou d’un tissu prélevée à des fins
d’examens, d’étude ou d’analyse d’une ou plusieurs grandeurs ou propriétés pour déterminer le
caractère de l’ensemble
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.16, modifiée — Les Notes à l’Article 1 à 3 ont été supprimées.]
3.15
essai d’aptitude
évaluation de la performance d’un participant par rapport à des critères préétablis au moyen de
comparaisons interlaboratoires
[SOURCE: ISO 17043:2010, 3.7, modifiée — Les Notes à l’Article 1 et 2 ont été supprimées.]
3.16
profil d’ARN
quantités de molécules d’ARN individuelles qui sont présentes dans un échantillon et qui peuvent être
mesurées en l’absence de toute perte, inhibition et interférence
3.17
ARN
acide ribonucléique
polymère de ribonucléotides se présentant sous la forme de double brin ou de simple brin
[SOURCE: ISO 22174:2005, 3.1.3]
3.18
RNase
ribonucléase
enzyme catalysant la dégradation de l’ARN en composants plus petits
3.19
température de laboratoire
pour les besoins du présent document, température dans la plage de 18 °C à 25 °C
Note 1 à l'article: Des réglementations locales ou nationales peuvent stipuler des définitions différentes.
3.20
échantillon
une ou plusieurs parties prélevées à partir d’un échantillon primaire
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.24, modifiée — L’EXEMPLE a été supprimé.]
3.21
stabilité
capacité d’un échantillon, lorsqu’il est entreposé dans des conditions spécifiées, à conserver une valeur
de propriété spécifiée dans des limites spécifiées pendant une période de temps spécifiée
Note 1 à l'article: L’analyte pour les besoins du présent document est composé d’ARN extrait.
[SOURCE: Guide ISO 30:2015, 2.1.15, modifiée — L’expression «matériau de référence» a été remplacée
par «échantillon», «caractéristique» a été remplacée par «capacité» et la Note 1 à l’article a été modifiée.]
3.22
stockage
interruption prolongée du flux de travail préanalytique d’un échantillon ou d’un analyte,
respectivement, ou de leurs dérivés, par exemple des coupes colorées ou des blocs de tissus, dans des
conditions appropriées afin de préserver leurs propriétés
Note 1 à l'article: Le stockage à long terme a généralement lieu dans les sites d’archivage des laboratoires ou dans
les biobanques.
3.23
validation
confirmation par des preuves objectives que les exigences pour une utilisation spécifique ou une
application prévues ont été satisfaites
Note 1 à l'article: Le terme «validé» est utilisé pour désigner l’état correspondant.
[SOURCE: ISO 9000:2015, 3.8.13, modifiée — Les Notes à l’Article 1 et 3 ont été supprimées.]
3.24
vérification
confirmation par des preuves objectives que les exigences spécifiées ont été satisfaites
Note 1 à l'article: Le terme «vérifié» est utilisé pour désigner l’état correspondant.
[SOURCE: ISO 9000:2015, 3.8.12, modifiée — Les Notes 1 et 2 n’ont pas été reprises.]
Note 2 à l'article: La confirmation peut couvrir des activités telles que:
— la réalisation d’autres calculs;
— la comparaison d’une spécification de conception nouvelle avec une spécification de conception similaire
éprouvée;
— la réalisation d’essais et de démonstrations;
— la revue des documents avant diffusion.
4 © ISO 2018 – Tous droits réservés
3.25
ischémie chaude
situation avant que le tissu soit prélevé de l’organisme, mais dans laquelle il est privé de son apport
sanguin normal
3.26
flux de travail
série d’activités nécessaires à la réalisation d’une tâche
4 Considérations générales
Pour les instructions générales relatives aux systèmes de management de la qualité de laboratoire
de biologie médicale et portant en particulier sur le prélèvement, la réception et la manipulation
d’échantillons primaires (y compris la prévention des contaminations croisées), voir l’ISO 15189:2012,
4.2, 5.4.4, 5.4.6 ou l’ISO/IEC 17020:2012, Article 8 et 7.2. Les exigences relatives aux équipements de
laboratoire, aux réactifs et aux consommables conformément à l’ISO 15189:2012, 5.3 doivent être
respectées; l’ISO 15189:2012, 5.5.1.2 et 5.5.1.3, et l’ISO/IEC 17020:2012, 6.2 peuvent également
s’appliquer.
Toutes les étapes d’un flux de travail de diagnostic peuvent influencer le résultat final de l’analyse.
Par conséquent, le flux de travail complet, y compris la stabilité des biomolécules et les conditions de
stockage des échantillons, doit être vérifié et validé. Les étapes du flux de travail qui ne peuvent pas
toujours être contrôlées (par exemple l’ischémie chaude) doivent être documentées. Une évaluation des
risques des étapes non contrôlables du flux de travail, incluant leur impact potentiel sur la performance
analytique, doit être réalisée et des mesures d’atténuation doivent être mises en place pour obtenir la
performance analytique requise.
Avant ou pendant la conception de la phase analytique, il convient donc d’étudier et de s’assurer que
le ou les profils d’ARN destinés à être analysés ne sont pas compromis de manière à avoir un impact
sur la performance analytique (par exemple en réalisant une expérience ou une étude cinétique; voir
également l’Annexe A).
Avant la stabilisation des tissus par congélation, le ou les profils d’ARN peuvent changer, par exemple
par induction de gènes, régulation à la baisse de l’expression de gènes et dégradation de l’ARN. Ces
effets dépendent de la durée des ischémies chaude et froide et de la température ambiante avant la
congélation. De plus, les effets décrits peuvent varier dans les tissus de différents donneurs/patients.
En général, plus la durée des ischémies chaude et froide est longue et plus la température ambiante est
élevée avant la congélation du prélèvement tissulaire, plus le risque est élevé de voir se produire des
modifications du profil d’ARN.
NOTE L’ischémie chaude peropératoire peut entraîner des modifications plus marquées des profils d’ARN
[7][8]
qu’au cours de l’ischémie froide postopératoire . Les profils d’ARN peuvent également varier en fonction
de l’origine et du type du tissu, de la maladie sous-jacente, de l’intervention chirurgicale, du traitement et des
médicaments administrés pour l’anesthésie ou pour le traitement d’une maladie concomitante, ainsi qu’en
fonction des différentes conditions environnementales après le prélèvement du tissu sur l’organisme.
Comme une normalisation de l’ischémie chaude n’est pas facilement réalisable, sa durée doit être
documentée. Lorsqu’il n’est pas possible d’éviter l’ischémie froide, sa durée doit être documentée
et il convient de consigner les températures aux abords du récipient du prélèvement. Lorsque le
prélèvement est transporté vers un autre établissement pour la congélation, la durée du transport doit
être documentée et il convient de documenter également les conditions ambiantes.
Les instructions en matière de sécurité pour le transport et la manipulation doivent être prises en
considération (voir l’ISO 15189:2012, 5.2.3 et 5.4.5 et l’ISO 15190).
Des précautions doivent être prises au cours de l’ensemble du processus préanalytique afin d’éviter
toute contamination croisée entre les différents prélèvements/échantillons, par exemple en utilisant,
dans la mesure du possible, du matériel à usage unique ou en mettant en place des méthodes de
nettoyage appropriées entre les traitements des différents prélèvements/échantillons.
Si un produit commercial n’est pas utilisé selon les instructions du fabricant, la responsabilité de son
utilisation et de sa performance incombe à l’utilisateur.
5 Hors du laboratoire
5.1 Recueil des prélèvements
5.1.1 Généralités
Pour le recueil du prélèvement, il convient de prendre en compte les exigences (par exemple pathologie,
taille du prélèvement) applicables à l’analyse moléculaire prévue (voir également l’Article 6).
Voir également l’ISO 15189:2012, 5.4.4.
5.1.2 Informations relatives au donneur/patient
La documentation doit inclure l’identifiant du donneur/patient, lequel peut se présenter sous la forme
d’un code.
Il convient que la documentation comprenne, sans toutefois s’y limiter:
a) l’état de santé correspondant du donneur/patient (par exemple sain, type de maladie, maladie
concomitante, données démographiques [par exemple âge et sexe]);
b) les informations concernant le traitement médical de routine et le traitement particulier avant le
prélèvement du tissu (par exemple anesthésiques, médicaments, protocoles chirurgicaux ou de
diagnostic);
c) le consentement approprié du donneur/patient.
5.1.3 Informations relatives au prélèvement
La documentation doit mentionner, sans toutefois s’y limiter:
a) le début d’ischémie dans l’organisme (ischémie chaude) établi par une documentation de l’heure
de la ligature/du clampage du vaisseau concerné par l’ischémie (généralement l’heure du clampage
artériel);
NOTE Pas nécessaire dans le cas d’une petite résection/biopsie de tissu en vue de sa congélation.
b) l’heure et la date auxquelles le tissu est prélevé sur l’organisme, ainsi que la méthode de prélèvement
(par exemple microbiopsie au trocart, résection, dispositif de biopsie utilisé pour le prélèvement);
c) la description du type et de l’origine du tissu, de l’état du tissu (par exemple pathologique, exempt
de la maladie), y compris les références de tout marquage réalisé par le chirurgien, le radiologue ou
le pathologiste à l’intérieur ou à l’extérieur du bloc opératoire.
Si la congélation du tissu est réalisée hors du laboratoire, la documentation des étapes décrites en 6.2,
lorsque l’évaluation de la pathologie est requise, et en 6.3, doit être effectuée.
Il convient que la documentation inclue également l’identifiant de la personne responsable du
prélèvement de l’échantillon primaire.
5.1.4 Traitement du prélèvement
Les tissus qui nécessitent d’être congelés à des fins de diagnostic peuvent provenir d’un prélèvement
tissulaire de grande taille ou être des prélèvements tissulaires de petite taille tels que des biopsies,
par exemple prélevées par endoscopie, ou prélevées sur des patients au cours d’une intervention
chirurgicale où un diagnostic sur une coupe rapidement congelée est requis.
6 © ISO 2018 – Tous droits réservés
Les tissus post-mortem peuvent être congelés à des fins de diagnostic. Toutefois, la préservation
de l’ARN dépend de l’intervalle de temps entre le décès et l’autopsie, ainsi que de la température de
stockage du corps après le décès.
Tout ajout ou changement apporté à l’échantillon primaire après le prélèvement sur l’organisme (par
exemple, étiquetage pour l’orientation du prélèvement [tel que marquage à l’encre, points de suture,
incision(s)]) doit être documenté.
Lorsqu’un diagnostic pathologique est requis sur le prélèvement, l’échantillonnage doit être effectué
par un professionnel de santé (par exemple docteur en médecine détenteur d’un certificat de spécialiste
en anatomopathologie, sous sa supervision ou conformément à ses recommandations (voir 6.2).
Lorsque l’échantillon primaire a été prélevé en l’absence d’une exigence de diagnostic pathologique,
l’évaluation, la sélection et la documentation des prélèvements peuvent être effectuées par d’autres
personnes qualifiées que des pathologistes.
La congélation de l’échantillon primaire ou des échantillons prélevés sur l’échantillon primaire peut
être réalisée hors du laboratoire ou dans le laboratoire.
L’ischémie froide peut avoir une influence sur le profil d’ARN; de ce fait, il convient de privilégier la
congélation directe.
a) Dans le cas où le prélèvement ou l’échantillon est congelé hors du laboratoire, continuer sans délai
avec 6.2.
b) Dans le cas où le prélèvement ou l’échantillon est congelé dans le laboratoire, il est nécessaire de
transporter les prélèvements de tissus frais vers le laboratoire. Les étapes décrites en 5.2 pour le
transport de tissus frais doivent être réalisées sans délai.
5.2 Exigences relatives au transport de tissus frais
5.2.1 Généralités
Lorsque le transport du prélèvement ou de l’échantillon vers le laboratoire est requis pour la congélation,
le laboratoire en collaboration avec le service clinique ou de chirurgie doit établir un protocole pour la
méthode de transport du prélèvement.
5.2.2 Préparation pour le transport
Les étapes suivantes doivent être suivies:
a) la sélection et l’utilisation de récipients et d’emballages (par exemple boîte réfrigérante, boîte pour
stockage et transport, emballage sous vide), conformément aux réglementations de transport en
vigueur;
b) la sélection et l’utilisation de méthodes de stabilisation (par exemple techniques de réfrigération)
en vue du transport;
NOTE Une congélation accidentelle du tissu (due par exemple à l’utilisation à mauvais escient de blocs
réfrigérants) entraînera une dégradation de l’ARN au moment où le tissu se décongèlera. Elle peut également
avoir un impact sur la caractérisation morphologique.
c) l’étiquetage du récipient (par exemple numéro d’enregistrement, code-barres, type de prélèvement,
quantité et organe d’origine) et une documentation supplémentaire [informations spécifiées en
5.1.2, 5.1.3 et 5.1.4 et 5.2.2 a) et b)].
Plusieurs prélèvements issus du même patient/donneur et partageant des caractéristiques communes
(aspect macroscopique, type de tissu, état pathologique, emplacement anatomique) peuvent être placés
dans un même récipient/compartiment de récipient.
Il convient de transférer sans délai les prélèvements dans le récipient après l’ablation sur l’organisme.
Il convient ensuite de conserver le récipient sur un bain de glace ou entre 2 °C et 8 °C afin de réduire le
plus possible les modifications de profils d’ARN.
Il convient de consigner les températures de l’environnement du récipient durant l’ischémie froide (par
exemple les températures dans les différents locaux, pendant le transport). Si la température n’est pas
mesurée, il convient d’évaluer la plage de températures en la classant comme température ambiante,
température de laboratoire ou entre 2 °C et 8 °C.
5.2.3 Au cours du transport
Il convient de mettre en œuvre une surveillance de la température de manière appropriée.
Si le prélèvement n’est pas déjà congelé, il convient de l’acheminer sans délai sur un bain de glace ou
entre 2 °C et 8 °C afin de réduire le plus possible les modifications du profil d’ARN.
NOTE Il a été montré que l’ARN dans les tissus peut être stabilisé dans des sacs en plastique sous vide
maintenus entre 0 °C et 4 °C au cours du transport avant que les échantillons soient archivés pour les biobanques
[9]
ou utilisés pour une évaluation histopathologique .
Le respect du protocole de la méthode de transport doit être documenté. Tout écart au protocole doit
être décrit et documenté.
6 Dans le laboratoire
6.1 Informations relatives à la réception du prélèvement
Le nom de la personne réceptionnant le prélèvement doit être consigné. La date et l’heure d’arrivée
du prélèvement, ainsi que les conditions (par exemple étiquetage, conditions de transport incluant la
température, le type et la quantité de tissu du prélèvement, fuite/bris du récipient) des prélèvements
reçus doivent être consignées. Tout écart au protocole établi pour la méthode de transport (voir 5.2)
doit être documenté.
NOTE Les conditions de température pendant le transport peuvent influer sur le profil d’ARN et la qualité
de l’ARN.
L’identification correcte du prélèvement doit être vérifiée. Il convient que cela comprenne les
informations cliniques (voir 5.1.1 et 5.1.3) du prélèvement, le numéro d’admission à l’hôpital et/ou de
l’identifiant du donneur/patient, le nom du patient et la date de naissance du patient.
6.2 Évaluation de la pathologie du prélèvement et sélection du ou des échantillons
L’évaluation et la documentation de la pathologie du prélèvement, de même que la sélection du ou des
échantillons issus du prélèvement pour traitement supplémentaire, doivent être effectuées par ou
sous la supervision ou la responsabilité d’un professionnel de santé (par exemple docteur en médecine
détenteur d’un certificat de spécialiste en anatomopathologie).
Des réglementations nationales, régionales ou locales peuvent s’appliquer.
Options de sélection du ou des échantillons pour l’analyse de l’ARN.
a) La sélection sur le prélèvement des pièces appropriées pour des analyses moléculaires et
histopathologiques, ainsi qu’à des fins de recherches complémentaires facultatives, doit être
effectuée par ou sous la supervision d’un professionnel de santé (par exemple docteur en médecine
détenteur d’un certificat de spécialiste en anatomopathologie), afin de garantir que le prélèvement
de l’échantillon destiné à l’analyse de l’ARN ne compromet pas les analyses histopathologiques.
Il convient de sélectionner des pièces de tissu appropriées pour l’analyse moléculaire et d’éviter
les pièces susceptibles de la compromettre le cas échéant, telles que les parties hémorragiques ou
8 © ISO 2018 – Tous droits réservés
nécrotiques. Il convient d’envisager la microdissection de tissu pour sélectionner ou compléter
certaines caractéristiques cellulaires d’une maladie.
NOTE 1 En fonction des procédures locales, la sélection des pièces appropriées du prélèvement peut
également être réalisée hors du laboratoire, par exemple dans le bloc opératoire (voir 5.1.4).
Dans le cadre de l’examen macroscopique du prélèvement chirurgical avant et/ou après la
congélation, il convient de vérifier les informations cliniques (voir 5.1.2 et 5.1.3) du prélèvement
(par exemple le type, la taille, le nombre), le numéro d’admission à l’hôpital et/ou le numéro de
dossier de pathologie et/ou l’identifiant du donneur/patient, le nom du patient, la date de naissance
du patient et le type de tissu. Le prélèvement chirurgical et tous les résultats doivent être décrits
de manière appropriée conformément aux lignes directrices des sociétés médicales respectives
et en corrélation avec les informations et questions cliniques. Le site anatomique représenté par
le prélèvement doit être décrit, les limites marginales de résection et autres zones importantes
peuvent être marquées si nécessaire et s’avérer utiles pour un examen microscopique ultérieur;
des photographies peuvent être prises. Des échantillons représentatifs doivent être pris (c’est-à-
dire découpés en petites pièces) aux fins d’une évaluation microscopique conformément aux lignes
directrices spécifiques aux organes/pathologies, adoptées par les sociétés médicales respectives.
NOTE 2 L’évaluation ou la documentation décrites ci-dessus peuvent également être réalisées hors du
laboratoire, par exemple dans le bloc opératoire.
b) Lorsque l’échantillon primaire de tissu a été prélevé sur l’organisme en absence d’une exigence de
diagnostic histopathologique, la documentation de cet échantillon primaire, ainsi que l’évaluation,
la sélection et la documentation des échantillons peuvent être effectuées par d’autres personnes
qualifiées que des pathologistes.
c) Lorsqu’un diagnostic sur une coupe congelée est requis, la partie du prélèvement sélectionnée doit
être congelée (voir 6.3) dans un milieu de congélation approprié. Le milieu de congélation utilisé
doit être documenté. Les coupes congelées doivent être évaluées par un professionnel de santé (par
exemple docteur en médecine détenteur d’un certificat de spécialiste en anatomopathologie).
6.3 Congélation du prélèvement, du ou des échantillons
La congélation du prélèvement ou du ou des échantillons doit être réalisée sans délai. Il convient de
sélectionner et d’utiliser la méthode de congélation la mieux adaptée (voir 6.3.2) pour le prélèvement ou
l’échantillon au regard de l’usage prévu et des conditions de travail.
Le tube doit être étiqueté avant d’être pré-refroidi.
Les trois procédures de congélation possibles sont comme suit.
[10]
a) Procédure de congélation instantanée : il convient de privilégier cette méthode, car elle offre la
meilleure préservation de la morphologie dans des échantillons de tissus congelés. L’isopentane
(C H , également appelé méthylbutane ou 2-méthylbutane) doit être pré-refroidi dans une
5 12
plage de températures de ≤ −80 °C à > −160 °C, à laquelle il peut être utilisé pour la congélation
instantanée. Il est possible d’effectuer la pré-réfrigération avec de l’azote liquide (−196 °C), de la
glace carbonique (−80 °C), des congélateurs à −80 °C ou des appareils de congélation dédiés qui
maintiennent l’isopentane à ≤ −80 °C avec ou sans vitesse de refroidissement contrôlée. L’isopentane
doit être refroidi dans un tube ou un autre récipient (par exemple, un bécher en verre) résistant
aux fluctuations importantes et brutales de température. Le volume d’isopentane pré-refroidi
doit être égal à au moins 10 fois le volume du prélèvement ou de l’échantillon. Pour la congélation
instantanée, l’échantillon de tissu doit être totalement immergé dans l’isopentane pré-refroidi.
Une fois le tissu congelé, il doit être transféré dans son tube cryogénique attitré étiqueté et pré-
refroidi. Le tube doit être fermé conformément aux instructions du fabricant. Il convient de
renouveler l’isopentane lorsque des sédiments de tissu sont visibles au fond du tube.
L’isopentane est un liquide extrêmement volatil et inflammable à température et à pression de
laboratoire. Par conséquent, il convient que le laboratoire soit convenablement ventilé. Il convient
de refroidir l’isopentane dans le tube.
b) Procédure de congélation rapide: les tissus doivent être rapidement congelés sur une plaque
métallique pré-refroidie ou un panier métallique placé à la surface d’un bain d’azote liquide ou de
glace carbonique. La surface métallique doit être pré-refroidie dans une plage de températures
de ≤ −80 °C à > −196 °C. La plaque métallique ou le panier métallique peuvent être fixés en
position à l’aide d’un support et d’une pince appropriés. En variante, l’échantillon peut être congelé
directement dans de l’azote liquide, ou encore dans le tube de stockage étiqueté et fermé placé
dans de l’azote liquide ou de la glace carbonique. Cependant, un processus de congélation lente
peut provoquer une rupture des membranes due à l’augmentation des concentrations en sel dans
les compartiments et à la formation de cristaux qui peuvent affecter sérieusement la morphologie.
Afin d’éviter toute contamination croisée, il convient de nettoyer le panier ou la plaque entre la
congélation des échantillons.
[11]
NOTE La congélation dans de l’azote liquide est caractérisée par l’effet Leidenfrost , produit par
l’ébullition de l’azote liquide autour du tissu induite par sa température relativement élevée. Cela réduit la
transmission de la chaleur de l’échantillon à l’azote liquide; cet effet est renforcé lorsque l’échantillon est
placé dans le tube étiqueté.
c) Procédure de coupe congelée: pour congeler un tissu en vue d’un diagnostic sur coupe rapidement
congelée: il convient de transporter sans délai vers le laboratoire le tissu fraîchement prélevé.
La partie du prélèvement sélectionnée doit être congelée sur des grilles métalliques spéciales
ajustables sur le cryostat, dans un milieu de congélation approprié. Il convient de documenter le
milieu de congélation utilisé. La grille métallique contenant le tissu et le milieu de congélation est
congelée en maintenant le métal dans de l’azote liquide ou de la glace carbonique jusqu’à ce que le
tissu soit congelé. Après avoir découpé les coupes congelées, il convient de retirer le tissu restant
de la grille métallique sans décongélation et de le placer dans un tube pré-refroidi pour stockage à
long terme.
NOTE 1 Il est reconnu que l’utilisation d’un milieu de congélation est préjudiciable à la spectrométrie de masse
des protéines, la colonne de séparation pouvant être détériorée.
NOTE 2 Il convient de conserver les échantillons traités avec un milieu de congélation à −70 °C afin d’éviter leur
desséchage et il convient d’évaluer la qualité de l’ARN de chaque échantillon traité avec un milieu de congélation
avant son utilisation.
Les étapes suivantes doivent être effectuées avant, pendant et après la procédure de congélation:
a) la documentation de la procédure de congélation (par exemple congélation dans de l’azote
liquide, congélation instantanée dans de l’isopentane refroidi à l’azote liquide ou de la glace
carbonique, congélation dans un milieu de congélation approprié, congélation avec une vitesse de
refroidissement contrôlée);
b) la documentation de l’heure et de la date de congélation (pour déterminer le temps de latence: temps
écoulé entre le prélèvement sur l’organisme et la congélation du prélèvement ou de l’échantillon);
c) déterminer si la taille de l’échantillon de tissu requise convient au tube cryogénique choisi avant
la congélation, car la taille du tissu détermine la taille du récipient; il est donc recommandé que le
prélèvement/l’échantillon ne soit pas supérieur à 1 cm dans une des dimensions;
d) le choix du récipient du prélèvement/de l’échantillon pour la cryopréservation:
1) le récipient doit avoir un volume suffisant pour la taille du prélèvement ou de l’échantillon à
conserver;
2) le récipient doit être homologué pour la température de stockage;
3) pour des raisons de sécurité, le récipient doit pouvoir être fermé hermétiquement, de préférence
avec un couvercle à vis; les récipients avec un couvercle rabattable ne doivent pas être utilisés;
10 © ISO 2018 – Tous droits réservés
NOTE Les récipients peuvent exploser lors de la récupération des prélèvements ou échantillons qui
ont été conservés dans de l’azote liquide.
4) les récipients doivent être adaptés pour un étiquetage permanent dans des conditions de
stockage par congélation;
e) l’étiquetage doit être adapté aux conditions respectives de stockage par congélation;
NOTE Les étiquettes appropriées sont, par exemple, les étiquettes autoadhésives, l’écriture manuscrite,
l’identification par radiofréquence (RFID), les récipients pré-étiquetés, qui ont été vérifiés pour l’usage prévu.
f) l’étiquetage du
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