ISO 11930:2019
(Main)Cosmetics — Microbiology — Evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product
Cosmetics — Microbiology — Evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product
This document specifies a procedure for the interpretation of data generated by the preservation efficacy test or by the microbiological risk assessment, or both, when evaluating the overall antimicrobial protection of a cosmetic product. It comprises: — a preservation efficacy test; — a procedure for evaluating the overall antimicrobial protection of a cosmetic product that is not considered low risk, based on a risk assessment described in ISO 29621. The preservation efficacy test is a reference method to evaluate the preservation of a cosmetic formulation. It is applicable to cosmetic products in the marketplace. This test does not apply to those cosmetic products for which the microbiological risk has been determined to be low according to Annex A and ISO 29621. This test is primarily designed for water-soluble or water-miscible cosmetic products and can be used with modification to test products in which water is the internal (discontinuous) phase. NOTE This test can be used as a guideline to establish a development method during the development cycle of cosmetic products. In this case, the test can be modified or extended, or both, for example, to make allowance for prior data and different variables (microbial strains, media, incubation conditions exposure time, etc.). Compliance criteria can be adapted to specific objectives. During the development stage of cosmetic products, other methods, where relevant, can be used to determine the preservation efficacy of formulations.
Cosmétiques — Microbiologie — Évaluation de la protection antimicrobienne d'un produit cosmétique
Le présent document spécifie un mode opératoire pour l'interprétation des données résultant de l'essai d'efficacité de la protection antimicrobienne et/ou de l'appréciation du risque microbiologique lors de l'évaluation globale de la protection antimicrobienne d'un produit cosmétique. Il comprend: — un essai d'efficacité de la protection antimicrobienne; et — un mode opératoire permettant d'évaluer la protection antimicrobienne globale d'un produit cosmétique qui n'est pas identifié comme étant à faible risque microbiologique d'après l'appréciation du risque décrite dans l'ISO 29621. L'essai d'efficacité de la protection antimicrobienne est une méthode de référence pour évaluer la protection antimicrobienne d'une formulation cosmétique. Il s'applique aux produits cosmétiques disponibles sur le marché. Cet essai n'est pas applicable aux produits cosmétiques pour lesquels il a été démontré que le risque microbiologique est faible, conformément à l'Annexe A et à l'ISO 29621. Cet essai est principalement conçu pour les produits cosmétiques solubles dans l'eau ou miscibles à l'eau, et peut être utilisé avec modification pour soumettre à essai des produits dont la phase interne (discontinue) est aqueuse. NOTE Cet essai peut servir de ligne directrice pour établir une méthode de développement au cours du cycle de développement d'un produit cosmétique. Dans ce cas, l'essai peut être modifié et/ou élargi, par exemple pour prendre en compte des données antérieures et différents paramètres (souches microbiennes, milieux, conditions et durée d'incubation, etc.). Les critères de conformité peuvent être adaptés à des objectifs spécifiques. Au cours de la phase de développement des produits cosmétiques, d'autres méthodes peuvent être utilisées, le cas échéant, pour déterminer l'efficacité de la protection antimicrobienne des formulations.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11930
Second edition
2019-01
Cosmetics — Microbiology —
Evaluation of the antimicrobial
protection of a cosmetic product
Cosmétiques — Microbiologie — Évaluation de la protection
antimicrobienne d'un produit cosmétique
Reference number
©
ISO 2019
© ISO 2019
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ii © ISO 2019 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Preservation efficacy test . 3
5.1 General . 3
5.2 Materials, apparatus, reagents and culture media . 3
5.2.1 General. 3
5.2.2 Materials . 3
5.2.3 Diluents . 3
5.2.4 Neutralizer . 4
5.2.5 Culture media . 5
5.3 Microbial strains . 6
5.4 Preparation and enumeration of inocula . 7
5.4.1 General. 7
5.4.2 Preparation of bacterial and Candida albicans suspensions . 7
5.4.3 Preparation of Aspergillus brasiliensis spore suspension . 8
5.5 Demonstration of the neutralizer efficacy . 9
5.5.1 Principle . 9
5.5.2 Procedure . 9
5.5.3 Calculations . 9
5.5.4 Interpretation of results and conclusion on neutralizer efficacy.10
5.6 Determination of the preservation efficacy of the formulation .10
5.6.1 Procedure .10
5.6.2 Counting of colonies.11
5.6.3 Calculations .11
5.7 Interpretation of test results and conclusions .12
5.7.1 Criteria .12
5.7.2 General case (efficacy of the neutralizer is demonstrated for all strains) .13
5.7.3 Case of formulations for which the efficacy of the neutralizer is not
demonstrated for some strains .13
5.8 Test report .13
6 Overall evaluation of the antimicrobial protection of the cosmetic product .14
6.1 General .14
6.2 Case 1 — Preservation efficacy test has been performed on the formulation.14
6.3 Case 2 — Preservation efficacy test has not been performed on the formulation .15
Annex A (normative) Decision diagram .16
Annex B (normative) Evaluation criteria for the preservation efficacy test .17
Annex C (informative) Examples of neutralizers for the antimicrobial activity of
preservatives and washing liquids .18
Annex D (informative) Packaging characteristics .20
Bibliography .21
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso
.org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 217, Cosmetics.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 11930:2012), which has been technically
revised. The main changes compared to the previous edition are as follows.
— Two types of diluents, composition 1 and composition 2 can be used as the diluents for bacteria and
Candida albicans on the revised version (5.2.3).
— 5.6.2 Paragraph 2 has been changed to “When counts of surviving microorganisms obtained in
5.6.1.4 c) are less than 30 for bacteria and C. albicans or less than 15 for A. brasiliensis at the dilution
where neutralization has been checked, record the number of colonies on Petri dishes and express
results by multiplying by the dilution factor. If no colonies are observed at the dilution where
neutralization has been checked, note the result as <1 and multiply by the dilution factor.”
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Introduction
This document is designed to be used in the overall evaluation of the antimicrobial protection of a
cosmetic product.
The antimicrobial protection of a product can come from many sources:
— chemical preservation;
— inherent characteristics of the formulation;
— package design;
— manufacturing process.
This document defines a series of steps to be taken when assessing the overall antimicrobial protection
of a cosmetic product. A reference method for a preservation efficacy test (challenge test) along with
evaluation criteria is also described in this document.
The test described in this document involves, for each test microorganism, placing the formulation in
contact with a calibrated inoculum, and then measuring the changes in the microorganism count at set
time intervals for a set period and at a set temperature.
The data generated by the risk assessment (see ISO 29621) or by the preservation efficacy test, or both,
are used to establish the level of antimicrobial protection required to minimize user risk.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 11930:2019(E)
Cosmetics — Microbiology — Evaluation of the
antimicrobial protection of a cosmetic product
1 Scope
This document specifies a procedure for the interpretation of data generated by the preservation
efficacy test or by the microbiological risk assessment, or both, when evaluating the overall
antimicrobial protection of a cosmetic product.
It comprises:
— a preservation efficacy test;
— a procedure for evaluating the overall antimicrobial protection of a cosmetic product that is not
considered low risk, based on a risk assessment described in ISO 29621.
The preservation efficacy test is a reference method to evaluate the preservation of a cosmetic
formulation. It is applicable to cosmetic products in the marketplace.
This test does not apply to those cosmetic products for which the microbiological risk has been
determined to be low according to Annex A and ISO 29621.
This test is primarily designed for water-soluble or water-miscible cosmetic products and can be used
with modification to test products in which water is the internal (discontinuous) phase.
NOTE This test can be used as a guideline to establish a development method during the development cycle
of cosmetic products. In this case, the test can be modified or extended, or both, for example, to make allowance
for prior data and different variables (microbial strains, media, incubation conditions exposure time, etc.).
Compliance criteria can be adapted to specific objectives. During the development stage of cosmetic products,
other methods, where relevant, can be used to determine the preservation efficacy of formulations.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 16212, Cosmetics — Microbiology — Enumeration of yeast and mould
ISO 18415, Cosmetics — Microbiology — Detection of specified and non-specified microorganisms
ISO 21148:2017, Cosmetics — Microbiology — General instructions for microbiological examination
ISO 21149, Cosmetics — Microbiology — Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria
ISO 29621, Cosmetics — Microbiology — Guidelines for the risk assessment and identification of
microbiologically low-risk products
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 21148 and the following apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at https: //www .electropedia .org/
3.1
cosmetic formulation
preparation of raw materials with a qualitatively and quantitatively defined composition
3.2
cosmetic product
cosmetic formulation (3.1) that has undergone all stages of production, including packaging in its final
container
3.3
antimicrobial protection of a cosmetic product
ability of a cosmetic product (3.2) to overcome microbial contamination that might present a potential
risk to the user or to the aesthetic and functional integrity of the product, during intended use
Note 1 to entry: The overall antimicrobial protection includes preservation of the formulation, the specific
manufacturing process and protective packaging.
3.4
preservation of a cosmetic formulation
set of means used to avoid microbial proliferation in a cosmetic formulation (3.1)
EXAMPLE Preservatives, multifunctional compounds, hostile raw materials, extreme pH, low water-
activity values.
3.5
reference method
method applied by interested parties to assess a product on the market and in case of dispute
3.6
development method
in-house method
method used during the development stage of a product before the product is put on the market
3.7
consumer
end user of a cosmetic product (3.2)
4 Principle
The evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product combines the following elements
(see Annex A).
a) The characteristics of its formulation (see ISO 29621) or the results of the preservation efficacy
test (if performed), or both.
The preservation efficacy test is described in Clause 5.
b) The characteristics of the cosmetic product in conjunction with the production conditions
(see ISO 22716 and ISO 29621), the packaging materials and, if justified, recommendations for use
of the product (see ISO 29621) and, when relevant, the area of application and the targeted user
population (see Annex D).
This document describes a procedure for the interpretation of data generated by the preservation
efficacy test (if appropriate) and by the microbiological risk assessment.
2 © ISO 2019 – All rights reserved
5 Preservation efficacy test
5.1 General
The evaluation of the preservation of a cosmetic formulation is based on inoculation of the formulation
with calibrated inocula (prepared from relevant strains of microorganisms). The number of surviving
microorganisms is measured at defined intervals during a period of 28 days. For each time and
each strain, the log reduction value is calculated and compared to the minimum values required for
evaluation criteria A or B (see Annex B).
When used as a reference method, procedures shall be strictly followed in order to avoid variability
in results. To determine the preservation efficacy of a formulation during product development, other
suitable development methods may be used.
Prior to the test, neutralizer efficacy shall be established (see 5.5), and the microbiological quality of
the product shall be determined (in accordance with ISO 21149 and ISO 16212, or with ISO 18415)
to ensure that any microorganisms present in the test sample do not interfere with recovery of test
organisms.
5.2 Materials, apparatus, reagents and culture media
5.2.1 General
When water is used in diluents, neutralizers or culture media preparation, use distilled water or
purified water as specified in ISO 21148:2017, 8.2.
5.2.2 Materials
In addition to the microbiology laboratory equipment described in ISO 21148, the following materials
should be used
5.2.2.1 Glass beads, 3 mm to 4 mm in diameter.
5.2.2.2 Sintered glass filter, of porosity 2 (40 µm to 100 µm).
5.2.2.3 Sterile glass containers with closures, of suitable volumes.
5.2.2.4 Centrifuge, capable of a centrifugal force of 2 000g.
5.2.3 Diluents
5.2.3.1 General
Unless otherwise specified, all reagents shall be equilibrated at ambient temperature before use. When
available, ready-to-use reagents and media may be used.
5.2.3.2 Diluents for bacteria and Candida albicans
5.2.3.2.1 Composition 1
Sodium chloride 8,5 g
Water 1 000 ml
5.2.3.2.2 Preparation
Dissolve sodium chloride in the water by mixing. Dispense into suitable containers. Sterilize in the
autoclave at 121 °C for 15 min.
5.2.3.2.3 Composition 2
Tryptone pancreatic digest of casein 1,0 g
Sodium chloride 8,5 g
Water 1 000 ml
5.2.3.2.4 Preparation
Dissolve the components in the water by mixing while heating. Dispense into suitable containers.
Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization, the pH shall be equivalent to 7,0 ± 0,2,
when measured at room temperature.
5.2.3.3 Diluent for preparation of Aspergillus brasiliensis: polysorbate solution
Prepare a solution of polysorbate 80 (0,5 g/l). Dissolve by mixing while heating until complete
dissolution is achieved. Dispense the solution into suitable containers. Sterilize in the autoclave at
121 °C for 15 min.
5.2.4 Neutralizer
5.2.4.1 General
The suitability and effectiveness of the neutralizing agent with respect to the test strains used and to
the tested formulation shall be demonstrated as specified in 5.5.
The neutralizer described in 5.2.4.2 is frequently used. Examples of other suitable neutralizers are
given in Annex C (see Table C.1).
5.2.4.2 Eugon LT 100 liquid broth
5.2.4.2.1 General
This medium contains ingredients that neutralize inhibitory substances present in the sample (lecithin
1) ®
and polysorbate 80) and dispersing agent octoxynol 9 (Triton X100 ). It may be prepared as described
in 5.2.4.2.2, or from dehydrated culture medium, according to the manufacturer’s instructions. A ready-
to-use medium may also be used.
5.2.4.2.2 Composition
Pancreatic digest of casein 15 g
Papaic digest of soybean meal 5 g
Sodium chloride 4 g
L-cystine 0,7 g
1) Triton X100® is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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Sodium sulphite 0,2 g
Glucose 5,5 g
Egg lecithin 1 g
Polysorbate 80 5 g
Octoxynol 9 1 g
Water 1 000 ml
5.2.4.2.3 Preparation
Dissolve successively into boiling water polysorbate 80, octoxynol 9 and egg lecithin until they are
completely dissolved. Dissolve the other components by mixing while heating. Dispense the medium
into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. Mix well after sterilization while
the liquid is still hot to redissolve settled substances. After sterilization, the pH shall be equivalent to
7,0 ± 0,2 when measured at room temperature.
5.2.5 Culture media
5.2.5.1 General
Culture media may be prepared as in 5.2.5.2, 5.2.5.3 and 5.2.5.4, or from dehydrated culture media
according to the manufacturer’s instructions. Ready-to-use media may be used when their composition
and/or growth yields are comparable to those of the formulae given in 5.2.5.2.1, 5.2.5.3.1 and 5.2.5.4.1.
5.2.5.2 Culture medium for bacteria: tryptic soy agar (TSA) or soybean casein digest agar
medium
5.2.5.2.1 Composition
Pancreatic digest of casein 15,0 g
Papaic digest of soybean meal 5,0 g
Sodium chloride 5,0 g
Agar 15,0 g
Water 1 000 ml
5.2.5.2.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water by mixing while heating.
Dispense the medium into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. Mix well
after sterilization while the liquid is still hot to redissolve settled substances. After sterilization and
cooling down, the pH shall be equivalent to 7,3 ± 0,2 when measured at room temperature.
5.2.5.3 Culture medium for C. albicans: Sabouraud dextrose agar medium (SDA)
5.2.5.3.1 Composition
Dextrose 40,0 g
Peptic digest of animal tissue 5,0 g
Pancreatic digest of casein 5,0 g
Agar 15,0 g
Water 1 000 ml
5.2.5.3.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water by mixing while heating.
Dispense the medium into suitable containers. Sterilize in an autoclave at 121 °C for 15 min. After
sterilization, the pH shall be equivalent to 5,6 ± 0,2 when measured at room temperature.
5.2.5.4 Culture medium for A. brasiliensis: potato dextrose agar (PDA)
5.2.5.4.1 Composition
Potato infusion 200,0 g
Dextrose 20,0 g
Agar (see 5.2.5.4.2, Note 1) 20,0 g
Water 1 000 ml
5.2.5.4.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water by heating. Dispense the
medium into suitable containers. Sterilize in an autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization, the
pH shall be equivalent to 5,6 ± 0,2 when measured at room temperature.
NOTE Commercially available dehydrated medium powders that contain less than 20 g/l of agar can be
supplemented with extra agar to the final concentration of 20 g/l if necessary.
5.3 Microbial strains
2)
The test shall be run using the following strains as test microorganisms :
® TM3) ® TM4) ® TM5)
— Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (equivalent strain: CIP 82.118 or NCIMB 8626
® TM6) ® TM7)
or NBRC 13275 or KCTC 2513 or other equivalent national collection strain);
2) These are examples of suitable products available commercially. This information is given for the convenience
of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of these products. ®
3) ATCC : American Type Culture Collection ®
4) CIP : Collection de l’Institut Pasteur ®
5) NCIMB : National Collection of Industrial Marine Bacteria ®
6) NBRC : NITE Biological Resource Center, JP ®
7) KCTC : Korean Collection for Type Cultures
6 © ISO 2019 – All rights reserved
® TM ® TM ® TM
— Staphylococcus aureus ATCC 6538 (equivalent strain: CIP 4.83 or NCIMB 9518 or
8)
® TM ® TM ® TM
NBRC 13276 or KCTC 3881 or NCTC 10788 or other equivalent national collection
strain);
® TM ® TM ® TM
— Escherichia coli ATCC 8739 (equivalent strain: CIP 53.126 or NCIMB 8545 or
® TM ® TM ® TM
NBRC 3972 or KCTC 2571 or NCTC 12923 or other equivalent national collection strain);
9) 10)
® TM TM ® TM
— Candida albicans ATCC 10231 (equivalent strain: IP 48.72 or NCPF 3179 or
® TM ® TM
NBRC 1594 or KCTC 7965 or other equivalent national collection strain);
® TM ® TM11)
— Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 (equivalent strain: IP 1431 or IMI 149007 or
® TM ® TM
NBRC 9455 or KCTC 6196 or other equivalent national collection strain).
The culture can be acquired frozen, freeze-dried, on slants or in ready-to-use formats and should be
prepared according to the procedures provided by the supplier of the reference strain. The strains
should be stored in a laboratory conforming to EN 12353 or according to another suitable method.
5.4 Preparation and enumeration of inocula
5.4.1 General
To perform the tests, use the strains stored in the laboratory (see 5.3) to obtain the stock cultures and
the working cultures.
The stock culture is a confluent culture obtained by streaking slant tubes or plates with the stored
strain (single-use vial or bead). After incubation, the stock culture can be kept between 2 °C and 8 °C for
two months and is used to obtain the working cultures.
The working culture, prepared when needed to perform a test, is used to obtain the calibrated
suspension (inoculum).
The same growth conditions (agar media and incubation) are used for both stock cultures and working
cultures (see 5.4.2 and 5.4.3).
NOTE 1 A limited number of serial subcultures and the use of confluent cultures instead of isolated colonies
lower the risk of change in the susceptibility of strains. The standardization of growth conditions and of inoculum
preparation improves the reproducibility of the test.
NOTE 2 Avoid thawing when multi-dose containers are used (for example, containers with several beads
brought out of the freezer to take one bead, then replaced in the freezer).
5.4.2 Preparation of bacterial and Candida albicans suspensions
5.4.2.1 To prepare the working culture of the test microorganism, prepare a subculture from the
stock culture by streaking slant tubes or plates (TSA for bacteria, SDA for C.albicans) in order to obtain a
confluent culture. Incubate at (32,5 ± 2,5) °C for 18 h to 24 h.
Prepare in the same way a second subculture, starting from the first subculture, and incubate at
(32,5 ± 2,5) °C for 18 h to 24 h. A third subculture can be grown in the same way, starting from the
second. The second subculture and the third one (if it was carried out) form the working cultures.
If the second subculture cannot be carried out in a timely manner, then the first subculture can be kept
for up to 48 h in the incubator (32,5 ± 2,5) °C and used to prepare the second subculture. In this case,
prepare the third 18 h to 24 h subculture and use this in the test. ®
8) NCTC : National Collection of Type Cultures
9) IP: Institut Pasteur ®
10) NCPF : National Collection of Pathogenic Fungi
11) IMI: International Mycological Institute, UK
It is recommended that a fourth subculture not be prepared from the initial stock culture.
5.4.2.2 Take 10 ml of diluent (5.2.3.2) and place in a suitable sterile container with approximately 5 g
of sterile glass beads. Transfer loopfuls of the cells harvested from the agar medium into the diluent; the
cells should be suspended in the diluent by rubbing the loop in a small amount of the diluent against the
side of the container to dislodge the cells.
5.4.2.3 Shake the container manually or mechanically, for a maximum of 3 min, to homogenize the
suspension. Aspirate the upper part of the suspension (avoiding any contact with the glass beads) and
transfer the obtained suspension to a sterile container.
7 8
5.4.2.4 Adjust the number of cells in the suspension to 1 × 10 cfu/ml to 1 × 10 cfu/ml (bacteria) or
6 7
1 × 10 cfu/ml to 1 × 10 cfu/ml (C. albicans) using the diluent (5.2.3.2) and in accordance with calibration
data produced in the laboratory (e.g. using a spectrophotometer, see ISO 21148:2017, Annex C).
Use this calibrated inoculum within 2 h.
5.4.2.5 At the time of the test, check the initial capacity of the suspension, N. Make successive tenfold
dilutions of the calibrated suspension in the diluent (5.2.3.2). Perform the enumeration by duplicating
1 ml of the suitable dilutions (see 5.6.2) into TSA for bacteria and into SDA for C. albicans. Incubate the
dishes at (32,5 ± 2,5) °C for 24 h to 48 h.
5.4.3 Preparation of Aspergillus brasiliensis spore
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11930
Deuxième édition
2019-01
Cosmétiques — Microbiologie
— Évaluation de la protection
antimicrobienne d'un produit
cosmétique
Cosmetics — Microbiology — Evaluation of the antimicrobial
protection of a cosmetic product
Numéro de référence
©
ISO 2019
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 2
5 Essai d’efficacité de la protection antimicrobienne. 3
5.1 Généralités . 3
5.2 Matériel, réactifs et milieux de culture . 3
5.2.1 Généralités . 3
5.2.2 Matériel . 3
5.2.3 Diluants . 3
5.2.4 Milieu neutralisant . 4
5.2.5 Milieux de culture . 5
5.3 Souches microbiennes . 7
5.4 Préparation et dénombrement des inoculums. 7
5.4.1 Généralités . 7
5.4.2 Préparation des suspensions bactériennes et de Candida albicans . 8
5.4.3 Préparation de la suspension de spores d’Aspergillus brasiliensis . 8
5.5 Démonstration de l’efficacité du milieu neutralisant . 9
5.5.1 Principe . 9
5.5.2 Mode opératoire . 9
5.5.3 Calculs .10
5.5.4 Interprétation des résultats et conclusion concernant l’efficacité du milieu
neutralisant .10
5.6 Détermination de l’efficacité de la protection antimicrobienne de la formulation .11
5.6.1 Mode opératoire .11
5.6.2 Comptage des colonies .12
5.6.3 Calculs .12
5.7 Interprétation des résultats d’essai et conclusions .13
5.7.1 Critères .13
5.7.2 Cas général (l’efficacité du milieu neutralisant est démontrée pour toutes
les souches) .14
5.7.3 Cas des formulations pour lesquelles l’efficacité du milieu neutralisant
n’est pas démontrée pour certaines souches .14
5.8 Rapport d’essai .14
6 Évaluation globale de la protection antimicrobienne d’un produit cosmétique .15
6.1 Généralités .15
6.2 Cas 1 — L’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne a été réalisé sur
la formulation . .15
6.3 Cas 2 — L’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne n’a pas été réalisé sur
la formulation . .16
Annexe A (normative) Diagramme décisionnel .17
Annexe B (normative) Critères d’évaluation pour l’essai d’efficacité de la protection
antimicrobienne .18
Annexe C (informative) Exemples de milieux neutralisants de l’activité antimicrobienne,
de conservateurs et liquides de lavage .19
Annexe D (informative) Caractéristiques du conditionnement .21
Bibliographie .22
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 217, Cosmétiques.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 11930:2012), qui a fait l’objet d’une
révision technique. Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivantes:
— deux types de diluants, la composition 1 et la composition 2, peuvent être utilisés comme diluants
pour les bactéries et Candida albicans dans la version révisée (5.2.3);
— 5.6.2 alinéa 2 a été modifié en «Lorsque le nombre de micro-organismes survivants obtenu en
5.6.1.4 c) est inférieur à 30 pour les bactéries et C. albicans ou à 15 pour A. brasiliensis à la dilution
pour laquelle la neutralisation a été vérifiée, noter le nombre de colonies sur les boîtes de Pétri et
exprimer le résultat en le multipliant par le facteur de dilution. Si aucune colonie n’a été observée
à la dilution pour laquelle la neutralisation a été vérifiée, noter le résultat comme étant < 1 et le
multiplier par le facteur de dilution».
iv © ISO 2019 – Tous droits réservés
Introduction
Le présent document est destiné à être utilisé pour l’évaluation globale de la protection antimicrobienne
d’un produit cosmétique.
La protection antimicrobienne d’un produit peut avoir plusieurs origines:
— protection chimique;
— caractéristiques inhérentes de la formulation;
— conception du conditionnement;
— procédé de fabrication.
Le présent document définit une série d’étapes à suivre pour évaluer la protection antimicrobienne
globale d’un produit cosmétique. Il décrit également une méthode de référence pour un essai d’efficacité
de la protection antimicrobienne (test d’épreuve), ainsi que les critères d’évaluation associés.
L’essai décrit dans le présent document implique, pour chaque micro-organisme d’essai, de mettre
en contact la formulation avec un inoculum calibré, puis de mesurer l’évolution du nombre de micro-
organismes à des intervalles de temps définis, pendant une période définie et à une température définie.
Les données résultant de l’appréciation du risque (voir l’ISO 29621) et/ou de l’essai d’efficacité de la
protection antimicrobienne sont utilisées pour établir le niveau de protection antimicrobienne requis
afin de réduire au minimum le risque pour l’utilisateur.
NORME INTERNATIONALE ISO 11930:2019(F)
Cosmétiques — Microbiologie — Évaluation de la
protection antimicrobienne d'un produit cosmétique
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie un mode opératoire pour l’interprétation des données résultant de l’essai
d’efficacité de la protection antimicrobienne et/ou de l’appréciation du risque microbiologique lors de
l’évaluation globale de la protection antimicrobienne d’un produit cosmétique.
Il comprend:
— un essai d’efficacité de la protection antimicrobienne; et
— un mode opératoire permettant d’évaluer la protection antimicrobienne globale d’un produit
cosmétique qui n’est pas identifié comme étant à faible risque microbiologique d’après l’appréciation
du risque décrite dans l’ISO 29621.
L’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne est une méthode de référence pour évaluer la
protection antimicrobienne d’une formulation cosmétique. Il s’applique aux produits cosmétiques
disponibles sur le marché.
Cet essai n’est pas applicable aux produits cosmétiques pour lesquels il a été démontré que le risque
microbiologique est faible, conformément à l’Annexe A et à l’ISO 29621.
Cet essai est principalement conçu pour les produits cosmétiques solubles dans l’eau ou miscibles à
l’eau, et peut être utilisé avec modification pour soumettre à essai des produits dont la phase interne
(discontinue) est aqueuse.
NOTE Cet essai peut servir de ligne directrice pour établir une méthode de développement au cours du cycle
de développement d’un produit cosmétique. Dans ce cas, l’essai peut être modifié et/ou élargi, par exemple pour
prendre en compte des données antérieures et différents paramètres (souches microbiennes, milieux, conditions
et durée d’incubation, etc.). Les critères de conformité peuvent être adaptés à des objectifs spécifiques. Au cours
de la phase de développement des produits cosmétiques, d’autres méthodes peuvent être utilisées, le cas échéant,
pour déterminer l’efficacité de la protection antimicrobienne des formulations.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 16212, Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement des levures et des moisissures
ISO 18415, Cosmétiques — Microbiologie — Détection des micro-organismes spécifiés et non spécifiés
ISO 21148:2017, Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour les examens microbiologiques
ISO 21149, Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement et détection des bactéries aérobies mésophiles
ISO 29621, Cosmétiques — Microbiologie — Lignes directrices pour l'appréciation du risque et
l'identification de produits à faible risque microbiologique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 21148 et les suivants
s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https: //www .electropedia .org/
3.1
formulation cosmétique
préparation constituée de matières premières dont la composition est qualitativement et
quantitativement définie
3.2
produit cosmétique
formulation cosmétique (3.1) ayant subi toutes les étapes de la production, y compris le conditionnement
dans son emballage final
3.3
protection antimicrobienne d’un produit cosmétique
aptitude d’un produit cosmétique (3.2) à résister à une contamination microbienne pouvant présenter
un risque potentiel pour l’utilisateur ou pour l’intégrité esthétique et fonctionnelle du produit au cours
de son utilisation prévue
Note 1 à l'article: La protection antimicrobienne globale inclut la protection antimicrobienne de la formulation, le
procédé de fabrication spécifique et le conditionnement protecteur.
3.4
protection antimicrobienne d’une formulation cosmétique
ensemble des moyens mis en œuvre pour éviter la prolifération microbienne dans une formulation
cosmétique (3.1)
EXEMPLE Conservateurs, composés multifonctionnels, matières premières hostiles, pH extrême et faible
activité de l’eau.
3.5
méthode de référence
méthode appliquée par les parties intéressées pour évaluer un produit sur le marché et en cas de litige
3.6
méthode de développement
méthode interne
méthode utilisée au cours de la phase de développement d’un produit avant sa mise sur le marché
3.7
consommateur
utilisateur final d’un produit cosmétique (3.2)
4 Principe
L’évaluation de la protection antimicrobienne d’un produit cosmétique comprend les points suivants
(voir l’Annexe A):
a) les caractéristiques de sa formulation (voir l’ISO 29621) et/ou les résultats de l’essai d’efficacité de
la protection antimicrobienne (s’il a été réalisé);
L’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne est décrit dans l’Article 5.
2 © ISO 2019 – Tous droits réservés
b) les caractéristiques du produit cosmétique conjointement avec les conditions de production
(voir l’ISO 22716 et l’ISO 29621), les matériaux de conditionnement et, si cela est justifié, les
recommandations d’utilisation du produit (voir l’ISO 29621) ainsi que, le cas échéant, la zone
d’application et la population d’utilisateurs ciblés (voir l’Annexe D).
Le présent document décrit un mode opératoire pour l’interprétation des données résultant de
l’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne (s’il est approprié) et de l’appréciation du risque
microbiologique.
5 Essai d’efficacité de la protection antimicrobienne
5.1 Généralités
L’évaluation de la protection antimicrobienne d’une formulation cosmétique repose sur l’inoculation
de la formulation avec des inoculums calibrés (préparés à partir de souches de micro-organismes
pertinents). Le nombre de micro-organismes survivants est mesuré à des intervalles de temps prédéfinis
pendant 28 jours. Pour chaque temps et chaque souche, le taux de réduction logarithmique est calculé
et comparé aux valeurs minimales requises pour les critères d’évaluation A ou B (voir l’Annexe B).
Lorsqu’ils sont utilisés comme méthode de référence, les modes opératoires doivent être suivis
scrupuleusement afin d’éviter toute variabilité des résultats. Pour déterminer l’efficacité de la
protection antimicrobienne d’une formulation lors du développement d’un produit, d’autres méthodes
de développement adaptées peuvent être utilisées.
Préalablement à l’essai, l’efficacité du milieu neutralisant doit être établie (voir 5.5) et la qualité
microbiologique du produit doit être déterminée (conformément à l’ISO 21149 et à l’ISO 16212, ou à
l’ISO 18415) afin de garantir que les micro-organismes présents dans l’échantillon d’essai n’interfèrent
pas avec le recouvrement des organismes d’essai.
5.2 Matériel, réactifs et milieux de culture
5.2.1 Généralités
Lorsque de l’eau est utilisée dans une préparation de diluant, de milieu neutralisant ou de milieu de
culture, utiliser de l’eau distillée ou de l’eau purifiée, comme spécifié dans l’ISO 21148:2017, 8.2.
5.2.2 Matériel
Outre le matériel courant de laboratoire de microbiologie décrit dans l’ISO 21148, il convient d’utiliser
le matériel suivant:
5.2.2.1 Billes de verre, de 3 mm à 4 mm de diamètre.
5.2.2.2 Filtre en verre fritté, de porosité 2 (40 µm à 100 µm).
5.2.2.3 Récipients en verre stériles, munis de bouchons, de volumes appropriés.
5.2.2.4 Centrifugeuse, capable de centrifuger à 2 000 g.
5.2.3 Diluants
5.2.3.1 Généralités
Sauf spécification contraire, tous les réactifs doivent être équilibrés à la température ambiante avant
usage. S’ils sont disponibles, des réactifs et des milieux prêts à l’emploi peuvent être utilisés.
5.2.3.2 Diluants pour bactéries et Candida albicans
5.2.3.2.1 Composition 1
Chlorure de sodium 8,5 g
Eau 1 000 ml
5.2.3.2.2 Préparation
Dissoudre le chlorure de sodium en le mélangeant dans l’eau. Répartir dans des récipients appropriés.
Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.
5.2.3.2.3 Composition 2
Tryptone, peptone pancréatique de caséine 1,0 g
Chlorure de sodium 8,5 g
Eau 1 000 ml
5.2.3.2.4 Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau en mélangeant tout en chauffant. Répartir dans des récipients
appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après la stérilisation, le pH doit être de
7,0 ± 0,2, le mesurage étant effectué à température ambiante.
5.2.3.3 Diluant pour la préparation d’Aspergillus brasiliensis: solution de polysorbate
Préparer une solution de polysorbate 80 (0,5 g/l). Dissoudre en mélangeant tout en chauffant jusqu’à
dissolution complète. Répartir la solution dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à
121 °C pendant 15 min.
5.2.4 Milieu neutralisant
5.2.4.1 Généralités
L’adéquation et l’efficacité du milieu neutralisant relativement aux souches d’essai utilisées et à la
formulation soumise à essai doivent être démontrées comme spécifié en 5.5.
Le milieu neutralisant décrit en 5.2.4.2 est souvent utilisé. D’autres milieux neutralisants pouvant
convenir sont donnés à titre d’exemples dans l’Annexe C (voir le Tableau C.1).
5.2.4.2 Milieu liquide Eugon LT 100
5.2.4.2.1 Généralités
Ce milieu contient des ingrédients qui neutralisent les substances inhibitrices présentes dans
1) ®
l’échantillon (lécithine et polysorbate 80), ainsi qu’un agent dispersant, octoxynol 9 (Triton X100 ).
Il peut être préparé comme indiqué en 5.2.4.2.2 ou à partir d’un milieu de culture déshydraté en
respectant les instructions du fabricant. Un milieu prêt à l’emploi peut également être utilisé. ®
1) Triton X100 est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée
à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande
l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
4 © ISO 2019 – Tous droits réservés
5.2.4.2.2 Composition
Peptone pancréatique de caséine 15 g
Peptone papaïque de soja 5 g
Chlorure de sodium 4 g
L-cystine 0,7 g
Sulfite de sodium 0,2 g
Glucose 5,5 g
Lécithine d’œuf 1 g
Polysorbate 80 5 g
Octoxynol 9 1 g
Eau 1 000 ml
5.2.4.2.3 Préparation
Dissoudre dans l’eau bouillante successivement le polysorbate 80, l’octoxynol 9 et la lécithine d’œuf
jusqu’à dissolution complète. Dissoudre les autres composants à chaud et en mélangeant. Répartir le
milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Bien mélanger
après stérilisation pendant que le liquide est encore chaud pour redissoudre les substances en dépôt.
Après stérilisation, le pH doit être de 7,0 ± 0,2, le mesurage étant effectué à la température ambiante.
5.2.5 Milieux de culture
5.2.5.1 Généralités
Les milieux de culture peuvent être préparés comme indiqué en 5.2.5.2, 5.2.5.3 et 5.2.5.4 ou à partir de
milieux de culture déshydratés en respectant les instructions du fabricant. Des milieux prêts à l’emploi
peuvent être utilisés si leur composition et/ou rendement de croissance sont comparables à ceux des
formulations indiquées en 5.2.5.2.1, 5.2.5.3.1 et 5.2.5.4.1.
5.2.5.2 Milieu de culture pour bactéries: gélose trypto-caséine-soja (TSA) ou milieu gélosé
aux peptones de caséine et de soja
5.2.5.2.1 Composition
Peptone pancréatique de caséine 15,0 g
Peptone papaïque de soja 5,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Gélose 15,0 g
Eau 1 000 ml
5.2.5.2.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau à chaud et en mélangeant les composants ou le milieu complet déshydraté.
Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Bien
mélanger après stérilisation pendant que le liquide est encore chaud pour redissoudre les substances
en dépôt. Après stérilisation et refroidissement, le pH doit être de 7,3 ± 0,2, le mesurage étant effectué à
la température ambiante.
5.2.5.3 Milieu de culture pour C. albicans: gélose de Sabouraud au dextrose (SDA)
5.2.5.3.1 Composition
Dextrose 40,0 g
Peptone pepsique de tissus animaux 5,0 g
Peptone pancréatique de caséine 5,0 g
Gélose 15,0 g
Eau 1 000 ml
5.2.5.3.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau à chaud et en mélangeant les composants ou le milieu complet déshydraté.
Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après
la stérilisation, le pH doit être de 5,6 ± 0,2, le mesurage étant effectué à température ambiante.
5.2.5.4 Milieu de culture pour A. brasiliensis: gélose à la pomme de terre et au dextrose (PDA)
5.2.5.4.1 Composition
Infusion de pommes de terre 200,0 g
Dextrose 20,0 g
Gélose (voir 5.2.5.4.2, Note 1) 20,0 g
Eau 1 000 ml
5.2.5.4.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau à chaud les composants ou le milieu complet déshydraté. Répartir le milieu dans
des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après la stérilisation, le pH
doit être de 5,6 ± 0,2, le mesurage étant effectué à température ambiante.
NOTE Si le milieu déshydraté disponible dans le commerce contient moins de 20 g/l de gélose, celui-ci peut
être, si nécessaire, complété en gélose pour obtenir une concentration finale de 20 g/l.
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5.3 Souches microbiennes
2)
L’essai doit être conduit en utilisant les souches suivantes comme micro-organismes d’essai :
3) 4) 5)
® TM ® TM ® TM
— Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (souche équivalente: CIP 82.118 ou NCIMB 8626
6) 7)
® TM ® TM
ou NBRC 13275 ou KCTC 2513 ou toute autre souche équivalente issue d’une collection
nationale);
® TM ® TM ® TM
— Staphylococcus aureus ATCC 6538 (souche équivalente: CIP 4.83 ou NCIMB 9518 ou
8)
® TM ® TM ® TM
NBRC 13276 ou KCTC 3881 ou NCTC 10788 ou toute autre souche équivalente issue
d’une collection nationale);
® TM ® TM ® TM
— Escherichia coli ATCC 8739 (souche équivalente: CIP 53.126 ou NCIMB 8545 ou
® TM ® TM ® TM
NBRC 3972 ou KCTC 2571 ou NCTC 12923 ou toute autre souche équivalente issue d’une
collection nationale);
9) 10)
® TM TM ® TM
— Candida albicans ATCC 10231 (souche équivalente: IP 48.72 ou NCPF 3179 ou
® TM ® TM
NBRC 1594 ou KCTC 7965 ou toute autre souche équivalente issue d’une collection nationale);
11)
® TM ® TM
— Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 (souche équivalente: IP 1431 ou IMI 149007 ou
® TM ® TM
NBRC 9455 ou KCTC 6196 ou toute autre souche équivalente issue d’une collection nationale).
La culture peut être acquise congelée, lyophilisée, sur pentes ou en formats prêts à l’emploi et il
convient de la préparer conformément aux modes opératoires fournis par le fournisseur de la souche
de référence. Il est recommandé de conserver les souches au laboratoire conformément à l’EN 12353 ou
selon une autre méthode appropriée.
5.4 Préparation et dénombrement des inoculums
5.4.1 Généralités
Pour réaliser les essais, utiliser les souches conservées au laboratoire (voir 5.3) pour obtenir les cultures
mères et les cultures de travail.
La culture mère est une culture confluente obtenue en étalant en stries la souche conservée (tube
monodose ou bille) sur des tubes en pente ou sur des boîtes. Après incubation, la culture mère peut être
conservée entre 2 °C et 8 °C pendant deux mois et elle est utilisée pour obtenir les cultures de travail.
La culture de travail, préparée au moment du besoin pour réaliser un essai, sert à obtenir la suspension
calibrée (inoculum).
2) Il s’agit d’exemples de produits appropriés disponibles dans le commerce. Cette information est donnée
à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande
l’emploi exclusif de ces produits ainsi désignés. ®
3) ATCC : American Type Culture Collection. ®
4) CIP : Collection de l’Institut Pasteur. ®
5) NCIMB : National Collection of Industrial and Marine Bacteria. ®
6) NBRC : NITE Biological Resource Center, JP. ®
7) KCTC : Korean Collection for Type Culture. ®
8) NCTC : National Collection of Type Cultures.
9) IP: Institut Pasteur. ®
10) NCPF : National Collection of Pathogenic Fungi.
11) IMI: International Mycological Institute, Royaume-Uni.
Les conditions de croissance (milieux gélosés et incubation) sont identiques pour les cultures mères et
les cultures de travail (voir 5.4.2 et 5.4.3).
NOTE 1 Un nombre limité de subcultures en série et l’utilisation de cultures confluentes à la place de colonies
isolées réduisent le risque de variation de la sensibilité des souches. La normalisation des conditions de croissance
et de la préparation de l’inoculum améliore la reproductibilité de l’essai.
NOTE 2 Éviter la décongélation lorsque des récipients multidoses sont utilisés (par exemple des récipients
contenant plusieurs billes sortis du congélateur pour prélever une bille, puis replacés dans le congélateur).
5.4.2 Préparation des suspensions bactériennes et de Candida albicans
5.4.2.1 Pour préparer la culture de travail du micro-organisme d’essai, préparer une subculture à
partir de la culture mère en repiquant la culture en stries sur des tubes en pente ou des boîtes (TSA
pour les bactéries, SDA pour C. albicans) afin d’obtenir une culture confluente. Incuber à (32,5 ± 2,5) °C
pendant 18 h à 24 h.
Préparer de la même manière une deuxième subculture à partir de la première et incuber à
(32,5 ± 2,5) °C pendant 18 h à 24 h. Il est possible de préparer une troisième subculture de la même
manière à partir de la seconde. La deuxième subculture et la troisième (si elle a été réalisée) constituent
les cultures de travail.
Si la deuxième subculture ne peut pas être réalisée à temps, la première subculture peut être conservée
jusqu’à 48 h dans l’incubateur (32,5 °C ± 2,5 °C) et utilisée pour préparer la deuxième subculture. Dans
ce cas, préparer la troisième subculture à incuber pendant 18 h à 24 h et l’utiliser pour réaliser l’essai.
Il est recommandé de ne pas préparer de quatrième subculture à partir de la culture mère initiale.
5.4.2.2 Mettre 10 ml de diluant (5.2.3.2) dans un récipient stérile approprié avec environ 5 g de billes
de verre stériles. À l’aide d’une anse, prélever la culture sur le milieu gélosé et la transférer dans le
diluant; il convient d’immerger l’anse dans une petite quantité de diluant contre la paroi du récipient et
de frotter l’anse pour disperser les cellules.
5.4.2.3 Agiter le récipient manuellement ou mécaniquement pendant au maximum 3 min pour
homogénéiser la suspension. Prélever par aspiration la partie supérieure de la suspension (en évitant
tout contact avec les billes de verre) et transférer la suspension ainsi obtenue dans un récipient stérile.
7 8
5.4.2.4 Ajuster le nombre de cellules dans la suspension à des valeurs de 1 × 10 UFC/ml à 1 × 10 UFC/
6 7
ml (bactéries) ou 1 × 10 UFC/ml à 1 × 10 UFC/ml (C. albicans) à l’aide du diluant (5.2.3.2) et en
fonction des données de calibrage obtenues au laboratoire (par exemple avec un spectrophotomètre,
voir l’ISO 21148:2017, Annexe C).
Utiliser cet inoculum calibré dans les 2 h.
5.4.2.5 Au moment de l’essai, contrôler le titre initial de la suspension, N. Réaliser des dilutions
décimales successives de la suspension calibrée dans le diluant (5.2.3.2). Réaliser le dénombrement par
inclusion en double de 1 ml des dilutions appropriées (voir 5.6.2) sur TSA pour les bactéries et sur SDA
pour C. albicans. Incuber les boîtes à (32,5 ± 2,5) °C pendant 24 h à 48 h.
5.4.3 Préparation de la suspension de spores d’Aspergillus brasiliensis
5.4.3.1 Pour obtenir la culture de travail du micro-organisme d’essai, utiliser une culture mère (sur
PDA) datant de moins de 2 mois et préparer une suspension dans le diluant (5.2.3.3). Inoculer par
inondation la surface de PDA (ou utiliser un nombre approprié de boîtes de Petri) de façon à obtenir une
culture confluente. Incuber à (22,5 ± 2,5) °C pendant 7 jours à 11 jours.
8 © ISO 2019 – Tous droits réservés
5.4.3.2 Après incubation, transférer 10 ml de la solution de polysorbate (5.2.3.3) sur la surface de PDA.
Détacher doucement les spores de la surface de la culture, par exemple à l’aide d’une spatule ou de billes
de verre.
Transférer la suspension dans un flacon approprié et agiter doucement pendant 1 min environ en
présence de billes de verre. Filtrer la suspension à l’aide d’un filtre en verre fritté de porosité 2 (c’est-à-
dire de 40 µm à 100 µm).
5.4.3.3 Observer au microscope (grossissement × 400) pour détecter la présence de spores germées
ou de fragments de mycélium.
— Si des spores germées sont présentes, la suspension doit être rejetée.
— Si du mycélium est présent dans plus d’un champ sur 10, laver la suspension filtrée par centrifugation
à 2 000 g pendant 20 min. Laver les spores au moins deux fois en les remettant en suspension dans
la solution de polysorbate (5.2.3.3) et en les centrifugeant.
5.4.3.4 Ajuster le nombre de spores dans la suspension à une valeur d’environ 1 × 10 spores/ml à
1 × 10 spores/ml à l’aide du diluant (5.2.3.3) et de tout moyen approprié.
Il est recommandé d’utiliser un dispositif de numération cellulaire (par exemple un hémocytomètre)
pour ajuster le nombre de spores. Si une cellule à numération appropriée est utilisée, suivre
scrupuleusement les instructions.
Il convient d’utiliser la suspension le jour même. Elle peut toutefois être utilisée le jour suivant si elle est
conservée entre 2 °C et 8 °C mais, au moment de l’essai, l’absence de spores germées doit être contrôlée.
5.4.3.5 Au moment de l’essai, contrôler le nombre initial de micro-organismes, N. Réaliser des dilutions
décimales successives de la suspension calibrée dans le diluant (5.2.3.3). Réaliser le dénombrement par
inclusion en double de 1 ml des dilutions appropriées (voir 5.6.2) sur des boîtes de PDA (en utilisant un
nombre approprié de boîtes de Petri). Incuber les boîtes à (22,5 ± 2,5) °C pendant 3 jours à 5 jours.
5.5 Démonstration de l’efficacité du milieu neutralisant
5.5.1 Principe
L’efficacité de la neutralisation est la vérification que le protocole d’une méthode d’essai neutralise
suffisamment les aspects antimicrobiens d’une formulation, garantissant que les micro-organismes
peuvent être détectés dans la matrice du produit sans inhiber les micro-organismes d’essai.
Une suspension calibrée de micro-organismes (environ 10 UFC/ml) est inoculée dans le milieu
neutralisant en présence (essai) et en l’absence (témoin) de formulation. L’efficacité du milieu
neutralisant est démontrée si les dénombrements réalisés sur l’inoculum, N , et le témoin, N
v vn
(mélange neutralisant/diluant) sont équivalents et si le dénombrement réalisé sur l’essai, N (mélange
vf
neutralisant/formulation) représente au moins 50 % de N (voir 5.5.4).
vn
5.5.2 Mode opératoire
Réaliser l’essai séparément pour chaque souche:
a) préparer une dilution de la suspension calibrée de micro-organismes [N étant compris entre
7 8 6 7
1 × 10 UFC/ml et 1 × 10 UFC/ml pour les bactéries, et entre 1 × 10 UFC/ml et 1 × 10 UFC/ml pour
C. albicans et A. brasiliensis (voir 5.4.2 et 5.4.3)] afin d’obtenir une suspension contenant environ
10 UFC/ml (inoculum);
b) transférer 1 g ou 1 ml de la formulation à soumettre à essai dans 9 ml de milieu neutralisant
(5.2.4). Agiter pour disperser la formulation. Si l’efficacité de neutralisation s’avère insuffisante
pour les conditions de dilution initiales/milieu neutralisant, répéter le mode opératoire en suivant
les recommandations données en 5.5.4, alinéa 4. D’autres conditions d’essai sont acceptables à
condition qu’au moins 1 g ou 1 ml de formulation soit utilisé et qu’une dilution décimale au minimal
soit réalisée;
c) laisser les tubes «essai» pendant (30 ± 15) minutes à la température ambiante. Préparer un témoin
en parallèle avec le même milieu neutralisant, mais en remplaçant la formulation soumise à essai
par 1 ml de diluant (5.2.3);
d) inoculer les tubes «essai» [dilution décimale et, si nécessaire, la dilution supplémentaire en 5.5.2 b)]
et les tubes «témoin» avec 1 ml de l’inoculum [5.5.2 a)] (volume final = 11 ml). Mélanger.
e) préparer le «témoin inoculum». Ajouter 1 ml de l’inoculum [5.5.2 a)] dans 10 ml de diluant (volume
final = 11 ml). Mélanger;
f) dénombrer en double par inclusion de 1 ml de chaque mélange («essai», «témoin» et «témoin
inoculum») dans le milieu gélosé approprié (TSA pour les bactéries, SDA pour C. albicans et PDA
pour A. brasiliensis);
Pour améliorer la précision des dénombrements (mélanges «essai», «témoin» et «témoin
inoculum»), il est recommandé de respecter le volume de 1 ml pour la suspension calibrée.
g) incuber à (32,5 ± 2,5) °C pendant 48 h à 72 h pour les bactéries et C. albicans, et à (22,5 ± 2,5) °C
pendant 3 jours à 5 jours pour A. brasiliensis.
5.5.3 Calculs
Calculer le nombre, N , de micro-organismes, en unités formant colonies par millilitre, présents dans le
v
témoin inoculum [voir 5.5.2 e)].
N est la moyenne du nombre de colonies dénombrées en double sur les boîtes dans 1 ml de prélèvement.
N doit être égal à 100 environ.
v
Calculer le nombre de micro-organismes, en unités formant colonies par millilitre, présents dans
le mélange «essai» avec le milieu neutralisant en présence de la formulation, N , et dans le mélange
vf
«témoin» avec le milieu neutralisant en l’absence de la formulation, N .
vn
N ou N est la moyenne du nombre de colonies dénombrées en double sur les boîtes dans 1 ml de
vf vn
prélèvement des mélanges «essai» et «témoin».
5.5.4 Interprétation des résultats et conclusion concernant l’efficacité du milieu neutralisant
L’efficacité du milieu neutralisant est démontrée si N ≥ 0,5N et si N est proche de N . Si N n’est
vf vn vn v vn
pas proche de N , le milieu neutralisant est considéré comme toxique pour les micro-organismes.
v
La variabilité inhérente au dénombrement sur gélose doit être prise en compte. Deux dénombrements
ne sont généralement considérés comme différents que si leur différence est supérieure à 50 %.
Noter les conditions d’essai (milieu neutralisant, volume, etc.), notamment la dilution de la formulation
(1/10, 1/100 ou autre) à laquelle l’efficacité du milieu neutralisant a été démontrée.
Si les résultats ne satisfont pas aux exigences, il est nécessaire:
— soit de modifier le milieu neutralisant (voir l’Annexe C) ou de procéder à une autre dilution de
l’échantillon;
— soit de réaliser une filtration sur membrane, si cela est possible.
Si les résultats ne sont toujours pas conformes aux exigences, il est peu probable que la formulation
puisse être contaminée par la souche concernée. Il est possible, même dans un tel cas, d’établir un
rapport d’essai [voir 5.7 et 5.8 f)].
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5.6 Détermination de l’efficacité de la protection antimicrobienne de la formulation
5.6.1 Mode opératoire
Réaliser l’essai séparément pour chaque souche.
5.6.1.1 Prélèvement du produit d’essai
Pour chaque souche, répartir 20 g ou 20 ml de la formulation soumise à essai dans un récipient stérile
(5.2.2.3).
5.6.1.2 Inoculation des micro-organismes d’essai
Ajouter dans chaque récipient 0,2 ml de l’inoculum calibré (voir 5.4.2 et 5.4.3) pour obtenir entre
5 6 4 5
1 × 10 UFC/ml et 1 × 10 UFC/ml ou g pour les bactéries, et entre 1 × 10 UFC/ml et 1 × 10 UFC/ml ou
g pour C. albicans et A. brasiliensis dans la formulation (concentration finale). Bien mélanger de façon à
obtenir une répartition homogène de l’inoculum.
La concentration initiale de micro-organismes présents dans le produit inoculé, N , est calculée à l’aide
des résultats du dénombrement de l’inoculum calibré, N [voir 5.6.3.2 b)].
5.6.1.3 Incubation de la formulation inoculée
Conserver les récipients contenant la formulation inoculée à (22,5 ± 2,5) °C.
5.6.1.4 Prélèvements et dénombrement
a) À chaque intervalle de prélèvement spécifié: 7 jours (T7), 14 jours (T14) et 28 jours (T28) selon
la souche d’essai (voir l’Annexe B), prélever 1 g de la formulation inoculée et préparer la dilution
pour laquelle l’efficacité de neutralisation a été démontrée (5.5). S’assurer que le facteur de dilution
approprié est utilisé en calculant N (voir 5.6.3.3).
x
Laisser en contact pendant (30 ± 15) min à la température ambiante.
b) À partir de la dilution pour laquelle l’efficacité de neutralisation a été démontrée, réaliser des
dilutions décimales successives dans le diluant (voir 5.2.3).
c) Dénombrer les micro-organismes en double en utilisant le milieu gélosé approprié (TSA pour les
bactéries, SDA pour C. albicans ou PDA pour A. brasiliensis) pour toutes les dilutions à T7. À T14 et
T28, la série de dilutions peut être ajustée en s’appuyant sur les résultats du T7.
d) Dans des boîtes de Petri de 85 mm à 100 mm de diamètre, mettre 1 ml de chaque dilution et verser
15 ml à 20 ml de milieu gélosé maintenu en surfusion dans un bain-marie à une température ne
dépassant pas 48 °C. Si des boîtes de Petri plus grandes sont utilisées, augmenter la quantité de
milieu gélosé en conséquence. Mélanger soigneusement la dilution et le milieu par rotation et
inclinaison des boîtes de manière à assurer la dispersion des micro-organismes. Laisser le mélange
se solidifier dans les boîtes de Petri en commençant sur une surface horizontale à la température
ambiante. D’autres méthodes de dénombrement (étalement en surface et filtrat
...
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