ISO 11930:2012
(Main)Cosmetics — Microbiology — Evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product
Cosmetics — Microbiology — Evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product
ISO 11930:2012 comprises a preservation efficacy test and a procedure for evaluating the overall antimicrobial protection of a cosmetic product which is not considered low risk. ISO 11930:2012 provides a procedure for interpretation of data generated by the preservation efficacy test or by the microbiological risk assessment, or both.
Cosmétiques — Microbiologie — Évaluation de la protection antimicrobienne d'un produit cosmétique
L'ISO 11930:2012 comprend un essai d'efficacité de la protection antimicrobienne et une procédure permettant d'évaluer la protection antimicrobienne globale d'un produit cosmétique qui n'est pas identifié comme étant à faible risque microbiologique. L'ISO 11930:2012 fournit une procédure pour l'interprétation des données résultant de l'essai d'efficacité de la protection antimicrobienne ou de l'évaluation du risque microbiologique, ou des deux.
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11930
First edition
2012-04-01
Corrected version
2013-05-01
Cosmetics — Microbiology — Evaluation
of the antimicrobial protection of a
cosmetic product
Cosmétiques — Microbiologie — Évaluation de la protection
antimicrobienne d'un produit cosmétique
Reference number
ISO 11930:2012(E)
©
ISO 2012
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ISO 11930:2012(E)
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ISO 11930:2012(E)
Contents
Foreword . iii
Introduction . v
1 Scope . 1
1.1 Preservation efficacy test . 1
1.2 Procedure for evaluating the antimicrobial protection of the cosmetic product . 1
2 Normative references . 2
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 3
5 Preservation efficacy test . 3
5.1 General . 3
5.2 Materials, apparatus, reagents and culture media . 3
5.2.1 Materials - Apparatus . 3
5.2.2 Diluents, neutralisers and culture media . 4
5.3 Microbial strains . 6
5.4 Preparation and enumeration of inocula . 7
5.4.1 General . 7
5.4.2 Preparation of bacterial and Candida albicans suspensions . 7
5.4.3 Preparation of Aspergillus brasiliensis (previously A. niger) spores suspension . 8
5.5 Demonstration of the neutraliser efficacy . 9
5.5.1 Principle . 9
5.5.2 Procedure . 9
5.5.3 Calculations . 9
5.5.4 Interpretation of results and conclusion on neutraliser efficacy . 10
5.6 Determination of the preservation efficacy of the formulation . 10
5.6.1 Procedure . 10
5.6.2 Counting of colonies . 11
5.6.3 Calculations . 12
5.7 Interpretation of test results and conclusions . 13
5.7.1 General case (the efficacy of neutraliser is demonstrated for all strains) . 13
5.7.2 Case of formulations for which the efficacy of neutraliser is not demonstrated for some
strains . 13
5.8 Test report . 14
6 Overall evaluation of the antimicrobial protection of the cosmetic product . 15
6.1 General . 15
6.2 Case 1 – The Preservation Efficacy test has been performed on the formulation . 15
6.3 Case 2 - The Preservation Efficacy test has not been performed on the formulation . 15
Annex A (normative) Decision diagram . 17
Annex B (normative) Evaluation criteria for the Preservation Efficacy Test (5.7) . 18
Annex C (informative) Examples of neutralisers for the antimicrobial activity of preservatives and
washing liquids . 19
Annex D (informative) Packaging Characteristics . 20
Bibliography . 21
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ISO 11930:2012(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 11930 was prepared by Technical Committee ISO/TC 217, Cosmetics.
This corrected version of ISO 11930:2012 incorporates the following correction:
— in Table B.1, in the Criteria A row, final column (T28), the words "and NI" have been added.
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ISO 11930:2012(E)
Introduction
This International Standard is to be used in the overall evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic
product.
The antimicrobial protection of a product can come from many sources:
— chemical preservation;
— inherent characteristics of the formulation;
— package design;
— manufacturing process.
This International Standard defines a series of steps to be taken when assessing the overall antimicrobial
protection of a cosmetic product. A reference method for a preservation efficacy test (challenge test) along
with evaluation criteria is also described in this International Standard.
The data generated by the risk assessment (see ISO 29621) or by the preservation efficacy test, or both, are
to be used to establish the level of antimicrobial protection required to minimize user risk.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 11930:2012(E)
Cosmetics — Microbiology — Evaluation of the antimicrobial
protection of a cosmetic product
1 Scope
1.1 General
This International Standard comprises:
— a preservation efficacy test;
— a procedure for evaluating the overall antimicrobial protection of a cosmetic product which is not
considered low risk, based on a risk assessment described in ISO 29621.
This International Standard provides a procedure for the interpretation of data generated by the preservation
efficacy test or by the microbiological risk assessment, or both.
1.2 Preservation efficacy test
This test is a reference method that is to be used to evaluate the preservation of a cosmetic formulation. It
applies to cosmetic products in the market place.
This test is not required for those cosmetic products for which the microbiological risk has been determined to
be low (see Annex A and ISO 29621).
This test is primarily designed for water-soluble or water-miscible cosmetic products and can require
adaptation, for example to test products in which water is the internal phase. The test described in this
International Standard involves, for each test micro-organism, placing the formulation in contact with a
calibrated inoculum, and then measuring the changes in the micro-organism count at set time intervals for a
set period and at a set temperature.
NOTE This test can be used as a guideline to develop an in-house method during the development cycle of cosmetic
products. In this case, the test can be modified or extended, or both, for example to make allowance for prior data and
different variables (microbial strains, media, incubation conditions exposure time, etc.). Compliance criteria can be
adapted to specific objectives. During the development stage of cosmetic products, other methods, where relevant, can be
used to determine the preservation efficacy of formulations.
1.3 Procedure for evaluating the antimicrobial protection of the cosmetic product
This procedure is based on careful consideration of the following points.
— Results of the preservation efficacy test. Not all cosmetic products will require a preservation efficacy test
(see Annex A and ISO 29621).
— Formulation characteristics and data provided by the microbiological risk assessment (see ISO 29621).
The analysis of the microbiological risk assessment is based on an overall approach. In particular, it
integrates variables such as characteristics and composition of the formulation, its production conditions,
the characteristics of the packaging in which the formulation will be delivered to the market place,
recommendations for use of the cosmetic product and, when relevant, the area of application and the
targeted user population (see Annex D).
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ISO 11930:2012(E)
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 16212, Cosmetics — Microbiology — Enumeration of yeast and mould
ISO 18415, Cosmetics — Microbiology — Detection of specified and non-specified microorganisms
ISO 21148, Cosmetics — Microbiology — General instructions for microbiological examination
ISO 21149, Cosmetics — Microbiology — Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria
ISO 22716, Cosmetics — Good Manufacturing Practices (GMP) — Guidelines on Good Manufacturing
Practices
ISO 29621, Cosmetics — Microbiology — Guidelines for the risk assessment and identification of
microbiologically low-risk products
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 21148 and the following apply.
3.1
cosmetic formulation
preparation of raw materials with a qualitatively and quantitatively defined composition
3.2
cosmetic product
finished cosmetic product that has undergone all stages of production, including packaging in its final
container for shipment
3.3
antimicrobial protection of a cosmetic product
ability of a cosmetic product to overcome microbial contamination that might present a potential risk to the
user
NOTE The overall antimicrobial protection includes preservation of the formulation, the specific manufacturing
process and protective packaging.
3.4
preservation of a cosmetic formulation
set of means used to avoid microbial proliferation in a cosmetic formulation
EXAMPLES Preservatives, multifunctional compounds, hostile raw materials, extreme pH, low water-activity values.
3.5
reference method
method applied by interested parties to assess a product on the market and in case of dispute
3.6
development method
in-house method
method used during the development stage of a product before the product is put on the market
2 © ISO 2012 – All rights reserved
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ISO 11930:2012(E)
3.7
consumer
end user of a cosmetic product
4 Principle
The evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product combines the following elements (see
Annex A).
a) The characteristics of its formulation (see ISO 29621) or the results of the preservation efficacy test (if
performed), or both.
The preservation efficacy test is described in 5.1.
b) The characteristics of the cosmetic product in conjunction with the production conditions (see ISO 22716
and ISO 29621), the packaging materials and, if justified, recommendations for use of the product (see
ISO 29621).
This International Standard describes a procedure for the interpretation of data generated by the preservation
efficacy test (if appropriate) and by the microbiological risk assessment.
5 Preservation efficacy test
5.1 General
The evaluation of the preservation of a cosmetic formulation is based on inoculation of the formulation with
calibrated inocula (prepared from relevant strains of micro-organisms). The number of surviving
micro-organisms is measured at defined intervals during a period of 28 days. For each time and each strain,
the log reduction value is calculated and compared to the minimum values required for evaluation criteria A or
B (see Annex B).
When used as a reference method, procedures shall be strictly followed in order to avoid variability in results.
To determine the preservation efficacy of a formulation during product development, other suitable
development methods may be used (see 1.2).
Prior to the test, the microbiological quality of the product shall be determined in accordance with ISO 21149
and ISO 16212, or with ISO 18415.
NOTE The micro-organisms present in the test sample should not interfere with the recovery of the test organisms.
In the test, the neutralization of the possible antimicrobial activity of the tested sample shall be checked and
demonstrated (see 5.5).
5.2 Materials, apparatus, reagents and culture media
General specifications and instructions are given in ISO 21148. When water is used in a formula, use distilled
water or purified water as specified in ISO 21148:2005, 8.2.
5.2.1 Materials
Use usual microbiology laboratory equipment (see ISO 21148) and:
5.2.1.1 Glass beads, 3 mm to 4 mm in diameter.
5.2.1.2 Sintered glass filter, of porosity 2 (40 µm to 100 µm).
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ISO 11930:2012(E)
5.2.1.3 Roux flasks.
5.2.1.4 Sterile glass containers with closures, of suitable volumes.
5.2.1.5 Centrifuge, capable of a centrifugal force of 2 000 g.
5.2.2 Diluents, neutralizers and culture media
5.2.2.1 General
Unless otherwise specified, all reagents shall be equilibrated at ambient temperature before use. When
available, ready-to-use reagents and media may be used.
5.2.2.2 Diluent
5.2.2.2.1 Composition
Pancreatic digest of casein 1,0 g
Sodium chloride 8,5 g
Water 1 000 ml
5.2.2.2.2 Preparation
Dissolve the components in the water by mixing while heating. Dispense into suitable containers. Sterilize in
the autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization, the pH shall be equivalent to 7,0 0,2 when measured
at room temperature.
5.2.2.2.3 Polysorbate solution (for preparation of A. brasiliensis spore suspension)
Prepare a solution of polysorbate 80 (0,5 g/l). Dissolve by mixing while heating until complete dissolution is
achieved. Dispense the solution into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min.
5.2.2.3 Neutralizer
5.2.2.3.1 General
The suitability and effectiveness of the neutralizing agent with respect to the test strains used and to the
tested formulation shall be demonstrated as specified in 5.5.
The neutralizer described in 5.2.2.3.2 is frequently used. Examples of other suitable neutralizers are given in
Annex C.
5.2.2.3.2 Eugon LT 100 liquid broth
5.2.2.3.2.1 General
This medium contains ingredients which neutralize inhibitory substances present in the sample (lecithin and
®
1
polysorbate 80) and dispersing agent octoxynol 9 (Triton X100 ). It may be prepared as described in
5.2.2.3.2.2, or from dehydrated culture medium, according to the manufacturer's instructions. A ready-to-use
medium may also be used.
1
Triton X100® is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience
of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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ISO 11930:2012(E)
5.2.2.3.2.2 Composition
Pancreatic digest of casein 15 g
Papaic digest of soybean meal 5 g
Sodium chloride 4 g
L-cystine 0,7 g
Sodium sulphite 0,2 g
Glucose 5,5 g
Egg lecithin 1 g
Polysorbate 80 5 g
Octoxynol 9 1 g
Water 1 000 ml
5.2.2.3.2.3 Preparation
Dissolve successively into boiling water polysorbate 80, octoxynol 9 and egg lecithin until they are completely
dissolved. Dissolve the other components by mixing while heating. Dispense the medium into suitable
containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. Mix well after sterilization while the liquid is still hot
to redissolve settled substances. After sterilization, the pH shall be equivalent to 7,0 0,2 when measured at
room temperature.
5.2.2.4 Culture media
5.2.2.4.1 General
Culture media may be prepared as in 5.2.2.4.2, or from dehydrated culture media according to the
manufacturer's instructions. Ready-to-use media may be used when their composition and/or growth yields
are comparable to those of the formulae given in 5.2.2.4.2.1.
5.2.2.4.2 Culture medium for bacteria: tryptic soy agar (TSA) or soybean casein digest agar medium
5.2.2.4.2.1 Composition
Pancreatic digest of casein 15,0 g
Papaic digest of soybean meal 5,0 g
Sodium chloride 5,0 g
Agar 15,0 g
Water 1 000 ml
5.2.2.4.2.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water by mixing while heating. Dispense
the medium into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. Mix well after sterilization
while the liquid is still hot to redissolve settled substances. After sterilization and cooling down, the pH shall be
equivalent to 7,3 0,2 when measured at room temperature.
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ISO 11930:2012(E)
5.2.2.4.3 Culture medium for C. albicans: Sabouraud dextrose agar medium (SDA)
5.2.2.4.3.1 Composition
40,0 g
Dextrose
5,0 g
Peptic digest of animal tissue
5,0 g
Pancreatic digest of casein
15,0 g
Agar
1 000 ml
Water
5.2.2.4.3.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water by mixing while heating. Dispense
the medium into suitable containers. Sterilize in an autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization, the pH
shall be equivalent to 5,6 0,2 when measured at room temperature.
5.2.2.4.4 Culture medium for A. brasiliensis: potato dextrose agar (PDA)
5.2.2.4.4.1 Composition
Potato infusion (see 5.2.2.4.4.2, Note 1) 200,0 g
Dextrose 20,0 g
Agar (see 5.2.2.4.4.2, Note 2) 20,0 g
Water 1 000 ml
5.2.2.4.4.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water by heating. Dispense the medium
into suitable containers. Sterilize in an autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization, the pH shall be
equivalent to 5,6 0,2 when measured at room temperature.
NOTE 1 To prepare potato infusion, use a commercial dehydrated form or boil 200 g sliced, unpeeled potatoes in 1 l of
water for 30 min. Filter through a cheesecloth, saving the effluent.
NOTE 2 Commercially available dehydrated medium powders which contain less than 20 g/l of agar can be
supplemented with extra agar to the final concentration of 20 g/l if necessary.
5.3 Microbial strains
The test shall be run using the following strains as test micro-organisms:
® TM ® TM ® TM
2 3 4
— Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (equivalent strain: CIP 82.118 or NCIMB 8626 or
® TM ® TM
5 6
NBRC 13275 or KCTC 2513 or other equivalent national collection strain);
®
2
ATCC : American Type Culture Collection
®
3
CIP : Collection de l'Institut Pasteur
®
4
NCIMB : National Collection of Industrial Marine Bacteria
®
5
NBRC : NITE Biological Resource Center, JP
®
6
KCTC : Korean Collection for Type Cultures
6 © ISO 2012 – All rights reserved
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ISO 11930:2012(E)
® TM ® TM ® TM
— Staphylococcus aureus ATCC 6538 (equivalent strain: CIP 4.83 or NCIMB 9518 or
® TM ® TM ® TM
7
NBRC 13276 or KCTC 3881 or NCTC 10788 or other equivalent national collection strain);
® TM ® TM ® TM ® TM
— Escherichia coli ATCC 8739 (equivalent strain: CIP 53.126 or NCIMB 8545 or NBRC 3972 or
® TM ® TM
KCTC 2571 or NCTC 12923 or other equivalent national collection strain);
® TM TM ® TM ® TM
8 9
— Candida albicans ATCC 10231 (equivalent strain: IP 48.72 or NCPF 3179 or NBRC 1594 or
® TM
KCTC 7965 or other equivalent national collection strain);
® TM
— Aspergillus brasiliensis (previously A. niger) ATCC 16404 (equivalent strain: IP 1431 or
® TM ® TM ® TM
10
IMI 149007 or NBRC 9455 or KCTC 6196 or other equivalent national collection strain).
The culture should be reconstituted according to the procedures provided by the supplier of the reference
strain. The strains should be stored in a laboratory conforming to EN 12353 or according to another suitable
method.
5.4 Preparation and enumeration of inocula
5.4.1 General
To perform the tests, use the strains stored in the laboratory (see 5.3) to obtain the stock cultures and the
working cultures.
The stock culture is a confluent culture obtained by streaking slant tubes or plates with the stored strain
(single-use vial or bead). After incubation, the stock culture can be kept between 2 °C and 8 °C for two
months and is used to obtain the working cultures.
The working culture, prepared when needed to perform a test, is used to obtain the calibrated suspension
(inoculum).
The same growth conditions (agar media and incubation) are used for both stock cultures and working
cultures (see 5.4.2 and 5.4.3).
NOTE 1 A limited number of serial subcultures and the use of confluent cultures instead of isolated colonies lower the
risk of change in the susceptibility of strains. The standardization of growth conditions and of inoculum preparation
improves the reproducibility of the test.
NOTE 2 Changes in susceptibility of strains stored by freezing may be observed (due to repeated heat shocks) when
multidose containers are used (for example, containers with several beads brought out of the freezer to take one bead,
then replaced in the freezer).
5.4.2 Preparation of bacterial and Candida albicans suspensions
5.4.2.1 To prepare the working culture of the test micro-organism, prepare a subculture from the stock
culture by streaking slant tubes or plates (TSA for bacteria, SDA for C.albicans) in order to obtain a confluent
culture. Incubate at (32,5 2,5) °C for 18 h to 24 h.
Prepare in the same way a second subculture, starting from the first, and incubate at (32,5 2,5) °C for 18 h
to 24 h. A third subculture can be grown in the same way, starting from the second. The second culture and
the third one (if it was carried out) form the working culture.
®
7
NCTC : National Collection of Type Cultures
8
IP: Institut Pasteur
®
9
NCPF : National Collection of Pathogenic Fungi
10
IMI: International Mycological Institute, UK
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ISO 11930:2012(E)
If the second subculture cannot be carried out in a timely manner, then the first subculture can be kept for up
to 48 h in the incubator (32,5 2,5) °C and used to prepare the second subculture. In this case, prepare the
third 18 h to 24 h subculture and use this in the test.
It is recommended that a fourth subculture not be prepared from the initial stock culture.
5.4.2.2 Take 10 ml of diluent (5.2.2.2) and place in a suitable sterile container with approximately 5 g of
sterile glass beads. Transfer loopfuls of the cells harvested from the agar medium into the diluent; the cells
should be suspended in the diluent by rubbing the loop in a small amount of the diluent against the side of the
container to dislodge the cells.
5.4.2.3 Shake the container manually or mechanically, for a maximum of 3 min, to homogenize the
suspension. Aspirate the upper part of the suspension (avoiding any contact with the glass beads) and
transfer the obtained suspension to a sterile container.
7 8
5.4.2.4 Adjust the number of cells in the suspension to 1 10 cfu/ml to 1 10 cfu/ml (bacteria) or
6 7
1 10 cfu/ml to 1 10 cfu/ml (C. albicans) using the diluent (5.2.2.2) and in accordance with calibration data
produced in the laboratory (e.g. using a spectrophotometer, see ISO 21148:2005, Annex C).
Use this calibrated suspension within 2 h.
5.4.2.5 At the time of the test, check the initial capacity of the suspension, N. Make successive tenfold
dilutions of the calibrated suspension in the diluent (5.2.2.2). Perform the enumeration by duplicating 1 ml of
the suitable dilutions (see 5.6.2) into TSA for bacteria and into SDA for C.albicans. Incubate the dishes at
(32,5 2,5) °C for 24 h to 48 h.
5.4.3 Preparation of A. brasiliensis (previously A. niger) spore suspension
5.4.3.1 To obtain the working culture of the test micro-organism, use a stock culture (on PDA) aged not
more than 2 months and prepare a suspension in the diluent (5.2.2.2). Inoculate by flooding the surface of
PDA, poured in a Roux flask (or use an appropriate number of Petri dishes), so as to obtain a confluent
culture. Incubate at (22,5 2,5) °C for 7 days to 11 days.
5.4.3.2 After incubation, transfer 10 ml of the polysorbate solution (5.2.2.2.3) to the Roux flask. Gently
detach the spores from the culture surface, for example using a spatula or glass beads.
Transfer the suspension to an appropriate flask and stir gently for about 1 min in the presence of glass beads.
Filter the suspension through a sintered glass filter of porosity 2 (i.e. 40 µm to 100 µm).
5.4.3.3 Carry out a microscopic examination (magnification 400) to detect the presence of germinated
spores or mycelium fragments.
— If germinated spores are present, the suspension shall be discarded.
— If mycelium is present in more than one field out of ten, wash the filtered suspension by centrifuging at
2 000 g for 20 min. Wash the spores at least twice by re-suspending them in the polysorbate solution
(5.2.2.2.3) and centrifuging.
6
5.4.3.4 Adjust the number of spores in the suspension to a value of about 1 10 spores/ml to
7
1 10 spores/ml using the diluent (5.2.2.2) and any appropriate means.
NOTE The use of a ce
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11930
Première édition
2012-04-01
Version corrigée
2013-05-01
Cosmétiques — Microbiologie —
Évaluation de la protection
antimicrobienne d'un produit cosmétique
Cosmetics — Microbiology — Evaluation of the antimicrobial protection
of a cosmetic product
Numéro de référence
ISO 11930:2012(F)
©
ISO 2012
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Sommaire Page
Avant-propos . iv
Introduction . v
1 Domaine d'application . 1
1.1 Généralités . 1
1.2 Essai d’efficacité de la protection antimicrobienne . 1
1.3 Procédure d’évaluation de la protection antimicrobienne d’un produit cosmétique . 1
2 Références normatives . 2
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 3
5 Essai d’efficacité de la protection antimicrobienne . 3
5.1 Généralités . 3
5.2 Matériel, réactifs et milieux de culture . 3
5.2.1 Matériel . 4
5.2.2 Diluant, neutralisants et milieux de culture . 4
5.3 Souches microbiennes . 7
5.4 Préparation et dénombrement des inoculums . 8
5.4.1 Généralités . 8
5.4.2 Préparation des suspensions bactériennes et de Candida albicans . 8
5.4.3 Préparation de la suspension de spores d’Aspergillus brasiliensis
(antérieurement Aspergillus niger) . 9
5.5 Démonstration de l’efficacité du neutralisant . 9
5.5.1 Principe . 9
5.5.2 Mode opératoire . 10
5.5.3 Calculs . 10
5.5.4 Interprétation des résultats et conclusion concernant l’efficacité du neutralisant . 10
5.6 Détermination de l’efficacité de la protection antimicrobienne de la formulation . 11
5.6.1 Mode opératoire . 11
5.6.2 Comptage des colonies . 12
5.6.3 Calculs . 12
5.7 Interprétation des résultats d’essai et conclusions . 14
5.7.1 Critères . 14
5.7.2 Cas général (l’efficacité du neutralisant est démontrée pour toutes les souches) . 14
5.7.3 Cas des formulations pour lesquelles l’efficacité du neutralisant n’est pas démontrée
pour certaines souches . 14
5.8 Rapport d’essai . 15
6 Évaluation globale de la protection antimicrobienne d’un produit cosmétique. 16
6.1 Généralités . 16
6.2 Cas 1 — L’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne a été réalisé sur la
formulation . 16
6.3 Cas 2 — L’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne n’a pas été réalisé sur la
formulation . 16
Annexe A (normative) Diagramme décisionnel . 18
Annexe B (normative) Critères d’évaluation pour l’essai d’efficacité de la protection
antimicrobienne (voir 5.7) . 19
Annexe C (informative) Exemples de neutralisants de l’activité antimicrobienne, de
conservateurs et liquides de lavage . 20
Annexe D (informative) Caractéristiques du conditionnement . 21
Bibliographie . 22
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ISO 11930:2012(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 11930 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 217, Cosmétiques.
La présente version corrigée de l’ISO 11930:2012 inclut une modification du Tableau B.1 ainsi qu’une
modification du texte dans le rectangle jaune en bas à droite du logigramme de l’Annexe A.
iv © ISO 2012 – Tous droits réservés
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ISO 11930:2012(F)
Introduction
La présente Norme internationale est destinée à être utilisée pour l’évaluation globale de la protection
antimicrobienne d’un produit cosmétique.
La protection antimicrobienne d’un produit peut avoir plusieurs origines:
— protection chimique;
— caractéristiques inhérentes de la formulation;
— conception du conditionnement;
— procédé de fabrication.
La présente Norme internationale définit une série d’étapes à suivre pour évaluer la protection
antimicrobienne globale d’un produit cosmétique. Une méthode de référence d’essai d’efficacité de la
protection antimicrobienne (test d’épreuve) accompagné de critères d’évaluation est également décrite dans
la présente Norme internationale.
Les données résultant de l’appréciation de risque (voir l’ISO 29621) ou de l’essai d’efficacité de la protection
antimicrobienne, ou des deux, doivent être utilisées pour établir le niveau de protection antimicrobienne requis
afin de réduire au minimum le risque pour l’utilisateur.
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NORME INTERNATIONALE ISO 11930:2012(F)
Cosmétiques — Microbiologie — Évaluation de la protection
antimicrobienne d'un produit cosmétique
1 Domaine d'application
1.1 Généralités
La présente Norme internationale comprend
— un essai d’efficacité de la protection antimicrobienne, et
— une procédure permettant d’évaluer la protection antimicrobienne globale d’un produit cosmétique qui
n’est pas identifié comme étant à faible risque microbiologique d’après l’appréciation du risque décrite
dans l’ISO 29621.
La présente Norme internationale fournit une procédure pour l’interprétation des données résultant de l’essai
d’efficacité de la protection antimicrobienne ou de l’appréciation du risque microbiologique, ou des deux.
1.2 Essai d’efficacité de la protection antimicrobienne
Cet essai est une méthode de référence servant à évaluer la protection antimicrobienne d’une formulation
cosmétique. Il s’applique aux produits cosmétiques sur le marché.
Cet essai n’est pas requis pour les produits cosmétiques pour lesquels il a été démontré que le risque
microbiologique est faible (voir l’Annexe A et l’ISO 29621).
Cet essai est principalement conçu pour les produits cosmétiques solubles dans l’eau ou miscibles à l’eau, et
il peut nécessiter une adaptation, par exemple pour les produits soumis à essai dont la phase interne est
aqueuse. L’essai décrit dans la présente Norme internationale implique, pour chaque micro-organisme
d’essai, de mettre en contact la formulation avec un inoculum calibré, puis de mesurer l’évolution du nombre
de micro-organismes à des intervalles de temps définis, pendant une période définie et à une température
définie.
NOTE Cet essai peut servir de ligne directrice pour mettre au point une méthode interne au cours du cycle de
développement d’un produit cosmétique. Dans ce cas, l’essai peut être modifié ou élargi, ou les deux, par exemple pour
prendre en compte des données antérieures et différents paramètres (souches microbiennes, milieux, conditions et durée
d’incubation, etc.). Les critères de conformité peuvent être adaptés à des objectifs spécifiques. Au cours de la phase de
développement des produits cosmétiques, d’autres méthodes peuvent être utilisées, le cas échéant, pour déterminer
l’efficacité de la protection antimicrobienne des formulations.
1.3 Procédure d’évaluation de la protection antimicrobienne d’un produit cosmétique
Cette procédure repose sur la prise en compte minutieuse des les points suivants.
— Les résultats de l’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne. Tous les produits cosmétiques ne
nécessitent pas un essai d’efficacité de la protection antimicrobienne (voir l’Annexe A et l’ISO 29621);
— Les caractéristiques de la formulation et les données fournies par l’évaluation du risque microbiologique
(voir l’ISO 29621). L’analyse pour l’évaluation du risque microbiologique repose sur une approche
globale. Elle intègre en particulier des paramètres, tels que les caractéristiques et la composition de la
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ISO 11930:2012(F)
formulation, ses conditions de production, les caractéristiques du conditionnement dans lequel la
formulation sera livrée sur le marché, les recommandations d’utilisation du produit cosmétique et, le cas
échéant, la zone d’application et la population d’utilisateurs ciblés (voir l’Annexe D).
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 16212, Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement des levures et des moisissures
ISO 18415, Cosmétiques — Microbiologie — Détection des micro-organismes spécifiés et non spécifiés
ISO 21148, Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour les examens microbiologiques
ISO 21149, Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement et détection des bactéries aérobies mésophiles
ISO 22716, Cosmétiques — Bonnes pratiques de fabrication (BPF) — Lignes directrices relatives aux bonnes
pratiques de fabrication
ISO 29621, Cosmétiques — Microbiologie — Lignes directrices pour l'appréciation du risque et l'identification
de produits à faible risque microbiologique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 21148 ainsi que les
suivants s’appliquent.
3.1
formulation cosmétique
préparation constituée de matières premières dont la composition est qualitativement et quantitativement
définie
3.2
produit cosmétique
produit cosmétique fini ayant subi toutes les étapes de la production, y compris le conditionnement dans son
emballage final
3.3
protection antimicrobienne d’un produit cosmétique
aptitude d’un produit cosmétique à résister à une contamination microbienne pouvant présenter un risque
potentiel pour l’utilisateur
NOTE La protection antimicrobienne globale inclut la protection antimicrobienne de la formulation, le procédé de
fabrication spécifique et le conditionnement protecteur.
3.4
protection antimicrobienne d’une formulation cosmétique
ensemble des moyens mis en œuvre pour éviter la prolifération microbienne dans une formulation cosmétique
EXEMPLES Conservateurs, composés multifonctionnels, matières premières hostiles, pH extrême et faible activité de
l’eau.
3.5
méthode de référence
méthode appliquée par les parties intéressées pour évaluer un produit sur le marché et en cas de litige
2 © ISO 2012 – Tous droits réservés
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ISO 11930:2012(F)
3.6
méthode de développement
méthode interne
méthode utilisée au cours de la phase de développement d’un produit avant sa mise sur le marché
3.7
consommateur
utilisateur final d’un produit cosmétique
4 Principe
L’évaluation de la protection antimicrobienne d’un produit cosmétique comprend les points suivants
(voir l’Annexe A).
a) Les caractéristiques de sa formulation (voir l’ISO 29621) ou les résultats de l’essai d’efficacité de la
protection antimicrobienne (s’il a été réalisé), ou les deux.
L'essai d'efficacité de la protection antimicrobienne est décrit en 5.1.
b) Les caractéristiques du produit cosmétique conjointement avec les conditions de production
(voir l’ISO 22716 et l’ISO 29621), les matériaux de conditionnement et, si cela est justifié, les
recommandations d’utilisation du produit (voir l’ISO 29621).
La présente Norme internationale décrit une procédure pour l’interprétation des données résultant de l’essai
d’efficacité de la protection antimicrobienne (s’il est approprié) et de l’évaluation du risque microbiologique.
5 Essai d’efficacité de la protection antimicrobienne
5.1 Généralités
L’évaluation de la protection antimicrobienne d’une formulation cosmétique repose sur l’inoculation de la
formulation avec des inoculums calibrés (préparés à partir de souches de micro-organismes pertinents). Le
nombre de micro-organismes survivants est mesuré à des intervalles de temps prédéfinis pendant 28 jours.
Pour chaque temps et chaque souche, le taux de réduction logarithmique est calculé et comparé aux valeurs
minimales requises pour les critères d’évaluation A ou B (voir Annexe B).
Lorsqu’ils sont utilisés comme méthode de référence, les modes opératoires doivent être suivis
scrupuleusement afin d’éviter toute variabilité des résultats. Pour déterminer l’efficacité de la protection
antimicrobienne d’une formulation lors du développement d’un produit, d’autres méthodes de développement
adaptées peuvent être utilisées (voir 1.2).
Préalablement à l’essai, la qualité microbiologique du produit doit être déterminée conformément à
l’ISO 21149 et l’ISO 16212, ou à l’ISO 18415.
NOTE Il est recommandé que les micro-organismes présents dans l’échantillon d’essai n’interfèrent pas avec le
recouvrement des organismes d’essai.
Au cours de l’essai, la neutralisation de l’éventuelle activité antimicrobienne de l’échantillon soumis à essai
doit être contrôlée et démontrée (voir 5.5).
5.2 Matériel, réactifs et milieux de culture
Des spécifications générales et des instructions sont fournies dans l’ISO 21148. Lorsque de l’eau est
mentionnée dans une composition, utiliser de l’eau distillée ou de l’eau purifiée, comme spécifié dans
l’ISO 21148:2005, 8.2.
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ISO 11930:2012(F)
5.2.1 Matériel
Utiliser le matériel courant d’un laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 21148) plus:
5.2.1.1 Billes de verre, de 3 mm à 4 mm de diamètre.
5.2.1.2 Filtre en verre fritté, de porosité 2 (40 µm à 100 µm).
5.2.1.3 Fioles de Roux.
5.2.1.4 Récipients en verre stériles, munis de bouchons, de volumes appropriés.
5.2.1.5 Centrifugeuse, capable de centrifuger à 2 000g.
5.2.2 Diluant, neutralisants et milieux de culture
5.2.2.1 Généralités
Sauf spécification contraire, tous les diluants et neutralisants doivent être équilibrés à la température
ambiante avant usage. S’ils sont disponibles, des diluants, neutralisants et milieux prêts à l’emploi peuvent
être utilisés.
5.2.2.2 Diluant
5.2.2.2.1 Composition
Peptone pancréatique de caséine 1,0 g
Chlorure de sodium 8,5 g
Eau 1 000 ml
5.2.2.2.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau à chaud et en mélangeant les composants. Répartir dans des récipients appropriés.
Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation, le pH doit être de 7,0 0,2, le mesurage
étant effectué à la température ambiante.
5.2.2.2.3 Solution de polysorbate (pour la préparation de la suspension de spores d’Aspergillus
brasiliensis)
Préparer une solution de polysorbate 80 [0,5 g/l]. Dissoudre en mélangeant tout en chauffant jusqu’à
dissolution complète. Répartir la solution dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C
pendant 15 min.
5.2.2.3 Neutralisant
5.2.2.3.1 Généralités
L’adéquation et l’efficacité du neutralisant relativement aux souches d’essai utilisées et à la formulation
soumise à essai doivent être démontrées comme spécifié en 5.5.
Le neutralisant décrit en 5.2.2.3.2 est souvent utilisé. D’autres neutralisants pouvant convenir sont donnés à
titre d’exemples dans l’Annexe C.
4 © ISO 2012 – Tous droits réservés
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ISO 11930:2012(F)
5.2.2.3.2 Milieu liquide Eugon LT 100
5.2.2.3.2.1 Généralités
Ce milieu contient des ingrédients qui neutralisent les substances inhibitrices présentes dans l’échantillon,
®
1
lécithine et polysorbate 80, ainsi qu’un agent dispersant, octoxynol 9 (Triton X100 ). Il peut être préparé
comme indiqué en 5.2.2.3.2.3 ou à partir d’un milieu de culture déshydraté en respectant les instructions du
fabricant. Un milieu prêt à l’emploi peut également être utilisé.
5.2.2.3.2.2 Composition
Peptone pancréatique de caséine 15 g
Peptone papaïque de soja 5 g
Chlorure de sodium 4 g
L-cystine 0,7 g
Sulfite de sodium 0,2 g
Glucose 5,5 g
Lécithine d’œuf 1 g
Polysorbate 80 5 g
Octoxynol 9 1 g
Eau 1 000 ml
5.2.2.3.2.3 Préparation
Dissoudre dans l’eau bouillante successivement le polysorbate 80, l’octoxynol 9 et la lécithine d’œuf jusqu’à
dissolution complète. Dissoudre les autres composants à chaud et en mélangeant. Répartir le milieu dans des
récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Bien mélanger après stérilisation
pendant que le liquide est encore chaud pour redissoudre les substances en dépôt. Après stérilisation, le pH
doit être de 7,0 0,2, le mesurage étant effectué à la température ambiante.
5.2.2.4 Milieux de culture
5.2.2.4.1 Généralités
Les milieux de culture peuvent être préparés comme indiqué en 5.2.2.4.2.2 ou à partir de milieux de culture
déshydratés en respectant les instructions du fabricant. Des milieux prêts à l’emploi peuvent être utilisés si
leur composition et/ou rendement de croissance sont comparables à ceux des formulations indiquées en
5.2.2.4.2.1.
®
1 Triton X100 est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention
des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du
produit ainsi désigné.
© ISO 2012 – Tous droits réservés 5
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ISO 11930:2012(F)
5.2.2.4.2 Milieu de culture pour bactéries: gélose trypto-caséine-soja (TSA) ou milieu gélosé aux
peptones de caséine et de soja
5.2.2.4.2.1 Composition
Peptone pancréatique de caséine 15,0 g
Peptone papaïque de soja 5,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Gélose 15,0 g
Eau 1 000 ml
5.2.2.4.2.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau à chaud et en mélangeant les composants ou le milieu complet déshydraté. Répartir le
milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Bien mélanger après
stérilisation pendant que le liquide est encore chaud pour redissoudre les substances en dépôt. Après
stérilisation et refroidissement, le pH doit être de 7,3 0,2, le mesurage étant effectué à la température
ambiante.
5.2.2.4.3 Milieu de culture pour Candida albicans: gélose de Sabouraud au dextrose (SDA)
5.2.2.4.3.1 Composition
Dextrose 40,0 g
Peptone pepsique de tissus animaux 5,0 g
Peptone pancréatique de caséine 5,0 g
Gélose 15,0 g
Eau 1 000 ml
5.2.2.4.3.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau à chaud et en mélangeant les composants ou le milieu complet déshydraté. Répartir le
milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation, le
pH doit être de 5,6 0,2, le mesurage étant effectué à la température ambiante.
5.2.2.4.4 Milieu de culture pour Aspergillus brasiliensis: gélose à la pomme de terre et au
dextrose (PDA)
5.2.2.4.4.1 Composition
Infusion de pommes de terre 200,0 g
(voir 5.2.2.4.4.2, Note 1)
Dextrose 20,0 g
Gélose (voir 5.2.2.4.4.2, Note 2) 20,0 g
Eau 1 000 ml
6 © ISO 2012 – Tous droits réservés
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ISO 11930:2012(F)
5.2.2.4.4.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau à chaud les composants ou le milieu complet déshydraté. Répartir le milieu dans des
récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation, le pH doit être de
5,6 0,2, le mesurage étant effectué à la température ambiante.
NOTE 1 Pour préparer l’infusion de pommes de terre, utiliser le produit déshydraté commercialisé ou faire bouillir
200 g de pommes de terre non épluchées et en tranches dans 1 l d’eau pendant 30 min. Filtrer à travers de la gaze en
conservant le filtrat.
NOTE 2 Si le milieu déshydraté disponible dans le commerce contient moins de 20 g/l de gélose, celui-ci peut être, si
nécessaire, supplémenté en gélose pour obtenir une concentration finale de 20 g/l.
5.3 Souches microbiennes
L’essai doit être conduit en utilisant les souches suivantes comme micro-organismes d’essai:
® ® ®
2 3 4
— Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (souche équivalente: CIP 82.118 ou NCIMB 8626 ou
® ®
5 6
NBRC 13275 ou KCTC 2513 ou toute autre souche équivalente issue d’une collection nationale);
® ® ® ®
— Staphylococcus aureus ATCC 6538 (souche équivalente: CIP 4.83 ou NCIMB 9518 ou NBRC 13276
® ®
7
ou KCTC 3881 ou NCTC 10788 ou toute autre souche équivalente issue d’une collection nationale);
® ® ® ®
— Escherichia coli ATCC 8739 (souche équivalente: CIP 53.126 ou NCIMB 8545 ou NBRC 3972 ou
® ®
KCTC 2571 ou NCTC 12923 ou toute autre souche équivalente issue d’une collection nationale);
® ® ®
8 9
— Candida albicans ATCC 10231 (souche équivalente: IP 48.72 ou NCPF 3179 ou NBRC 1594 ou
®
7965 ou toute autre souche équivalente issue d’une collection nationale);
KCTC
®
— Aspergillus brasiliensis (antérieurement A. niger) ATCC 16404 (souche équivalente: IP 1431 ou
® ® ®
10
IMI 149007 ou NBRC 9455 ou KCTC 6196 ou toute autre souche équivalente issue d’une collection
nationale).
Il convient de reconstituer la culture conformément aux modes opératoires indiqués par le fournisseur de la
souche de référence. Il convient de conserver les souches au laboratoire conformément à l’EN 12353 ou
selon une autre méthode appropriée.
®
2
ATCC : American Type Culture Collection
®
3
CIP : Collection de l’Institut Pasteur
®
4
NCIMB : National Collection of Industrial and Marine Bacteria
®
5
NBRC : NITE Biological Resource Center, JP
®
6
KCTC : Korean Collection for Type Culture
®
7
NCTC : National Collection of Type Cultures
8
IP: Institut Pasteur
®
9
NCPF : National Collection of Pathogenic Fungi
10
IMI: International Mycological Institute, Royaume-Uni
© ISO 2012 – Tous droits réservés 7
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ISO 11930:2012(F)
5.4 Préparation et dénombrement des inoculums
5.4.1 Généralités
Pour réaliser les essais, utiliser les souches conservées au laboratoire (voir 5.3) pour obtenir les cultures
mères et les cultures de travail.
La culture mère est une culture confluente obtenue en étalant en stries sur des tubes en pente ou sur des
boîtes la souche conservée (tube monodose ou bille). Après incubation, la culture mère peut être conservée
entre 2 °C et 8 °C pendant deux mois et elle est utilisée pour obtenir les cultures de travail.
La culture de travail, préparée au moment du besoin pour réaliser un essai, sert à obtenir la suspension
calibrée (inoculum).
Les conditions de croissance (milieux gélosés et incubation) sont identiques pour les cultures mères et les
cultures de travail (voir 5.4.2 et 5.4.3).
NOTE 1 Un nombre limité de subcultures en série et l’utilisation de cultures confluentes à la place de colonies isolées
réduisent le risque de variation de la sensibilité des souches. La standardisation des conditions de croissance et de la
préparation de l’inoculum améliore la reproductibilité de l’essai.
NOTE 2 Des changements de sensibilité des souches conservées par congélation peuvent être observés (en raison
des chocs thermiques répétés) lorsque des récipients multidoses sont utilisés (par exemple des récipients contenant
plusieurs billes sortis du congélateur pour prélever une bille, puis replacés dans le congélateur).
5.4.2 Préparation des suspensions bactériennes et de Candida albicans
5.4.2.1 Pour préparer la culture de travail du micro-organisme d’essai, préparer une subculture à partir
de la culture mère en repiquant la culture en stries sur des tubes en pente ou des boîtes (TSA pour les
bactéries, SDA pour Candida albicans) afin d’obtenir une culture confluente. Incuber à 32,5 °C 2,5 °C
pendant 18 h à 24 h.
Préparer de la même manière une seconde subculture à partir de la première et incuber à 32,5 °C 2,5 °C
pendant 18 h à 24 h. Il est possible de préparer une troisième subculture de la même manière à partir de la
seconde. La seconde cultu
...
PROJET
NORME ISO/FDIS
FINAL
INTERNATIONALE 11930
ISO/TC 217
Cosmétiques — Microbiologie —
Secrétariat: ISIRI
Évaluation de la protection
Début de vote:
antimicrobienne d’un produit cosmétique
2012-01-12
Vote clos le:
Cosmetics — Microbiology — Evaluation of the antimicrobial protection
2012-03-12
of a cosmetic product
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT
INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSER-
Veuillez consulter les notes administratives en page iii
VATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT
CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMEN-
TATION EXPLICATIVE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS
INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET COM-
Numéro de référence
MERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE DES
ISO/FDIS 11930:2012(F)
UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR POSSI-
BILITÉ DE DEVENIR DES NORMES POUVANT
SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA RÉGLEMENTA-
©
TION NATIONALE. ISO 2012
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/FDIS 11930:2012(F)
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TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
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soumis selon le mode de collaboration sous la direction de l’ISO, tel que défini dans l’Accord de Vienne.
Le projet final a été établi sur la base des observations reçues lors de l’enquête parallèle sur le projet.
Le projet final est par conséquent soumis aux comités membres de l’ISO et aux comités membres du CEN
en parallèle à un vote d’approbation de deux mois au sein de l’ISO et à un vote formel au sein du CEN.
Les votes positifs ne doivent pas être accompagnés d’observations.
Les votes négatifs doivent être accompagnés des arguments techniques pertinents.
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ISO/FDIS 11930:2012(F)
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application .1
1.1 Généralités .1
1.2 Essai d’efficacité de la protection antimicrobienne .1
1.3 Procédure d’évaluation de la protection antimicrobienne d’un produit cosmétique .1
2 Références normatives .2
3 Termes et définitions .2
4 Principe .3
5 Essai d’efficacité de la protection antimicrobienne .3
5.1 Généralités .3
5.2 Matériel, réactifs et milieux de culture .3
5.3 Souches microbiennes .6
5.4 Préparation et dénombrement des inoculums .7
5.5 Démonstration de l’efficacité du neutralisant .9
5.6 Détermination de l’efficacité de la protection antimicrobienne de la formulation .10
5.7 Interprétation des résultats d’essai et conclusions .13
5.8 Rapport d’essai .14
6 Évaluation globale de la protection antimicrobienne d’un produit cosmétique .14
6.1 Généralités .14
6.2 Cas 1 — L’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne a été réalisé sur la
formulation .15
6.3 Cas 2 — L’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne n’a pas été réalisé sur la
formulation .15
Annexe A (normative) Diagramme décisionnel .16
Annexe B (normative) Critères d’évaluation pour l’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne
(voir 5.7) .17
Annexe C (informative) Exemples de neutralisants de l’activité antimicrobienne, de conservateurs et
liquides de lavage .18
Annexe D (informative) Caractéristiques du conditionnement .19
Bibliographie .20
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ISO/FDIS 11930:2012(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits
de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir
identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 11930 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 217, Cosmétiques.
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ISO/FDIS 11930:2012(F)
Introduction
La présente Norme internationale est destinée à être utilisée pour l’évaluation globale de la protection
antimicrobienne d’un produit cosmétique.
La protection antimicrobienne d’un produit peut avoir plusieurs origines:
— protection chimique;
— caractéristiques inhérentes de la formulation;
— conception du conditionnement;
— procédé de fabrication.
La présente Norme internationale définit une série d’étapes à suivre pour évaluer la protection antimicrobienne
globale d’un produit cosmétique. Une méthode de référence d’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne
(test d’épreuve) accompagné de critères d’évaluation est également décrite dans la présente Norme
internationale.
Les données résultant de l’appréciation de risque (voir l’ISO 29621) ou de l’essai d’efficacité de la protection
antimicrobienne, ou des deux, doivent être utilisées pour établir le niveau de protection antimicrobienne requis
afin de réduire au minimum le risque pour l’utilisateur.
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PROJET FINAL DE NORME INTERNATIONALE ISO/FDIS 11930:2012(F)
Cosmétiques — Microbiologie — Évaluation de la protection
antimicrobienne d’un produit cosmétique
1 Domaine d’application
1.1 Généralités
La présente Norme internationale comprend un essai d’efficacité de la protection antimicrobienne et une
procédure permettant d’évaluer la protection antimicrobienne globale d’un produit cosmétique qui n’est pas
identifié comme étant à faible risque microbiologique d’après l’appréciation du risque décrite dans l’ISO 29621.
La présente Norme internationale fournit une procédure pour l’interprétation des données résultant de l’essai
d’efficacité de la protection antimicrobienne ou de l’évaluation du risque microbiologique, ou des deux.
1.2 Essai d’efficacité de la protection antimicrobienne
Cet essai est une méthode de référence servant à évaluer la protection antimicrobienne d’une formulation
cosmétique. Il s’applique aux produits cosmétiques mis sur le marché.
Cet essai n’est pas requis pour les produits cosmétiques pour lesquels il a été démontré que le risque
microbiologique est faible (voir l’Annexe A et l’ISO 29621).
Cet essai est principalement conçu pour les produits cosmétiques solubles dans l’eau ou miscibles à l’eau,
et il peut nécessiter une adaptation, par exemple pour les produits soumis à essai dont la phase interne est
aqueuse. L’essai décrit dans la présente Norme internationale implique, pour chaque micro-organisme d’essai,
de mettre en contact la formulation avec un inoculum calibré, puis de mesurer l’évolution du nombre de micro-
organismes à des intervalles de temps définis, pendant une période définie et à une température définie.
NOTE Cet essai peut servir de ligne directrice pour mettre au point une méthode interne au cours du cycle de
développement d’un produit cosmétique. Dans ce cas, l’essai peut être modifié ou élargi, ou les deux, par exemple pour
prendre en compte des données antérieures et différents paramètres (souches microbiennes, milieux, conditions et durée
d’incubation, etc.). Les critères de conformité peuvent être adaptés à des objectifs spécifiques. Au cours de la phase de
développement des produits cosmétiques, d’autres méthodes peuvent être utilisées, le cas échéant, pour déterminer
l’efficacité de la protection antimicrobienne des formulations.
1.3 Procédure d’évaluation de la protection antimicrobienne d’un produit cosmétique
Cette procédure repose sur la prise en compte minutieuse de tous les points suivants.
— Les résultats de l’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne. Tous les produits cosmétiques ne
nécessitent pas un essai d’efficacité de la protection antimicrobienne (voir l’Annexe A et l’ISO 29621);
— Les caractéristiques de la formulation et les données fournies par l’évaluation du risque microbiologique
(voir l’ISO 29621). L’analyse pour l’évaluation du risque microbiologique repose sur une approche globale.
Elle intègre en particulier des paramètres, tels que les caractéristiques et la composition de la formulation,
ses conditions de production, les caractéristiques du conditionnement dans lequel la formulation sera
livrée sur le marché, les recommandations d’utilisation du produit cosmétique et, le cas échéant, la zone
d’application et la population d’utilisateurs ciblée (voir l’Annexe D).
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2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l’application du présent document. Pour les
références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 16212, Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement des levures et des moisissures
ISO 18415, Cosmétiques — Microbiologie — Détection des micro-organismes spécifiés et non spécifiés
ISO 21148:2005, Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour les examens microbiologiques
ISO 21149, Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement et détection des bactéries aérobies mésophiles
ISO 22716, Cosmétiques — Bonnes pratiques de fabrication (BPF) — Lignes directrices relatives aux bonnes
pratiques de fabrication
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 21148 ainsi que les suivants
s’appliquent.
3.1
formulation cosmétique
préparation constituée de matières premières dont la composition est qualitativement et quantitativement
définie
3.2
produit cosmétique
produit cosmétique fini ayant subi toutes les étapes de la production, y compris le conditionnement dans son
emballage final
3.3
protection antimicrobienne d’un produit cosmétique
aptitude d’un produit cosmétique à résister à une contamination microbienne pouvant présenter un risque
potentiel pour l’utilisateur
NOTE La protection antimicrobienne globale inclut la protection antimicrobienne de la formulation, le procédé de
fabrication spécifique et le conditionnement protecteur.
3.4
protection antimicrobienne d’une formulation cosmétique
ensemble des moyens mis en œuvre pour éviter la prolifération microbienne dans une formulation cosmétique
EXEMPLES Conservateurs, composés multifonctionnels, matières premières hostiles, pH extrême et faible activité de
l’eau.
3.5
méthode de référence
méthode appliquée par les parties intéressées pour évaluer un produit mis sur le marché et en cas de litige
3.6
méthode de développement
méthode interne
méthode utilisée au cours de la phase de développement d’un produit avant sa mise sur le marché
3.7
consommateur
utilisateur final d’un produit cosmétique
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4 Principe
L’évaluation de la protection antimicrobienne d’un produit cosmétique comprend les points suivants
(voir l’Annexe A).
a) Les caractéristiques de sa formulation (voir l’ISO 29621) ou les résultats de l’essai d’efficacité de la
protection antimicrobienne (s’il a été réalisé), ou les deux.
b) L’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne est décrit en 5.1. Les caractéristiques du produit
cosmétique conjointement avec les conditions de production (voir l’ISO 22716 et l’ISO 29621), les matériaux
de conditionnement et, si cela est justifié, les recommandations d’utilisation du produit (voir l’ISO 29621).
La présente Norme internationale décrit une procédure pour l’interprétation des données résultant de l’essai
d’efficacité de la protection antimicrobienne (s’il est approprié) et de l’évaluation du risque microbiologique.
5 Essai d’efficacité de la protection antimicrobienne
5.1 Généralités
L’évaluation de la protection antimicrobienne d’une formulation cosmétique repose sur l’inoculation de la
formulation avec des inoculums calibrés (préparés à partir de souches de micro-organismes pertinents). Le
nombre de micro-organismes survivants est mesuré à des intervalles de temps prédéfinis pendant 28 jours.
Pour chaque temps et chaque souche, le taux de réduction logarithmique est calculé et comparé aux valeurs
minimales requises pour les critères d’évaluation A ou B (voir Annexe B).
Lorsqu’ils sont utilisés comme méthode de référence, les modes opératoires doivent être suivis scrupuleusement
afin d’éviter toute variabilité des résultats. Pour déterminer l’efficacité de la protection antimicrobienne d’une
formulation lors du développement d’un produit, d’autres méthodes de développement adaptées peuvent être
utilisées, par exemple un essai d’efficacité de la protection antimicrobienne (voir 1.2).
Préalablement à l’essai, la qualité microbiologique du produit doit être déterminée conformément à l’ISO 21149
et l’ISO 16212, ou à l’ISO 18415.
NOTE Il est recommandé que les micro-organismes présents dans l’échantillon d’essai n’interfèrent pas avec le
recouvrement des organismes d’essai.
Au cours de l’essai, la neutralisation de l’éventuelle activité antimicrobienne de l’échantillon soumis à essai doit
être contrôlée et démontrée (voir 5.5).
5.2 Matériel, réactifs et milieux de culture
Des spécifications générales et des instructions sont fournies dans l’ISO 21148. Lorsque de l’eau est mentionnée
dans une formulation, utiliser de l’eau distillée ou de l’eau purifiée, comme spécifié dans l’ISO 21148:2005, 8.2.
5.2.1 Matériel
Utiliser le matériel courant d’un laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 21148) plus:
5.2.1.1 Billes de verre, de 3 mm à 4 mm de diamètre.
5.2.1.2 Filtre en verre fritté, de porosité 2 (40 µm à 100 µm).
5.2.1.3 Fioles de Roux.
5.2.1.4 Récipients en verre stériles, munis de bouchons, de volumes appropriés.
5.2.1.5 Centrifugeuse, capable de centrifuger à 2 000g.
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5.2.2 Diluant, neutralisants et milieux de culture
5.2.2.1 Généralités
Sauf spécification contraire, tous les diluants et neutralisants doivent être équilibrés à la température ambiante
avant usage. S’ils sont disponibles, des diluants et neutralisants, et des milieux prêts à l’emploi peuvent être
utilisés.
5.2.2.2 Diluant
5.2.2.2.1 Composition
Peptone pancréatique de caséine 1,0 g
Chlorure de sodium 8,5 g
Eau 1 000 ml
5.2.2.2.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau à chaud et en mélangeant les composants. Répartir dans des récipients appropriés.
Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation, le pH doit être de 7,0 ± 0,2, le mesurage
étant effectué à la température ambiante.
5.2.2.2.3 Solution de polysorbate (pour la préparation de la suspension de spores d’Aspergillus
brasiliensis)
Préparer une solution de polysorbate 80 [0,5 g/l]. Dissoudre en mélangeant tout en chauffant jusqu’à dissolution
complète. Répartir la solution dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.
5.2.2.3 Neutralisant
5.2.2.3.1 Généralités
L’adéquation et l’efficacité du neutralisant relativement aux souches d’essai utilisées et à la formulation soumise
à essai doivent être démontrées comme spécifié en 5.5.
Le neutralisant décrit en 5.2.2.3.2 est souvent utilisé. D’autres neutralisants pouvant convenir sont donnés à
titre d’exemples dans l’Annexe C.
5.2.2.3.2 Milieu liquide Eugon LT 100
5.2.2.3.2.1 Généralités
Ce milieu contient des ingrédients qui neutralisent les substances inhibitrices présentes dans l’échantillon,
®1)
lécithine et polysorbate 80, ainsi qu’un agent dispersant, octoxynol 9 (Triton X100 ). Il peut être préparé
comme indiqué en 5.2.2.3.2.3 ou à partir d’un milieu de culture déshydraté en respectant les instructions du
fabricant. Un milieu prêt à l’emploi peut également être utilisé.
5.2.2.3.2.2 Composition
Peptone pancréatique de caséine 15 g
Peptone papaïque de soja 5 g
®
1) Triton X100 est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à
l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif
du produit ainsi désigné.
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ISO/FDIS 11930:2012(F)
Chlorure de sodium 4 g
L-cystine 0,7 g
Sulfite de sodium 0,2 g
Glucose 5,5 g
Lécithine d’œuf 1 g
Polysorbate 80 5 g
Octoxynol 9 1 g
Eau 1 000 ml
5.2.2.3.2.3 Préparation
Dissoudre dans l’eau bouillante successivement le polysorbate 80, l’octoxynol 9 et la lécithine d’œuf jusqu’à
dissolution complète. Dissoudre les autres composants à chaud et en mélangeant. Répartir le milieu dans
des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Bien mélanger après stérilisation
pendant que le liquide est encore chaud pour redissoudre les substances en dépôt. Après stérilisation, le pH
doit être de 7,0 ± 0,2, le mesurage étant effectué à la température ambiante.
5.2.2.4 Milieux de culture
5.2.2.4.1 Généralités
Les milieux de culture peuvent être préparés comme indiqué en 5.2.2.4.2.2 ou à partir de milieux de culture
déshydratés en respectant les instructions du fabricant. Des milieux prêts à l’emploi peuvent être utilisés si
leur composition et/ou rendement de croissance sont comparables à ceux des formulations indiquées en
5.2.2.4.2.1.
5.2.2.4.2 Milieu de culture pour bactéries: gélose trypto-caséine-soja (TSA) ou milieu gélosé aux
peptones de caséine et de soja
5.2.2.4.2.1 Composition
Peptone pancréatique de caséine 15,0 g
Peptone papaïque de soja 5,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Gélose 15,0 g
Eau 1 000 ml
5.2.2.4.2.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau à chaud et en mélangeant les composants ou le milieu complet déshydraté. Répartir
le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Bien mélanger
après stérilisation pendant que le liquide est encore chaud pour redissoudre les substances en dépôt. Après
stérilisation et refroidissement, le pH doit être de 7,3 ± 0,2, le mesurage étant effectué à la température ambiante.
5.2.2.4.3 Milieu de culture pour Candida albicans: gélose de Sabouraud au dextrose (SDA)
5.2.2.4.3.1 Composition
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ISO/FDIS 11930:2012(F)
Dextrose 40,0 g
Peptone pepsique de tissus animaux 5,0 g
Peptone pancréatique de caséine 5,0 g
Gélose 15,0 g
Eau 1 000 ml
5.2.2.4.3.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau à chaud et en mélangeant les composants ou le milieu complet déshydraté. Répartir le
milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation, le
pH doit être de 5,6 ± 0,2, le mesurage étant effectué à la température ambiante.
5.2.2.4.4 Milieu de culture pour Aspergillus brasiliensis: gélose à la pomme de terre et au
dextrose (PDA)
5.2.2.4.4.1 Composition
Infusion de pommes de terre 200,0 g
(voir 5.2.2.4.4.2, Note 1)
Dextrose 20,0 g
Gélose (voir 5.2.2.4.4.2, Note 2) 20,0 g
Eau 1 000 ml
5.2.2.4.4.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau à chaud les composants ou le milieu complet déshydraté. Répartir le milieu dans des
récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation, le pH doit être de
5,6 ± 0,2, le mesurage étant effectué à la température ambiante.
NOTE 1 Pour préparer l’infusion de pommes de terre, utiliser le produit déshydraté commercialisé ou faire bouillir
200 g de pommes de terre non épluchées et en tranches dans 1 l d’eau pendant 30 min. Filtrer à travers de la gaze en
conservant le filtrat.
NOTE 2 Si le milieu déshydraté disponible dans le commerce contient moins de 20 g/l de gélose, celui-ci peut être, si
nécessaire, supplémenté en gélose pour obtenir une concentration finale de 20 g/l.
5.3 Souches microbiennes
L’essai doit être conduit en utilisant les souches suivantes comme micro-organismes d’essai:
®2) ®3) ®4)
— Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (souche équivalente: CIP 82.118 ou NCIMB 8626 ou
®5) ®6)
NBRC 13275 ou KCTC 2513 ou toute autre souche équivalente issue d’une collection nationale);
® ® ® ®
— Staphylococcus aureus ATCC 6538 (souche équivalente: CIP 4.83 ou NCIMB 9518 ou NBRC 13276
® ®7)
ou KCTC 3881 ou NCTC 10788 ou toute autre souche équivalente issue d’une collection nationale);
®
2) ATCC : American Type Culture Collection
®
3) CIP : Collection de l’Institut Pasteur
®
4) NCIMB : National Collection of Industrial and Marine Bacteria
®
5) NBRC : NITE Biological Resource Center, JP
®
6) KCTC : Korean Collection for Type Culture
®
7) NCTC : National Collection of Type Cultures
6 © ISO 2012 – Tous droits réservés
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ISO/FDIS 11930:2012(F)
® ® ® ®
— Escherichia coli ATCC 8739 (souche équivalente: CIP 53.126 ou NCIMB 8545 ou NBRC 3972 ou
® ®
KCTC 2571 ou NCTC 8545 ou toute autre souche équivalente issue d’une collection nationale);
® 8) ®9) ®
— Candida albicans ATCC 10231 (souche équivalente: IP 48.72 ou NCPF 3179 ou NBRC 1594 ou
®
KCTC 7965 ou toute autre souche équivalente issue d’une collection nationale);
®
— Aspergillus brasiliensis (antérieurement A. niger) ATCC 16404 (souche équivalente: IP 1431 ou
®10) ® ®
IMI 149007 ou NBRC 9455 ou KCTC 6196 ou toute autre souche équivalente issue d’une collection
nationale).
Il convient de reconstituer la culture conformément aux modes opératoires indiqués par le fournisseur de la
souche de référence. Il convient de conserver les souches au laboratoire conformément à l’EN 12353 ou selon
une autre méthode appropriée.
5.4 Préparation et dénombrement des inoculums
5.4.1 Généralités
Pour réaliser les essais, utiliser les souches conservées au laboratoire (voir 5.3) pour obtenir les cultures
mères et les cultures de travail.
La culture mère est une culture confluente obtenue en étalant en stries sur des tubes en pente ou sur des
boîtes la souche conservée (tube monodose ou bille). Après incubation, la culture mère peut être conservée
entre 2 °C et 8 °C pendant deux mois et elle est utilisée pour obtenir les cultures de travail.
La culture de travail, préparée au moment du besoin pour réaliser un essai, sert à obtenir la suspension
calibrée (inoculum).
Les conditions de croissance (milieux gélosés et incubation) sont identiques pour les cultures mères et les
cultures de travail (voir 5.4.2 et 5.4.3).
NOTE 1 Un nombre limité de subcultures en série et l’utilisation de cultures confluentes à la place de colonies isolées
réduisent le risque de variation de la sensibilité des souches. La standardisation des conditions de croissance et de la
préparation de l’inoculum améliore la reproductibilité de l’essai.
NOTE 2 Des changements de sensibilité des souches conservées par congélation peuvent être observés (en raison
des chocs thermiques répétés) lorsque des récipients multidoses sont utilisés (par exemple des récipients contenant
plusieurs billes sortis du congélateur pour prélever une bille, puis replacés dans le congélateur).
5.4.2 Préparation des suspensions bactériennes et de Candida albicans
5.4.2.1 Pour préparer la culture de travail du micro-organisme d’essai, préparer une subculture à partir de la
culture mère en repiquant la culture en stries sur des tubes en pente ou des boîtes (TSA pour les bactéries, SDA
pour Candida albicans) afin d’obtenir une culture confluente. Incuber à 32,5 °C ± 2,5 °C pendant 18 h à 24 h.
Préparer de la même manière une seconde subculture à partir de la première et incuber à 32,5 °C ± 2,5 °C
pendant 18 h à 24 h. Il est possible de préparer une troisième subculture de la même manière à partir de la
seconde. La seconde culture et la troisième (si elle a été réalisée) constituent la culture de travail.
Si la seconde subculture ne peut pas être réalisée à temps, la première subculture peut être conservée jusqu’à
48 h dans l’incubateur (32,5 °C ± 2,5 °C) et utilisée pour préparer la seconde subculture. Dans ce cas, préparer
la troisième subculture à incuber pendant 18 h à 24 h et l’utiliser pour réaliser l’essai.
Il est recommandé de ne pas préparer de quatrième subculture à partir de la culture mère initiale.
8) IP: Institut Pasteur
®
9) NCPF : National Collection of Pathogenic Fungi
10) IMI: International Mycological Institute, Royaume-Uni
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ISO/FDIS 11930:2012(F)
5.4.2.2 Mettre 10 ml de diluant (voir 5.2.2.2) dans un récipient stérile approprié avec environ 5 g de billes
de verre stériles. À l’aide d’une ans
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11930
Première édition
2012-04-01
Cosmétiques — Microbiologie —
Évaluation de la protection
antimicrobienne d’un produit cosmétique
Cosmetics — Microbiology — Evaluation of the antimicrobial protection
of a cosmetic product
Numéro de référence
ISO 11930:2012(F)
©
ISO 2012
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ISO 11930:2012(F)
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© ISO 2012
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Web www.iso.org
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Avant-propos .iv
Introduction . v
1 Domaine d’application . 1
1.1 Généralités . 1
1.2 Essai d’efficacité de la protection antimicrobienne . 1
1.3 Procédure d’évaluation de la protection antimicrobienne d’un produit cosmétique . 1
2 Références normatives . 2
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 3
5 Essai d’efficacité de la protection antimicrobienne . 3
5.1 Généralités . 3
5.2 Matériel, réactifs et milieux de culture . 3
5.3 Souches microbiennes . 6
5.4 Préparation et dénombrement des inoculums . 7
5.5 Démonstration de l’efficacité du neutralisant . 9
5.6 Détermination de l’efficacité de la protection antimicrobienne de la formulation .10
5.7 Interprétation des résultats d’essai et conclusions .13
5.8 Rapport d’essai .14
6 Évaluation globale de la protection antimicrobienne d’un produit cosmétique .14
6.1 Généralités .14
6.2 Cas 1 — L’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne a été réalisé sur la formulation .15
6.3 Cas 2 — L’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne n’a pas été réalisé sur
la formulation .15
Annexe A (normative) Diagramme décisionnel .16
Annexe B (normative) Critères d’évaluation pour l’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne
(voir 5.7) .17
Annexe C (informative) Exemples de neutralisants de l’activité antimicrobienne, de conservateurs et
liquides de lavage .18
Annexe D (informative) Caractéristiques du conditionnement .19
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L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits
de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir
identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 11930 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 217, Cosmétiques.
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ISO 11930:2012(F)
Introduction
La présente Norme internationale est destinée à être utilisée pour l’évaluation globale de la protection
antimicrobienne d’un produit cosmétique.
La protection antimicrobienne d’un produit peut avoir plusieurs origines:
— protection chimique;
— caractéristiques inhérentes de la formulation;
— conception du conditionnement;
— procédé de fabrication.
La présente Norme internationale définit une série d’étapes à suivre pour évaluer la protection antimicrobienne
globale d’un produit cosmétique. Une méthode de référence d’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne
(test d’épreuve) accompagné de critères d’évaluation est également décrite dans la présente Norme
internationale.
Les données résultant de l’appréciation de risque (voir l’ISO 29621) ou de l’essai d’efficacité de la protection
antimicrobienne, ou des deux, doivent être utilisées pour établir le niveau de protection antimicrobienne requis
afin de réduire au minimum le risque pour l’utilisateur.
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NORME INTERNATIONALE ISO 11930:2012(F)
Cosmétiques — Microbiologie — Évaluation de la protection
antimicrobienne d’un produit cosmétique
1 Domaine d’application
1.1 Généralités
La présente Norme internationale comprend
— un essai d’efficacité de la protection antimicrobienne, et
— une procédure permettant d’évaluer la protection antimicrobienne globale d’un produit cosmétique qui
n’est pas identifié comme étant à faible risque microbiologique d’après l’appréciation du risque décrite
dans l’ISO 29621.
La présente Norme internationale fournit une procédure pour l’interprétation des données résultant de l’essai
d’efficacité de la protection antimicrobienne ou de l’appréciation du risque microbiologique, ou des deux.
1.2 Essai d’efficacité de la protection antimicrobienne
Cet essai est une méthode de référence servant à évaluer la protection antimicrobienne d’une formulation
cosmétique. Il s’applique aux produits cosmétiques sur le marché.
Cet essai n’est pas requis pour les produits cosmétiques pour lesquels il a été démontré que le risque
microbiologique est faible (voir l’Annexe A et l’ISO 29621).
Cet essai est principalement conçu pour les produits cosmétiques solubles dans l’eau ou miscibles à l’eau,
et il peut nécessiter une adaptation, par exemple pour les produits soumis à essai dont la phase interne est
aqueuse. L’essai décrit dans la présente Norme internationale implique, pour chaque micro-organisme d’essai,
de mettre en contact la formulation avec un inoculum calibré, puis de mesurer l’évolution du nombre de micro-
organismes à des intervalles de temps définis, pendant une période définie et à une température définie.
NOTE Cet essai peut servir de ligne directrice pour mettre au point une méthode interne au cours du cycle de
développement d’un produit cosmétique. Dans ce cas, l’essai peut être modifié ou élargi, ou les deux, par exemple pour
prendre en compte des données antérieures et différents paramètres (souches microbiennes, milieux, conditions et durée
d’incubation, etc.). Les critères de conformité peuvent être adaptés à des objectifs spécifiques. Au cours de la phase de
développement des produits cosmétiques, d’autres méthodes peuvent être utilisées, le cas échéant, pour déterminer
l’efficacité de la protection antimicrobienne des formulations.
1.3 Procédure d’évaluation de la protection antimicrobienne d’un produit cosmétique
Cette procédure repose sur la prise en compte minutieuse des les points suivants.
— Les résultats de l’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne. Tous les produits cosmétiques ne
nécessitent pas un essai d’efficacité de la protection antimicrobienne (voir l’Annexe A et l’ISO 29621);
— Les caractéristiques de la formulation et les données fournies par l’évaluation du risque microbiologique
(voir l’ISO 29621). L’analyse pour l’évaluation du risque microbiologique repose sur une approche globale.
Elle intègre en particulier des paramètres, tels que les caractéristiques et la composition de la formulation,
ses conditions de production, les caractéristiques du conditionnement dans lequel la formulation sera
livrée sur le marché, les recommandations d’utilisation du produit cosmétique et, le cas échéant, la zone
d’application et la population d’utilisateurs ciblés (voir l’Annexe D).
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ISO 11930:2012(F)
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l’application du présent document. Pour les
références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 16212, Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement des levures et des moisissures
ISO 18415, Cosmétiques — Microbiologie — Détection des micro-organismes spécifiés et non spécifiés
ISO 21148, Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour les examens microbiologiques
ISO 21149, Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement et détection des bactéries aérobies mésophiles
ISO 22716, Cosmétiques — Bonnes pratiques de fabrication (BPF) — Lignes directrices relatives aux bonnes
pratiques de fabrication
ISO 29621, Cosmétiques — Microbiologie — Lignes directrices pour l’appréciation du risque et l’identification
de produits à faible risque microbiologique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 21148 ainsi que les suivants
s’appliquent.
3.1
formulation cosmétique
préparation constituée de matières premières dont la composition est qualitativement et quantitativement définie
3.2
produit cosmétique
produit cosmétique fini ayant subi toutes les étapes de la production, y compris le conditionnement dans son
emballage final
3.3
protection antimicrobienne d’un produit cosmétique
aptitude d’un produit cosmétique à résister à une contamination microbienne pouvant présenter un risque
potentiel pour l’utilisateur
NOTE La protection antimicrobienne globale inclut la protection antimicrobienne de la formulation, le procédé de
fabrication spécifique et le conditionnement protecteur.
3.4
protection antimicrobienne d’une formulation cosmétique
ensemble des moyens mis en œuvre pour éviter la prolifération microbienne dans une formulation cosmétique
EXEMPLES Conservateurs, composés multifonctionnels, matières premières hostiles, pH extrême et faible
activité de l’eau.
3.5
méthode de référence
méthode appliquée par les parties intéressées pour évaluer un produit sur le marché et en cas de litige
3.6
méthode de développement
méthode interne
méthode utilisée au cours de la phase de développement d’un produit avant sa mise sur le marché
3.7
consommateur
utilisateur final d’un produit cosmétique
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ISO 11930:2012(F)
4 Principe
L’évaluation de la protection antimicrobienne d’un produit cosmétique comprend les points suivants
(voir l’Annexe A).
a) Les caractéristiques de sa formulation (voir l’ISO 29621) ou les résultats de l’essai d’efficacité de la
protection antimicrobienne (s’il a été réalisé), ou les deux.
L’essai d’efficacité de la protection antimicrobienne est décrit en 5.1.
b) Les caractéristiques du produit cosmétique conjointement avec les conditions de production (voir l’ISO 22716
et l’ISO 29621), les matériaux de conditionnement et, si cela est justifié, les recommandations d’utilisation
du produit (voir l’ISO 29621).
La présente Norme internationale décrit une procédure pour l’interprétation des données résultant de l’essai
d’efficacité de la protection antimicrobienne (s’il est approprié) et de l’évaluation du risque microbiologique.
5 Essai d’efficacité de la protection antimicrobienne
5.1 Généralités
L’évaluation de la protection antimicrobienne d’une formulation cosmétique repose sur l’inoculation de la
formulation avec des inoculums calibrés (préparés à partir de souches de micro-organismes pertinents). Le
nombre de micro-organismes survivants est mesuré à des intervalles de temps prédéfinis pendant 28 jours.
Pour chaque temps et chaque souche, le taux de réduction logarithmique est calculé et comparé aux valeurs
minimales requises pour les critères d’évaluation A ou B (voir Annexe B).
Lorsqu’ils sont utilisés comme méthode de référence, les modes opératoires doivent être suivis scrupuleusement
afin d’éviter toute variabilité des résultats. Pour déterminer l’efficacité de la protection antimicrobienne d’une
formulation lors du développement d’un produit, d’autres méthodes de développement adaptées peuvent être
utilisées (voir 1.2).
Préalablement à l’essai, la qualité microbiologique du produit doit être déterminée conformément à l’ISO 21149
et l’ISO 16212, ou à l’ISO 18415.
NOTE Il est recommandé que les micro-organismes présents dans l’échantillon d’essai n’interfèrent pas avec le
recouvrement des organismes d’essai.
Au cours de l’essai, la neutralisation de l’éventuelle activité antimicrobienne de l’échantillon soumis à essai doit
être contrôlée et démontrée (voir 5.5).
5.2 Matériel, réactifs et milieux de culture
Des spécifications générales et des instructions sont fournies dans l’ISO 21148. Lorsque de l’eau est mentionnée
dans une composition, utiliser de l’eau distillée ou de l’eau purifiée, comme spécifié dans l’ISO 21148:2005, 8.2.
5.2.1 Matériel
Utiliser le matériel courant d’un laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 21148) plus:
5.2.1.1 Billes de verre, de 3 mm à 4 mm de diamètre.
5.2.1.2 Filtre en verre fritté, de porosité 2 (40 µm à 100 µm).
5.2.1.3 Fioles de Roux.
5.2.1.4 Récipients en verre stériles, munis de bouchons, de volumes appropriés.
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5.2.1.5 Centrifugeuse, capable de centrifuger à 2 000g.
5.2.2 Diluant, neutralisants et milieux de culture
5.2.2.1 Généralités
Sauf spécification contraire, tous les diluants et neutralisants doivent être équilibrés à la température ambiante
avant usage. S’ils sont disponibles, des diluants, neutralisants et milieux prêts à l’emploi peuvent être utilisés.
5.2.2.2 Diluant
5.2.2.2.1 Composition
Peptone pancréatique de caséine 1,0 g
Chlorure de sodium 8,5 g
Eau 1 000 ml
5.2.2.2.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau à chaud et en mélangeant les composants. Répartir dans des récipients appropriés.
Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation, le pH doit être de 7,0 ± 0,2, le mesurage
étant effectué à la température ambiante.
5.2.2.2.3 Solution de polysorbate (pour la préparation de la suspension de spores d’Aspergillus
brasiliensis)
Préparer une solution de polysorbate 80 [0,5 g/l]. Dissoudre en mélangeant tout en chauffant jusqu’à dissolution
complète. Répartir la solution dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.
5.2.2.3 Neutralisant
5.2.2.3.1 Généralités
L’adéquation et l’efficacité du neutralisant relativement aux souches d’essai utilisées et à la formulation soumise
à essai doivent être démontrées comme spécifié en 5.5.
Le neutralisant décrit en 5.2.2.3.2 est souvent utilisé. D’autres neutralisants pouvant convenir sont donnés à
titre d’exemples dans l’Annexe C.
5.2.2.3.2 Milieu liquide Eugon LT 100
5.2.2.3.2.1 Généralités
Ce milieu contient des ingrédients qui neutralisent les substances inhibitrices présentes dans l’échantillon,
®1)
lécithine et polysorbate 80, ainsi qu’un agent dispersant, octoxynol 9 (Triton X100 ). Il peut être préparé
comme indiqué en 5.2.2.3.2.3 ou à partir d’un milieu de culture déshydraté en respectant les instructions du
fabricant. Un milieu prêt à l’emploi peut également être utilisé.
5.2.2.3.2.2 Composition
Peptone pancréatique de caséine 15 g
®
1) Triton X100 est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à
l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif
du produit ainsi désigné.
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ISO 11930:2012(F)
Peptone papaïque de soja 5 g
Chlorure de sodium 4 g
L-cystine 0,7 g
Sulfite de sodium 0,2 g
Glucose 5,5 g
Lécithine d’œuf 1 g
Polysorbate 80 5 g
Octoxynol 9 1 g
Eau 1 000 ml
5.2.2.3.2.3 Préparation
Dissoudre dans l’eau bouillante successivement le polysorbate 80, l’octoxynol 9 et la lécithine d’œuf jusqu’à
dissolution complète. Dissoudre les autres composants à chaud et en mélangeant. Répartir le milieu dans
des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Bien mélanger après stérilisation
pendant que le liquide est encore chaud pour redissoudre les substances en dépôt. Après stérilisation, le pH
doit être de 7,0 ± 0,2, le mesurage étant effectué à la température ambiante.
5.2.2.4 Milieux de culture
5.2.2.4.1 Généralités
Les milieux de culture peuvent être préparés comme indiqué en 5.2.2.4.2.2 ou à partir de milieux de culture
déshydratés en respectant les instructions du fabricant. Des milieux prêts à l’emploi peuvent être utilisés si leur
composition et/ou rendement de croissance sont comparables à ceux des formulations indiquées en 5.2.2.4.2.1.
5.2.2.4.2 Milieu de culture pour bactéries: gélose trypto-caséine-soja (TSA) ou milieu gélosé aux
peptones de caséine et de soja
5.2.2.4.2.1 Composition
Peptone pancréatique de caséine 15,0 g
Peptone papaïque de soja 5,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Gélose 15,0 g
Eau 1 000 ml
5.2.2.4.2.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau à chaud et en mélangeant les composants ou le milieu complet déshydraté. Répartir
le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Bien mélanger
après stérilisation pendant que le liquide est encore chaud pour redissoudre les substances en dépôt. Après
stérilisation et refroidissement, le pH doit être de 7,3 ± 0,2, le mesurage étant effectué à la température ambiante.
5.2.2.4.3 Milieu de culture pour Candida albicans: gélose de Sabouraud au dextrose (SDA)
5.2.2.4.3.1 Composition
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Dextrose 40,0 g
Peptone pepsique de tissus animaux 5,0 g
Peptone pancréatique de caséine 5,0 g
Gélose 15,0 g
Eau 1 000 ml
5.2.2.4.3.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau à chaud et en mélangeant les composants ou le milieu complet déshydraté. Répartir le
milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation, le
pH doit être de 5,6 ± 0,2, le mesurage étant effectué à la température ambiante.
5.2.2.4.4 Milieu de culture pour Aspergillus brasiliensis: gélose à la pomme de terre et au
dextrose (PDA)
5.2.2.4.4.1 Composition
Infusion de pommes de terre 200,0 g
(voir 5.2.2.4.4.2, Note 1)
Dextrose 20,0 g
Gélose (voir 5.2.2.4.4.2, Note 2) 20,0 g
Eau 1 000 ml
5.2.2.4.4.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau à chaud les composants ou le milieu complet déshydraté. Répartir le milieu dans des
récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation, le pH doit être de
5,6 ± 0,2, le mesurage étant effectué à la température ambiante.
NOTE 1 Pour préparer l’infusion de pommes de terre, utiliser le produit déshydraté commercialisé ou faire bouillir
200 g de pommes de terre non épluchées et en tranches dans 1 l d’eau pendant 30 min. Filtrer à travers de la gaze en
conservant le filtrat.
NOTE 2 Si le milieu déshydraté disponible dans le commerce contient moins de 20 g/l de gélose, celui-ci peut être, si
nécessaire, supplémenté en gélose pour obtenir une concentration finale de 20 g/l.
5.3 Souches microbiennes
L’essai doit être conduit en utilisant les souches suivantes comme micro-organismes d’essai:
®2) ®3) ®4)
— Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (souche équivalente: CIP 82.118 ou NCIMB 8626 ou
®5) ®6)
NBRC 13275 ou KCTC 2513 ou toute autre souche équivalente issue d’une collection nationale);
® ® ® ®
— Staphylococcus aureus ATCC 6538 (souche équivalente: CIP 4.83 ou NCIMB 9518 ou NBRC 13276
® ®7)
ou KCTC 3881 ou NCTC 10788 ou toute autre souche équivalente issue d’une collection nationale);
®
2) ATCC : American Type Culture Collection
®
3) CIP : Collection de l’Institut Pasteur
®
4) NCIMB : National Collection of Industrial and Marine Bacteria
®
5) NBRC : NITE Biological Resource Center, JP
®
6) KCTC : Korean Collection for Type Culture
®
7) NCTC : National Collection of Type Cultures
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ISO 11930:2012(F)
® ® ® ®
— Escherichia coli ATCC 8739 (souche équivalente: CIP 53.126 ou NCIMB 8545 ou NBRC 3972 ou
® ®
KCTC 2571 ou NCTC 12923 ou toute autre souche équivalente issue d’une collection nationale);
® 8) ®9) ®
— Candida albicans ATCC 10231 (souche équivalente: IP 48.72 ou NCPF 3179 ou NBRC 1594 ou
®
KCTC 7965 ou toute autre souche équivalente issue d’une collection nationale);
® ®10)
— Aspergillus brasiliensis (antérieurement A. niger) ATCC 16404 (souche équivalente: IP 1431 ou IMI 149007
® ®
ou NBRC 9455 ou KCTC 6196 ou toute autre souche équivalente issue d’une collection nationale).
Il convient de reconstituer la culture conformément aux modes opératoires indiqués par le fournisseur de la
souche de référence. Il convient de conserver les souches au laboratoire conformément à l’EN 12353 ou selon
une autre méthode appropriée.
5.4 Préparation et dénombrement des inoculums
5.4.1 Généralités
Pour réaliser les essais, utiliser les souches conservées au laboratoire (voir 5.3) pour obtenir les cultures
mères et les cultures de travail.
La culture mère est une culture confluente obtenue en étalant en stries sur des tubes en pente ou sur des
boîtes la souche conservée (tube monodose ou bille). Après incubation, la culture mère peut être conservée
entre 2 °C et 8 °C pendant deux mois et elle est utilisée pour obtenir les cultures de travail.
La culture de travail, préparée au moment du besoin pour réaliser un essai, sert à obtenir la suspension
calibrée (inoculum).
Les conditions de croissance (milieux gélosés et incubation) sont identiques pour les cultures mères et les
cultures de travail (voir 5.4.2 et 5.4.3).
NOTE 1 Un nombre limité de subcultures en série et l’utilisation de cultures confluentes à la place de colonies isolées
réduisent le risque de variation de la sensibilité des souches. La standardisation des conditions de croissance et de la
préparation de l’inoculum améliore la reproductibilité de l’essai.
NOTE 2 Des changements de sensibilité des souches conservées par congélation peuvent être observés (en raison
des chocs thermiques répétés) lorsque des récipients multidoses sont utilisés (par exemple des récipients contenant
plusieurs billes sortis du congélateur pour prélever une bille, puis replacés dans le congélateur).
5.4.2 Préparation des suspensions bactériennes et de Candida albicans
5.4.2.1 Pour préparer la culture de travail du micro-organisme d’essai, préparer une subculture à partir de la
culture mère en repiquant la culture en stries sur des tubes en pente ou des boîtes (TSA pour les bactéries, SDA
pour Candida albicans) afin d’obtenir une culture confluente. Incuber à 32,5 °C ± 2,5 °C pendant 18 h à 24 h.
Préparer de la même manière une seconde subculture à partir de la première et incuber à 32,5 °C ± 2,5 °C
pendant 18 h à 24 h. Il est possible de préparer une troisième subculture de la même manière à partir de la
seconde. La seconde culture et la troisième (si elle a été réalisée) constituent la culture de travail.
Si la seconde subculture ne peut pas être réalisée à temps, la première subculture peut être conservée jusqu’à
48 h dans l’incubateur (32,5 °C ± 2,5 °C) et utilisée pour préparer la seconde subculture. Dans ce cas, préparer
la troisième subculture à incuber pendant 18 h à 24 h et l’utiliser pour réaliser l’essai.
Il est recommandé de ne pas préparer de quatrième subculture à partir de la culture mère initiale.
5.4.2.2 Mettre 10 ml de diluant (voir 5.2.2.2) dans un récipient stérile approprié avec environ 5 g de billes
de verre stériles. À l’aide d’une anse, prélever la culture sur le milieu gélosé et la transférer dans le diluant en
8) IP: Institut Pasteur
®
9) NCPF : National Collection of Pathogenic Fungi
10) IMI: International Mycological Institute, Royaume-Uni
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ISO 11930:2012(F)
immergeant, par exemple, l’anse dans une petite quantité de diluant contre la paroi du récipient et en frottant
l’anse pour disperser les cellules.
5.4.2.3 Agiter le récipient manuellement ou mécaniquement pendant au maximum 3 min pour homogénéiser
la suspension. Prélever par aspiration la partie supérieure de la suspension (en évitant tout contact avec les
billes de verre) et transférer la suspension ainsi obtenue dans un récipient stérile.
7 8
5.4.2.4 Ajuster le nombre de cellules dans la suspension à des valeurs de 1 × 10 ufc/ml à 1 × 10 ufc/ml
6 7
(bactéries) ou de 1 × 10 ufc/ml à 1 × 10 ufc/ml (C. albicans) à l’aide du diluant (5.2.2.2) et en fonction des données
de calibrage obtenues au laboratoire (par exemple avec un spectrophotomètre, voir l’ISO 21148:2005, Annexe C).
Utiliser cette suspension calibrée dans les 2 h.
5.4.2.5 Au moment de l’essai, contrôler le titre initial de la suspension, C. Réaliser des dilutions décimales
successives de la suspension calibrée dans le diluant (5.2.2.2). Réaliser le dénombrement par inclusion en
double de 1 ml des dilutions appropriées (voir 5.6.2) sur TSA pour les bactéries et sur SDA pour C. albicans.
Incuber les boîtes à 32,5 °C ± 2,5 °C pendant 24 h à 48 h.
5.4.3 Préparation de la suspension de spores d’Aspergillus brasiliensis (antérieurement Aspergillus
niger)
5.4.3.1 Pour obtenir la culture de travail du micro-organisme d’essai, utiliser une culture mère (sur PDA)
datant de moins de 2 mois et préparer une suspension dans le diluant (5.2.2.2). Inoculer par inondation en
surface le PDA coulé en fiole de Roux (ou utiliser un nombre approprié de boîtes de Pétri) de façon à obtenir
une culture confluente. Incuber à 22,5 °C ± 2,5 °C pendant 7 jours à 11 jours.
5.4.3.2 Après incubation, transférer dans la fiole de Roux 10 ml de la solution de polysorbate (5.2.2.2.3). Détacher
doucement les spores de la surface de la culture, par exemple à l’aide d’une spatule ou de billes de verre.
Transférer la suspension dans un flacon approprié et agiter doucement pendant 1
...
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