ISO 10705-3:2003

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10705-3
First edition
2003-10-01
Water quality — Detection and
enumeration of bacteriophages —
Part 3:
Validation of methods for concentration
of bacteriophages from water
Qualité de l'eau — Détection et dénombrement des bactériophages —
Partie 3: Validation des méthodes de concentration des bactériophages
dans l'eau
Reference number
©
ISO 2003
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Contents Page
Foreword. iv
1 Scope. 1
2 Normative references. 1
3 Terms and definitions. 2
4 Principle. 2
5 Reagents. 2
6 Apparatus and glassware. 3
7 Sampling. 3
8 Preparation of sewage samples for spiking. 3
9 Procedure. 4
10 Calculation. 5
11 Analytical quality control . 6
12 Test report. 7
Annex A (informative) Recommended methods for concentration of bacteriophages from water
depending on the volume, turbidity and particle content. 8
Annex B (informative) Example of a validation process of a concentration method. 10
Bibliography . 13

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 10705-3 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,
Microbiological methods.
ISO 10705 consists of the following parts, under the general title Water quality — Detection and enumeration
of bacteriophages:
 Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages
 Part 2: Enumeration of somatic coliphages
 Part 3: Validation of methods for concentration of bacteriophages from water
 Part 4: Enumeration of bacteriophages infecting Bacteroides fragilis

iv © ISO 2003 — All rights reserved

INTERNATIONAL STANDARD ISO 10705-3:2003(E)

Water quality — Detection and enumeration of
bacteriophages —
Part 3:
Validation of methods for concentration of bacteriophages from
water
WARNING — Persons using this part of ISO 10705 should be familiar with normal laboratory practice.
This part of ISO 10705 does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with
its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to
ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is imperative that personnel involved in validation of methods for concentration of
bacteriophages from water have relevant experience with the methods of enumeration of
[1]
bacteriophages (see ISO/TR 13843 ).
1 Scope
This part of ISO 10705 specifies the general principles for assessing the performance of methods for the
concentration of bacteriophages from water. Concentration is recommended for those water samples
expected to contain < 3 pfp (plaque-forming particles) per millilitre. Concentration methods can be applied to
all kinds of water provided that the amount and nature of suspended solids and/or dissolved matter do not
interfere with the concentration procedure.
This part of ISO 10705 does not give specific details of concentration methods, but outlines the fundamental
principles for evaluating the suitability of a particular method for a given type and volume of water. Annex A
gives examples of methods that have been found satisfactory and their fields of application.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial
suspension and decimal dilutions
ISO 8199, Water quality — General guide to the enumeration of micro-organisms by culture
ISO 10705-1, Water quality — Detection and enumeration of bacteriophages — Part 1: Enumeration of
F-specific RNA bacteriophages
ISO 10705-2, Water quality — Detection and enumeration of bacteriophages — Part 2: Enumeration of
somatic coliphages
ISO 10705-4, Water quality — Detection and enumeration of bacteriophages — Part 4: Enumeration of
bacteriophages infecting Bacteroides fragilis
ISO/IEC Guide 2, Standardization and related activities — General vocabulary
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO/IEC Guide 2 and the following
apply:
3.1
bacteriophages
bacterial viruses which are capable of infecting selected host strains
NOTE Bacteriophages produce visible plaques (clearance zones) in a confluent lawn of the host strain grown under
appropriate culture conditions.
4 Principle
The sample is treated according to a method of choice, by which the bacteriophages are concentrated from a
relatively large volume of sample (100 ml up to several litres) to a smaller volume (typically from a few to
20 ml). The concentrated sample is then analysed for bacteriophages according to an International Standard
method or other suitable protocol.
The concentration method to be evaluated should be carefully described in a protocol, following ISO standard
layout as much as possible. The description should include the target group(s) of bacteriophages and their
detection method(s), the types of water and ranges of volumes to be analysed, as well as exceptions to the
field of application, e.g. turbidity.
The method is validated according to principles laid down in this part of ISO 10705. The validation procedure
consists of determining the recovery of bacteriophages from a series of samples, seeded with naturally
polluted water (raw or treated sewage). The recovery is studied in a range of volumes, and particular attention
is paid to its reproducibility.
5 Reagents
Use ingredients of uniform quality and chemicals of analytical grade for the preparation of culture media. For
information on storage see ISO 8199, except where indicated in this part of ISO 10705. Alternatively, use
dehydrated complete media and follow strictly the manufacturer's instructions.
Other grades of chemicals may be used provided they can be shown to lead to the same results.
5.1 Water, for the preparation of media, glass-distilled water or de-ionized water free from substances that
might inhibit bacterial growth under the conditions of the test, and at least Grade 3 as specified in ISO 3696.
5.2 Diluent, for making dilutions, peptone-saline solution or another suitable diluent in accordance with
ISO 6887-1 or ISO 8199.
5.3 Culture media and reference cultures, as specified in the corresponding standard method of
ISO 10705-1, ISO 10705-2 and ISO 10705-4 for the phage assay.
5.4 Glycerol (ρ = 870 g/l), autoclaved at (121 ± 3) ºC for 15 min and stored in the dark at room temperature
for a period no longer than 1 year.
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6 Apparatus and glassware
SAFETY PRECAUTIONS — Field apparatus should be disinfected before use. Apply safety
precautions appropriate to the disinfectant solution used. Some stages of the concentration process
may involve the application of hydrostatic or pneumatic pressure. Observe relevant safety
precautions.
Use usual microbiological laboratory equipment as specified in the method for the phage assay (Clause 8),
and the protocol for the concentration method.
7 Sampling
Samples up to 10 l can conveniently be transported to the laboratory. Take the samples and deliver them to
[2]
the laboratory as specified in ISO 8199 (see also ISO 19458 ). For larger samples, it is advisable to perform
the first step of the concentration procedure in the field. This process may take up to several hours. If parallel
examination for indicator bacteria or other micro-organisms is carried out, take a time-proportional sample for
these analyses, preferably by filling a sample bottle with a side flow from the concentration apparatus. Filters,
precipitates or other products from the first concentration step may be further treated in the field, or may be
transported to the laboratory. Include the transport and storage conditions of intermediate stages of the
process in the validation procedure.
8 Preparation of sewage samples for spiking
Obtain a sample of primary or secondary (biologically treated) sewage and centrifuge at 1 000 g for 20 min or
filter through an 8 µm to 12 µm membrane filter. Store supernatant or filtrate on melting ice. Enumerate the
target bacteriophages in 1 ml volumes according to the chosen method. If necessary, dilute the sample to
obtain a concentration of 60 pfp to 200 pfp (plaque-forming particles) per millilitre. Add glycerol to obtain a
final volume fraction of 5 %; mix well. Distribute 10-ml aliquots into glass or plastic bottles (or tubes, or vials)
and freeze at (−20 ± 5) °C or (−70 ± 10) °C. Thaw two bottles at room temperature. From each bottle, examine
two 0,5-ml aliquots for the target bacteriophages. The average counts should be within the limits as specified
above (i.e. 30 pfp to 100 pfp per plate). Analyse the counts for within and between bottle homogeneity as
follows:
IJ

zz

ii++

Tz=−
1 ij
∑∑
JJ


ij==11

where
T is Cochran's dispersion test statistic to determine the variation in pfp within one vial of reference
material;
z is the total count of plaques of the duplicates of one vial.
i+
J
z = z
ii+ j
∑
j=1
I is the number of vials (in this case 2);
J is the number of duplicates (in this case 2);
The number of degrees of freedom for T is equal to I(J−1) and
J

zz

++ ++

Tz=−
2 i+
∑
II


j=1

where
T is Cochran's dispersion test statistic to determ
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 10705-3
Première édition
2003-10-01
Qualité de l'eau — Détection et
dénombrement des bactériophages —
Partie 3:
Validation des méthodes de
concentration des bactériophages dans
l'eau
Water quality — Detection and enumeration of bacteriophages —
Part 3: Validation of methods for concentration of bacteriophages from
water
Numéro de référence
©
ISO 2003
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Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos. iv
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives. 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe. 2
5 Réactifs. 2
6 Appareillage et verrerie. 3
7 Échantillonnage. 3
8 Préparation des échantillons d'eaux usées pour le dopage . 3
9 Mode opératoire. 4
10 Calculs. 6
11 Contrôle de qualité analytique. 7
12 Rapport d'essai. 7
Annexe A (informative) Méthodes recommandées de concentration des bactériophages dans
l'eau selon le volume, la turbidité et la teneur en particules. 8
Annexe B (informative) Exemple de processus de validation d'une méthode de concentration . 10
Bibliographie . 13

Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 10705-3 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 4,
Études microbiologiques.
L'ISO 10705 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l'eau — Détection et
dénombrement des bactériophages:
 Partie 1: Dénombrement des bactériophages ARN F spécifiques
 Partie 2: Dénombrement des coliphages somatiques
 Partie 3: Validation des méthodes de concentration des bactériophages dans l'eau
 Partie 4: Dénombrement des bactériophages infectant Bacteroides fragilis

iv © ISO 2003 — Tous droits réservés

NORME INTERNATIONALE ISO 10705-3:2003(F)

Qualité de l'eau — Détection et dénombrement des
bactériophages —
Partie 3:
Validation des méthodes de concentration des bactériophages
dans l'eau
AVERTISSEMENT — Les utilisateurs de la présente partie de l'ISO 10705 doivent être familiarisés avec
les pratiques d'usage en laboratoire. La présente partie de l'ISO 10705 n'a pas la prétention d'aborder
tous les problèmes de sécurité concernés par son usage. II est de la responsabilité de l'utilisateur de
consulter et d'établir des règles de sécurité et d'hygiène appropriées et de déterminer I'applicabilité
des restrictions réglementaires avant utilisation.
IMPORTANT — Il est impératif que le personnel impliqué dans la validation des méthodes de
concentration des bactériophages dans l'eau possèdent l'expérience nécessaire pour mettre en
[1]
œuvre les méthodes de dénombrement des bactériophages (voir l'ISO/TR 13843 ).
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO 10705 spécifie les principes généraux qui permettent d'évaluer les performances
des méthodes de concentration des bactériophages dans l'eau. La concentration est recommandée pour les
échantillons d'eau supposés contenir moins de 3 pfp (particules formant plage) par millilitre. Les méthodes de
concentration peuvent être appliquées à tous les types d'eau, sous réserve que la quantité et la nature des
matières en suspension et/ou des matières dissoutes n'interfèrent pas avec le mode opératoire de
concentration.
La présente partie de l'ISO 10705 ne donne pas de détails spécifiques quant aux méthodes de concentration,
mais esquisse les principes fondamentaux pour l'évaluation de l'adéquation d'une méthode particulière pour
un type et un volume d'eau donnés. L'Annexe A donne des exemples de méthodes qui ont été jugées
satisfaisantes ainsi que leur domaine d'application.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
ISO 6887-1, Microbiologie — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales
en vue de l'examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de la suspension mère
et des dilutions décimales
ISO 8199, Qualité de l'eau — Guide général pour le dénombrement des micro-organismes sur milieu de
culture
ISO 10705-1, Qualité de l'eau — Détection et dénombrement des bactériophages — Partie 1: Dénombrement
des bactériophages ARN F spécifiques
ISO 10705-2, Qualité de l'eau — Détection et dénombrement des bactériophages — Partie 2: Dénombrement
des coliphages somatiques
ISO 10705-4, Qualité de l'eau — Détection et dénombrement des bactériophages — Partie 4: Dénombrement
des bactériophages infectant Bacteroides fragilis
ISO/CEI Guide 2, Normalisation et activités connexes — Vocabulaire général
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l'ISO/CEI Guide 2 ainsi que le
terme et la définition suivants s'appliquent.
3.1
bactériophages
virus bactériens capables d'infecter des souches hôtes sélectionnées
NOTE Les bactériophages produisent des plages visibles (zones de lyse) dans un tapis confluent de la souche hôte
cultivée dans des conditions appropriées.
4 Principe
L'échantillon est traité selon une méthode choisie qui permet de concentrer les bactériophages d'un volume
d'échantillon relativement important (de 100 ml à plusieurs litres) à un volume plus petit (de quelques ml à
20 ml). L'échantillon concentré est ensuite analysé pour rechercher des bactériophages selon une méthode
internationale normalisée ou tout autre protocole approprié.
Il convient de décrire avec précision dans un protocole la méthode de concentration à évaluer, en respectant
autant que possible une présentation conforme aux normes ISO. Il convient que la description comprenne le
ou les groupes cibles de bactériophages et leur(s) méthode(s) de détection, les types d'eau et la gamme des
volumes à analyser ainsi que les exceptions au domaine d'application, par exemple la turbidité.
La méthode est validée selon les principes énoncés dans la présente partie de l'ISO 10705. La procédure de
validation consiste à déterminer le taux de récupération des bactériophages à partir d'une série d'échantillons
ensemencés avec de l'eau naturellement polluée (eaux usées brutes ou traitées). Le taux de récupération est
testé dans une gamme de volumes, et une attention particulière est portée à sa reproductibilité.
5 Réactifs
Pour la préparation des milieux de culture, utiliser des ingrédients de qualité constante et des produits
chimiques de qualité analytique. En ce qui concerne la conservation, se reporter à l'ISO 8199, sauf si précisé
dans la présente partie de l'ISO 10705. Comme variante, des milieux complets déshydratés peuvent être
utilisés. Dans ce cas, suivre scrupuleusement les instructions du fabricant.
Il est possible d'utiliser des produits chimiques d'une autre qualité à la condition qu'il soit reconnu qu'ils
donnent les mêmes résultats.
5.1 Eau, pour la préparation des milieux de culture, utiliser de l'eau distillée sous verre ou de l'eau
déionisée, exempte de substances susceptibles d'inhiber la croissance des bactéries dans les conditions de
l'essai, et conforme au moins à la qualité 3 comme spécifiée par l'ISO 3696.
5.2 Diluant, pour réaliser les dilutions, utiliser une solution peptonée saline ou tout autre diluant adéquat
conforme à l'ISO 6887-1 ou à l'ISO 8199.
2 © ISO 2003 — Tous droits réservés

5.3 Milieux de culture et cultures de référence, tels que spécifiés dans la méthode normalisée
correspondant à l'analyse des phages (ISO 10705-1, ISO 10705-2 et ISO 10705-4).
5.4 Glycérol (ρ = 870 g/l), stérilisé à l'autoclave à (121 ± 3) °C pendant 15 min et conservé à l'abri de la
lumière à température ambiante pendant un an au maximum.
6 Appareillage et verrerie
PRÉCAUTIONS DE SÉCURITÉ — Il convient de désinfecter les appareillages de terrain avant
utilisation. Prendre les précautions de sécurité appropriées à la solution désinfectante utilisée.
Certaines étapes du processus de concentration peuvent nécessiter l'application d'une pression
hydrostatique ou pneumatique. Observer les précautions de sécurité appropriées.
Utiliser le matériel courant de laboratoire pour analyse microbiologique comme spécifié dans la méthode
d'analyse des phages (Article 8) et dans le protocole de la méthode de concentration.
7 Échantillonnage
Des échantillons allant jusqu'à 10 l sont facilement transportables au laboratoire. Prélever les échantillons et
[2]
les transmettre au laboratoire comme spécifié dans l'ISO 8199 (voir également l'ISO 19458 ). Pour des
échantillons de plus grand volume, il est souhaitable d'effectuer la première étape de la procédure de
concentration sur place. Ce processus peut durer plusieurs heures. Si parallèlement, une recherche
d'indicateurs bactériens ou d'autres microorganismes est effectuée, prélever un échantillon proportionnel pour
ces analyses, de préférence en remplissant un flacon d'échantillon par un écoulement latéral provenant de
l'appareillage de concentration. Les filtres, précipités ou autres produits de la première étape de concentration
peuvent par la suite être traités sur place, ou peuvent être transportés au laboratoire. Inclure les conditions de
transport et de conservation des étapes intermédiaires du processus dans la procédure de validation.
8 Préparation des échantillons d'eaux usées pour le dopage
Se procurer un écha
...