ISO 10705-1:1995

INTERNATIONAL IS0
STANDARD 10705-I
First edition
1995-08-01
Water quality - Detection and
enumeration of bacteriophages -
Part 1:
Enumeration of F-specific RNA bacteriophages
Qualit6 de I’eau - D6tection et dhnombrement des bactkiophages -
Partie 1: Dhnombrement des bactkiophages ARN F spkifiques
Reference number
IS0 10705-I :I 995(E)
IS0 10705=1:1995(E)
Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (IS0 member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through IS0
technical committees. Each member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. IS0
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard IS0 10705-l was prepared by Technical Committee
lSO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4, Microbiological
methods.
IS0 10705 consists of the following parts, under the general title Water
quality - Detection and enumeration of bacteriophages:
- Part 7: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages
- Part 2: Enumeration of somatic coliphages
Annex A forms an integral part of this part of IS0 10705. Annexes B and
C are for information only.
0 IS0 1995
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case Postale 56 l CH-1211 Geneve 20 l Switzerland
Printed in Switzerland
ii
IS0 10705-1:1995(E)
INTERNATIONAL STANDARD 0 IS0
Water quality - Detection and enumeration of
bacteriophages -
Part 1:
Enumeration of F-specific RNA bacteriophages
tions of the standards indicated below. Members of
1 Scope
IEC and IS0 maintain registers of currently valid
International Standards.
This part of IS0 10705 specifies a method for the
detection and enumeration of F-specific ribonucleic
IS0 3696: 1987, Water for analytical laboratory use -
acid (RNA) bacteriophages by incubating the sample
Specification and test methods.
with an appropriate host strain. The method can be
applied to all kinds of water, sediments and sludges,
IS0 5667-l : 1980, Water quality - Sampling -
where necessary after dilution. In the case of low
Part I: Guidance on the design of sampling pro-
numbers, a preconcentration step may be necessary
grammes.
for which a separate part of IS0 10705 will be devel-
oped. The method can also be applied to shellfish
IS0 5667-2: 1991, Water quality - Sampling -
extracts. Depending on the relative abundance of F-
Part 2: Guidance on sampling techniques.
specific RNA bacteriophages to background
organisms, additional confirmatory tests may be
IS0 5667-3: 1994, Water quality - Sampling -
necessary and are also specified in this part of
Part 3: Guidance on the preservation and handling of
IS0 10705.
samples.
The presence of F-specific RNA bacteriophages in a
IS0 6887: 1983, Microbiology - General guidance for
water sample generally indicates pollution by
the preparation of dilutions for microbiological exam-
wastewater contaminated by human or animal faeces.
ina tion.
Their survival in the environment, removal by widely
used water treatment processes and concentration
I SO 8199: 1988, Water quality - General guide to the
or retention by shellfish resembles that of foodborne
enumeration of micro-organisms by culture.
and waterborne human enteric viruses, for example
the enteroviruses, hepatitis A virus and rotaviruses.
3 Definition
For the purposes of this part of IS0 10705, the fol-
2 Normative references
lowing definition applies.
The following standards contain provisions which,
through reference in this text, constitute provisions 3.1 F-specific RNA bacteriophages: Bacterial vi-
of this part of IS0 10705. At the time of publication, ruses which are capable of infecting a specified host
strain with F-pili or sex-pili to produce visible plaques
the editions indicated were valid. All standards are
(clearance zones) on a confluent lawn grown under
subject to revision, and parties to agreements based
appropriate culture conditions, whereas the infectious
on this part of IS0 10705 are encouraged to investi-
process is inhibited in the presence of a concentration
gate the possibility of applying the most recent edi-
.
0 IS0
IS0 10705-1:1995(E)
of 40 (occasionally 400) Clglml of RNase in the plating 6.3 Reagents
medium.
6.3.1 RNase from bovine pancreas, specific ac-
tivity approximately 50 units/mg (Kunitz).
4 Principle
6.3.2 Antibiotic discs, for susceptibility testing with
The sample is mixed with a small volume of semi-
nalidixic acid (130 pg; 9 mm) and kanamycin
solid nutrient medium. A culture of host strain is
(100 pg; 9 mm).
added and plated on a solid nutrient medium. After
this, incubation and reading of plates for visible
6.3.3 Glycerol, 870 g/litre.
plaques takes place. Where necessary, simultaneous
examination of parallel plates with added RNase for
6.4 Microbiological reference cultures
confirmation by differential counts is carried out. The
results are expressed as the number concentration
Salmonella typhimurium strain WG49, phage type 3
of plaque-forming particles (Cpfp) per unit of volume.
Nal’ (F’ 42 /ac::Tn5), NCTC 12484.
Bacteriophage MS2, NCTC 12487 or ATCC 15597-Bl .
5 Safety precautions
Escherichia co/; K-12 Hfr from appropriate culture col-
The host strain used is a Salntonella fyphimurium
lection, e.g. NCTC 12486 or ATCC 23631.
mutant of low pathogenicity and should be hand-
led in accordance with the appropriate national NOTE 1 The NCTC strains are available from the National
Collection of Type Cultures, 61 Colindale Avenue, London
or international safety procedures for this bac-
NW9 6HT, England. The ATCC strains are available from the
terial species. F-specific RNA bacteriophages are
American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
non-pathogenic for man and animals, but are very
Rockville, Maryland, U.S.A.
Appropriate precautions
resistant to drying.
should therefore be taken to prevent cross-
contamination of test materials, particularly when
7 Apparatus and glassware
examining or handling cultures of high titre or
when inoculating cultures of the host strains.
Usual microbiological laboratory equipment, including
Such procedures must be carried out in a
biohazard cabinet or a separate area of the lab-
7.1 Hot-air oven for dry-heat sterilization and an
oratory.
autoclave. Apart from apparatus supplied sterile,
glassware and other equipment shall be sterilized ac-
cording to the instructions given in IS0 8199.
6 Diluent, culture media and reagents
7.2 Incubator or water bath, thermostatically
controlled at 37 “C + 1 “C.
-
6.1 Basic materials
Use ingredients of uniform quality and chemicals of
7.3 Incubator or water bath, thermostatically
analytical grade for the preparation of culture media
controlled at 37 “C +_ 1 “C and equipped with a rotary
and reagents, and follow the instructions given in an-
platform at 100 min-’ + 10 min-‘.
-
nex A. For information on storage see IS0 8199, ex-
cept where indicated in this part of IS0 10705.
7.4 Water bath, thermostatically controlled at
Alternatively, use dehydrated complete media and
45 “C + 1 “C.
-
follow strictly the manufacturer’s instructions.
7.5 Water bath or equivalent device, for melting
For the preparation of media, use glass-distilled water
agar media.
or deionized water free from substances which might
inhibit bacterial growth under the conditions of the
test, and in accordance with IS0 3696.
7.6 pH-meter.
7.7 Counting apparatus, with indirect, oblique light.
6.2 Diluent
For making sample dilutions, use peptone saline sol- 7.8 Deep freezer, thermostatically controlled at
ution as indicated in A.8. - 20 “C + 5 “C.
-
0 IS0 I 10705=1:1995(E)
thermostatically controlled at 7.14 Culture tubes, with cap:
7.9 Deep freezer,
-
7o”c+100c.
-
7.15 Measuring cylinders, of suitable capacity.
7.10 Spectrometer, capable of holding 1 cm
cuvettes or side-arm of nephelometric flasks (7.17) 7.16 Conical flasks, of capacity 250 ml to 300 ml,
and equipped with a filter in the range 500 nm to with cotton wool plugs or suitable alternatives.
650 nm with a maximum bandwidth of + 10 nm.
7.17 Cuvettes, of optical path length 1 cm or
Usual sterile, microbiological laboratory glassware or
nephelometric conical flasks, of capacity 250 ml to
disposable plastics ware according to IS0 8199 and
300 ml, with cylindrical side-arms which can be fitted
including the following.
to the spectrometer (7.10) and with cotton wool plugs
or suitable alternatives. (See figure 1.)
7.11 Petri dishes, of diameter 9 cm or 15 cm.
7.18 Membrane filter units, for sterilization, pore
7.12 Graduated pipettes, of capacities 1 ml, 5 ml
size 0,2 pm.
and 10 ml.
7.19 Plastics vials, lidded, of capacity I,5 ml to
2 ml.
7.13 Glass bottles, of suitable volumes.
Figure 1 - Nephelometric conical flasks for culturing the host strain

IS0 10705-1:1995(E)
9.1.1 Preparation of stock cultures
8 Sampling
Take samples and deliver them to the laboratory in
accordance with IS0 8199, IS0 5667-1, IS0 5667-2,
Rehydrate the contents of a lyophilized ampoule of
and IS0 5667-3.
the reference culture of the host strains in a small
volume of TYGB (A.l) using a Pasteur pipette. Trans-
9 Preparation of test materials
fer the suspension to 50 ml of TYGB in a 300 ml
conical flask (7.16). Incubate for 18 h & 2 h at
9.1 Culturing and maintenance of host
37 “C + 1 “C while shaking at 100 min-I
-
strains WG49 and E. co/i K12 Hfr + 10 min-‘. Add 10 ml of glycerol (A.6) and mix well.
Distribute into plastics vials (7.19) in I,2 ml aliquots
The culturing and maintenance of host strains in-
and store at - 70 “C + 10 “C.
volves several stages which are summarized in
figure2. The figure also indicates the stages where NOTE 2 This first culture of the host strain should be
stored as a reference standard in the laboratory.
quality control of the host culture is performed.
REFERENCECULTURE
(9.1.1)
Overnight culture, add
20 % (V/V) glycerol
STOCKCULTURE
Store at - 70 "C (9.1.1)
Log-phase culture from
Lactose-positive colonies,
add 20 % (V/V) glycerol
WORKING CULTURE
Storeat-70°C QUALITY CONTROL (9.3)
max.2 years (9.12)
Log-phase culture
Figure 2 - Scheme for culturing, maintenance and quality control of host strain WG49
Q IS0
IS0 10705-1:1995(E)
9.1.2 Preparation of working cultures
9.3 Quality control of host strain WG49
Thaw one vial of stock culture (9.1 .I ) at room tem-
Use a culture as prepared in 9.2.
perature and inoculate on a plate of McConkey agar
(A.7), or another lactose-containing medium, in such At times t = 0 h and t = 3 h, also inoculate two plates
a way that single colonies will be obtained. Incubate of McConkey agar (A.7), or another lactose-containing
at37”C+l “Cfor18h+2h.Add50mlofTYGBto medium with the same dilution series, and incubate
(A.1) a 300 ml conical flask (7.16) and warm to room at 37 “C k 1 “C for 24 h + 2 h. From plates yielding
between 30 and 300 colonies, count the number of
temperature. Select three to five lactose-positive col-
lactose-positive and lactose-negative colonies and
onies from the McConkey agar and inoculate material
from each of these colonies in the flask with TYGB. calculate the percentage of lactose-negative colonies.
Incubate for 5 h + 1 h at 37 “C +_ 1 “C while shaking
At times t = 0 h and t = 3 h, spread 0,l ml of the
at 100 min- ’ * 10 min- I. Add 10 ml of glycerol
1 O-* dilution on a plate of McConkey agar or alterna-
(A.6) and mix well. Distribute into plastics vials (7.19)
tive, place one disk with nalidixic acid (Nal) and one
in I,2 ml aliquots and store at - 70 “C + 10 “C for a
disk with kanamycin (Km) on the plates and incubate
maximum of 2 years. Control the quality of the work- l
for 24 h + 2 h at 37 “C + 1 “C.
- -
ing culture according to 9.3.
NOTES Measure inhibition zones around the antibiotic disks.
3 If a great number of te sts is an ticipated, several
The host strain is acceptable if the following criteria
fla sks can be inoculated tn parallel.
are met:
4 If quality control fails, prepare new inocula from the
plate count on TYGA (9.2) at 0 h: 0,5 to
stock culture. After repeated failures, or if the stock culture
3 x IO7 cfp/ml;
is depleted, obtain a new lyophilized ampoule of the refer-
ence culture. Do not subculture repeatedly in the laboratory.
plate count on TYGA (9.2) at 3 h: 7 to
40 x IO7 cfp/ml;
lactose-negative colonies (plasmid segregation)
9.2 Calibration of turbidity measurements
< 8 %;
Take one vial of working culture of host strain WG49
inhibition zone around Nal disk: absent;
from the freezer and thaw at room temperature. Add
50 ml of TYGB (A.1) to a nephelometric conical flask
Km disk: < 20 mm diameter.
(7.17) warm to room temperature, adjust the
NOTE 6 Antibiotic disks with a different diameter or
spectrometer reading to 0 on the filled side-arm.
concentration can be used; another criterion for the maxi-
Alternatively, use a plain conical flask (7.16) and adjust
mum inhibition zone around the Km disk should be set.
the spectrometer reading to 0 on broth transferred to
a cuvette (7.17). Inoculate 0,5 ml of working culture.
Check the host
strain for sensitivity for F-specific RNA
Incubate at 37 “C + 1 “C while shaking at
bacteriophages
as follows.
100 min-’ + 10 min- ‘for up to 3 h. Every 30 min,
measure the turbidity and withdraw a 1 ml sample for
Prepare a stock culture of bacteriophage MS2 as de-
viable counts, assuring that the flask is taken from the
scribed in annex C and store at 4 “C + 2 “C. Prepare
incubator for as short a time as possible.
a decimal dilution series and plate out according to
10.1; but use the E. co/; K-12 Hfr host strain. Store the
Dilute samples to 1 Om6 and spread 0,l ml volumes
dilution series at
...

NORME Iso
INTERNATIONALE 10705-I
Première édition
1995-08-01
Qualité de l’eau - Détection et
dénombrement des bactériophages -
Partie 1:
Dénombrement des bactériophages ARN F
spécifiques
- Detection and enumeration of bacteriophages -
Wa ter quality
Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages
Numéro de référence
ISO 10705-I : 1995(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 10705-l a été élaborée par le comité techni-
que lSO/TC 147, Qualité de /‘eau, sous-comité SC 4, Méthodes micro-
biologiques.
L’ISO 10705 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre gé-
néral Qualité de l’eau - Détection et dénombrement des
bactériophages:
- Partie 1: Dénombrement des bactériophages ARN F spécifiques
- Partie 2: Dénombrement des coliphages somatiques
L’annexe A fait partie intégrante de la présente partie de I’ISO 10705. Les
annexes B et C sont données uniquement à titre d’information.
0 ISO 1995
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
NORME INTERNATIONALE 0 ISO
- Détection et dénombrement des
Qualité de l’eau
bactériophages -
Partie 1:
Dénombrement des bactériophages ARN F spécifiques
2 Références normatives
1 Domaine d’application
La présente partie de I’ISO 10705 prescrit une mé-
thode de détection et de dénombrement des
Les normes suivantes contiennent des dispositions
bactériophages ARN F spécifiques par incubation de
qui, par suite de la référence qui en est faite, consti-
l’échantillon avec une souche-hôte appropriée. La
tuent des dispositions valables pour la présente partie
méthode peut être appliquée à tous les types d’eaux,
de I’ISO 10705. Au moment de la publication, les
de sédiments et de boues, si nécessaire après dilu-
éditions indiquées étaient en vigueur. Toute norme
tion. Dans le cas de faible population, une étape de
est sujette à révision et les parties prenantes des ac-
préconcentration peut être nécessaire pour laquelle
cords fondés sur la présente partie de I’ISO 10705
une partie séparée sera élaborée. La méthode peut
sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer les
également être appliquée aux extraits de coquillage.
éditions les plus récentes des normes indiquées ci-
Des essais supplémentaires de confirmation des ré-
après. Les membres de la CEI et de I’ISO possèdent
sultats, également spécifiés dans la présente partie
le registre des Normes internationales en vigueur à
de I’ISO 10705, peuvent être nécessaires, suivant le
un moment donné.
nombre plus ou moins élevé des bactériophages
ARN F spécifiques par rapport aux autres organismes
ISO 3696: 1987, Eau pour laboratoire à usage analyti-
présents.
- Spécifica tion et méthodes d’essai.
que
La présence de bactériophages ARN F spécifiques
ISO 5667-l : 1980, Qualité de l’eau - Échantillonnage
dans un échantillon d’eau indique en général une pol-
- Partie 1: Guide général pour I’établissemen t des
lution par des eaux usées contaminées par des ma-
programmes d’échan tilonnage.
tières fécales d’origine animale ou humaine. Les
caractéristiques de leur résistance dans I’environ- ISO 5667-2: 1991, Qualité de l’eau - Échantillonnage
nement, de leur élimination par des procédés cou- - Partie 2: Guide général sur les techniques
rants de traitement de l’eau, ainsi que de leur d’échantillonnage.
concentration ou rétention par les coquillages, res-
ISO 5667-3:1994, Qualité de l’eau - Échantillonnage
semble à celle des virus entériques humains présents
- Partie 3: Guide général pour la conservation et la
dans l’eau et dans les aliments, par exemple les
entérovirus, le virus de I’hépatite A et les rotavirus. manipulation des échantillons.

0 KO
doivent être effectuées dans une enceinte pour
I SO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales
risque biologique ou dans une zone séparée du
pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
laboratoire.
microbiologique.
ISO 8199: 1988, Qualité de l’eau - Guide général
pour le dénombrement des micro-organismes sur mi-
6 Diluant, milieux de culture et réactifs
lieu de culture.
6.1 Matériaux de base
Pour la préparation des milieux de culture et des ré-
3 Définition
actifs, utiliser des ingrédients de qualité uniforme et
des réactifs de qualité analytique, et suivre les ins-
Pour les besoins de la présente partie de I’ISO 10705,
tructions données dans l’annexe A. En ce qui
la définition suivante s’applique.
concerne la conservation, se reporter à I’ISO 8199,
sauf si précisé dans la présente partie de I’ISO 10705.
3.1 bactériophages ARN F spécifiques: Virus
Des milieux complets déshydratés peuvent
bactériens capables d’infecter une souche-hôte pos-
également être utilisés. Dans ce cas, suivre à la lettre
sédant des pili sexuels ou F produisant des plages vi-
les instructions du fabricant.
sibles de lyse bactérienne sur un tapis de bactéries
confluentes développées dans des conditions appro-
Pour la préparation des milieux de culture, utiliser de
priées, alors que le processus infectieux est inhibé en
l’eau distillée dans des récipients en verre ou
présence d’une concentration de 40 (parfois 400)
déionisée, exempte de substances pouvant inhiber la
pg/ml de RNase dans le milieu ensemencé.
croissance des bactéries dans les conditions de I’es-
sai, et conforme à I’ISO 3696.
4 Principe
6.2 Diluant
Mélanger un échantillon avec un faible volume de
Pour diluer l’échantillon, utiliser une solution peptonée
milieu de culture nutritif semi-solide. Y ajouter une
saline comme indiqué en A.8.
culture de souche-hôte et l’ensemencer sur un milieu
nutritif solide. Incuber puis examiner les boîtes pour
6.3 Réactifs
y repérer l’apparition de plaques. Si nécessaire, ef-
fectuer un examen simultané de boîtes préparées en
6.3.1 RNase pancréatique bovine, activité spécifi-
parallèle avec ajout de RNase pour confirmer les ré-
que approximative de 50 unités/mg (Kunitz).
sultats par comptages différentiels. Exprimer les ré-
sultats en concentration en nombre de particules
6.32 Disques antibiotiques, pour examiner la sen-
formant des plages (Cptp) par unité de volume.
sibilité à l’acide nalidixique (130 pg; 9 mm) et à la
kanamycine (100 pg; 9 mm).
6.3.3 Glycérol, 870 g/litre.
5 Précautions relatives à la sécurité
La souche-hôte utilisée est une souche mutée de
6.4 Cultures microbiologiques de référence
Salmonella typhimurium faiblement pathogène,
qu’il convient de manipuler conformément aux
Souche de Salmonella typhimurium WG49, de type
procédures (nationales ou internationales) de sé- phage 3 Nal’ (F’ 42 /ac::Tn5), NCTC 12484.
curité mises au point pour cette espèce
Bactériophage MS2, NCTC 12487 ou ATCC 15597-Bl.
bactérienne. Les bactériophages ARN F spécifi-
ques ne sont pas pathogènes pour l’homme ou
Escherichia coli K-12 Hfr provenant d’une collection
l’animal, mais ils sont très résistants au séchage.
de cultures appropriées, par exemple NCTC 12486 ou
II est donc recommandé de prendre des précau-
ATCC 23631.
tions appropriées pour empêcher des contami-
nations croisées des matériaux d’essai, et plus
NOTE 1 Les souches NCTC sont disponibles à la National
particulièrement lors des opérations de manipu-
Collection of Type Cultures, 61 Colindale Avenue, London
.
lation et d’examen des cultures bactériennes à
NW9 6HT, Angleterre. Les souches ATCC sont disponibles
forte concentration ou lors de l’ensemencement
à I’American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
des cultures de souches-hôtes. Ces opérations Rockville, Maryland, U.S.A.

0 ISO ISO 10705~1:1995( F)
7.15 Éprouvettes graduées, de capacités appro-
7 Appareillage et verrerie
priées.
Matériel courant de laboratoire pour analyses micro-
7.16 Fioles coniques, de 250 ml à 300 ml de capa-
biologiques, et
cité, munies de bouchons en ouate ou de tout autre
matériau approprié.
7.1 Étuve à air chaud pour stérilisation en cha-
leur sèche et autoclave. Exception faite des appa-
7.17 Cuves optiques, de 1 cm de trajet optique ou
reillages fournis déjà stérilisés, la verrerie et autre
fioles coniques néphélométriques, de 250 ml à
matériel doivent être stérilisés suivant les instructions
300 ml de capacité, munies de tubes latéraux pouvant
données dans I’ISO 8199.
être adaptés sur un spectromètre (7.10) et de bou-
chons en ouate ou de tout autre matériau approprié.
7.2 Incubateur ou bain d’eau, contrôlé thermosta-
(Voir figure 1.)
tiquement à 37 “C & 1 “C.
7.18 Unités de filtres sur membrane, pour la sté-
7.3 Incubateur ou bain d’eau, contrôlé thermosta-
rilisation, de porosité 0,2 prn.
tiquement à 37 “C + 1 “C et équipé d’un plateau
tournant à 100 min-’ & 10 min- ‘.
7.19 Fioles en plastique, munies d’un couvercle,
de 1,5 ml à 2 ml de capacité.
7.4 Bain d’eau, contrôlé thermostatiquement à
45 “C + 1 “C.
-
8 Échantillonnage
7.5 Bain d’eau ou dispositif équivalent, permet-
tant de faire fondre la gélose.
Prélever des échantillons et les livrer au laboratoire
conformément à I’ISO 8199, NS0 5667-1,
7.6 pH-mètre.
I’ISO 5667-2 et I’ISO 5667-3.
7.7 Appareil de comptage, équipé d’une source de
lumière indirecte, oblique.
9 Préparation des matériaux d’essai
7.8 Congélateur, contrôlé thermostatiquement à
9.1 Mise en culture et maintien des
- 20 “C & 5 “C.
souche-hôtes WG49 et de I’E coli K12 Hfr
7.9 Congélateur, contrôlé thermostatiquement à
La mise en culture et le maintien des souches-hôtes
-7O”Cf 10°C.
impliquent le respect de différentes étapes résumées
à la figure2. Cette figure indique également à quel
7.10 Spectromètre, capable de contenir des cuves
moment effectuer le contrôle qualité de la culture-
optiques de 1 cm ou le tube latéral de flacons
hôte.
néphélométriques (7.17) et muni d’un filtre de
500 nm à 650 nm avec une largeur de bande maxi-
9.1.1 Préparation des cultures mères
male de + 10 nm.
-
Réhydrater le contenu d’une ampoule lyophilisée de
Verrerie de laboratoire stérile d’usage courant en
la culture de référence des souches-hôtes dans un
microbiologie ou matériel à usage unique en plastique
faible volume de milieu (A.1) à l’aide d’une pipette
conformément à I’ISO 8199, et
Pasteur. Ajouter la suspension à 50 ml de milieu
(A.l) dans une fiole conique de 300 ml (7.16). Incuber
7.11 Boîtes de Petri, de 9 cm à 15 cm de diamètre.
pendant 18 h + 2 h à 37 “C + 1 “C tout en agitant à
100 min-’ +?O min-‘.
Ajouter 10 ml de glycérol
7.12 Pipettes graduées, de capacités 1 ml, 5 ml et
(A.6) et mélanger soigneusement. Répartir dans des
10 ml.
fioles en plastique (7.19) par portions aliquotes de
1,2 ml et conserver à - 70 “C + 10 OC.
-
7.13 Flacons en verre, de volumes appropriés.
NOTE 2 II convient que cette
première cultu re de la
7.14 Tubes de culture, avec bouchons. souche-hôte soit conservée comm e étalon au labo Iratoire.

0 ISO
Fioles coniques néphélométriques pour la mise en culture des souches-hôtes
Figure 1 -
CULTUREDEREFERENCE
Cultureincubee une nuit,ajouter
20 % (V/I4 de glycérol
CULTUREMERE
1 Conserverti;7OT (9.1.1) 1
Culture en phase exponentielle h
partir de colonies lactose positif,
ajouter 20 % WV) de glycWo1
1 C%;:;!;?;C t CDNTRDLE QUALITE (9.3
Culture en phase exponentielle
CULTUREDEL'INOCULUM
Conserver sur glace fondante,
utiliser dans les 2 h (10.1)
Figure 2 - Schéma de la mise en culture, du maintien et du contrôle qualité de la souche-hôte WG49
4 Si le contrôle qualité échoue, préparer de nouveaux ino-
9.1.2 Préparation des cultures d’essai
cula à partir de la culture mère. Si le contrôle qualité échoue
plusieurs fois ou si la culture mère est épuisée, se procurer
une nouvelle ampoule lyophilisée de la culture de référence.
Ne pas procéder à des repiquages successifs dans le labo-
Laisser décongeler le contenu d’une fiole de la culture
ratoire.
mère (9.1 .l) à température ambiante et l’ensemencer
dans une boîte contenant une gélose de McConkey
(A.7), ou tout autre milieu contenant du lactose de
façon à obtenir des colonies isolées. Incuber à
9.2 Étalonnage des mesures de turbidité
37 “C + 1 “C pendant 18 h + 2 h. Ajouter 50 ml de
milieu jA.1) à une fiole conique de 300 ml (7.16) et
Sortir du congélateur une fiole contenant la culture
réchauffer à température ambiante. Choisir trois à
d’essai de la souche-hôte WG49 et la laisser dé-
cinq colonies lactose positif à partir de la gélose de
congeler à température ambiante. Ajouter 50 ml de
McConkey et ensemencer chacune de ces colonies
milieu (A.l) à une fiole conique néphélométrique
dans la fiole contenant le milieu (A.l). Incuber à
(7.17) et réchauffer à température ambiante. Ajuster
37 “C + 1 “C pendant 5 h rt: 1 h tout en agitant à
le spectromètre à 0 avec le tube latéral rempli. On
Ajouter 10 ml de glycérol
100 min-’ + 10 min-‘.
peut également utiliser des fioles coniques ordinaires
(A.6) et méinger soigneusement. Répartir dans les
(7.16) et ajuster le spectromètre à 0 après transva-
fioles en plastique (7.19) par portions aliquotes de
sement du bouillon dans la cuve optique (7.17). En-
1,2 ml et conserver à - 70 “C + 10 “C pendant 2 ans
-
semencer 0,5 ml de la culture d’essai. Incuber à
maximum. Contrôler la qualité des cultures de travail
37 “C + 1 “C tout en agitant à 100 min-’
conformément à 9.3.
+ 10 min-’ pendant 3 h. Mesurer la
...

NORME Iso
INTERNATIONALE 10705-I
Première édition
1995-08-01
Qualité de l’eau - Détection et
dénombrement des bactériophages -
Partie 1:
Dénombrement des bactériophages ARN F
spécifiques
- Detection and enumeration of bacteriophages -
Wa ter quality
Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages
Numéro de référence
ISO 10705-I : 1995(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 10705-l a été élaborée par le comité techni-
que lSO/TC 147, Qualité de /‘eau, sous-comité SC 4, Méthodes micro-
biologiques.
L’ISO 10705 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre gé-
néral Qualité de l’eau - Détection et dénombrement des
bactériophages:
- Partie 1: Dénombrement des bactériophages ARN F spécifiques
- Partie 2: Dénombrement des coliphages somatiques
L’annexe A fait partie intégrante de la présente partie de I’ISO 10705. Les
annexes B et C sont données uniquement à titre d’information.
0 ISO 1995
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
NORME INTERNATIONALE 0 ISO
- Détection et dénombrement des
Qualité de l’eau
bactériophages -
Partie 1:
Dénombrement des bactériophages ARN F spécifiques
2 Références normatives
1 Domaine d’application
La présente partie de I’ISO 10705 prescrit une mé-
thode de détection et de dénombrement des
Les normes suivantes contiennent des dispositions
bactériophages ARN F spécifiques par incubation de
qui, par suite de la référence qui en est faite, consti-
l’échantillon avec une souche-hôte appropriée. La
tuent des dispositions valables pour la présente partie
méthode peut être appliquée à tous les types d’eaux,
de I’ISO 10705. Au moment de la publication, les
de sédiments et de boues, si nécessaire après dilu-
éditions indiquées étaient en vigueur. Toute norme
tion. Dans le cas de faible population, une étape de
est sujette à révision et les parties prenantes des ac-
préconcentration peut être nécessaire pour laquelle
cords fondés sur la présente partie de I’ISO 10705
une partie séparée sera élaborée. La méthode peut
sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer les
également être appliquée aux extraits de coquillage.
éditions les plus récentes des normes indiquées ci-
Des essais supplémentaires de confirmation des ré-
après. Les membres de la CEI et de I’ISO possèdent
sultats, également spécifiés dans la présente partie
le registre des Normes internationales en vigueur à
de I’ISO 10705, peuvent être nécessaires, suivant le
un moment donné.
nombre plus ou moins élevé des bactériophages
ARN F spécifiques par rapport aux autres organismes
ISO 3696: 1987, Eau pour laboratoire à usage analyti-
présents.
- Spécifica tion et méthodes d’essai.
que
La présence de bactériophages ARN F spécifiques
ISO 5667-l : 1980, Qualité de l’eau - Échantillonnage
dans un échantillon d’eau indique en général une pol-
- Partie 1: Guide général pour I’établissemen t des
lution par des eaux usées contaminées par des ma-
programmes d’échan tilonnage.
tières fécales d’origine animale ou humaine. Les
caractéristiques de leur résistance dans I’environ- ISO 5667-2: 1991, Qualité de l’eau - Échantillonnage
nement, de leur élimination par des procédés cou- - Partie 2: Guide général sur les techniques
rants de traitement de l’eau, ainsi que de leur d’échantillonnage.
concentration ou rétention par les coquillages, res-
ISO 5667-3:1994, Qualité de l’eau - Échantillonnage
semble à celle des virus entériques humains présents
- Partie 3: Guide général pour la conservation et la
dans l’eau et dans les aliments, par exemple les
entérovirus, le virus de I’hépatite A et les rotavirus. manipulation des échantillons.

0 KO
doivent être effectuées dans une enceinte pour
I SO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales
risque biologique ou dans une zone séparée du
pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
laboratoire.
microbiologique.
ISO 8199: 1988, Qualité de l’eau - Guide général
pour le dénombrement des micro-organismes sur mi-
6 Diluant, milieux de culture et réactifs
lieu de culture.
6.1 Matériaux de base
Pour la préparation des milieux de culture et des ré-
3 Définition
actifs, utiliser des ingrédients de qualité uniforme et
des réactifs de qualité analytique, et suivre les ins-
Pour les besoins de la présente partie de I’ISO 10705,
tructions données dans l’annexe A. En ce qui
la définition suivante s’applique.
concerne la conservation, se reporter à I’ISO 8199,
sauf si précisé dans la présente partie de I’ISO 10705.
3.1 bactériophages ARN F spécifiques: Virus
Des milieux complets déshydratés peuvent
bactériens capables d’infecter une souche-hôte pos-
également être utilisés. Dans ce cas, suivre à la lettre
sédant des pili sexuels ou F produisant des plages vi-
les instructions du fabricant.
sibles de lyse bactérienne sur un tapis de bactéries
confluentes développées dans des conditions appro-
Pour la préparation des milieux de culture, utiliser de
priées, alors que le processus infectieux est inhibé en
l’eau distillée dans des récipients en verre ou
présence d’une concentration de 40 (parfois 400)
déionisée, exempte de substances pouvant inhiber la
pg/ml de RNase dans le milieu ensemencé.
croissance des bactéries dans les conditions de I’es-
sai, et conforme à I’ISO 3696.
4 Principe
6.2 Diluant
Mélanger un échantillon avec un faible volume de
Pour diluer l’échantillon, utiliser une solution peptonée
milieu de culture nutritif semi-solide. Y ajouter une
saline comme indiqué en A.8.
culture de souche-hôte et l’ensemencer sur un milieu
nutritif solide. Incuber puis examiner les boîtes pour
6.3 Réactifs
y repérer l’apparition de plaques. Si nécessaire, ef-
fectuer un examen simultané de boîtes préparées en
6.3.1 RNase pancréatique bovine, activité spécifi-
parallèle avec ajout de RNase pour confirmer les ré-
que approximative de 50 unités/mg (Kunitz).
sultats par comptages différentiels. Exprimer les ré-
sultats en concentration en nombre de particules
6.32 Disques antibiotiques, pour examiner la sen-
formant des plages (Cptp) par unité de volume.
sibilité à l’acide nalidixique (130 pg; 9 mm) et à la
kanamycine (100 pg; 9 mm).
6.3.3 Glycérol, 870 g/litre.
5 Précautions relatives à la sécurité
La souche-hôte utilisée est une souche mutée de
6.4 Cultures microbiologiques de référence
Salmonella typhimurium faiblement pathogène,
qu’il convient de manipuler conformément aux
Souche de Salmonella typhimurium WG49, de type
procédures (nationales ou internationales) de sé- phage 3 Nal’ (F’ 42 /ac::Tn5), NCTC 12484.
curité mises au point pour cette espèce
Bactériophage MS2, NCTC 12487 ou ATCC 15597-Bl.
bactérienne. Les bactériophages ARN F spécifi-
ques ne sont pas pathogènes pour l’homme ou
Escherichia coli K-12 Hfr provenant d’une collection
l’animal, mais ils sont très résistants au séchage.
de cultures appropriées, par exemple NCTC 12486 ou
II est donc recommandé de prendre des précau-
ATCC 23631.
tions appropriées pour empêcher des contami-
nations croisées des matériaux d’essai, et plus
NOTE 1 Les souches NCTC sont disponibles à la National
particulièrement lors des opérations de manipu-
Collection of Type Cultures, 61 Colindale Avenue, London
.
lation et d’examen des cultures bactériennes à
NW9 6HT, Angleterre. Les souches ATCC sont disponibles
forte concentration ou lors de l’ensemencement
à I’American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
des cultures de souches-hôtes. Ces opérations Rockville, Maryland, U.S.A.

0 ISO ISO 10705~1:1995( F)
7.15 Éprouvettes graduées, de capacités appro-
7 Appareillage et verrerie
priées.
Matériel courant de laboratoire pour analyses micro-
7.16 Fioles coniques, de 250 ml à 300 ml de capa-
biologiques, et
cité, munies de bouchons en ouate ou de tout autre
matériau approprié.
7.1 Étuve à air chaud pour stérilisation en cha-
leur sèche et autoclave. Exception faite des appa-
7.17 Cuves optiques, de 1 cm de trajet optique ou
reillages fournis déjà stérilisés, la verrerie et autre
fioles coniques néphélométriques, de 250 ml à
matériel doivent être stérilisés suivant les instructions
300 ml de capacité, munies de tubes latéraux pouvant
données dans I’ISO 8199.
être adaptés sur un spectromètre (7.10) et de bou-
chons en ouate ou de tout autre matériau approprié.
7.2 Incubateur ou bain d’eau, contrôlé thermosta-
(Voir figure 1.)
tiquement à 37 “C & 1 “C.
7.18 Unités de filtres sur membrane, pour la sté-
7.3 Incubateur ou bain d’eau, contrôlé thermosta-
rilisation, de porosité 0,2 prn.
tiquement à 37 “C + 1 “C et équipé d’un plateau
tournant à 100 min-’ & 10 min- ‘.
7.19 Fioles en plastique, munies d’un couvercle,
de 1,5 ml à 2 ml de capacité.
7.4 Bain d’eau, contrôlé thermostatiquement à
45 “C + 1 “C.
-
8 Échantillonnage
7.5 Bain d’eau ou dispositif équivalent, permet-
tant de faire fondre la gélose.
Prélever des échantillons et les livrer au laboratoire
conformément à I’ISO 8199, NS0 5667-1,
7.6 pH-mètre.
I’ISO 5667-2 et I’ISO 5667-3.
7.7 Appareil de comptage, équipé d’une source de
lumière indirecte, oblique.
9 Préparation des matériaux d’essai
7.8 Congélateur, contrôlé thermostatiquement à
9.1 Mise en culture et maintien des
- 20 “C & 5 “C.
souche-hôtes WG49 et de I’E coli K12 Hfr
7.9 Congélateur, contrôlé thermostatiquement à
La mise en culture et le maintien des souches-hôtes
-7O”Cf 10°C.
impliquent le respect de différentes étapes résumées
à la figure2. Cette figure indique également à quel
7.10 Spectromètre, capable de contenir des cuves
moment effectuer le contrôle qualité de la culture-
optiques de 1 cm ou le tube latéral de flacons
hôte.
néphélométriques (7.17) et muni d’un filtre de
500 nm à 650 nm avec une largeur de bande maxi-
9.1.1 Préparation des cultures mères
male de + 10 nm.
-
Réhydrater le contenu d’une ampoule lyophilisée de
Verrerie de laboratoire stérile d’usage courant en
la culture de référence des souches-hôtes dans un
microbiologie ou matériel à usage unique en plastique
faible volume de milieu (A.1) à l’aide d’une pipette
conformément à I’ISO 8199, et
Pasteur. Ajouter la suspension à 50 ml de milieu
(A.l) dans une fiole conique de 300 ml (7.16). Incuber
7.11 Boîtes de Petri, de 9 cm à 15 cm de diamètre.
pendant 18 h + 2 h à 37 “C + 1 “C tout en agitant à
100 min-’ +?O min-‘.
Ajouter 10 ml de glycérol
7.12 Pipettes graduées, de capacités 1 ml, 5 ml et
(A.6) et mélanger soigneusement. Répartir dans des
10 ml.
fioles en plastique (7.19) par portions aliquotes de
1,2 ml et conserver à - 70 “C + 10 OC.
-
7.13 Flacons en verre, de volumes appropriés.
NOTE 2 II convient que cette
première cultu re de la
7.14 Tubes de culture, avec bouchons. souche-hôte soit conservée comm e étalon au labo Iratoire.

0 ISO
Fioles coniques néphélométriques pour la mise en culture des souches-hôtes
Figure 1 -
CULTUREDEREFERENCE
Cultureincubee une nuit,ajouter
20 % (V/I4 de glycérol
CULTUREMERE
1 Conserverti;7OT (9.1.1) 1
Culture en phase exponentielle h
partir de colonies lactose positif,
ajouter 20 % WV) de glycWo1
1 C%;:;!;?;C t CDNTRDLE QUALITE (9.3
Culture en phase exponentielle
CULTUREDEL'INOCULUM
Conserver sur glace fondante,
utiliser dans les 2 h (10.1)
Figure 2 - Schéma de la mise en culture, du maintien et du contrôle qualité de la souche-hôte WG49
4 Si le contrôle qualité échoue, préparer de nouveaux ino-
9.1.2 Préparation des cultures d’essai
cula à partir de la culture mère. Si le contrôle qualité échoue
plusieurs fois ou si la culture mère est épuisée, se procurer
une nouvelle ampoule lyophilisée de la culture de référence.
Ne pas procéder à des repiquages successifs dans le labo-
Laisser décongeler le contenu d’une fiole de la culture
ratoire.
mère (9.1 .l) à température ambiante et l’ensemencer
dans une boîte contenant une gélose de McConkey
(A.7), ou tout autre milieu contenant du lactose de
façon à obtenir des colonies isolées. Incuber à
9.2 Étalonnage des mesures de turbidité
37 “C + 1 “C pendant 18 h + 2 h. Ajouter 50 ml de
milieu jA.1) à une fiole conique de 300 ml (7.16) et
Sortir du congélateur une fiole contenant la culture
réchauffer à température ambiante. Choisir trois à
d’essai de la souche-hôte WG49 et la laisser dé-
cinq colonies lactose positif à partir de la gélose de
congeler à température ambiante. Ajouter 50 ml de
McConkey et ensemencer chacune de ces colonies
milieu (A.l) à une fiole conique néphélométrique
dans la fiole contenant le milieu (A.l). Incuber à
(7.17) et réchauffer à température ambiante. Ajuster
37 “C + 1 “C pendant 5 h rt: 1 h tout en agitant à
le spectromètre à 0 avec le tube latéral rempli. On
Ajouter 10 ml de glycérol
100 min-’ + 10 min-‘.
peut également utiliser des fioles coniques ordinaires
(A.6) et méinger soigneusement. Répartir dans les
(7.16) et ajuster le spectromètre à 0 après transva-
fioles en plastique (7.19) par portions aliquotes de
sement du bouillon dans la cuve optique (7.17). En-
1,2 ml et conserver à - 70 “C + 10 “C pendant 2 ans
-
semencer 0,5 ml de la culture d’essai. Incuber à
maximum. Contrôler la qualité des cultures de travail
37 “C + 1 “C tout en agitant à 100 min-’
conformément à 9.3.
+ 10 min-’ pendant 3 h. Mesurer la
...