ISO 11053:2009

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11053
First edition
2009-09-01


Vegetable fats and oils — Determination
of cocoa butter equivalents in milk
chocolate
Corps gras d'origine végétale — Détermination des équivalents au
beurre de cacao dans le chocolat au lait




Reference number
ISO 11053:2009(E)
©
ISO 2009

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ISO 11053:2009(E)
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ISO 11053:2009(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope . 1
2 Terms and definitions. 1
3 Principle. 1
4 Reagents, solutions and standards . 2
5 Apparatus and equipment . 3
6 Sampling. 4
7 Sample preparation . 4
7.1 Preparation of IRMM-801 for calibration purposes and system suitability tests. 4
7.2 Preparation of pure milk fat for system suitability tests . 4
7.3 Preparation of chocolate sample . 5
8 Procedure . 6
8.1 Construction of calibration curve for determination of PSB content . 6
8.2 Separation of individual TAGs of IRMM-801 by HR-GLC. 7
8.3 Separation of individual TAGs of pure MF by HR-GLC. 7
8.4 Separation of individual TAGs of chocolate fat by HR-GLC . 7
8.5 Identification. 8
9 Calculation. 8
9.1 PSB and MF quantification in chocolate fat and chocolate . 8
9.2 CBE detection in chocolate fat. 9
9.3 CBE quantification in chocolate fat and chocolate. 11
10 Procedural requirements . 13
10.1 General considerations. 13
10.2 System suitability . 13
11 Precision. 13
11.1 Interlaboratory test . 13
11.2 Repeatability. 13
11.3 Reproducibility. 14
12 Test report . 14
Annex A (informative) Results of interlaboratory test. 15
Annex B (informative) Example chromatograms . 19
Bibliography . 22

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ISO 11053:2009(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 11053 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11, Animal
and vegetable fats and oils.


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INTERNATIONAL STANDARD ISO 11053:2009(E)

Vegetable fats and oils — Determination of cocoa butter
equivalents in milk chocolate
1 Scope
This International Standard specifies a procedure for the detection and quantification of cocoa butter
equivalents (CBEs) and milk fat (MF) in milk chocolate by triacylglycerol (TAG) profiling using high-resolution
capillary gas-liquid chromatography (HR-GLC), and subsequent data evaluation by simple and partial least-
squares regression analysis. CBE admixtures can be detected at a minimum level of 0,5 g CBE/100 g milk
chocolate and quantified at a level of 5 % mass fraction CBE addition to milk chocolate with a predicted error
of 0,7 g CBE/100 g milk chocolate.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
milk fat content of milk chocolate
mass fraction of milk fat in milk chocolate determined by the procedure specified in this International Standard
NOTE The mass fraction is expressed in grams per 100 g of milk chocolate.
2.2
cocoa butter equivalents
non-cocoa vegetable oils and fats detected in milk chocolate in accordance with the procedure prescribed in
this International Standard
NOTE The result is expressed qualitatively, i.e. CBEs present/CBEs not present (YES/NO).
2.3
cocoa butter equivalent content of milk chocolate
mass fraction of substances determined by the procedure specified in this International Standard
NOTE The mass fraction is expressed in grams per 100 g of milk chocolate.
3 Principle
Test samples, i.e. chocolate fats obtained from milk chocolate using a rapid fat extraction procedure, are
separated by HR-GLC into TAG fractions according to their relative molecular mass and degree of
unsaturation. Individual TAG fractions, i.e. 1-palmitoyl-2-stearoyl-3-butyroyl-glycerol (PSB), 1,3-dipalmitoyl-
2-oleoyl-glycerol (POP), 1-palmitoyl-2-oleoyl-3-stearoyl-glycerol (POS), 1-palmitoyl-2,3-dioleoyl-glycerol
(POO), 1,3-distearoyl-2-oleoyl-glycerol (SOS), and 1-stearoyl-2,3-dioleoyl-glycerol (SOO) are used:
a) to calculate the MF content in the chocolate fat (grams of MF per 100 g chocolate fat);
b) to determine the presence/absence of CBEs in chocolate fat using a simple linear regression model
based on the three TAGs, POP, POS, and SOS, corrected for the TAG contribution originating from MF,
and if this procedure indicates that the sample is not pure cocoa butter (CB);
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c) to quantify the amount of the CBE admixture in chocolate fat (grams of CBE per 100 g chocolate fat)
using a partial least-squares (PLS) regression model with six input variables, i.e. the five TAGs, POP,
POS, POO, SOS, and SOO, normalized to 100 % and the determined MF content of the chocolate fat.
To ensure the correct labelling of milk chocolate, the results obtained relating to chocolate fat are converted
into grams of MF per 100 g chocolate and grams of CBE per 100 g chocolate, necessitating the accurate
determination of the total fat content of the chocolate using a Soxhlet extraction procedure (based on AOAC
[5]
Official Method 963.15 ). When the detection procedure proves the absence of CBEs in the chocolate fat, the
quantification and total fat content are not necessary.
4 Reagents, solutions and standards
NOTE Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
WARNING — Attention is drawn to the regulations which specify the handling of dangerous matter.
Technical, organizational and personal safety measures should be followed.
1)
4.1 Cocoa butter Certified Reference Material (IRMM-801) (see Reference [6]), for calibration purposes
and system suitability tests.
4.2 Pure milk fat, for system suitability tests.
2)
4.3 1-Palmitoyl-2-stearoyl-3-butyroyl-glycerol (PSB) .
4.3.1 General
For calibration purposes, dissolve ~40 mg of PSB in a 50 ml volumetric flask (5.9) with isooctane resulting in a
stock solution of ~ρ = 0,8 mg/ml. Mix thoroughly until complete dissolution.
From this PSB stock solution prepare a series of five calibration solutions in matrix (IRMM-801) by weighing
on an analytical balance (5.1) IRMM-801 (4.1) into 25 ml volumetric flasks (5.9) and adding the respective
volumes of the PSB stock solution as given in Table 1. Make up to the mark with isooctane.
Table 1 — Masses of IRMM-801 and volumes of PSB stock solution
for preparation of series of PSB calibration solutions in matrix
Concentration of
Final IRMM-PSB
PSB in
IRMM-801 (4.1) weighed Volume taken from PSB stock
concentration of
Calibration
calibration
into 25 ml solution and added to 25 ml
solution
solution
solution
volumetric flask volumetric flask
ρ
IRMM-PSB
ρ i
PSB
mg ml mg/ml mg/ml
1 ~250 4 0,128 ~10
2 ~250 3 0,096 ~10
3 ~250 2 0,064 ~10
4 ~250 1 0,032 ~10
5 ~250 0,5 0,016 ~10

1) Commercially available from the Institute for Reference Materials and Measurements (http://irmm.jrc.ec.europa.eu/),
Belgium. This information is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an
endorsement by ISO of this product.
2) Commercially available from Larodan (http://www.larodan.se/), Sweden. This information is given for the convenience
of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent
products may be used if they can be shown to lead to the same results.
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4.3.2 Cold on-column (OCI) injection
Dilute each calibration solution with isooctane, ϕ = 1 ml/5 ml, to obtain a final IRMM-PSB concentration
(ρ ) of ~2 mg/ml in each solution and PSB concentrations (ρ ) ranging from 0,025 6 mg/ml
IRMM-PSB PSB
(calibration solution 1) to 0,003 2 mg/ml (calibration solution 5).
4.3.3 Split injection (e.g. split ratio of 1:10)
Dilute each calibration solution with isooctane, ϕ = 1 ml/2 ml, to obtain a final IRMM-PSB concentration
(ρ ) of ~5 mg/ml in each solution and PSB concentrations (ρ ) ranging from 0,064 mg/ml
IRMM-PSB PSB
(calibration solution 1) to 0,008 mg/ml (calibration solution 5).
NOTE The final PSB concentrations shall be calculated using the actual mass in the stock standard solution.
3)
4.4 α-Cholestane , ρ = 100 mg/100 ml, used as internal standard.
Dissolve ~50 mg α-cholestane in 50 ml of isooctane.
⎯ For cold on-column injection: Dilute 1:250 (ρ = 0,004 mg/ml).
⎯ For split injection (e.g. split ratio of 1:10): Dilute 1:100 (ρ = 0,01 mg/ml).
4.5 Fat solvent, non-chlorinated solvents (e.g. petroleum ether, n-hexane, n-heptane, isooctane).
4.6 Hydrochloric acid, c(HCl) = 4 mol/l.
5 Apparatus and equipment
5.1 Analytical balance, readable to the nearest 0,1 mg.
5.2 Drying oven. A dry heater block may be used.
4)
5.3 Filter paper, diameter 15 cm [e.g. S&S 589/1 ].
5.4 Food grater, a kitchen blender with a design featuring the motor above the mixing chamber to avoid
melting the samples.
5.5 Rotary evaporator. Alternative evaporation procedures may be used.
5.6 Evaporation block, with nitrogen supply.
5.7 Desiccator, sealable enclosure containing desiccants used for preserving moisture-sensitive items.
5.8 Soxhlet extractor, with standard taper joints, siphon capacity ~100 ml (33 mm × 88 mm extraction
thimble), 250 ml Erlenmeyer flask, and regulated heating mantle (or equivalent).
5.9 Volumetric flasks, of capacity 10 ml, 25 ml, 50 ml and 100 ml (or other capacities if needed),
[2]
ISO 1042 class A.
[1]
5.10 Pipettes, of capacities ranging from 1 ml to 10 ml (or other capacities if necessary), ISO 648 class A
[4]
or ISO 8655-2 .

3) May be obtained from Sigma-Aldrich (http://www.sigmaaldrich.com/), Belgium.
4) S&S 589/1 black ribbon paper is an example of a suitable product commercially available. This information is given for
the convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
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5.11 Microsyringe, with maximum volume 10 µl, graduated to 0,1 µl, or automatic sample injector.
5.12 Gas chromatograph (GC), fitted with a cold on-column or a split injection system and a flame
ionization detector (FID).
NOTE 1 Alternative injection systems [e.g. a programmed-temperature vaporizer (PTV) or a moving-needle injector]
may be used provided the same results are obtained as indicated in 10.2.
The separation and quantification have proven to be satisfactory if the following experimental conditions are
followed:
GLC column: CB-TAP 25 m × 0,25 mm i.d., fused silica coated with a medium polar
thermostable phenylmethylpolysiloxane stationary phase with a film
thickness of 0,10 µm
Oven programme for OCI: 100 °C held for at least 2 min; 30 °C/min to 270 °C held for 1 min;
2,5 °C/min to 340 °C held for 7 min
Oven programme for split: 200 °C held for at least 1 min; 14 °C/min to 270 °C held for 1 min;
2,5 °C/min to 340 °C held for 10 min
Detector (FID): 360 °C
Carrier gas for OCI: H (purity W 99,999 %) with a constant flow rate of 3,5 ml/min (another
2
suitable carrier gas is helium)
Carrier gas for split: H (purity W 99,999 %) with a constant flow rate of 2,5 ml/min (another
2
suitable carrier gas is helium)
NOTE 2 Columns and alternative experimental conditions, used in an international collaborative study (see
Reference [7]), are listed in Table A 1. Operating conditions may be changed to obtain optimum separation.
5.13 Chromatographic data system.
6 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method
[3]
is given in ISO 5555 . A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have
been damaged or changed during transport or storage.
7 Sample preparation
7.1 Preparation of IRMM-801 for calibration purposes and system suitability tests
Before opening and using the IRMM-801 (4.1), warm the ampoule in an oven (5.2) until the contents have
melted. When a clear solution is obtained, mix the contents by repeated inversion for not less than 20 s. Then
open and transfer the contents to a clean vial, which can be tightly sealed and preserved in a cool place for
future usage.
7.2 Preparation of pure milk fat for system suitability tests
If no pure MF is available, it can be obtained from a butter sample by melting and passing the fat layer through
a folded filter paper (5.3) at 50 °C in an oven (5.2).
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7.3 Preparation of chocolate sample
7.3.1 General
Chill approximately 200 g of chocolate until hard, and grate to a fine granular condition using a food grater
(5.4). Mix thoroughly and preserve in a tightly stoppered bottle in a cool place.
7.3.2 Rapid fat extraction
The chocolate fat is separated from 5 g grated chocolate (7.3.1) by extracting with two to three 10 ml portions
of a suitable fat solvent (4.5). Centrifuge and decant. Combine the extracts and evaporate (5.5) most of the fat
solvent and finally dry it under a stream of nitrogen (5.6).
The chocolate fat obtained by rapid fat extraction is used for the final TAG analysis by HR-GLC. For the
detection of CBEs in chocolate, the accurate amount of total fat in chocolate is not needed. When no CBEs
are detected, the second part of the standard, i.e. quantification of CBEs around the statutory limit of 5 %, is
not necessary. When CBEs are detected, the quantification part should be performed using the same TAG
profile as used for the CBE detection. However, in this case, determine the accurate amount of total fat in
chocolate using the procedure in 7.3.3. Alternative extraction procedures may be used provided that the same
results are obtained.
7.3.3 Determination of total fat content
Separate the chocolate fat and determine the total fat content in a sample of milk chocolate (prepared as
[5]
described in 7.3.2) by Soxhlet extraction (based on AOAC Official Method 963.15 ), as follows.
Weigh (5.1) 4 g to 5 g of chocolate into a 300 ml to 500 ml beaker. Add slowly, while stirring, 45 ml of boiling
water to obtain a homogeneous suspension. Add 55 ml of HCl (4.6) and a few defatted boiling chips, or other
antibumping agents, and stir. Cover with a watch glass, bring the solution slowly to the boil, and simmer for
15 min. Rinse the watch glass with 100 ml of water. Filter the solution through a medium fluted filter
paper (5.3), or equivalent, rinsing the beaker three times with water. Continue washing until the last portion of
filtrate is chlorine-free. Transfer the filter with the sample to a defatted extraction thimble and dry for 2 h in a
small beaker at 100 °C. Place a glass wool plug over the filter paper. Add a few defatted antibumping chips to
a 250 ml Erlenmeyer flask and dry for 1 h at 100 °C. Cool the flask to room temperature in a desiccator (5.7)
then weigh (5.1) it. Place the thimble containing the dried sample in the Soxhlet apparatus (5.8), supporting it
with a spiral or glass beads. Rinse the digestion beaker, drying beaker and watch glass with three 50 ml
portions of petroleum ether, and add the washings to the thimble. Reflux the digested sample for 4 h,
adjusting the heat so that the extractor siphons more than 30 times. Remove the flask and evaporate the
solvent. Dry the flask at 102 °C to constant mass (1,5 h). Cool in the desiccator (5.7) to room temperature,
then weigh (5.1). Constant mass is attained when successive 1 h drying periods show additional loss of
< 0,05 % fat. Duplicate determinations should agree to within 0,1 % fat.
The mass fraction, expressed as a percentage, of total fat in the chocolate, w , is given by:
fat; choc
m ×100
fat
w = (1)
fat; choc
m
where
m is the mass, in grams, of chocolate taken;
m is the mass, in grams, of the total fat obtained from the chocolate by Soxhlet extraction (based
fat
[5]
on AOAC Official Method 963.15 ).
Alternative extraction procedures may be used (e.g. by accelerated solvent extraction, by supercritical carbon
dioxide or by using microwaves) provided that the same results are obtained. The chocolate fat obtained by
Soxhlet extraction should not be used for TAG analysis by HR-GLC since changes in the obtained TAG profile
could be observed in some cases.
Report the result to two decimal places.
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8 Procedure
8.1 Construction of calibration curve for determination of PSB content
Five calibration solutions containing different concentrations of PSB (4.3) but always the same concentration
of α-cholestane (4.4) are prepared as follows.
For cold on-column (OCI) injection:
⎯ Calibration solution 1 (Final ρ = 0,012 8 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 1 α-cholestane 1
calibration solution 1 (ρ = 0,025 6 mg/ml; 4.3) into a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 1
(ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
⎯ Calibration solution 2 (Final ρ = 0,009 6 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 2 α-cholestane 2
calibration solution 2 (ρ = 0,019 2 mg/ml; 4.3) into a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 2
(ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
⎯ Calibration solution 3 (Final ρ = 0,006 4 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 3 α-cholestane 3
calibration solution 3 (ρ = 0,012 8 mg/ml; 4.3) into a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 3
(ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
⎯ Calibration solution 4 (Final ρ = 0,003 2 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 4 α-cholestane 4
calibration solution 4 (ρ = 0,006 4 mg/ml; 4.3) into a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 4
(ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
⎯ Calibration solution 5 (Final ρ = 0,001 6 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 5 α-cholestane 5
calibration solution 5 (ρ = 0,003 2 mg/ml; 4.3) into a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 5
(ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
Inject 0,5 µl of each calibration solution into the HR-GLC system using the cold on-column injection system.
For split injection:
⎯ Calibration solution 1 (Final ρ = 0,032 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 1 α-cholestane 1
calibration solution 1 (ρ = 0,064 mg/ml; 4.3) into a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 1
(ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
⎯ Calibration solution 2 (Final ρ = 0,024 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 2 α-cholestane 2
calibration solution 2 (ρ = 0,048 mg/ml; 4.3) into a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 2
(ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
⎯ Calibration solution 3 (Final ρ = 0,016 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 3 α-cholestane 3
calibration solution 3 (ρ = 0,032 mg/ml; 4.3) into a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 3
(ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
⎯ Calibration solution 4 (Final ρ = 0,008 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 4 α-cholestane 4
calibration solution 4 (ρ = 0,016 mg/ml; 4.3) in a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 4
(ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
⎯ Calibration solution 5 (Final ρ = 0,004 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 5 α-cholestane 5
calibration solution 5 (ρ = 0,008 mg/ml; 4.3) into a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 5
(ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
Inject 1 µl of the final test solution into the HR-GLC system using the split injection system.
Alternative sample amounts and injectors may be used provided that the detection system employed gives a
linear response and conforms to the system suitability criteria (10.2).
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8.2 Separation of individual TAGs of IRMM-801 by HR-GLC
The IRMM-801 (4.1) shall be warmed in a drying oven (5.2) until completely melted. Pipettes (or similar
equipment) used for transferring the sample during weighing operations should be brought to a temperature of
~55 °C in a drying oven to avoid partial fat fractionation during handling of samples.
For cold on-column (OCI) injection: Weigh (5.1) ~0,1 g of IRMM-801 (4.1) in a 10 ml volumetric flask (5.9)
and dilute to the mark with isooctane (4.5). Pipette (5.10) 1 ml of the resulting solution into another 50 ml
volumetric flask (5.9) and dilute to the mark with the same solvent (ρ = 0,2 mg/ml). Inject 0,5 µl of the final test
solution into the HR-GLC system using the cold on-column injection system.
For split injection: Weigh (5.1) ~0,1 g of IRMM-801 (4.1) in a 10 ml volumetric flask (5.9) and dilute to the
mark with isooctane (4.5). Pipette (5.10) 1 ml of the resulting solution into another 10 ml volumetric flask and
dilute to the mark with the same solvent (ρ = 1 mg/ml). Inject 1 µl of the final test solution into the HR-GLC
system using the split injection system.
Alternative fat solvents, sample amounts and injectors may be used provided that the detection system
employed gives a linear response and conforms to the system suitability criteria (10.2).
8.3 Separation of individual TAGs of pure MF by HR-GLC
For cold on-column injection (OCI): Weigh (5.1) ~0,05 g of pure MF (4.2) in a 50 ml volumetric flask (5.9)
and dilute to the mark with isooctane (4.5) (ρ = 1 mg/ml). Transfer 1 ml of this solution to a test tube and add
1 ml of α-cholestane solution (4.4) (resulting test solution ρ = 0,5 mg/ml). Inject 0,5 µl of the final test solution
into the HR-GLC system using the cold on-column injection system.
For split injection: Weigh (5.1) ~0,25 g of pure MF (4.2) in a 50 ml volumetric flask (5.9) and dilute to the
mark with isooctane (4.5) (ρ = 5 mg/ml). Transfer 1 ml of this solution to a test tube and add 1 ml of α-
cholestane solution (4.4) (resulting test solution ρ = 2,5 mg/ml). Inject 1 µl of the final test solution into the HR-
GLC system using the split injection system.
Alternative fat solvents, sample amounts and injectors may be used provided that the detection system
employed gives a linear response and conforms to the system suitability criteria (10.2).
8.4 Separation of individual TAGs of chocolate fat by HR-GLC
The test sample [chocolate fat extracted from milk chocolate by rapid fat extraction (7.3.2)] shall be warmed in
a drying oven (5.2) until completely melted. If the liquid sample contains some sediment, filter the sample
inside the oven to obtain a clear filtrate. Pipettes (or similar equipment) used for transferring the sample during
weighing operations should be brought to a temperature of ~55 °C in a drying oven in order to avoid partial fat
fractionation during handling of samples.
For cold on-column (OCI) injection: Weigh (5.1) ~0,1 g of chocolate fat (as obtained in 7.3.2) on an
analytical balance (5.1) in a 100 ml volumetric flask (5.9) and dilute to the mark with isooctane (4.5)
(ρ = 1 mg/ml). Transfer 1 ml of this solution to a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution (4.4) (resulting
test solution ρ = 0,5 mg/ml). Inject 0,5 µl of the final test solution into the HR-GLC system using the cold
on-column injection system.
For split injection: Weigh (5.1) ~0,5 g of chocolate fat (as obtained in 7.3.2) on an analytical balance (5.1) in
a 100 ml volumetric flask (5.9) and dilute to the mark with isooctane (4.5
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 11053
Première édition
2009-09-01



Corps gras d'origine végétale —
Détermination des équivalents au beurre
de cacao dans le chocolat au lait
Vegetable fats and oils — Determination of cocoa butter equivalents in
milk chocolate




Numéro de référence
ISO 11053:2009(F)
©
ISO 2009

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ISO 11053:2009(F)
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Publié en Suisse

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ISO 11053:2009(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
1 Domaine d'application. 1
2 Termes et définitions. 1
3 Principe. 1
4 Réactifs, solutions et étalons . 2
5 Appareillage et équipement. 3
6 Échantillonnage . 5
7 Préparation de l'échantillon. 5
7.1 Préparation de l'IRMM-801 pour les besoins d'étalonnage et les essais d'aptitude du
système. 5
7.2 Préparation de la matière grasse pure du lait pour les essais d'aptitude du système . 5
7.3 Préparation de l'échantillon de chocolat. 5
8 Mode opératoire . 6
8.1 Construction de la courbe d'étalonnage pour la détermination de la teneur en PSB . 6
8.2 Séparation des TAG individuels de l'IRMM-801 par CGL-HR. 7
8.3 Séparation des TAG individuels de MGL pure par CGL-HR. 8
8.4 Séparation des TAG individuels de la matière grasse du chocolat par CGL-HR. 8
8.5 Identification. 8
9 Calcul . 9
9.1 Quantification de PSB et MGL dans la matière grasse du chocolat et le chocolat . 9
9.2 Détection d'EBC dans la matière grasse du chocolat. 10
9.3 Quantification des EBC dans la matière grasse du chocolat et dans le chocolat. 12
10 Exigences de la méthode. 14
10.1 Considérations générales. 14
10.2 Aptitude à l'emploi du système. 14
11 Fidélité . 15
11.1 Essai interlaboratoires . 15
11.2 Répétabilité. 15
11.3 Reproductibilité. 15
12 Rapport d'essai . 15
Annexe A (informative) Résultats de l'essai interlaboratoires . 16
Annexe B (informative) Exemple de chromatogrammes. 20
Bibliographie . 23

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ISO 11053:2009(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 11053 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 11,
Corps gras d'origines animale et végétale.


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NORME INTERNATIONALE ISO 11053:2009(F)

Corps gras d'origine végétale — Détermination des équivalents
au beurre de cacao dans le chocolat au lait
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détection et de quantification des équivalents au
beurre de cacao (EBC) et matière grasse du lait (MGL) dans le chocolat au lait par établissement de profils de
triacylglycérols (TAG) en utilisant la chromatographie gaz-liquide sur colonne capillaire haute résolution
(CGL-HR) ainsi que les évaluations subséquentes des données par analyse de régression simple ou partielle
des moindres carrés. Les adjuvants d'EBC peuvent être détectés à un niveau minimal de 0,5 g d'EBC/100 g
de chocolat au lait et évalués quantitativement à un niveau d’ajout de 5 % en fraction massique d'EBC au
chocolat au lait, avec une erreur prévue de 0,7 g d'EBC/100 g de chocolat au lait.
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
teneur en matière grasse du lait dans le chocolat au lait
fraction massique de matière grasse du lait dans le chocolat au lait, déterminée par la méthode spécifiée dans
la présente Norme internationale
NOTE La fraction massique est exprimée en grammes par 100 g de chocolat au lait.
2.2
équivalents au beurre de cacao
EBC
corps gras d'origine végétale, autres que le cacao, détectés dans le chocolat au lait conformément à la
méthode spécifiée dans la présente Norme internationale
NOTE Le résultat est exprimé en terme qualitatif, c'est-à-dire EBC présents/EBC absents (OUI/NON).
2.3
teneur en équivalents au beurre de cacao du chocolat au lait
fraction massique des substances déterminée par la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale
NOTE La fraction massique est exprimée en grammes par 100 g de chocolat au lait.
3 Principe
Les échantillons pour essai, c'est-à-dire la matière grasse du chocolat obtenue à partir du chocolat au lait en
utilisant une méthode d'extraction rapide de matière grasse, sont séparés par CGL-HR en fractions de TAG
selon leur masse moléculaire et leur degré d'insaturation. Les fractions individuelles de TAG,
c'est-à-dire 1-palmityl-2-stéaryl-3-butyrylglycérol (PSB), 1,3-dipalmityl-2-oléylglycérol (POP),
1-palmityl-2-oléyl-3-stéarylglycérol (POS), 1-palmityl-2,3-dioléylglycérol (POO), 1,3-distéaryl-2-oléylglycérol
(SOS) et 1-stéaryl-2,3-dioléylglycérol (SOO), sont utilisées:
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ISO 11053:2009(F)
a) pour calculer la teneur en MGL dans la matière grasse du chocolat (grammes de MGL par 100 g de
matière grasse du chocolat);
b) pour déterminer la présence/l'absence d'EBC dans la matière grasse du chocolat en utilisant un modèle
de régression linéaire simple fondé sur les trois TAG: POP, POS et SOS corrigées pour la contribution du
TAG provenant de la MGL, et si cette méthode indique que l'échantillon n'est pas du beurre de cacao
pur (BC);
c) pour quantifier la quantité d'adjuvant d'EBC dans la matière grasse du chocolat (grammes d'EBC par
100 g de matière grasse du chocolat) en utilisant un modèle de régression partielle des moindres carrés
à six variables d'entrée, c'est-à-dire les cinq TAG: POP, POS, POO, SOS et SOO normalisés à 100 % et
la teneur en MGL déterminée de la matière grasse du chocolat.
Afin de garantir l'étiquetage correct du chocolat au lait, les résultats obtenus pour la matière grasse du
chocolat sont convertis en grammes de MGL par 100 g de chocolat et grammes d'EBC par 100 g de chocolat,
ce qui nécessite la détermination exacte de la teneur totale en matière grasse du chocolat en utilisant une
[5]
méthode d'extraction de Soxhlet (fondée sur la méthode officielle 963.15 de l'AOAC ). Lorsque la méthode
de détection montre l'absence d'EBC dans la matière grasse du chocolat, la quantification et la teneur totale
en matière grasse ne sont pas nécessaires.
4 Réactifs, solutions et étalons
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
AVERTISSEMENT — L'attention est attirée sur les réglementations traitant de la manipulation des
substances dangereuses. Il convient de suivre les mesures de sécurité d'ordre technique,
organisationnel et personnel.
1)
4.1 Matériau de Référence Certifié du beurre de cacao (IRMM-801) (voir Référence [6]), pour les
besoins d'étalonnage et les essais d'aptitude du système.
4.2 Matière grasse du lait pure, pour les essais d'aptitude du système.
2)
4.3 1-palmityl-2-stéaryl-3-butyrylglycérol (PSB) .
4.3.1 Généralités
Pour les besoins d'étalonnage, dissoudre environ 40 mg de PSB dans une fiole jaugée de 50 ml (5.9) avec de
l'isooctane pour obtenir une solution mère d'environ ρ = 0,8 mg/ml. Mélanger soigneusement jusqu'à
dissolution complète.
À partir de cette solution mère de PSB, préparer une série de cinq solutions étalons dans la matrice
(IRMM-801) en pesant, sur une balance analytique (5.1) l'IRMM-801 (4.1) dans des fioles jaugées de 25 ml
(5.9) et en ajoutant les volumes respectifs de la solution mère de PSB comme indiqué dans le Tableau 1.
Compléter jusqu'au repère avec de l'isooctane.

1) Disponible auprès de l'Institut des matériaux de référence et des mesures (http://irmm.jrc.ec.europa.eu/), Belgique.
Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que
l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif de ce produit.
2) Disponible auprès de Larodan (http://www.larodan.se/), Suède. Cette information est donnée à l'intention des
utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi
exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent aux
mêmes résultats.
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ISO 11053:2009(F)
Tableau 1 — Masses d'IRMM-801 et volumes de solution mère de PSB pour la préparation
de la série des solutions étalons de PSB dans la matrice
Concentration
Concentration de
finale en
IRMM-801 (4.1) pesé Volume prélevé de solution
PSB dans la
IRMM-PSB
Solution étalon dans une fiole jaugée mère de PSB et ajouté dans
solution étalon
dans la solution
de 25 ml la fiole jaugée de 25 ml
ρ i
PSB
ρ
IRMM-PSB
mg ml mg/ml mg/ml
1 ~250 4 0,128 ~10
2 ~250 3 0,096 ~10
3 ~250 2 0,064 ~10
4 ~250 1 0,032 ~10
5 ~250 0,5 0,016 ~10
4.3.2 Injection en tête de colonne à froid (ITCF)
Diluer chaque solution étalon à ϕ = 1 ml/5 ml avec de l'isooctane pour obtenir une concentration finale en
IRMM-PSB (ρ ) d'environ 2 mg/ml dans chaque solution et des concentrations en PSB (ρ ) allant
IRMM-PSB PSB
de 0,025 6 mg/ml (solution étalon 1) à 0,003 2 mg/ml (solution étalon 5).
4.3.3 Injection avec division (par exemple rapport de division de 1:10)
Diluer chaque solution étalon à ϕ = 1 ml/2 ml avec de l'isooctane pour obtenir une concentration finale en
IRMM-PSB (ρ ) d'environ 5 mg/ml dans chaque solution et des concentrations en PSB (ρ ) allant
IRMM-PSB PSB
de 0,064 mg/ml (solution étalon 1) à 0,008 mg/ml (solution étalon 5).
NOTE Les concentrations finales en PSB doivent être calculées en utilisant la masse réelle dans la solution étalon
mère.
3)
4.4 α-Cholestane , ρ = 100 mg/100 ml, utilisé comme étalon interne.
Dissoudre environ 50 mg d'α-cholestane dans 50 ml d'isooctane.
⎯ Pour l'injection en tête de colonne à froid: Diluer à 1:250 (ρ = 0,004 mg/ml).
⎯ Pour l'injection avec division (par exemple rapport de division de 1:10): Diluer à 1:100 (ρ = 0,01 mg/ml).
4.5 Solvant de matière grasse, solvants non chlorés (par exemple éther de pétrole, n-hexane, n-heptane,
isooctane).
4.6 Acide chlorhydrique, c(HCl) = 4 mol/l.
5 Appareillage et équipement
5.1 Balance analytique, lisible à 0,1 mg près.
5.2 Étuve. Un bloc de séchage à sec peut être utilisé.

3) Disponible auprès de Sigma-Aldrich (http://www.sigmaaldrich.com/), Belgique.
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ISO 11053:2009(F)
4)
5.3 Papier-filtre, de 15 cm de diamètre [par exemple S&S 589/1 ].
5.4 Râpe à aliments, mélangeur de cuisine avec une conception comportant le moteur au-dessus de la
chambre de mélange pour éviter la fusion des échantillons.
5.5 Évaporateur rotatif. D'autres méthodes d'évaporation peuvent être utilisées.
5.6 Bloc d'évaporation, avec alimentation en azote.
5.7 Dessiccateur, enceinte hermétique contenant des déshydratants, utilisée pour conserver les produits
sensibles à l'humidité.
5.8 Extracteur de Soxhlet, avec raccords coniques normalisés, capacité de siphon d'environ 100 ml
(cartouche pour extraction 33 mm × 88 mm), erlenmeyer de 250 ml et chauffe-ballon régulé (ou équivalent).
5.9 Fioles jaugées, d'une capacité de 10 ml, 25 ml, 50 ml et 100 ml (ou autres capacités si nécessaire),
[2]
ISO 1042 , classe A.
[1]
5.10 Pipettes, de capacités allant de 1 ml à 10 ml (ou autres capacités si nécessaire), ISO 648 , classe A
[4]
ou ISO 8655-2 .
5.11 Microseringue, d'un volume maximal de 10 µl, graduée à 0,1 µl, ou injecteur automatique d'échantillon.
5.12 Chromatographe en phase gazeuse (CG), équipé d'un injecteur en tête de colonne à froid ou d'un
système d'injection avec division et d'un détecteur à ionisation de flamme (DIF).
NOTE 1 D'autres systèmes d'injection [par exemple un vaporisateur à température programmée (PTV) ou un injecteur
à aiguille mobile] peuvent être utilisés à condition d'obtenir les mêmes résultats que ceux indiqués en 10.2.
La séparation et la quantification s'avèrent satisfaisantes si les conditions expérimentales suivantes sont
suivies:
Colonne de CGL: BC-TAP 25 m × 0,25 mm de diamètre intérieur, silice fondue enduite
d'une phase stationnaire thermostable moyennement polaire de type
phénylméthylpolysiloxane, d'épaisseur de film 0,10 µm
Programme d'étuve pour ITCF: 100 °C maintenus pendant au minimum 2 min; 30 °C/min jusqu'à
270 °C maintenus pendant 1 min; 2,5 °C/min jusqu'à 340 °C maintenus
pendant 7 min
Programme d'étuve pour diviseur: 200 °C maintenus pendant au minimum 1 min; 14 °C/min jusqu'à
270 °C maintenus pendant 1 min; 2,5 °C/min jusqu'à 340 °C maintenus
pendant 10 min
Détecteur (DIF): 360 °C
Gaz vecteur pour ITCF: H (pureté W 99,999 %) avec un débit constant de 3,5 ml/min (l'hélium

2
peut également être un gaz vecteur convenable)
Gaz vecteur pour diviseur: H (pureté W 99,999 %) avec un débit constant de 2,5 ml/min (l'hélium
2
peut également être un gaz vecteur convenable)
NOTE 2 Les colonnes et d'autres conditions expérimentales, utilisées dans une étude interlaboratoires
internationale (voir Référence [7]), sont énumérées dans le Tableau A.1. Les conditions de fonctionnement peuvent être
modifiées pour obtenir une séparation optimale.
5.13 Système de données chromatographiques.

4) Le papier ruban noir S&S 589/1 est un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette information
est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou
recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré
qu'ils conduisent aux mêmes résultats.
4 © ISO 2009 – Tous droits réservés

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ISO 11053:2009(F)
6 Échantillonnage
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
[3]
méthode d'échantillonnage recommandée est donnée dans l'ISO 5555 . Il convient d'envoyer au laboratoire
un échantillon représentatif. Il convient qu'il ne soit pas endommagé ou modifié pendant le transport ou le
stockage.
7 Préparation de l'échantillon
7.1 Préparation de l'IRMM-801 pour les besoins d'étalonnage et les essais d'aptitude du
système
Avant l'ouverture et l'utilisation de l'IRMM-801 (4.1), chauffer l'ampoule dans une étuve (5.2) jusqu'à fusion du
contenu. Après obtention d'une solution claire, mélanger le contenu par inversions répétées pendant au moins
20 s. Ouvrir et transférer ensuite le contenu dans une fiole propre, qui peut être hermétiquement scellée et
conservée dans un endroit frais pour utilisation ultérieure.
7.2 Préparation de la matière grasse pure du lait pour les essais d'aptitude du système
Si aucune MGL pure n'est disponible, elle peut être obtenue à partir d'un échantillon de beurre par fusion et
passage de la couche de matière grasse sur un papier-filtre plissé (5.3) dans une étuve (5.2) à 50 °C.
7.3 Préparation de l'échantillon de chocolat
7.3.1 Généralités
Refroidir environ 200 g de chocolat jusqu'à durcissement, et le râper jusqu'à l'état granulaire fin à l'aide d'une
râpe à aliments (5.4). Mélanger soigneusement et conserver dans une bouteille hermétiquement bouchée
dans un endroit frais.
7.3.2 Extraction rapide de matière grasse
La matière grasse du chocolat est extraite de 5 g de chocolat râpé (7.3.1) au moyen de deux à trois portions
de 10 ml d'un solvant approprié à l'extraction des matières grasses (4.5). Centrifuger et décanter. Combiner
les extraits, évaporer (5.5) la majeure partie du solvant, puis sécher sous azote (5.6).
La matière grasse du chocolat obtenue par l'extraction rapide de matière grasse est utilisée pour l'analyse
finale de TAG par CGL-HR. Pour la détection des EBC dans le chocolat, la quantité précise de matière grasse
totale dans le chocolat n'est pas nécessaire. Lorsque aucun EBC n'est détecté, la deuxième partie de la
norme, c'est-à-dire la quantification des EBC autour de la limite établie de 5 %, n'est pas nécessaire. Lorsque
des EBC sont détectés, il convient de réaliser la quantification en utilisant le même profil de TAG que celui
utilisé pour la détection des EBC. Cependant, dans ce cas, déterminer la quantité précise de matière grasse
totale dans le chocolat en utilisant la méthode en 7.3.3. D'autres méthodes d'extraction peuvent être utilisées
à condition d'obtenir les mêmes résultats.
7.3.3 Détermination de la teneur totale en matière grasse
Séparer la matière grasse du chocolat et déterminer la teneur totale en matière grasse dans un échantillon de
chocolat au lait (préparé tel que décrit en 7.3.2) par extraction de Soxhlet (fondée sur la méthode officielle
[5]
963.15 de l'AOAC ), comme suit.
Peser (5.1) 4 g à 5 g de chocolat dans un bécher de 300 ml à 500 ml. Ajouter lentement, tout en remuant,
45 ml d'eau bouillante pour obtenir une suspension homogène. Ajouter 55 ml de HCl (4.6) et quelques
régulateurs d'ébullition exempts de matière grasse, ou autres agents anti-projection, et remuer. Couvrir avec
un verre de montre, porter la solution lentement à ébullition, et laisser bouillir doucement pendant 15 min.
Rincer le verre de montre avec 100 ml d'eau. Filtrer la solution à l'aide d'un papier-filtre plissé moyen (5.3) ou
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un équivalent, en rinçant le bécher trois fois avec de l'eau. Continuer le rinçage jusqu'à ce que la dernière
portion du filtrat soit exempte de chlore. Transférer le filtre avec l'échantillon dans une cartouche pour
extraction dégraissée et sécher pendant 2 h dans un petit bécher à 100 °C. Placer un bouchon de laine de
verre sur le papier-filtre. Ajouter quelques agents anti-projections exempts de matière grasse dans un
erlenmeyer de 250 ml et sécher pendant 1 h à 100 °C. Refroidir le flacon à la température ambiante dans un
dessiccateur (5.7) et le peser (5.1). Placer la cartouche contenant l'échantillon séché dans l'extracteur de
Soxhlet (5.8), en le soutenant avec une spirale ou des billes de verre. Rincer le bécher de digestion, le bécher
de séchage et le verre de montre avec trois portions de 50 ml d'éther de pétrole, et ajouter les rinçages à la
cartouche. Porter à ébullition à reflux l'échantillon digéré pendant 4 h, en ajustant la température pour que le
siphonage de l'extracteur soit supérieur à 30 fois. Retirer le flacon et évaporer le solvant. Sécher le flacon à
102 °C à masse constante (1,5 h). Refroidir dans le dessiccateur (5.7) à température ambiante, puis peser
(5.1). La masse constante est atteinte lorsque des périodes successives de séchage de 1 h indiquent une
perte supplémentaire de matière grasse inférieure à 0,05 %. Il convient que les déterminations doubles
s'inscrivent dans les limites de 0,1 % de matière grasse.
La fraction massique, exprimée sous forme de pourcentage, de matière grasse totale dans le chocolat,
w , est donnée par:
fat; choc
m ×100
fat
w = (1)
fat; choc
m
où
m est la masse, en grammes, de chocolat prélevée;
m est la masse, en grammes, de la matière grasse totale obtenue à partir du chocolat par
fat
[5]
extraction de Soxhlet (fondée sur la méthode officielle 963.15 de l'AOAC ).
D'autres méthodes d'extraction peuvent être utilisées (par exemple par extraction accélérée de solvant, par
dioxyde de carbone supercritique ou par micro-ondes) à condition d'obtenir les mêmes résultats. Il convient
de ne pas utiliser la matière grasse du chocolat obtenue par l'extraction de Soxhlet pour l'analyse de TAG par
CGL-HR, car il est possible d'observer dans certains cas des changements du profil de TAG obtenu.
Exprimer les résultats à deux décimales.
8 Mode opératoire
8.1 Construction de la courbe d'étalonnage pour la détermination de la teneur en PSB
Cinq solutions étalons contenant des concentrations différentes de PSB (4.3) mais à concentration constante
d'α-cholestane (4.4) sont préparées comme suit.
Pour l'injection en tête de colonne à froid (ITCF):
⎯ Solution étalon 1 (concentration finale ρ = 0,012 8 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transférer
PSB 1 α-cholestane 1
1 ml de la solution étalon 1 (ρ = 0,025 6 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la
PSB 1
solution d'α-cholestane (ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
⎯ Solution étalon 2 (concentration finale ρ = 0,009 6 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transférer
PSB 2 α-cholestane 2
1 ml de la solution étalon 2 (ρ = 0,019 2 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la
PSB 2
solution d'α-cholestane (ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
⎯ Solution étalon 3 (concentration finale ρ = 0,006 4 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transférer
PSB 3 α-cholestane 3
1 ml de la solution étalon 3 (ρ = 0,012 8 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la
PSB 3
solution d'α-cholestane (ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
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ISO 11053:2009(F)
⎯ Solution étalon 4 (concentration finale ρ = 0,003 2 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transférer
PSB 4 α-cholestane 4
1 ml de la solution étalon 4 (ρ = 0,006 4 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la
PSB 4
solution d'α-cholestane (ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
⎯ Solution étalon 5 (concentration finale ρ = 0,001 6 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transférer
PSB 5 α-cholestane 5
1 ml de la solution étalon 5 (ρ = 0,003 2 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la
PSB 5
solution d'α-cholestane (ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
Injecter 0,5 µl de chaque solution étalon dans le système de CGL-HR en utilisant le système d'injection en
tête de colonne à froid.
Pour l'injection avec division:
⎯ Solution étalon 1 (concentration finale ρ = 0,032 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transférer
PSB 1 α-cholestane 1
1 ml de la solution étalon 1 (ρ = 0,064 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la solution
PSB 1
d'α-cholestane (ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
⎯ Solution étalon 2 (concentration finale ρ = 0,024 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transférer
PSB 2 α-cholestane 2
1 ml de la solution étalon 2 (ρ = 0,048 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la solution
PSB 2
d'α-cholestane (ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
⎯ Solution étalon 3 (concentration finale ρ = 0,016 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transférer
PSB 3 α-cholestane 3
1 ml de la solution étalon 3 (ρ = 0,032 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la solution
PSB 3
d'α-cholestane (ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
⎯ Solution étalon 4 (concentration finale ρ = 0,008 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transférer
PSB 4 α-cholestane 4
1 ml de la solution étalon 4 (ρ = 0,016 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la solution
PSB 4
d'α-cholestane (ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
⎯ Solution étalon 5 (concentration finale ρ = 0,004 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transférer
PSB 5 α-cholestane 5
1 ml de la solution étalon 5 (ρ = 0,008 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la solution
PSB 5
d'α-cholestane (ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
Injecter 1 µl de la solution finale pour essai dans le système de CGL-HR en utilisant le système d'injection
avec division.
D'autres quantités d'échantillons et d'autres injecteurs peuvent être utilisés à condition que le système de
détection employé donne une réponse linéaire et soit conforme aux critères d'aptitude du système (10.2).
8.2 Séparation des TAG individuels de l'IRMM-801 par CGL-HR
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