ISO 22303:2008

NORME ISO
INTERNATIONALE 22303
Première édition
2008-07-15
Tabac — Dosage des nitrosamines
spécifiques du tabac — Méthode
d'extraction par solution tampon
Tobacco — Determination of tobacco specific nitrosamines — Method
using buffer extraction
Numéro de référence
©
ISO 2008
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Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives. 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principe. 1
5 Réactifs. 2
6 Appareillage. 2
7 Préparation de la solution d'extraction et des étalons . 3
7.1 Préparation de la solution tampon d'extraction . 3
7.2 Préparation de l'étalon interne . 3
7.3 Préparation des étalons d'étalonnage. 3
7.4 Réglage du chromatographe en phase gazeuse et du détecteur . 4
7.5 Extraction du tabac et isolation des nitrosamines spécifiques du tabac. 5
7.6 Concentration de l'extrait. 5
8 Analyse des données et calcul des résultats . 6
9 Répétabilité et reproductibilité . 6
10 Rapport d'essai . 7
Annexe A (informative) Exemples de chromatogrammes et de courbes d'étalonnage. 8
Bibliographie . 10

Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 22303 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 126, Tabac et produits du tabac.
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Introduction
Au cours de l'élaboration de la présente Norme internationale, des essais interlaboratoires ont été effectués à
l'aide de deux méthodes différentes de dosage des nitrosamines spécifiques du tabac: la présente méthode
par extraction par solution tampon et la méthode par extraction au chlorure de méthylène alcalin
(voir Références [2] et [3]).
Ces études montrent qu'il n'existe aucune différence entre les résultats obtenus avec ces deux méthodes
(voir Référence [4]). La méthode par extraction au chlorure de méthylène alcalin est décrite dans la
Spécification technique ISO/TS 22304, (voir Référence [1]).

NORME INTERNATIONALE ISO 22303:2008(F)

Tabac — Dosage des nitrosamines spécifiques du tabac —
Méthode d'extraction par solution tampon
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie le mode opératoire à suivre pour le dosage des nitrosamines
spécifiques du tabac (TSNAs): N-nitrosonornicotine (NNN), N-nitrosoanatabine (NAT), N-nitrosoanabasine
(NAB) et 4-(méthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) par chromatographie en phase gazeuse dans
le tabac en feuilles broyées, le tabac manufacturé et les produits du tabac manufacturés.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence (y compris les éventuels amendements) s'applique.
ISO 1042, Verrerie de laboratoire — Fioles jaugées à un trait
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
nitrosamines spécifiques du tabac
TSNAs
quatre nitrosamines sont prédominantes dans le tabac: la N-nitrosonornicotine (NNN), la N-nitrosoanatabine
(NAT), la N-nitrosoanabasine (NAB) et la 4-(méthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK)
4 Principe
Les nitrosamines spécifiques du tabac sont extraites d'échantillons de tabac broyé à l'aide d'une solution
tampon. La portion aqueuse de la solution tampon est absorbée sur de la terre de diatomées. Les
nitrosamines spécifiques du tabac sont ensuite éluées de la terre de diatomées à l'aide de chlorure de
méthylène et concentrées à l'aide d'azote dans un bain d'eau chauffé. Elles sont ensuite séparées et
quantifiées par chromatographie en phase gazeuse avec détection par chimiluminescence. La quantification
est réalisée par une technique d'étalonnage interne.
5 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
PRÉCAUTIONS DE SÉCURITÉ — Les nitrosamines sont considérées être des substances
cancérigènes; il convient donc de prendre les précautions appropriées pour la préparation des
étalons. Toujours porter des gants de laboratoire pour manipuler les solutions titrées et pour effectuer
les dilutions.
1)
5.1 N-nitrosonornicotine, (NNN, CAS: 53759-22-1), w W 98 % (fraction massique).
5.2 N-nitrosoanatabine, (NAT, CAS: 71267-22-6), w W 98 %.
5.3 N-nitrosoanabasine, (NAB, CAS: 1133-64-8), w W 98 %.
5.4 4-(méthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone, (NNK, CAS: 64091-91-4), w W 98 %.
5.5 N-nitrosodi-n-hexylamine, (NDHA, CAS: 6949-28-6) (étalon interne), w W 98 %.
5.6 Acide citrique, anhydre (CAS: 77-92-9), w W 99,5 %.
5.7 Phosphate d'hydrogène de sodium, (Na HPO ), anhydre (CAS: 7558-79-4), w W 99 %.
2 4
5.8 Acide L-ascorbique, (CAS: 50-81-7), w W 99 %.
5.9 Dichlorométhane, (CAS: 75-09-02), w W 99,9 %.
5.10 Eau, (CAS: 7732-18-5), au moins conforme à la qualité 2 de l'ISO 3696.
5.11 Azote, (CAS: 7727-37-9), pour évaporateur d'éluant, w W 99,995 %.
5.12 Hélium, (CAS: 7440-59-7), pour gaz vecteur, w W 99,995 %.
5.13 Oxygène, (CAS: 7782-44-7), pour générer de l'ozone dans le détecteur, w W 99,6 %.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Chromatographe en phase gazeuse (CG), avec un détecteur à chimiluminescence et un passeur
d'échantillons (facultatif).
6.2 Évaporateur de solvant, pour concentrer l'extrait d'échantillon.
6.3 Bain à ultrasons, pour l'extraction de l'échantillon.
6.4 Colonne de CG, colonne capillaire en silice fondue d'une longueur de 30 m et d'un diamètre intérieur
de 0,53 mm, revêtue d'un film de 3,0 µm de diméthylpolysiloxane à 100 %.
NOTE D'autres colonnes peuvent être utilisées si elles permettent d'obtenir une séparation satisfaisante.

1) CAS: Chemical Abstract Service.
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6.5 Colonne de terre de diatomées calcinées, d'une capacité de 100 ml.
6.6 Système de collecte de données chromatographiques, permettant de mesurer les surfaces de pic
par des moyens électroniques.
6.7 Fioles jaugées à un trait, conformes à la classe A de l'ISO 1042.
6.8 Pipettes en verre jetables, d'une longueur de 229 mm.
6.9 Systèmes de distribution de solvant inclinés en verre, de volumes constants, 10 ml et 50 ml.
6.10 Erlenmeyers en verre, d'une capacité de 125 ml.
6.11 Éprouvette graduée en verre, d'une capacité de 250 ml.
6.12 Récipients à échantillons, flacons en verre borosilicaté pour passeur d'échantillons, d'une capacité de
2 ml, fermés par un septum revêtu de PTFE.
6.13 Tube pour prélèvement, d'une capacité de 300 ml.
6.14 Unité de réfrigération, pour stocker des étalons à −20 °C.
7 Préparation de la solution d'extraction et des étalons
7.1 Préparation de la solution tampon d'extraction
Les quantités nécessaires pour préparer 2 l de solution tampon sont (21,1 ± 0,1) g d'acide citrique (5.6),
(25,6 ± 0,1) g d'hydrogénophosphate de sodium (5.7) et (7,0 ± 0,1) g d'acide L-ascorbique (5.8). Le volume
est complété à l'aide d'eau distillée déionisée et le mélange est homogénéisé jusqu'à dissolution de tous les
solides. Il convient de préparer la solution tampon une fois par semaine et de la conserver à environ 4 °C
lorsqu'elle n'est pas utilisée. La solution tampon d'extraction est limpide et incolore avec un pH de (4,3 ± 0,2).
7.2 Préparation de l'étalon interne
Préparer l'étalon interne en dissolvant le NDHA (5.5) dans le dichlorométhane (5.9) de manière à obtenir une
réponse suffisante dans le chromatogramme. Par exemple, lorsque la masse de l'échantillon est de 1 g et que
la
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