ISO 10993-5:2009
(Main)Biological evaluation of medical devices - Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity
Biological evaluation of medical devices - Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity
ISO 10993-5:2009 describes test methods to assess the in vitro cytotoxicity of medical devices. These methods specify the incubation of cultured cells in contact with a device and/or extracts of a device either directly or through diffusion. These methods are designed to determine the biological response of mammalian cells in vitro using appropriate biological parameters.
Évaluation biologique des dispositifs médicaux — Partie 5: Essais concernant la cytotoxicité in vitro
L'ISO 10993-5:2009 spécifie les méthodes d'essai d'évaluation de la cytotoxicité in vitro des dispositifs médicaux. Ces méthodes décrivent l'incubation des cellules cultivées en contact avec un dispositif et/ou des extraits de dispositif, soit directement, soit par diffusion. Elles sont conçues pour déterminer la réponse biologique in vitro des cellules de mammifère au moyen de paramètres biologiques adaptés.
General Information
- Status
- Published
- Publication Date
- 19-May-2009
- Technical Committee
- ISO/TC 194 - Biological and clinical evaluation of medical devices
- Drafting Committee
- ISO/TC 194/WG 5 - Cytotoxicity
- Current Stage
- 9093 - International Standard confirmed
Relations
- Effective Date
- 15-Apr-2008
Overview
ISO 10993-5:2009, "Biological evaluation of medical devices - Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity," specifies methods to assess the in vitro cytotoxicity of medical devices and materials. The standard defines extract, direct-contact and indirect-contact test approaches in which cultured mammalian cells are incubated with devices or device extracts to determine cellular responses using appropriate biological endpoints. ISO 10993-5 is part of the ISO 10993 series for biological evaluation of medical devices.
Key topics and technical requirements
- Test categories:
- Extract tests (expose cells to liquid extracts of the device)
- Direct-contact tests (device placed directly onto cell monolayer)
- Indirect-contact tests (diffusion-based exposure)
- Sample and control preparation:
- Sample preparation per ISO 10993-12; include negative, positive and blank controls in each assay. Examples in the standard include organotin‑stabilized polyurethane or phenol as positive controls and high‑density polyethylene as a negative control.
- Extraction vehicles and conditions:
- Preferred vehicle: culture medium with serum; other vehicles (saline, purified water, DMSO) may be used with justification.
- Typical extraction conditions (historical precedent): 24 ±2 h at 37 ±1 °C; 72 ±2 h at 50 ±2 °C; 24 ±2 h at 70 ±2 °C; or 1 ±0.2 h at 121 ±2 °C - choice depends on device characteristics and intended use.
- Cell systems and media: selection of appropriate cell lines and culture media; maintain subconfluent cultures for exposure.
- Endpoints and evaluation methods: morphological assessment, measures of cell damage, cell growth/clonogenic assays, and metabolic assays. Informative annexes provide example protocols (e.g., Neutral Red Uptake, colony formation, MTT, XTT).
- Reporting and result interpretation: requirements for test reports and guidance on assessing cytotoxic effects.
Applications and who uses it
ISO 10993-5 is used by:
- Medical device manufacturers for preclinical biocompatibility screening and material selection
- Contract testing laboratories performing cytotoxicity assays
- Regulatory and quality assurance teams preparing submissions and risk assessments
- R&D and toxicology scientists evaluating new materials, coatings or sterilization effects
Practical uses include screening raw materials, evaluating finished device extracts, verifying sterilization/processing effects, and providing evidence for regulatory dossiers.
Related standards
- ISO 10993-1: Evaluation and testing within a risk management process (normative reference)
- ISO 10993-12: Sample preparation and reference materials (normative reference)
- Other parts of ISO 10993 (e.g., Parts 6, 7, 10, 11) provide complementary guidance on implantation, sterilization residuals, irritation, and systemic toxicity.
Keywords: ISO 10993-5:2009, in vitro cytotoxicity, cytotoxicity testing, medical devices, biological evaluation, extract test, direct contact, indirect contact, MTT, NRU, XTT.
Related Packages
Frequently Asked Questions
ISO 10993-5:2009 is a standard published by the International Organization for Standardization (ISO). Its full title is "Biological evaluation of medical devices - Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity". This standard covers: ISO 10993-5:2009 describes test methods to assess the in vitro cytotoxicity of medical devices. These methods specify the incubation of cultured cells in contact with a device and/or extracts of a device either directly or through diffusion. These methods are designed to determine the biological response of mammalian cells in vitro using appropriate biological parameters.
ISO 10993-5:2009 describes test methods to assess the in vitro cytotoxicity of medical devices. These methods specify the incubation of cultured cells in contact with a device and/or extracts of a device either directly or through diffusion. These methods are designed to determine the biological response of mammalian cells in vitro using appropriate biological parameters.
ISO 10993-5:2009 is classified under the following ICS (International Classification for Standards) categories: 11.100.20 - Biological evaluation of medical devices. The ICS classification helps identify the subject area and facilitates finding related standards.
ISO 10993-5:2009 has the following relationships with other standards: It is inter standard links to ISO 10993-5:1999. Understanding these relationships helps ensure you are using the most current and applicable version of the standard.
You can purchase ISO 10993-5:2009 directly from iTeh Standards. The document is available in PDF format and is delivered instantly after payment. Add the standard to your cart and complete the secure checkout process. iTeh Standards is an authorized distributor of ISO standards.
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10993-5
Third edition
2009-06-01
Biological evaluation of medical
devices —
Part 5:
Tests for in vitro cytotoxicity
Évaluation biologique des dispositifs médicaux —
Partie 5: Essais concernant la cytotoxicité in vitro
Reference number
©
ISO 2009
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat
accepts no liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In
the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
© ISO 2009
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2009 – All rights reserved
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Sample and control preparation. 2
4.1 General. 2
4.2 Preparation of liquid extracts of material. 3
4.3 Preparation of material for direct-contact tests .4
4.4 Preparation of controls . 5
5 Cell lines . 5
6 Culture medium. 5
7 Preparation of cell stock culture. 6
8 Test procedures . 6
8.1 Number of replicates . 6
8.2 Test on extracts . 6
8.3 Test by direct contact. 7
8.4 Test by indirect contact. 7
8.5 Determination of cytotoxicity . 9
9 Test report . 10
10 Assessment of results. 11
Annex A (informative) Neutral red uptake (NRU) cytotoxicity test. 12
Annex B (informative) Colony formation cytotoxicity test. 19
Annex C (informative) MTT cytotoxicity test . 24
Annex D (informative) XTT cytotoxicity test. 29
Bibliography . 34
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 10993-5 was prepared by Technical Committee ISO/TC 194, Biological evaluation of medical devices.
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 10993-5:1999) which has been technically
revised.
ISO 10993 consists of the following parts, under the general title Biological evaluation of medical devices:
⎯ Part 1: Evaluation and testing within a risk management process
⎯ Part 2: Animal welfare requirements
⎯ Part 3: Tests for genotoxicity, carcinogenicity and reproductive toxicity
⎯ Part 4: Selection of tests for interactions with blood
⎯ Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity
⎯ Part 6: Tests for local effects after implantation
⎯ Part 7: Ethylene oxide sterilization residuals
⎯ Part 9: Framework for identification and quantification of potential degradation products
⎯ Part 10: Tests for irritation and skin sensitization
⎯ Part 11: Tests for systemic toxicity
⎯ Part 12: Sample preparation and reference materials
⎯ Part 13: Identification and quantification of degradation products from polymeric medical devices
⎯ Part 14: Identification and quantification of degradation products from ceramics
⎯ Part 15: Identification and quantification of degradation products from metals and alloys
iv © ISO 2009 – All rights reserved
⎯ Part 16: Toxicokinetic study design for degradation products and leachables
⎯ Part 17: Establishment of allowable limits for leachable substances
⎯ Part 18: Chemical characterization of materials
⎯ Part 19: Physico-chemical, morphological and topographical characterization of materials [Technical
Specification]
⎯ Part 20: Principles and methods for immunotoxicology testing of medical devices [Technical Specification]
Introduction
Due to the general applicability of in vitro cytotoxicity tests and their widespread use in evaluating a large
range of devices and materials, it is the purpose of this part of ISO 10993, rather than to specify a single test,
to define a scheme for testing which requires decisions to be made in a series of steps. This should lead to
the selection of the most appropriate test.
Three categories of test are listed: extract test, direct contact test, indirect contact test.
The choice of one or more of these categories depends upon the nature of the sample to be evaluated, the
potential site of use and the nature of the use.
This choice then determines the details of the preparation of the samples to be tested, the preparation of the
cultured cells, and the way in which the cells are exposed to the samples or their extracts.
At the end of the exposure time, the evaluation of the presence and extent of the cytotoxic effect is undertaken.
It is the intention of this part of ISO 10993 to leave open the choice of type of evaluation. Such a strategy
makes available a battery of tests, which reflects the approach of many groups that advocate in vitro biological
tests.
The numerous methods used and endpoints measured in cytotoxicity determination can be grouped into the
following categories of evaluation:
⎯ assessments of cell damage by morphological means;
⎯ measurements of cell damage;
⎯ measurements of cell growth;
⎯ measurements of specific aspects of cellular metabolism.
There are several means of producing results in each of these four categories. The investigator should be
aware of the test categories and into which category a particular technique fits, in order that comparisons be
able to be made with other results on similar devices or materials both at the intra- and interlaboratory level.
Examples of quantitative test protocols are given in annexes. Guidance for the interpretation of the results is
given in this part of ISO 10993.
vi © ISO 2009 – All rights reserved
INTERNATIONAL STANDARD ISO 10993-5:2009(E)
Biological evaluation of medical devices —
Part 5:
Tests for in vitro cytotoxicity
1 Scope
This part of ISO 10993 describes test methods to assess the in vitro cytotoxicity of medical devices.
These methods specify the incubation of cultured cells in contact with a device and/or extracts of a device
either directly or through diffusion.
These methods are designed to determine the biological response of mammalian cells in vitro using
appropriate biological parameters.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 10993-1, Biological evaluation of medical devices — Part 1: Evaluation and testing within a risk
management system
ISO 10993-12, Biological evaluation of medical devices — Part 12: Sample preparation and reference
materials
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 10993-1 and the following apply.
3.1
culture vessels
vessels appropriate for cell culture including glass petri dishes, plastic culture flasks or plastic multiwells and
microtitre plates
NOTE These can be used interchangeably in these methods provided that they meet the requirements of tissue
culture grade and are suitable for use with mammalian cells.
3.2
positive control material
material which, when tested in accordance with this part of ISO 10993, provides a reproducible cytotoxic
response
NOTE The purpose of the positive control is to demonstrate an appropriate test system response. For example, an
1)
organotin-stabilized polyurethane has been used as positive control for solid materials and extracts. Dilutions of phenol,
for example, have been used as a positive control for extracts. In addition to a material, pure chemicals can also be used
to demonstrate the performance of the test system.
3.3
blank
extraction vehicle not containing the test sample, retained in a vessel identical to that which holds the test
sample and subjected to conditions identical to those to which the test sample is subjected during its
extraction
NOTE The purpose of the blank is to evaluate the possible confounding effects due to the extraction vessel, vehicle
and extraction process.
3.4
negative control material
material which, when tested in accordance with this part of ISO 10993, does not produce a cytotoxic response
NOTE The purpose of the negative control is to demonstrate background response of the cells. For example,
2)
high-density polyethylene for synthetic polymers, and aluminium oxide ceramic rods for dental material have been used
as negative controls.
3.5
test sample
material, device, device portion, component, extract or portion thereof that is subjected to biological or
chemical testing or evaluation
3.6
subconfluency
approximately 80 % confluency, i.e. the end of the logarithmic phase of growth
4 Sample and control preparation
4.1 General
The test shall be performed on
a) an extract of the test sample
and/or
b) the test sample itself.
Sample preparation shall be in accordance with ISO 10993-12.
Negative and positive controls shall be included in each assay.
1) The ZDEC and ZDBC polyurethanes are available from the Food and Drug Safety Center, Hatano Research Institute,
Ochiai 729-5, Hadanoshi, Kanagawa 257, Japan.
2) High-density polyethylene can be obtained from the U.S. Pharmacopeia (Rockville, MD, USA) and from the Food and
Drug Safety Center, Hatano Research Institute (Ochiai 729-5, Hadanoshi, Kanagawa 257, Japan).
The information given in 1) and 2) is for the convenience of the user of this part of ISO 10993 and does not constitute an
endorsement by ISO of these products. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
2 © ISO 2009 – All rights reserved
4.2 Preparation of liquid extracts of material
4.2.1 Principles of extraction
Extracting conditions should attempt to simulate or exaggerate the clinical use conditions so as to determine
the potential toxicological hazard without causing significant changes in the test sample, such as fusion,
melting or any alteration of the chemical structure, unless this is expected during clinical application. Due to
the nature of certain materials (e.g. biodegradable materials), alteration of the chemical structure can occur
during the extraction procedure.
NOTE The concentration of any endogenous or extraneous substances in the extract, and hence the amount
exposed to the test cells, depends on the interfacial area, the extraction volume, pH, chemical solubility, diffusion rate,
osmolarity, agitation, temperature, time and other factors.
For devices that involve mixing two or more components in the patient to arrive at the final device (for example
bone cement), the final device should not be washed prior to extraction. Washing the test sample can reduce
or remove residuals present on the device. If the test sample is to be used in a sterile environment, a sterilized
test sample should be used to extract chemical constituents.
4.2.2 Extraction vehicle
The choice of the extraction vehicle(s) taking into account the chemical characteristics of the test sample shall
be justified and documented. For mammalian cell assays one or more of the following vehicles shall be used:
a) culture medium with serum;
b) physiological saline solution;
c) other suitable vehicle.
The choice of vehicle should reflect the aim of the extraction. Consideration shall be given to the use of both a
polar and a non-polar vehicle. Culture medium with serum is the preferred extraction vehicle. The use of
culture medium with serum is preferred for extraction because of its ability to support cellular growth as well as
extract both polar and non-polar substances. In addition to culture medium with serum, use of medium without
serum should be considered in order to specifically extract polar substances (e.g. ionic compounds). Other
suitable vehicles include purified water and dimethyl sulfoxide (DMSO). DMSO is cytotoxic in selected assay
systems at greater than 0,5 % (volume fraction). The cellular exposure concentration of extractables in DMSO
will be lower due to the greater dilution as compared to extraction in culture medium with serum.
NOTE 1 Different types of serum (e.g. foetal, bovine/calf serum, newborn calf serum) might be used and the choice of
the serum is dependent on the cell type.
NOTE 2 It is important to recognise that serum/proteins are known to bind, to some extent, extractables.
4.2.3 Extraction conditions
4.2.3.1 The extraction shall be performed in sterile, chemically inert, closed containers by using aseptic
techniques, in accordance with ISO 10993-12.
4.2.3.2 With the exception of circumstances given below, the extraction shall be conducted under one of
the following conditions and shall be applied according to the device characteristics and specific conditions for
use:
a) (24 ± 2) h at (37 ± 1) °C;
b) (72 ± 2) h at (50 ± 2) °C;
c) (24 ± 2) h at (70 ± 2) °C;
d) (1 ± 0,2) h at (121 ± 2) °C.
Extraction conditions described above, which have been used to provide a measure of the hazard potential for
risk estimation of the device or material, are based on historical precedent. Other conditions, e.g. prolonged or
shortened extraction times at 37 °C, which simulate the extraction that occurs during clinical use or provide an
adequate measure of the hazard potential, may be used, but shall be justified and documented. For medical
devices that are in short-term contact (no greater than 4 h cumulative contact duration) with intact skin or
mucosa and that are not implanted, this may include extraction times of less than 24 h but no less than 4 h, as
given in a) to c).
Cell culture medium with serum should only be used in accordance with a) because extraction temperatures
greater than (37 ± 1) °C can adversely impact chemistry and/or stability of the serum and other constituents in
the culture medium.
For polymeric test samples, the extraction temperature should not exceed the glass transition temperature as
the higher temperature can change the extractant composition.
4.2.3.3 If the extract is filtered, centrifuged or processed by other methods prior to being applied to the
cells, these details shall be recorded in the final report along with a rationale for the additional steps (see
Clause 9). Any pH adjustment of the extract shall be reported. Manipulation of the extract, such as by pH
adjustment, should be avoided because it could influence the result.
4.3 Preparation of material for direct-contact tests
4.3.1 Form of test samples
Materials that have various shapes, sizes or physical states (i.e. liquid, gels, solids, etc.) may be tested
without modification in the cytotoxicity assays.
The preferred test sample of a solid material should have at least one flat surface. If not, adjustments shall be
made to achieve flat surfaces.
4.3.2 Sterility of test samples
4.3.2.1 Sterility of the test sample shall be taken into account.
4.3.2.2 Test samples from sterilized devices shall be handled aseptically throughout the test procedure.
4.3.2.3 Test samples from devices that are normally supplied non-sterile but are sterilized before use
shall be sterilized by the method recommended by the manufacturer and handled aseptically throughout the
test procedure.
The effect of sterilization methods or agents on the device should be considered in defining the preparation of
the test sample prior to use in the test system.
4.3.2.4 Test samples from devices not required to be sterile in use shall be used as supplied and handled
aseptically throughout the test procedure. It may be justifiable to sterilize the test material in order to avoid
microbial contamination of the cell culture; however, the sterilization process shall not alter the properties of
the test material.
If non-sterile test samples are used, they should be checked for bacterial contamination because the
contamination can lead to a false assessment of cytotoxicity.
4.3.3 Liquid test samples
Liquid test samples shall be tested by either
a) direct deposition
or
b) deposition on a biologically inert absorbent matrix.
Filter discs have been found to be suitable for use as inert absorbent matrices.
4 © ISO 2009 – All rights reserved
4.3.4 Absorbent test samples
If appropriate, test samples that are absorbent shall be soaked with culture medium prior to testing to prevent
adsorption of the culture medium in the testing vessel.
4.4 Preparation of controls
Controls should be selected so that they can be prepared by the same procedure as the test sample.
5 Cell lines
3)
Established cell lines are preferred and where used shall be obtained from recognised repositories .
Where specific sensitivity is required, primary cell cultures, cell lines and organotypic cultures obtained directly
from living tissues shall only be used if reproducibility and accuracy of the response can be demonstrated.
If a stock culture of a cell line is stored, storage shall be at −80 °C or below in the corresponding culture
medium but containing a cryoprotectant, e.g. dimethylsulfoxide or glycerol. Long-term storage (several months
up to many years) is only possible at −130 °C or below.
Only cells free from mycoplasma shall be used for the test. Before use, stock cultures should be tested for the
absence of mycoplasma.
It is important to check cells regularly (e.g. morphology, doubling time, modal chromosome number) because
sensitivity in tests can vary with passage number.
Good cell culture practices should be used. See Reference [5].
6 Culture medium
The culture medium shall be sterile.
The culture medium with or without serum shall meet the growth requirements of the selected cell line.
Antibiotics may be included in the medium provided that they do not adversely affect the assays.
Storage conditions shall be validated.
NOTE The stability of the culture medium varies with the composition and storage conditions.
The culture medium shall be maintained at a pH of between 7,2 and 7,4.
3) For example, cell lines American Type Culture Collection CCL 1 (NCTC clone 929), CCL 163 (Balb/3T3 clone A31),
CCL 171 (MRC-5) and CCL 75 (WI-38), CCL 81 (Vero) and CCL 10 [BHK-21 (C-13)] and V-79 379A are endorsed by ISO
experts to be suitable.
This information is given for the convenience of the user of this part of ISO 10993 and does not constitute an endorsement
by ISO of the products named. Other cell lines may be used if they can be shown to lead to the same or more relevant
results.
7 Preparation of cell stock culture
Using the chosen cell line and culture medium, prepare sufficient cells to complete the test. If the cells are to
be grown from cultures taken from storage, remove the cryoprotectant, if present. Subculture the cells at least
once before use.
When subculturing cells, remove and resuspend the cells by enzymatic and/or mechanical disaggregation
using a method appropriate for the cell line.
8 Test procedures
8.1 Number of replicates
A minimum of three replicates shall be used for test samples and controls.
8.2 Test on extracts
8.2.1 This test allows both qualitative and quantitative assessment of cytotoxicity.
8.2.2 Pipette an aliquot of the continuously stirred cell suspension into each of a sufficient number of
vessels for exposure to the extracts. Distribute the cells evenly over the surface of each vessel by gentle
rotation.
8.2.3 Incubate the cultures at (37 ± 1) °C in air with or without carbon dioxide as appropriate for the buffer
system chosen for the culture medium.
The test should be performed on a subconfluent monolayer or on freshly suspended cells.
In the colony-forming assay only an appropriate low cell density shall be used.
8.2.4 Verify the subconfluency and the morphology of the cultures with a microscope before starting the test.
In exceptional cases, exponentially growing cells (e.g. primary cells, high proliferating cells) may be seeded at
the starting point of the test.
8.2.5 Perform the test on
a) the original extract
and/or
b) the original extract and a dilution series of the extracts using the extract vehicle as diluent.
Alternatively, where materials of limited solubility are known or suspected to be present, dilution should be
achieved by varying the original extraction ratio of test sample to extraction medium.
If monolayers are used for the test, remove and discard the culture medium from the cultures and add an
aliquot of the extract or dilution thereof into each of the vessels.
If suspended cells are used for the test, add the extract or dilution thereof into each of the replicate vessels,
immediately after preparation of the cell suspension.
8.2.6 When a non-physiological extract is used, e.g. water, the extract shall be tested at the highest
physiologically compatible concentration after dilution in culture medium.
NOTE Concentrated culture medium, e.g. 2×, 5×, is recommended for use in diluting aqueous extracts.
6 © ISO 2009 – All rights reserved
8.2.7 Add known aliquots of the blank and the negative and positive controls to additional replicate vessels.
NOTE A fresh culture medium control can also be tested, if appropriate.
8.2.8 Incubate the vessels using the same conditions as described in 8.2.3 for an appropriate interval
corresponding to the selected specific assay.
8.2.9 After an incubation period of at least 24 h, determine the cytotoxic effects in accordance with 8.5.
8.3 Test by direct contact
8.3.1 This test allows both qualitative and quantitative assessment of cytotoxicity.
8.3.2 Pipette a known aliquot of the continuously stirred cell suspension into each of a sufficient number of
vessels for direct exposure to the test sample. Distribute the cells evenly over the surface of each vessel by
gentle horizontal rotation.
8.3.3 Incubate the culture at (37 ± 1) °C in air, with or without carbon dioxide as appropriate for the buffer
system chosen for the culture medium, until the cultures have grown to subconfluency.
8.3.4 Verify the subconfluency and the morphology of the cultures with a microscope before starting the test.
In exceptional cases, exponentially growing cells (e.g. primary cells, high proliferating cells) may be seeded at
the starting point of the test.
8.3.5 Remove and discard the culture medium. Then add fresh culture medium to each vessel.
8.3.6 Carefully place individual specimens of the test sample on the cell layer in the centre of each of the
replicate vessels. Ensure that the specimen covers approximately one tenth of the cell layer surface.
Other ratios of specimen surface to cell layer surface may be used if justified.
Exercise care to prevent unnecessary movement of the specimens, as this could cause physical trauma to the
cells. For example, patches of dislodged cells can result from unnecessary movement.
NOTE When appropriate, the specimen can be placed in the culture vessel prior to the addition of the cells.
8.3.7 Prepare replicate vessels for both the negative control and positive control material.
8.3.8 Incubate the vessels under the same conditions as described in 8.3.3 for an appropriate interval (a
minimum of 24 h) corresponding to the selected specific assay.
8.3.9 Discard the supernatant culture medium before adding chemicals/dyes in order to determine the
cytotoxic effects in accordance with 8.5.
8.4 Test by indirect contact
8.4.1 Agar diffusion
8.4.1.1 This test allows a qualitative assessment of cytotoxicity. This assay is not appropriate for
leachables that cannot diffuse through the agar layer, or that may react with agar. The use of the agar
diffusion assay for the assessment of cytotoxicity shall be justified.
8.4.1.2 Pipette a known aliquot of the continuously stirred cell suspension into each of a sufficient
number of replicate vessels for the test. Distribute the cells evenly over the surface of each vessel by gentle
horizontal rotation.
8.4.1.3 Incubate the cultures at (37 ± 1) °C in air, with or without carbon dioxide as appropriate for the
buffer system chosen for the culture medium, until the cultures have grown to approximate subconfluency at
the end of the logarithmic phase of the growth curve.
8.4.1.4 Verify the subconfluency and the morphology of the cultures with a microscope before starting the
test.
8.4.1.5 Remove and discard the culture medium from the vessel. Then mix fresh culture medium
containing serum with melted agar to obtain a final mass concentration of agar of 0,5 % to 2 % and pipette an
appropriate volume into each vessel. Use only agar that is suitable for the growth of mammalian cells in
culture. The agar/culture medium mixture should be in a liquid state and at a temperature that is compatible
with mammalian cells.
NOTE Agar is available in various molecular weight ranges and purities.
8.4.1.6 Carefully place replicate specimens of the test sample on the solidified agar layer in each vessel.
Ensure that the specimen covers approximately one tenth of the cell layer surface.
Other ratios of specimen surface to cell layer surface may be used if justified.
Pre-soak any absorbent material with the culture medium before placing it on the agar to prevent dehydration
of the agar.
8.4.1.7 Prepare replicate vessels with both the negative control and positive control material.
8.4.1.8 Incubate the vessels using the same conditions as described in 8.4.1.3 for 24 h to 72 h.
8.4.1.9 Examine the cells to determine cytotoxic effect before and after carefully removing the specimens
from the agar.
Use of a vital stain, e.g. neutral red, can aid in the detection of cytotoxicity. The vital stain may be added
before or after the incubation with the specimen. If the stain is added before the incubation, protect the
cultures from light to prevent cell damage elicited by photoactivation of the stain.
8.4.2 Filter diffusion
8.4.2.1 This test allows a qualitative assessment of cytotoxicity.
8.4.2.2 Place a surfactant-free filter with 0,45 µm pore size into each vessel and add a known aliquot of
the continuously stirred cell suspension into each of a sufficient number of replicate vessels for the test.
Distribute the cells evenly over the surface of each filter by gentle rotation.
8.4.2.3 Incubate the cultures at (37 ± 1) °C in air, with or without carbon dioxide as appropriate for the
buffer system chosen for the culture medium, until the cultures have grown to approximate subconfluency at
the end of the logarithmic phase of the growth curve.
8.4.2.4 Remove and discard the culture medium from the vessels. Then transfer the filters, cell side down,
on to a layer of solidified agar (see 8.4.1.5).
8.4.2.5 Carefully place the replicate specimens of the test sample on the acellular (top) side of the filter.
Retain liquid extracts and freshly mixed compounds in non-reactive rings placed on the filter.
8.4.2.6 Prepare replicate filters with both the negative control and positive control material.
8.4.2.7 Incubate the vessels using the same conditions described in 8.4.2.3 for 2 h ± 10 min.
8.4.2.8 Carefully remove the specimens from the filter and carefully separate the filter from the agar
surface.
8.4.2.9 Determine the cytotoxic effects using an appropriate stain procedure.
8 © ISO 2009 – All rights reserved
8.5 Determination of cytotoxicity
8.5.1 Determine cytotoxic effects by either qualitative or quantitative means. Quantitative evaluation of
cytotoxicity is preferable. Qualitative means are appropriate for screening purposes.
Qualitative evaluation: Examine the cells microscopically using cytochemical staining if desired. Assess
changes in, for example, general morphology, vacuolization, detachment, cell lysis and membrane integrity.
The change from normal morphology shall be recorded in the test report descriptively or numerically. A useful
way to grade test samples is given in Tables 1 and 2.
Table 1 — Qualitative morphological grading of cytotoxicity of extracts
Grade Reactivity Conditions of all cultures
0 None Discrete intracytoplasmatic granules, no cell lysis, no reduction of cell growth
Not more than 20 % of the cells are round, loosely attached and without
1 Slight intracytoplasmatic granules, or show changes in morphology; occasional
lysed cells are present; only slight growth inhibition observable.
Not more than 50 % of the cells are round, devoid of intracytoplasmatic
2 Mild granules, no extensive cell lysis; not more than 50 % growth inhibition
observable.
Not more than 70 % of the cell layers contain rounded cells or are lysed; cell
3 Moderate layers not completly destroyed, but more than 50 % growth inhibition
observable.
4 Severe Nearly complete or complete destruction of the cell layers.
Table 2 — Reactivity grades for agar and filter diffusion test and direct contact test
Grade Reactivity Description of reactivity zone
0 None No detectable zone around or under specimen
1 Slight Some malformed or degenerated cells under specimen
2 Mild Zone limited to area under specimen
3 Moderate Zone extending specimen size up to 1,0 cm
4 Severe Zone extending farther than 1,0 cm beyond specimen
The method of evaluation and the results of the evaluation shall be included in the test report.
The achievement of a numerical grade greater than 2, based on Tables 1 and 2, is considered a cytotoxic
effect.
Quantitative evaluation: Measure cell death, inhibition of cell growth, cell proliferation or colony formation.
The number of cells, amount of protein, release of enzymes, release of vital dye, reduction of vital dye or any
other measurable parameter may be quantified by objective means. The objective measure and response
shall be recorded in the test report.
Reduction of cell viability by more than 30 % is considered a cytotoxic effect. Other criteria, including different
cut-off points or an acceptable ratio of test-to-control result shall be justified for alternate cell lines or
multi-layered tissue constructs. The criteria shall be justified and documented.
The protocols described in Annexes A to D may be used for the quantitative determination of cytotoxicity of
extracts.
NOTE Protocols A and B have been proven to be suitable for chemicals in international validation studies and for
medical devices in an international round-robin test. For cytotoxic materials, they permit the graduation of the cytotoxic
effect by the calculation of an IC value (inhibitory concentration estimated to affect the endpoint in question by 50 %).
Annexes C and D describe other protocols widely used for the quantitative determination of cytotoxicity.
For particular methods of determining cytotoxicity, a zero time or baseline cell culture control can be
necessary.
8.5.2 Ensure that care is taken in the choice of evaluation methods, as the test results can be invalid if the
test sample releases substances that interfere with the test system or measurement.
Materials that can release formaldehyde can only be reliably tested when cell viability is evaluated.
8.5.3 If there are evident differences in the test result for replicate culture vessels, then the test is either
inappropriate or invalid. In this case, the test shall be repeated, or an alternative methodology used.
8.5.4 If the negative, positive and any other controls (reference, medium, blank, reagent, etc.) do not have
the expected response in the test system, then repeat the entire assay(s).
9 Test report
The test report shall include at least the following details:
a) name and address of testing facility;
b) name of the person(s) who conducted the test;
c) dates of start and end of the test;
d) description of the sample;
e) cell line, justification of the choice and cell source(s);
f) name of company and batch of medium, serum and antibiotics, when added;
g) assay method and rationale;
h) extraction procedure (if appropriate) and, if possible, the nature and concentration of the leached
substance(s);
i) negative, positive and other controls;
j) cell response and other observations;
k) any other relevant data necessary for the assessment of results.
10 © ISO 2009 – All rights reserved
10 Assessment of results
The overall assessment of the results shall be carried out by a person capable of making informed decisions
based on the test data. Cytotoxicity data shall be assessed in relation to other biocompatibility data and the
intended use of the product.
The interpretation of the results of the cytotoxicity test shall take into account the classification of the device as
given in ISO 10993-1.
If there is a cytotoxic effect, further evaluation can be performed, for example:
a) additional tests (presence/absence of serum, changing of the level of serum in the culture medium);
b) extract analysis (e.g. residues from sterilization and other production processes), where appropriate;
c) concentration response analysis of dilutions;
d) chemical characterization of leachable components,
e) other test procedures.
Any cytotoxic effect can be of concern. However, it is primarily an indication of potential for in vivo toxicity and
the device cannot necessarily be determined to be unsuitable for a given clinical application based solely on
cytotoxicity data.
Annex A
(informative)
Neutral red uptake (NRU) cytotoxicity test
A.1 General
The following test protocol is based on, and describes only, those parts of Annex C of Reference [1], which
are relevant for this test.
A.2 Experimental procedure
A.2.1 Basic procedure
BALB/c 3T3 cells are seeded into 96-well plates and maintained in culture for 24 h (∼ 1 doubling period) to
form a semi-confluent monolayer (see Reference [5] for more information on cell maintenance and culture
procedures). They are then exposed to the test compound over a range of concentrations. After 24 h
exposure, NRU is determined for each treatment concentration and compared to that determined in control
cultures. For each treatment (i.e. concentration of the test chemical), the inhibition of growth percentage is
calculated, if the extract exhibits a cytotoxic effect on the cells. The IC (i.e. the concentration producing
50 % reduction of NRU) is calculated from the concentration-response and expressed as a dilution percentage
of the extract. The neat extract is designated as 100 % extract.
A.2.2 Material
A.2.2.1 Cell line
BALB/c 3T3 cells, clone 31 (e.g. ECACC86110401, European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire
SP4 0JG, UK; CCL-163, American Type Culture Collection [ATCC], Manassas, VA, USA) and JCRB 9005,
prepared from CCL-163[ATCC], Human Science Research Resources Bank, Osaka, Japan.
A.2.2.2 Technical equipment
A.2.2.2.1 Incubator, 37 °C, humidified, 5 % CO /air [alternatively, in the absence of a suitable buffer in the
cell culture medium, 7,5 % CO /air may be used because cells are very sensitive to pH changes; however
5 % is more commonly used in most laboratories, while HEPES [acid 4-(2-hydroxyethyl)-1-
piperazineethanesulfonic acid] is added for better buffering.
A.2.2.2.2 Laminar flow cabinet, standard: “biological hazard”.
A.2.2.2.3 Water bath, 37 °C.
A.2.2.2.4 Inverse phase contrast microscope.
A.2.2.2.5 Laboratory burner.
A.2.2.2.6 Centrifuge, optionally equipped with microtitre plate rotor.
A.2.2.2.7 Laboratory balance.
A.2.2.2.8 96-well plate photometer, equipped with 540 nm filter.
12 © ISO 2009 – All rights reserved
A.2.2.2.9 Shaker, for microtitre plates.
A.2.2.2.10 Cell counter or hemacytometer.
A.2.2.2.11 Pipetting aid.
A.2.2.2.12 Pipettes, 8-channel pipettes, dilution block.
A.2.2.2.13 Cryotubes.
2 2
A.2.2.2.14 Tissue culture flasks, 80 cm , 25 cm .
A.2.2.2.15 96-well tissue culture microtitre plates.
A.2.2.3 Chemicals, media and sera
A.2.2.3.1 Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium (DMEM), without L-glutamine
A.2.2.3.2 L-glutamine, 200 mM, or glutamax.
A.2.2.3.3 Newborn calf serum (NBCS).
IMPORTANT — Foetal calf serum (FCS) shall not be used. FCS causes a strongly reduced O.D. due to
the formation of vacuoles in the cells.
Due to lot variability of NBCS, first check a lot for growth-stimulating properties with 3T3 cells (20 h to 25 h
doubling time) and then reserve a sufficient amount of NBCS.
A.2.2.3.4 Trypsin/EDTA solution.
2+ 2+
A.2.2.3.5 Phosphate-buffered saline (PBS), without Ca and Mg (for trypsinization).
A.2.2.3.6 HEPES (see A.2.2.2.1).
2+ 2+
A.2.2.3.7 PBS, with Ca and Mg (for rinsing).
A.2.2.3.8 Penicillin/streptomycin solution.
A.2.2.3.9 Neutral red (NR).
A.2.2.3.10 Dimethyl sulfoxide (DMSO), analytical grade.
A.2.2.3.11 Ethanol (ETOH), analytical grade.
A.2.2.3.12 Glacial acetic acid, analytical grade.
A.2.2.3.13 Distilled water or any purified water suitable for cell culture.
A.2.2.4 Preparations
A.2.2.4.1 General
All solutions (except NR stock solution, NR medium and NR desorb), glassware, etc., shall be sterile and all
procedures should be carried out under aseptic conditions and in the sterile environment of a laminar flow
cabinet (biological hazard standard).
A.2.2.4.2 Media
DMEM (buffered with sodium bicarbonate) supplemented with (final concentrations in DMEM are quoted):
(A) For freezing
⎯ 20 % NBCS
⎯ 7 % to 10 % DMSO
(B) For routine culture
⎯ 10 % NBCS
⎯ 4 mM L-glutamine or glutamax
⎯ 100 IU/ml penicillin
⎯ 100 µg/ml streptomycin
⎯ 20 mM HEPES
(C) For treatment with test samples
⎯ 5 % NBCS
⎯ 4 mM glutamine or glutamax
⎯ 100 IU/ml penicillin
⎯ 100 µg/ml streptomycin
⎯ 20 mM HEPES
Complete media should be kept at 4 °C and stored for no longer than two weeks.
The serum concentration of treatment medium is reduced to 5 %, since serum proteins can mask the toxicity
of the test substance. Serum cannot be totally excluded because cell growth is markedly reduced in its
absence.
A.2.2.4.3 Neutral red (NR) stock solution
⎯ 0,4 g NR dye
⎯ 100 ml H O
Make up prior to use and s
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 10993-5
Troisième édition
2009-06-01
Évaluation biologique des dispositifs
médicaux —
Partie 5:
Essais concernant la cytotoxicité in vitro
Biological evaluation of medical devices —
Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity
Numéro de référence
©
ISO 2009
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées
acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute
responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info
du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir
l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,
veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2009
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2009 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . vi
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Préparation des échantillons et des contrôles. 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Préparation des extraits liquides de matériau.3
4.3 Préparation du matériau pour les essais en contact direct . 4
4.4 Préparation des contrôles . 5
5 Lignées cellulaires. 5
6 Milieu de culture. 6
7 Préparation de la culture cellulaire mère . 6
8 Modes opératoires d'essai. 6
8.1 Nombre d'exemplaires . 6
8.2 Essais à partir d'extraits . 6
8.3 Essai par contact direct . 7
8.4 Essai par contact indirect . 8
8.5 Détermination de la cytotoxicité . 9
9 Rapport d'essai . 11
10 Interprétation des résultats . 11
Annexe A (informative) Essai de cytotoxicité par fixation du rouge neutre (NRU) . 12
Annexe B (informative) Essai de cytotoxicité par formation de colonies . 19
Annexe C (informative) Essai de cytotoxicité au MTT. 24
Annexe D (informative) Essai de cytotoxicité au XTT . 29
Bibliographie . 34
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 10993-5 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 194, Évaluation biologique des dispositifs
médicaux.
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 10993-5:1999), qui a fait l'objet d'une
révision technique.
L'ISO 10993 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Évaluation biologique des
dispositifs médicaux:
⎯ Partie 1: Évaluation et essais au sein d'un processus de gestion du risque
⎯ Partie 2: Exigences relatives à la protection des animaux
⎯ Partie 3: Essais concernant la génotoxicité, la cancérogénicité et la toxicité sur la reproduction
⎯ Partie 4: Choix des essais pour les interactions avec le sang
⎯ Partie 5: Essais concernant la cytotoxicité in vitro
⎯ Partie 6: Essais concernant les effets locaux après implantation
⎯ Partie 7: Résidus de stérilisation à l'oxyde d'éthylène
⎯ Partie 9: Cadre pour l'identification et la quantification des produits potentiels de dégradation
⎯ Partie 10: Essais d'irritation et de sensibilisation cutanée
⎯ Partie 11: Essais de toxicité systémique
⎯ Partie 12: Préparation des échantillons et matériaux de référence
⎯ Partie 13: Identification et quantification de produits de dégradation de dispositifs médicaux à base de
polymères
iv © ISO 2009 – Tous droits réservés
⎯ Partie 14: Identification et quantification des produits de dégradation des céramiques
⎯ Partie 15: Identification et quantification des produits de dégradation issus des métaux et alliages
⎯ Partie 16: Conception des études toxicocinétiques des produits de dégradation et des substances
relargables
⎯ Partie 17: Établissement des limites admissibles des substances relargables
⎯ Partie 18: Caractérisation chimique des matériaux
⎯ Partie 19: Caractérisations physicochimique, morphologique et topographique des matériaux
[Spécification technique]
⎯ Partie 20: Principes et méthodes relatifs aux essais d'immunotoxicologie des dispositifs médicaux
[Spécification technique]
Introduction
En raison de l'applicabilité générale des essais de cytotoxicité in vitro et de leur utilisation courante pour
l'évaluation de toute une variété de dispositifs et matériaux, l'objet de la présente partie de l'ISO 10993 est de
définir un schéma des essais qui nécessite la prise de décisions concernant une série de phases, plutôt que
de spécifier un essai unique. Cette démarche doit mener à la sélection de l'essai le plus approprié.
Trois catégories d'essais sont répertoriées: essai d'extrait, essai par contact direct, essai par contact indirect.
Le choix d'une ou de plusieurs de ces catégories dépend de la nature de l'échantillon à évaluer, du site
d'utilisation potentiel et de la nature de l'utilisation.
Ce choix détermine alors les détails de la préparation des échantillons à soumettre à essai, de la préparation
des cellules cultivées et la façon dont les cellules sont exposées aux échantillons ou à leurs extraits.
L'évaluation de la présence et de la mesure de l'effet cytotoxique est entreprise à la fin de la durée
d'exposition. L'intention de la présente partie de l'ISO 10993 est de laisser ouvert le choix du type d'évaluation.
Une telle stratégie laisse à disposition toute une batterie d'essais et reflète l'approche de nombreux groupes
qui recommandent des essais biologiques in vitro.
Les nombreuses méthodes employées et les points finaux mesurés lors de la détermination de cytotoxicité
peuvent être regroupés selon les différentes catégories d'évaluation suivantes:
⎯ évaluation des dommages cellulaires par des observations morphologiques;
⎯ mesurages des dommages cellulaires;
⎯ mesurages de la croissance cellulaire;
⎯ mesurages d'aspects particuliers du métabolisme cellulaire.
Il existe plusieurs moyens d'obtenir des résultats dans chacune de ces quatre catégories. Afin que des
comparaisons avec d'autres résultats intra- et interlaboratoires sur des dispositifs ou matériaux similaires
puissent être faites, il est préférable que l'investigateur connaisse les catégories d'essai à laquelle chaque
technique particulière appartient. Des exemples de protocoles d'essai quantitatif sont donnés dans les
annexes. Les directives d'interprétation des résultats sont données dans la présente partie de l'ISO 10993.
vi © ISO 2009 – Tous droits réservés
NORME INTERNATIONALE ISO 10993-5:2009(F)
Évaluation biologique des dispositifs médicaux —
Partie 5:
Essais concernant la cytotoxicité in vitro
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO 10993 spécifie les méthodes d'essai d'évaluation de la cytotoxicité in vitro des
dispositifs médicaux.
Ces méthodes décrivent l'incubation des cellules cultivées en contact avec un dispositif et/ou des extraits de
dispositif, soit directement, soit par diffusion.
Elles sont conçues pour déterminer la réponse biologique in vitro des cellules de mammifère au moyen de
paramètres biologiques adaptés.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 10993-1, Évaluation biologique des dispositifs médicaux — Partie 1: Évaluation et essais au sein d'un
système de gestion du risque
ISO 10993-12, Évaluation biologique des dispositifs médicaux — Partie 12: Préparation des échantillons et
matériaux de référence
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l'ISO 10993-1, ainsi que les
suivants s'appliquent.
3.1
récipients de culture
récipients adaptés à la culture cellulaire tels que les boîtes de Petri en verre, les flacons de culture en
plastique ou les plaques multipuits et les plaques de microtitration en plastique
NOTE Dans ces méthodes, ces récipients de culture peuvent être utilisés de manière interchangeable tant qu'ils
satisfont aux exigences de classe de culture tissulaire et conviennent à la culture cellulaire de mammifère.
3.2
matériau de contrôle positif
matériau qui, soumis à essai conformément à la présente partie de l'ISO 10993, induit une réponse
cytotoxique reproductible
NOTE L'objet du contrôle positif est de mettre en évidence une réponse adaptée à l'essai choisi. Par exemple, des
1)
polyuréthanes stabilisés à l'étain ont servi de contrôles positifs pour les matériaux solides et les extraits. Des dilutions de
phénol, par exemple, ont servi de contrôle positif pour les extraits. En plus des matériaux, des produits chimiques purs
peuvent aussi être utilisés pour démontrer la performance du système d'essai.
3.3
blanc
véhicule d'extraction ne contenant pas l'échantillon d'essai, contenu dans un récipient identique à celui
renfermant l'échantillon d'essai et soumis à des conditions identiques à ce dernier au cours de son extraction
NOTE L'objet du blanc est d'évaluer les effets trompeurs provoqués par le récipient d'extraction, le véhicule et le
processus d'extraction.
3.4
matériau de contrôle négatif
matériau qui, soumis à essai conformément à la présente partie de l'ISO 10993, n'induit pas de réponse
cytotoxique
NOTE L'objet du contrôle négatif est de mettre en évidence la réponse basale des cellules. Par exemple, du
2)
polyéthylène haute densité , dans le cas des polymères synthétiques, et des tiges de céramique à l'oxyde d'aluminium,
dans le cas des matériaux dentaires, ont servi de contrôles négatifs.
3.5
échantillon d'essai
matériau, dispositif, partie de dispositif, composant, extrait ou partie de composant soumis à des essais ou à
une évaluation biologique ou chimique
3.6
sous-confluence
environ 80 % de la confluence, c'est-à-dire la fin de la phase logarithmique de croissance
4 Préparation des échantillons et des contrôles
4.1 Généralités
L'essai doit être réalisé sur
a) un extrait de l'échantillon d'essai, et/ou
b) l'échantillon d'essai lui-même.
La préparation des échantillons doit être conforme à l'ISO 10993-12.
Des contrôles positif et négatif doivent être incorporés à chaque essai.
1) Les polyuréthanes ZDEC et ZDBC peuvent être obtenus auprès du Food and Drug Safety Center, Hatano Research
Institute, Ochiai 729-5, Hadanoshi, Kanagawa 257, Japon.
2) Le polyéthylène haute densité peut être obtenu auprès de la pharmacopée des États-Unis (Rockville, Maryland, USA)
et du Food and Drug Safety Center, Hatano Research Institute (Ochiai 729-5, Hadanoshi, Kanagawa 257, Japon).
Les informations données en 1) et 2) sont données à l'intention des utilisateurs de la présente partie de l'ISO 10993 et ne
signifient nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits
équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent aux mêmes résultats.
2 © ISO 2009 – Tous droits réservés
4.2 Préparation des extraits liquides de matériau
4.2.1 Principes d'extraction
Il convient que les conditions d'extraction simulent ou exagèrent les conditions d'utilisation clinique du
matériau afin de définir le danger potentiel de toxicité sans induire de modifications significatives de
l'échantillon d'essai telles qu'une fusion, un ramollissement ou une altération de sa structure chimique, hors
de celles prévues lors de son utilisation clinique. En raison de la nature de certains matériaux (par exemple
les matériaux biodégradables), une altération de la structure chimique peut se produire au cours du mode
opératoire d'extraction.
NOTE La concentration de toute substance endogène ou exogène dans l'extrait, et donc la quantité de ces
substances mise au contact des cellules utilisées dans l'essai, dépendent de la surface de contact, du volume d'extraction,
du pH, de la solubilité chimique, de la vitesse de diffusion, de l'osmolarité, de l'agitation, de la température, de la durée et
d'autres facteurs.
Pour les dispositifs impliquant un mélange de deux ou de plusieurs composants chez le patient pour obtenir le
dispositif final (ciment à os), il est recommandé de ne pas rincer le dispositif final avant extraction. Le rinçage
du dispositif peut faire disparaître, partiellement ou totalement, les résidus présents sur le dispositif. Si
l'échantillon d'essai est destiné à une utilisation en environnement stérile, il convient d'utiliser un échantillon
d'essai stérilisé pour extraire les constituants chimiques.
4.2.2 Véhicule d'extraction
Le choix du (des) véhicule(s) d'extraction tenant compte des caractéristiques chimiques du matériau doit être
justifié et documenté. Pour les essais de cellules de mammifères, un ou plusieurs des véhicules suivants
doivent être utilisés:
a) milieu de culture avec sérum;
b) solution saline physiologique;
c) autre véhicule adapté.
Il convient que le choix du véhicule reflète l'objectif de l'extraction. L'utilisation d'un véhicule polaire et non
polaire doit aussi être prise en considération. Le milieu de culture avec sérum est le véhicule d'extraction
favori. Il est préféré pour l'extraction à cause de sa capacité à soutenir la croissance cellulaire ainsi qu'à
extraire des substances polaires et non polaires. En plus du milieu de culture avec sérum, il convient de
considérer l'emploi de milieu sans sérum afin d'extraire spécifiquement les substances polaires (par exemple
les composés ioniques). L'eau purifiée et le diméthylesulfoxyde (DMSO) sont également des véhicules
adaptés. Au-delà de 0,5 % (fraction volumique), dans certains systèmes d'essai, le DMSO est connu pour être
cytotoxique. La concentration d'exposition cellulaire des extractibles dans le DMSO sera inférieure à celle
d'une extraction en milieu de culture avec sérum, en raison de la dilution plus importante.
NOTE 1 Différents types de sérum peuvent être utilisés (par exemple sérum fœtal, sérum bovin/du veau, sérum du
veau nouveau-né) et le choix du sérum dépend du type de cellule.
NOTE 2 Il est important de ne pas oublier que le sérum/les protéines sont connus pour se lier, dans une certaine
mesure, aux substances extractibles.
4.2.3 Conditions d'extraction
4.2.3.1 L'extraction doit être effectuée dans des conteneurs stériles, chimiquement inertes et fermés, en
conditions d'asepsie, et en conformité avec l'ISO 10993-12.
4.2.3.2 À l'exception des circonstances indiquées ci-dessous, l'extraction doit être menée dans l'une des
conditions suivantes et effectuée conformément aux caractéristiques du dispositif et à ses conditions
d'utilisation:
a) (24 ± 2) h à (37 ± 1) °C;
b) (72 ± 2) h à (50 ± 2) °C;
c) (24 ± 2) h à (70 ± 2) °C;
d) (1 ± 0,2) h à (121 ± 2) °C.
Les conditions d'extraction décrites ci-dessus, qui ont servi à établir une mesure du danger potentiel pour
l'estimation du risque du dispositif ou matériau, sont fondées sur des données historiques. D'autres conditions,
par exemple des temps d'extraction à 37 °C rallongés ou raccourcis, stimulant l'extraction se déroulant au
cours de l'utilisation clinique ou fournissant une mesure adéquate du potentiel de danger, peuvent aussi être
utilisées; mais elles doivent être justifiées et documentées. Pour les dispositifs médicaux n'entrant que peu de
temps (pas plus de 4 h) en contact avec la peau ou les muqueuses intactes et non implantés, cela peut
comprendre des temps d'extraction inférieurs à 24 h mais supérieurs à 4 h, comme indiqué de a) à c).
Il convient que le milieu de culture cellulaire avec sérum ne soit utilisé que conformément à a) car des
températures d'extraction supérieures à (37 ± 1) °C peuvent agir de façon négative sur la chimie et/ou la
stabilité du sérum et d'autres constituants du milieu de culture.
Pour les échantillons d'essai polymériques, il est recommandé que la température d'extraction ne dépasse
pas la température de transition vitreuse car une température plus élevée peut changer la composition du
solvant d'extraction.
4.2.3.3 Si l'extrait est filtré, centrifugé ou traité par d'autres méthodes avant d'être mis en contact avec les
cellules, tous ces détails doivent être consignés dans le rapport final, accompagnés des raisons des
manipulations supplémentaires (voir Article 9). Tout ajustement de pH de l'extrait doit être signalé. Il convient
que les manipulations de l'extrait, telles que les ajustements de pH, soient évitées parce qu'elle peuvent
influer sur le résultat.
4.3 Préparation du matériau pour les essais en contact direct
4.3.1 Les matériaux ayant des formes, des tailles ou des états physiques variés (liquide, solide, gels, etc.)
peuvent être soumis à essai sans modification des essais de cytotoxicité.
Il est recommandé que l'échantillon d'essai d'un matériau solide ait au moins une surface plane. Sinon, des
ajustements doivent être faits pour obtenir des surfaces planes.
4.3.2 Stérilité des échantillons d'essai
4.3.2.1 La stérilité de l'échantillon d'essai doit être prise en compte.
4.3.2.2 Les échantillons d'essai issus de dispositifs stérilisés doivent être manipulés en asepsie tout au
long de la réalisation de l'essai.
4.3.2.3 Les échantillons d'essai issus de dispositifs normalement fournis non stériles mais devant être
stérilisés avant utilisation doivent être stérilisés selon la méthode recommandée par le fabricant et manipulés
en asepsie tout au long de la réalisation de l'essai.
Il convient que les effets des méthodes ou des agents de stérilisation sur le dispositif soient pris en compte
lors de la définition de la préparation de l'échantillon d'essai avant sa mise en œuvre dans le système d'essai
choisi.
4 © ISO 2009 – Tous droits réservés
4.3.2.4 Les matériaux d'essai issus de dispositifs n'ayant pas besoin d'être stérilisés avant utilisation
doivent être employés tels qu'ils sont fournis et manipulés en asepsie tout au long de la réalisation de l'essai.
La stérilisation de l'échantillon d'essai afin d'éviter toute contamination microbienne de la culture de cellules
peut être justifiée; toutefois, le procédé de stérilisation ne doit pas modifier les propriétés du matériau d'essai.
Si des échantillons d'essai non stériles sont utilisés, il convient que l'absence de contamination bactérienne
sur ceux-ci soit vérifiée car elle peut produire une fausse évaluation de la cytotoxicité.
4.3.3 Échantillons d'essai liquides
Les échantillons d'essai liquides doivent être soumis à essai
a) par apposition directe, ou
b) par apposition sur une matrice absorbante biologiquement inerte.
Les disques pour filtration ont été considérés comme des matrices absorbantes inertes convenables.
4.3.4 Échantillons d'essai absorbants
Le cas échéant, les échantillons d'essai absorbants doivent être imbibés de milieu de culture avant l'essai afin
d'empêcher l'adsorption du milieu de culture dans le récipient d'essai.
4.4 Préparation des contrôles
Il est recommandé que les contrôles soient choisis de sorte à pouvoir être préparés selon le même mode
opératoire que l'échantillon d'essai.
5 Lignées cellulaires
Les lignées cellulaires établies sont préférées et, lorsqu'elles sont utilisées, doivent être obtenues à partir de
3)
sources reconnues .
Lorsqu'une sensibilité spécifique est nécessaire, des cultures primaires, des lignées cellulaires et des cultures
organotypiques obtenues directement à partir de tissus vivants ne doivent être utilisées que si la
reproductibilité et la précision de la réponse peuvent être démontrées.
Si une culture mère d'une lignée cellulaire est conservée, le stockage doit se faire à −80 °C ou moins, dans le
milieu de culture correspondant, en présence d'un cryoprotecteur tel que du diméthylsulfoxyde ou du glycérol.
Un stockage de longue durée (plusieurs mois à plusieurs années) n'est possible qu'à −130 °C ou moins.
Seules les cellules dépourvues de mycoplasme peuvent être utilisées pour l'essai. Avant utilisation, il convient
de vérifier l'absence de mycoplasme dans les cultures mères.
Il est important de contrôler régulièrement les cellules (par exemple leurs morphologie, temps de doublement,
nombre de chromosomes modal) car la sensibilité dans les essais peut varier avec le nombre de passages.
Il convient d'employer les bonnes pratiques de culture cellulaire. Voir Référence [5].
3) Par exemple les lignées de cellules American Type Culture Collection CCL 1 (NCTC clone 929), CCL 163 (Balb/3T3
clone A31), CCL 171 (MRC-5) et CCL 75 (WI-38), CCL 81 (Vero) et CCL 10 [BHK-21 (C 13)] et V-79 379A sont
recommandées par les experts de l'ISO comme adaptées.
Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente partie de l'ISO 10993 et ne signifie nullement que
l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné. D'autres lignées cellulaires peuvent être
utilisées s'il est démontré qu'elles conduisent aux mêmes résultats ou à des résultats meilleurs.
6 Milieu de culture
Le milieu de culture doit être stérile.
Le milieu de culture, avec ou sans sérum, doit satisfaire aux exigences de croissance de la lignée choisie.
Des antibiotiques peuvent être ajoutés au milieu, à condition qu'ils n'aient pas d'incidence négative sur les
essais.
Les conditions de stockage doivent être validées.
NOTE La stabilité du milieu de culture varie avec sa composition et ses conditions de stockage.
Le milieu de culture doit être conservé à un pH compris entre 7,2 et 7,4.
7 Préparation de la culture cellulaire mère
En utilisant la lignée cellulaire et le milieu de culture choisis, préparer assez de cellules pour réaliser l'essai. Si
les cellules à faire croître proviennent de cultures qui étaient stockées, éliminer le cryoprotecteur, s'il est
présent. Repiquer les cellules au moins une fois avant utilisation.
Lors du repiquage, détacher et mettre les cellules en suspension par désagrégation enzymatique et/ou
mécanique, selon la méthode adaptée à la lignée cellulaire.
8 Modes opératoires d'essai
8.1 Nombre d'exemplaires
Un minimum de trois exemplaires doit être utilisé pour les échantillons d'essai et les contrôles.
8.2 Essais à partir d'extraits
8.2.1 Cet essai permet d'évaluer la cytotoxicité à la fois de façon qualitative et quantitative.
8.2.2 Dans la suspension cellulaire continuellement agitée, pipetter une aliquote et la transférer dans
chacun des récipients en nombre suffisant pour réaliser l'exposition des extraits. Répartir uniformément les
cellules à la surface de chaque récipient par une rotation douce.
8.2.3 Mettre les cultures à incuber à (37 ± 1) °C dans de l'air supplémenté ou non de dioxyde de carbone
selon le système tampon sélectionné pour le milieu de culture.
Il est recommandé que l'essai soit réalisé sur une monocouche sous-confluente ou sur des cellules venant
d'être mises en suspension.
Pour l'essai de formation de colonies, seule une densité cellulaire faible appropriée doit être utilisée.
8.2.4 Avant de commencer l'essai, vérifier la sous-confluence et la morphologie des cultures au microscope.
Dans des cas exceptionnels, il est permis d'ensemencer des cellules à croissance exponentielle (par exemple
des cellules primaires, des cellules à forte prolifération) au départ de l'essai.
8.2.5 Réaliser l'essai sur
a) l'extrait pur, et/ou
b) l'extrait pur et une série de dilutions de l'extrait, en utilisant le véhicule d'extraction comme diluant.
6 © ISO 2009 – Tous droits réservés
Autrement, lorsqu'on soupçonne la présence de matériaux à solubilité limitée, il convient que les dilutions
soient accomplies en variant le rapport d'extraction d'origine de l'échantillon d'essai sur le milieu d'extraction.
Si des monocouches sont utilisées pour l'essai, enlever et jeter le milieu de culture et ajouter une aliquote de
l'extrait ou de sa dilution dans chacun des récipients.
Si l'essai est réalisé sur des cellules en suspension, ajouter l'extrait ou sa dilution dans chacun des récipients,
immédiatement après préparation de la suspension cellulaire.
8.2.6 Lorsqu'un extrait non physiologique est utilisé, par exemple de l'eau, il doit être soumis à essai à la
concentration la plus élevée physiologiquement compatible, après dilution dans le milieu de culture.
NOTE Un milieu de culture concentré, par exemple 2×, 5×, est recommandé pour diluer les extraits aqueux.
8.2.7 Ajouter des aliquotes connues du blanc et des contrôles positif et négatif dans des récipients
supplémentaires.
NOTE Un contrôle constitué du milieu de culture frais peut aussi être soumis à essai, si nécessaire.
8.2.8 Placer les récipients en incubation à des conditions similaires à celles décrites en 8.2.3 pour une
durée appropriée pour l'essai choisi.
8.2.9 Au terme d'une période d'incubation d'au moins 24 h, déterminer les effets cytotoxiques
conformément à 8.5.
8.3 Essai par contact direct
8.3.1 Cet essai permet d'évaluer la cytotoxicité à la fois de façon qualitative et quantitative.
8.3.2 Dans la suspension cellulaire continuellement agitée, pipetter une aliquote connue et la transférer
dans chacun des récipients en nombre suffisant pour réaliser l'exposition directe aux échantillons d'essai.
Répartir uniformément les cellules à la surface de chaque récipient par une rotation horizontale douce.
8.3.3 Mettre la culture à incuber à (37 ± 1) °C dans de l'air supplémenté ou non de dioxyde de carbone,
selon le système tampon sélectionné pour le milieu de culture, jusqu'à ce que les cellules aient atteint la sous-
confluence.
8.3.4 Avant de commencer l'essai, vérifier la sous-confluence et la morphologie des cultures au microscope.
Dans des cas exceptionnels, il est permis d'ensemencer des cellules à croissance exponentielle (par exemple
des cellules primaires, des cellules à forte prolifération) au départ de l'essai.
8.3.5 Retirer et jeter le milieu de culture. Puis, ajouter du milieu de culture frais dans chaque récipient.
8.3.6 Déposer délicatement les échantillons du matériau d'essai sur la couche de cellules, au centre de
chaque récipient. Veiller que l'échantillon couvre approximativement un dixième de la surface de la couche
cellulaire.
D'autres rapports de surface d'échantillon sur surface de couche cellulaire peuvent être utilisés s'ils sont
justifiés.
Bien veiller à éviter tout mouvement inutile des échantillons, ce qui peut causer des traumatismes physiques
aux cellules. Par exemple, des détachements de plaques de cellules peuvent résulter de mouvements inutiles.
NOTE Si nécessaire, l'échantillon peut être placé dans le récipient de culture avant l'ajout des cellules.
8.3.7 Préparer des récipients pour les matériaux de contrôle positif et négatif.
8.3.8 Placer les récipients en incubation à des conditions similaires à celles décrites en 8.3.3 pour une
durée appropriée pour l'essai choisi (un minimum de 24 h).
8.3.9 Jeter le milieu de culture surnageant avant d'ajouter les produits chimiques/colorants afin de
déterminer les effets cytotoxiques conformément à 8.5.
8.4 Essai par contact indirect
8.4.1 Diffusion dans l'agar
8.4.1.1 Cet essai permet d'évaluer la cytotoxicité de façon qualitative. Il ne convient pas pour les
substances relargables qui ne diffusent pas à travers la couche d'agar ou qui peuvent réagir avec l'agar.
L'emploi d'un essai de diffusion dans l'agar pour l'évaluation de la cytotoxicité doit être justifié.
8.4.1.2 Dans la suspension cellulaire continuellement agitée, pipetter une aliquote connue et la transférer
dans chacun des récipients en nombre suffisant pour réaliser l'essai. Répartir uniformément les cellules à la
surface de chaque récipient par une rotation horizontale douce.
8.4.1.3 Mettre les cultures à incuber à (37 ± 1) °C dans de l'air supplémenté ou non de dioxyde de
carbone, selon le système tampon sélectionné pour le milieu de culture, jusqu'à ce que les cellules aient
atteint une confluence approximative à la fin de la phase logarithmique de la courbe de croissance.
8.4.1.4 Avant de commencer l'essai, vérifier la sous-confluence et la morphologie des cultures au
microscope.
8.4.1.5 Retirer et jeter le milieu de culture du récipient. Puis, mélanger le milieu de culture frais contenant
du sérum avec de l'agar fondu pour obtenir une concentration massique finale en agar de 0,5 % à 2 % et en
pipetter un volume adapté dans chaque récipient. N'utiliser que de l'agar compatible avec la croissance de
cellules de mammifères en culture. Il est recommandé que le mélange milieu de culture/agar soit à l'état
liquide et à une température adaptée aux cellules de mammifère.
NOTE L'agar existe dans différents degrés de pureté et différentes masses moléculaires.
8.4.1.6 Dans chaque récipient, déposer délicatement les échantillons du matériau d'essai sur la couche
d'agar solidifié. Veiller que l'échantillon couvre approximativement un dixième de la surface de la couche
cellulaire.
D'autres rapports de surface d'échantillon sur surface de couche cellulaire peuvent être utilisés s'ils sont
justifiés.
Humidifier préalablement tout matériau absorbant avec le milieu de culture avant de le placer sur l'agar, afin
d'éviter la déshydratation de l'agar.
8.4.1.7 Préparer des récipients avec les matériaux de contrôle positif et négatif.
8.4.1.8 Placer les récipients en incubation à des conditions similaires à celles décrites en 8.4.1.3 pour
une durée de 24 h à 72 h.
8.4.1.9 Examiner les cellules pour la cytotoxicité avant et après avoir soigneusement retiré les
échantillons de l'agar.
L'utilisation d'un colorant vital, par exemple le rouge neutre, peut aider à la détection de la cytotoxicité. Le
colorant vital peut être ajouté avant ou après l'incubation avec l'échantillon. S'il est ajouté avant, protéger les
cultures de la lumière pour éviter les dommages cellulaires induits par photoactivation du colorant.
8.4.2 Diffusion à travers un filtre
8.4.2.1 Cet essai permet d'évaluer la cytotoxicité de façon qualitative.
8 © ISO 2009 – Tous droits réservés
8.4.2.2 Déposer un filtre de pores de 0,45 µm dépourvu d'agent de surface dans chaque récipient et
ajouter une aliquote connue de la suspension cellulaire continuellement agitée dans un nombre de récipients
suffisant pour réaliser l'essai. Répartir uniformément les cellules à la surface de chaque filtre par une rotation
douce.
8.4.2.3 Mettre les cultures à incuber à (37 ± 1) °C dans de l'air supplémenté ou non de dioxyde de
carbone, selon le système tampon sélectionné pour le milieu de culture, jusqu'à ce que les cellules aient
atteint une sous-confluence approximative à la fin de la phase logarithmique de la courbe de croissance.
8.4.2.4 Retirer et jeter le milieu de culture des récipients. Puis, transférer les filtres, le côté des cellules
vers le bas, sur une couche d'agar solidifié (voir 8.4.1.5).
8.4.2.5 Déposer soigneusement les échantillons identiques du matériau d'essai sur le côté sans cellules
(haut) du filtre. Retenir les extraits liquides et les composants fraîchement mélangés dans des bagues inertes
placées sur le filtre.
8.4.2.6 Préparer les filtres avec les matériaux de contrôle positif et négatif.
8.4.2.7 Placer les récipients en incubation à des conditions similaires à celles décrites en 8.4.2.3 pour
une durée de 2 h ± 10 min.
8.4.2.8 Enlever soigneusement les échantillons du filtre et séparer délicatement le filtre de la surface de
l'agar.
8.4.2.9 Déterminer la cytotoxicité en utilisant une technique de coloration appropriée.
8.5 Détermination de la cytotoxicité
8.5.1 Déterminer la cytotoxicité par des méthodes quantitatives ou qualitatives. L'évaluation quantitative est
préférable. Les méthodes qualitatives conviennent à des objectifs de dépistage.
Évaluation qualitative: Examiner les cellules au microscope en utilisant éventuellement un colorant
cytochimique. Évaluer les modifications, par exemple, de morphologie générale, l'apparition de vacuolisations,
d'un détachement ou d'une lyse cellulaire ou d'une perte de l'intégrité membranaire. Les modifications par
rapport à la morphologie normale doivent être consignées dans le rapport d'essai de manière descriptive ou
numérique. Une façon pratique de classer les échantillons pour essai est donnée dans les Tableaux 1 et 2.
Tableau 1 — Classement morphologique qualitatif de la cytotoxicité des extraits
Classe Réactivité États de toutes les cultures
0 Aucune Petits granules intracytoplasmiques, pas de lyse cellulaire, pas de réduction
de la croissance cellulaire
1 Légère Un maximum de 20 % des cellules sont rondes, liées de façon lâche et sans
granules intracytoplasmiques ni changements visibles de morphologie;
quelques cellules lysées sont présentes; seule une inhibition légère de la
croissance est observable
2 Bénigne Un maximum de 50 % des cellules sont rondes, vides de granules
intracytoplasmiques, pas de lyse cellulaire importante, un maximum de 50 %
d'inhibition de la croissance observable
3 Modérée Un maximum de 70 % des couches cellulaires contiennent des cellules
arrondies ou sont lysées; les couches cellulaires ne sont pas totalement
détruites, mais plus de 50 % d'inhibition de la croissance est observable
4 Sévère Destruction totale ou presque des couches de cellules
Tableau 2 — Classes de réactivité pour les essais de diffusion à travers l'agar ou filtre
et par contact direct
Classe Réactivité Description de la zone de réactivité
0 Aucune Pas de zone détectable autour de l'échantillon ou en dessous
1 Légère Quelques cellules malformées ou dégénérées sous l'échantillon
2 Bénigne Zone limitée à la surface sous l'échantillon
3 Modérée Zone d'une taille dépassant celle de l'échantillon jusqu'à 1,0 cm
4 Sévère Zone d'une taille dépassant celle de l'échantillon de plus de 1,0 cm
La méthode d'évaluation et les résultats de l'évaluation doivent figurer dans le rapport d'essai.
L'atteinte d'une classe supérieure à 2 selon les Tableaux 1 et 2 est considérée comme un effet cytotoxique.
Évaluation quantitative: Mesurer la mort cellulaire, l'inhibition de la croissance cellulaire, la prolifération
cellulaire ou la formation de colonies. Le nombre de cellules, la quantité de protéines, le relargage d'enzymes,
le relargage d'un colorant vital, la réduction d'un colorant vital ou tout autre paramètre mesurable peuvent être
quantifiés par des méthodes objectives. La mesure objective et la réponse doivent être consignées dans le
rapport d'essai.
Une réduction de la viabilité cellulaire de plus de 30 % est considérée comme un effet cytotoxique. D'autres
critères, tels que différents points d'inclusion ou un rapport de résultat d'essai sur résultat de contrôle
acceptable, doivent être justifiés pour certaines lignées cellulaires ou des constructions tissulaires
multicouches. Les critères doivent être justifiés et documentés.
Le protocole décrit dans les Annexes A à D peut toujours servir pour la détermination quantitative de la
cytotoxicité des extraits.
NOTE Les protocoles A et B se sont révélés adaptés aux produits chimiques dans des études internationales de
validation et pour les dispositifs médicaux dans des essais comparatifs interlaboratoires internationaux. Pour les
matériaux cytotoxiques, ils permettent la graduation de l'effet cytotoxique par le calcul d'une valeur de IC (concentration
inhibitrice estimée affecter le point final par une réduction de 50 %). Les Annexes C et D décrivent d'autres protocoles
largement utilisés pour la détermination quantitative de la cytotoxicité.
Pour certaines méthodes de détermination de la cytotoxicité, des contrôles à temps zéro ou une ligne de base
peuvent être nécessaires.
8.5.2 Veiller à choisir de bonnes méthodes d'évaluation, car les résultats d'essai peuvent s'avérer
inexploitables si l'échantillon d'essai relargue des substances qui interfèrent avec le système d'essai ou la
méthode de mesure.
Les matériaux susceptibles de relarguer du formaldéhyde ne peuvent pas être soumis à essai lorsque la
viabilité cellulaire est évaluée.
8.5.3 Si des différences évidentes apparaissent dans les résultats d'essai au sein des récipients de culture,
l'essai n'est pas approprié ou valable. Dans ce cas, l'essai doit être répété ou une méthode alternative doit
être utilisée.
8.5.4 Si le contrôle négatif, positif ou autre (référence, milieu, blanc, réactif, etc.) ne fournit pas la réponse
attendue dans le système d'essai, répéter le(s) essai(s).
10 © ISO 2009 – Tous droits réservés
9 Rapport d'essai
Le rapport d'essai doit au moins fournir les renseignements suivants:
a) nom et adresse du laboratoire d'essai:
b) nom de la (des) personne(s) ayant réalisé l'essai;
c) dates de début et fin de l'essai;
d) description de l'échantillon;
e) lignée cellulaire, justification du choix et des sources cellulaires;
f) nom du fabricant et lot du milieu, du sérum et des antibiotiques ajoutés le cas échéant;
g) méthode d'essai et sa justification;
h) mode opératoire d'extraction (le cas échéant) et, si possible, la nature et la concentration des substances
relarguées;
i) contrôles positif, négatif et autres;
j) réponse cellulaire et autres observations;
k) toute autre donnée pertinente pour l'interprétation des résultats.
10 Interprétation des résultats
L'interprétation globale des résultats doit être réalisée par une personne compétente capable de prendre les
bonnes décisions fondées sur les données de l'essai. Les données de cytotoxicité doivent être évaluées en
relation avec d'autres données de biocompatibilité et l'utilisation prévue du produit.
L'interprétation des résultats de l'essai de cytotoxicité doit prendre en compte la classification du dispositif
selon l'ISO 10993-1.
En cas d'effet cytotoxique, des évaluations supplémentaires peuvent être réalisées, par exemple
a) des essais complémentaires (présence/absence de sérum, changement de quantité de sérum dans le
milieu de culture),
b) une analyse d'extrait (par exemple résidus de stérilisation et autres processus de production), le cas
échéant,
c) une analyse de la réponse en fonction de la concentration pour les dilutions,
d) une caractérisation chimique des com
...
ISO 10993-5:2009 is a standard that outlines test methods for evaluating the toxicity of medical devices on cells in a laboratory setting. The methods involve exposing cultured cells to the device or its extracts either directly or through diffusion. The goal of these tests is to understand how mammalian cells respond to the device and its components, using specific biological parameters.
記事のタイトル：ISO 10993-5:2009 - 医療機器の生体評価 - 第5部：体外細胞毒性試験 記事の内容：ISO 10993-5:2009は、医療機器の体外細胞毒性を評価するためのテスト方法について説明しています。これらの方法は、培養細胞を装置や装置の抽出物と接触させること、直接または拡散を通じて行うことを明記しています。これらの方法は、適切な生物学的パラメータを使用して、体外で哺乳動物細胞の生物学的応答を評価するために設計されています。
Artikelüberschrift: ISO 10993-5:2009 - Biologische Bewertung von Medizinprodukten - Teil 5: Tests zur in-vitro-Zytotoxizität Artikelinhalt: ISO 10993-5:2009 beschreibt Testmethoden zur Bewertung der in-vitro-Zytotoxizität von Medizinprodukten. Diese Methoden umfassen die Inkubation von kultivierten Zellen in Kontakt mit einem Gerät und/oder Extrakte eines Geräts, entweder direkt oder über Diffusion. Diese Methoden sollen die biologische Reaktion von Säugerzellen in vitro unter Verwendung geeigneter biologischer Parameter bestimmen.
The article discusses ISO 10993-5:2009, which outlines test methods for evaluating the in vitro cytotoxicity of medical devices. The methods involve placing cultured cells in contact with the device or extracts from the device, either directly or through diffusion. These methods aim to assess the biological response of mammalian cells in a laboratory setting, using relevant biological parameters.
Titre de l'article : ISO 10993-5:2009 - Évaluation biologique des dispositifs médicaux - Partie 5: Tests pour la cytotoxicité in vitro Contenu de l'article: L'ISO 10993-5:2009 décrit les méthodes de test permettant d'évaluer la cytotoxicité in vitro des dispositifs médicaux. Ces méthodes spécifient l'incubation de cellules en culture en contact avec un dispositif et/ou des extraits d'un dispositif, soit directement soit par diffusion. Ces méthodes sont conçues pour déterminer la réponse biologique des cellules mammaliennes in vitro en utilisant des paramètres biologiques appropriés.
記事のタイトル: ISO 10993-5:2009 - 医療機器の生体評価- 第5部: in vitro細胞毒性試験 記事の内容: ISO 10993-5:2009は、医療機器のin vitro細胞毒性を評価するための試験方法を説明しています。これらの方法では、培養細胞をデバイスと/またはデバイスの抽出物と直接または拡散によって接触させることを指定しています。これらの方法は、適切な生物学的パラメータを使用してin vitroで哺乳類の細胞の生体応答を評価することを目的としています。
기사 제목: ISO 10993-5:2009 - 의료기기 생체 측정 - 5부: 체외 세포독성 실험 기사 내용: ISO 10993-5:2009는 의료기기의 체외 세포독성을 평가하기 위한 실험 방법을 설명한다. 이러한 방법들은 배양세포를 기기와/또는 기기의 추출물과 직접 또는 확산을 통해 접촉시키는 것을 명시한다. 이러한 방법들은 적절한 생물학적 지표를 통해 체외에서 포유류 세포의 생체반응을 결정하는 것을 목표로 한다.
기사 제목: ISO 10993-5:2009 - 의료 기기의 생물학적 평가 - 제 5부: 체외 세포 독성 테스트 기사 내용: ISO 10993-5:2009는 의료 기기의 체외 세포 독성을 평가하기 위한 테스트 방법을 설명한다. 이러한 방법은 기기와/또는 기기의 추출물과 배양된 세포를 직접 또는 확산을 통해 접촉시키는 것을 명시한다. 이러한 방법은 적합한 생물학적 매개변수를 사용하여 체외에서 포유 동물 세포의 생물학적 반응을 결정하는데 사용된다.
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
Loading comments...