ISO 10993-5:2009
(Main)Biological evaluation of medical devices — Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity
Biological evaluation of medical devices — Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity
ISO 10993-5:2009 describes test methods to assess the in vitro cytotoxicity of medical devices. These methods specify the incubation of cultured cells in contact with a device and/or extracts of a device either directly or through diffusion. These methods are designed to determine the biological response of mammalian cells in vitro using appropriate biological parameters.
Évaluation biologique des dispositifs médicaux — Partie 5: Essais concernant la cytotoxicité in vitro
L'ISO 10993-5:2009 spécifie les méthodes d'essai d'évaluation de la cytotoxicité in vitro des dispositifs médicaux. Ces méthodes décrivent l'incubation des cellules cultivées en contact avec un dispositif et/ou des extraits de dispositif, soit directement, soit par diffusion. Elles sont conçues pour déterminer la réponse biologique in vitro des cellules de mammifère au moyen de paramètres biologiques adaptés.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10993-5
Third edition
2009-06-01
Biological evaluation of medical
devices —
Part 5:
Tests for in vitro cytotoxicity
Évaluation biologique des dispositifs médicaux —
Partie 5: Essais concernant la cytotoxicité in vitro
Reference number
ISO 10993-5:2009(E)
©
ISO 2009
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ISO 10993-5:2009(E)
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ISO 10993-5:2009(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Sample and control preparation. 2
4.1 General. 2
4.2 Preparation of liquid extracts of material. 3
4.3 Preparation of material for direct-contact tests .4
4.4 Preparation of controls . 5
5 Cell lines . 5
6 Culture medium. 5
7 Preparation of cell stock culture. 6
8 Test procedures . 6
8.1 Number of replicates . 6
8.2 Test on extracts . 6
8.3 Test by direct contact. 7
8.4 Test by indirect contact. 7
8.5 Determination of cytotoxicity . 9
9 Test report . 10
10 Assessment of results. 11
Annex A (informative) Neutral red uptake (NRU) cytotoxicity test. 12
Annex B (informative) Colony formation cytotoxicity test. 19
Annex C (informative) MTT cytotoxicity test . 24
Annex D (informative) XTT cytotoxicity test. 29
Bibliography . 34
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ISO 10993-5:2009(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 10993-5 was prepared by Technical Committee ISO/TC 194, Biological evaluation of medical devices.
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 10993-5:1999) which has been technically
revised.
ISO 10993 consists of the following parts, under the general title Biological evaluation of medical devices:
⎯ Part 1: Evaluation and testing within a risk management process
⎯ Part 2: Animal welfare requirements
⎯ Part 3: Tests for genotoxicity, carcinogenicity and reproductive toxicity
⎯ Part 4: Selection of tests for interactions with blood
⎯ Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity
⎯ Part 6: Tests for local effects after implantation
⎯ Part 7: Ethylene oxide sterilization residuals
⎯ Part 9: Framework for identification and quantification of potential degradation products
⎯ Part 10: Tests for irritation and skin sensitization
⎯ Part 11: Tests for systemic toxicity
⎯ Part 12: Sample preparation and reference materials
⎯ Part 13: Identification and quantification of degradation products from polymeric medical devices
⎯ Part 14: Identification and quantification of degradation products from ceramics
⎯ Part 15: Identification and quantification of degradation products from metals and alloys
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⎯ Part 16: Toxicokinetic study design for degradation products and leachables
⎯ Part 17: Establishment of allowable limits for leachable substances
⎯ Part 18: Chemical characterization of materials
⎯ Part 19: Physico-chemical, morphological and topographical characterization of materials [Technical
Specification]
⎯ Part 20: Principles and methods for immunotoxicology testing of medical devices [Technical Specification]
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ISO 10993-5:2009(E)
Introduction
Due to the general applicability of in vitro cytotoxicity tests and their widespread use in evaluating a large
range of devices and materials, it is the purpose of this part of ISO 10993, rather than to specify a single test,
to define a scheme for testing which requires decisions to be made in a series of steps. This should lead to
the selection of the most appropriate test.
Three categories of test are listed: extract test, direct contact test, indirect contact test.
The choice of one or more of these categories depends upon the nature of the sample to be evaluated, the
potential site of use and the nature of the use.
This choice then determines the details of the preparation of the samples to be tested, the preparation of the
cultured cells, and the way in which the cells are exposed to the samples or their extracts.
At the end of the exposure time, the evaluation of the presence and extent of the cytotoxic effect is undertaken.
It is the intention of this part of ISO 10993 to leave open the choice of type of evaluation. Such a strategy
makes available a battery of tests, which reflects the approach of many groups that advocate in vitro biological
tests.
The numerous methods used and endpoints measured in cytotoxicity determination can be grouped into the
following categories of evaluation:
⎯ assessments of cell damage by morphological means;
⎯ measurements of cell damage;
⎯ measurements of cell growth;
⎯ measurements of specific aspects of cellular metabolism.
There are several means of producing results in each of these four categories. The investigator should be
aware of the test categories and into which category a particular technique fits, in order that comparisons be
able to be made with other results on similar devices or materials both at the intra- and interlaboratory level.
Examples of quantitative test protocols are given in annexes. Guidance for the interpretation of the results is
given in this part of ISO 10993.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 10993-5:2009(E)
Biological evaluation of medical devices —
Part 5:
Tests for in vitro cytotoxicity
1 Scope
This part of ISO 10993 describes test methods to assess the in vitro cytotoxicity of medical devices.
These methods specify the incubation of cultured cells in contact with a device and/or extracts of a device
either directly or through diffusion.
These methods are designed to determine the biological response of mammalian cells in vitro using
appropriate biological parameters.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 10993-1, Biological evaluation of medical devices — Part 1: Evaluation and testing within a risk
management system
ISO 10993-12, Biological evaluation of medical devices — Part 12: Sample preparation and reference
materials
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 10993-1 and the following apply.
3.1
culture vessels
vessels appropriate for cell culture including glass petri dishes, plastic culture flasks or plastic multiwells and
microtitre plates
NOTE These can be used interchangeably in these methods provided that they meet the requirements of tissue
culture grade and are suitable for use with mammalian cells.
3.2
positive control material
material which, when tested in accordance with this part of ISO 10993, provides a reproducible cytotoxic
response
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NOTE The purpose of the positive control is to demonstrate an appropriate test system response. For example, an
1)
organotin-stabilized polyurethane has been used as positive control for solid materials and extracts. Dilutions of phenol,
for example, have been used as a positive control for extracts. In addition to a material, pure chemicals can also be used
to demonstrate the performance of the test system.
3.3
blank
extraction vehicle not containing the test sample, retained in a vessel identical to that which holds the test
sample and subjected to conditions identical to those to which the test sample is subjected during its
extraction
NOTE The purpose of the blank is to evaluate the possible confounding effects due to the extraction vessel, vehicle
and extraction process.
3.4
negative control material
material which, when tested in accordance with this part of ISO 10993, does not produce a cytotoxic response
NOTE The purpose of the negative control is to demonstrate background response of the cells. For example,
2)
high-density polyethylene for synthetic polymers, and aluminium oxide ceramic rods for dental material have been used
as negative controls.
3.5
test sample
material, device, device portion, component, extract or portion thereof that is subjected to biological or
chemical testing or evaluation
3.6
subconfluency
approximately 80 % confluency, i.e. the end of the logarithmic phase of growth
4 Sample and control preparation
4.1 General
The test shall be performed on
a) an extract of the test sample
and/or
b) the test sample itself.
Sample preparation shall be in accordance with ISO 10993-12.
Negative and positive controls shall be included in each assay.
1) The ZDEC and ZDBC polyurethanes are available from the Food and Drug Safety Center, Hatano Research Institute,
Ochiai 729-5, Hadanoshi, Kanagawa 257, Japan.
2) High-density polyethylene can be obtained from the U.S. Pharmacopeia (Rockville, MD, USA) and from the Food and
Drug Safety Center, Hatano Research Institute (Ochiai 729-5, Hadanoshi, Kanagawa 257, Japan).
The information given in 1) and 2) is for the convenience of the user of this part of ISO 10993 and does not constitute an
endorsement by ISO of these products. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
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ISO 10993-5:2009(E)
4.2 Preparation of liquid extracts of material
4.2.1 Principles of extraction
Extracting conditions should attempt to simulate or exaggerate the clinical use conditions so as to determine
the potential toxicological hazard without causing significant changes in the test sample, such as fusion,
melting or any alteration of the chemical structure, unless this is expected during clinical application. Due to
the nature of certain materials (e.g. biodegradable materials), alteration of the chemical structure can occur
during the extraction procedure.
NOTE The concentration of any endogenous or extraneous substances in the extract, and hence the amount
exposed to the test cells, depends on the interfacial area, the extraction volume, pH, chemical solubility, diffusion rate,
osmolarity, agitation, temperature, time and other factors.
For devices that involve mixing two or more components in the patient to arrive at the final device (for example
bone cement), the final device should not be washed prior to extraction. Washing the test sample can reduce
or remove residuals present on the device. If the test sample is to be used in a sterile environment, a sterilized
test sample should be used to extract chemical constituents.
4.2.2 Extraction vehicle
The choice of the extraction vehicle(s) taking into account the chemical characteristics of the test sample shall
be justified and documented. For mammalian cell assays one or more of the following vehicles shall be used:
a) culture medium with serum;
b) physiological saline solution;
c) other suitable vehicle.
The choice of vehicle should reflect the aim of the extraction. Consideration shall be given to the use of both a
polar and a non-polar vehicle. Culture medium with serum is the preferred extraction vehicle. The use of
culture medium with serum is preferred for extraction because of its ability to support cellular growth as well as
extract both polar and non-polar substances. In addition to culture medium with serum, use of medium without
serum should be considered in order to specifically extract polar substances (e.g. ionic compounds). Other
suitable vehicles include purified water and dimethyl sulfoxide (DMSO). DMSO is cytotoxic in selected assay
systems at greater than 0,5 % (volume fraction). The cellular exposure concentration of extractables in DMSO
will be lower due to the greater dilution as compared to extraction in culture medium with serum.
NOTE 1 Different types of serum (e.g. foetal, bovine/calf serum, newborn calf serum) might be used and the choice of
the serum is dependent on the cell type.
NOTE 2 It is important to recognise that serum/proteins are known to bind, to some extent, extractables.
4.2.3 Extraction conditions
4.2.3.1 The extraction shall be performed in sterile, chemically inert, closed containers by using aseptic
techniques, in accordance with ISO 10993-12.
4.2.3.2 With the exception of circumstances given below, the extraction shall be conducted under one of
the following conditions and shall be applied according to the device characteristics and specific conditions for
use:
a) (24 ± 2) h at (37 ± 1) °C;
b) (72 ± 2) h at (50 ± 2) °C;
c) (24 ± 2) h at (70 ± 2) °C;
d) (1 ± 0,2) h at (121 ± 2) °C.
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Extraction conditions described above, which have been used to provide a measure of the hazard potential for
risk estimation of the device or material, are based on historical precedent. Other conditions, e.g. prolonged or
shortened extraction times at 37 °C, which simulate the extraction that occurs during clinical use or provide an
adequate measure of the hazard potential, may be used, but shall be justified and documented. For medical
devices that are in short-term contact (no greater than 4 h cumulative contact duration) with intact skin or
mucosa and that are not implanted, this may include extraction times of less than 24 h but no less than 4 h, as
given in a) to c).
Cell culture medium with serum should only be used in accordance with a) because extraction temperatures
greater than (37 ± 1) °C can adversely impact chemistry and/or stability of the serum and other constituents in
the culture medium.
For polymeric test samples, the extraction temperature should not exceed the glass transition temperature as
the higher temperature can change the extractant composition.
4.2.3.3 If the extract is filtered, centrifuged or processed by other methods prior to being applied to the
cells, these details shall be recorded in the final report along with a rationale for the additional steps (see
Clause 9). Any pH adjustment of the extract shall be reported. Manipulation of the extract, such as by pH
adjustment, should be avoided because it could influence the result.
4.3 Preparation of material for direct-contact tests
4.3.1 Form of test samples
Materials that have various shapes, sizes or physical states (i.e. liquid, gels, solids, etc.) may be tested
without modification in the cytotoxicity assays.
The preferred test sample of a solid material should have at least one flat surface. If not, adjustments shall be
made to achieve flat surfaces.
4.3.2 Sterility of test samples
4.3.2.1 Sterility of the test sample shall be taken into account.
4.3.2.2 Test samples from sterilized devices shall be handled aseptically throughout the test procedure.
4.3.2.3 Test samples from devices that are normally supplied non-sterile but are sterilized before use
shall be sterilized by the method recommended by the manufacturer and handled aseptically throughout the
test procedure.
The effect of sterilization methods or agents on the device should be considered in defining the preparation of
the test sample prior to use in the test system.
4.3.2.4 Test samples from devices not required to be sterile in use shall be used as supplied and handled
aseptically throughout the test procedure. It may be justifiable to sterilize the test material in order to avoid
microbial contamination of the cell culture; however, the sterilization process shall not alter the properties of
the test material.
If non-sterile test samples are used, they should be checked for bacterial contamination because the
contamination can lead to a false assessment of cytotoxicity.
4.3.3 Liquid test samples
Liquid test samples shall be tested by either
a) direct deposition
or
b) deposition on a biologically inert absorbent matrix.
Filter discs have been found to be suitable for use as inert absorbent matrices.
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4.3.4 Absorbent test samples
If appropriate, test samples that are absorbent shall be soaked with culture medium prior to testing to prevent
adsorption of the culture medium in the testing vessel.
4.4 Preparation of controls
Controls should be selected so that they can be prepared by the same procedure as the test sample.
5 Cell lines
3)
Established cell lines are preferred and where used shall be obtained from recognised repositories .
Where specific sensitivity is required, primary cell cultures, cell lines and organotypic cultures obtained directly
from living tissues shall only be used if reproducibility and accuracy of the response can be demonstrated.
If a stock culture of a cell line is stored, storage shall be at −80 °C or below in the corresponding culture
medium but containing a cryoprotectant, e.g. dimethylsulfoxide or glycerol. Long-term storage (several months
up to many years) is only possible at −130 °C or below.
Only cells free from mycoplasma shall be used for the test. Before use, stock cultures should be tested for the
absence of mycoplasma.
It is important to check cells regularly (e.g. morphology, doubling time, modal chromosome number) because
sensitivity in tests can vary with passage number.
Good cell culture practices should be used. See Reference [5].
6 Culture medium
The culture medium shall be sterile.
The culture medium with or without serum shall meet the growth requirements of the selected cell line.
Antibiotics may be included in the medium provided that they do not adversely affect the assays.
Storage conditions shall be validated.
NOTE The stability of the culture medium varies with the composition and storage conditions.
The culture medium shall be maintained at a pH of between 7,2 and 7,4.
3) For example, cell lines American Type Culture Collection CCL 1 (NCTC clone 929), CCL 163 (Balb/3T3 clone A31),
CCL 171 (MRC-5) and CCL 75 (WI-38), CCL 81 (Vero) and CCL 10 [BHK-21 (C-13)] and V-79 379A are endorsed by ISO
experts to be suitable.
This information is given for the convenience of the user of this part of ISO 10993 and does not constitute an endorsement
by ISO of the products named. Other cell lines may be used if they can be shown to lead to the same or more relevant
results.
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7 Preparation of cell stock culture
Using the chosen cell line and culture medium, prepare sufficient cells to complete the test. If the cells are to
be grown from cultures taken from storage, remove the cryoprotectant, if present. Subculture the cells at least
once before use.
When subculturing cells, remove and resuspend the cells by enzymatic and/or mechanical disaggregation
using a method appropriate for the cell line.
8 Test procedures
8.1 Number of replicates
A minimum of three replicates shall be used for test samples and controls.
8.2 Test on extracts
8.2.1 This test allows both qualitative and quantitative assessment of cytotoxicity.
8.2.2 Pipette an aliquot of the continuously stirred cell suspension into each of a sufficient number of
vessels for exposure to the extracts. Distribute the cells evenly over the surface of each vessel by gentle
rotation.
8.2.3 Incubate the cultures at (37 ± 1) °C in air with or without carbon dioxide as appropriate for the buffer
system chosen for the culture medium.
The test should be performed on a subconfluent monolayer or on freshly suspended cells.
In the colony-forming assay only an appropriate low cell density shall be used.
8.2.4 Verify the subconfluency and the morphology of the cultures with a microscope before starting the test.
In exceptional cases, exponentially growing cells (e.g. primary cells, high proliferating cells) may be seeded at
the starting point of the test.
8.2.5 Perform the test on
a) the original extract
and/or
b) the original extract and a dilution series of the extracts using the extract vehicle as diluent.
Alternatively, where materials of limited solubility are known or suspected to be present, dilution should be
achieved by varying the original extraction ratio of test sample to extraction medium.
If monolayers are used for the test, remove and discard the culture medium from the cultures and add an
aliquot of the extract or dilution thereof into each of the vessels.
If suspended cells are used for the test, add the extract or dilution thereof into each of the replicate vessels,
immediately after preparation of the cell suspension.
8.2.6 When a non-physiological extract is used, e.g. water, the extract shall be tested at the highest
physiologically compatible concentration after dilution in culture medium.
NOTE Concentrated culture medium, e.g. 2×, 5×, is recommended for use in diluting aqueous extracts.
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8.2.7 Add known aliquots of the blank and the negative and positive controls to additional replicate vessels.
NOTE A fresh culture medium control can also be tested, if appropriate.
8.2.8 Incubate the vessels using the same conditions as described in 8.2.3 for an appropriate interval
corresponding to the selected specific assay.
8.2.9 After an incubation period of at least 24 h, determine the cytotoxic effects in accordance with 8.5.
8.3 Test by direct contact
8.3.1 This test allows both qualitative and quantitative assessment of cytotoxicity.
8.3.2 Pipette a known aliquot of the continuously stirred cell suspension into each of a sufficient number of
vessels for direct exposure to the test sample. Distribute the cells evenly over the surface of each vessel by
gentle horizontal rotation.
8.3.3 Incubate the culture at (37 ± 1) °C in air, with or without carbon dioxide as appropriate for the buffer
system chosen for the culture medium, until the cultures have grown to subconfluency.
8.3.4 Verify the subconfluency and the morphology of the cultures with a microscope before starting the test.
In exceptional cases, exponentially growing cells (e.g. primary cells, high proliferating cells) may be seeded at
the starting point of the test.
8.3.5 Remove and discard the culture medium. Then add fresh culture medium to each vessel.
8.3.6 Carefully place individual specimens of the test sample on the cell layer in the centre of each of the
replicate vessels. Ensure that the specimen covers approximately one tenth of the cell layer surface.
Other ratios of specimen surface to cell layer surface may be used if justified.
Exercise care to prevent unnecessary movement of the specimens, as this could cause physical trauma to the
cells. For example, patches of dislodged cells can result from unnecessary movement.
NOTE When appropriate, the specimen can be placed in the culture vessel prior to the addition of the cells.
8.3.7 Prepare replicate vessels for both the negative control and positive control material.
8.3.8 Incubate the vessels under the same conditions as described in 8.3.3 for an appropriate interval (a
minimum of 24 h) corresponding to the selected specific assay.
8.3.9 Discard the supernatant culture medium before adding chemicals/dyes in order to determine the
cytotoxic effects in accordance with 8.5.
8.4 Test by indirect contact
8.4.1 Agar diffusion
8.4.1.1 This test allows a qualitative assessment of cytotoxicity. This assay is not appropriate for
leachables that cannot diffuse through the agar layer, or that may react with agar. The use of the agar
diffusion assay for the assessm
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 10993-5
Troisième édition
2009-06-01
Évaluation biologique des dispositifs
médicaux —
Partie 5:
Essais concernant la cytotoxicité in vitro
Biological evaluation of medical devices —
Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity
Numéro de référence
ISO 10993-5:2009(F)
©
ISO 2009
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Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . vi
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Préparation des échantillons et des contrôles. 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Préparation des extraits liquides de matériau.3
4.3 Préparation du matériau pour les essais en contact direct . 4
4.4 Préparation des contrôles . 5
5 Lignées cellulaires. 5
6 Milieu de culture. 6
7 Préparation de la culture cellulaire mère . 6
8 Modes opératoires d'essai. 6
8.1 Nombre d'exemplaires . 6
8.2 Essais à partir d'extraits . 6
8.3 Essai par contact direct . 7
8.4 Essai par contact indirect . 8
8.5 Détermination de la cytotoxicité . 9
9 Rapport d'essai . 11
10 Interprétation des résultats . 11
Annexe A (informative) Essai de cytotoxicité par fixation du rouge neutre (NRU) . 12
Annexe B (informative) Essai de cytotoxicité par formation de colonies . 19
Annexe C (informative) Essai de cytotoxicité au MTT. 24
Annexe D (informative) Essai de cytotoxicité au XTT . 29
Bibliographie . 34
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ISO 10993-5:2009(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 10993-5 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 194, Évaluation biologique des dispositifs
médicaux.
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 10993-5:1999), qui a fait l'objet d'une
révision technique.
L'ISO 10993 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Évaluation biologique des
dispositifs médicaux:
⎯ Partie 1: Évaluation et essais au sein d'un processus de gestion du risque
⎯ Partie 2: Exigences relatives à la protection des animaux
⎯ Partie 3: Essais concernant la génotoxicité, la cancérogénicité et la toxicité sur la reproduction
⎯ Partie 4: Choix des essais pour les interactions avec le sang
⎯ Partie 5: Essais concernant la cytotoxicité in vitro
⎯ Partie 6: Essais concernant les effets locaux après implantation
⎯ Partie 7: Résidus de stérilisation à l'oxyde d'éthylène
⎯ Partie 9: Cadre pour l'identification et la quantification des produits potentiels de dégradation
⎯ Partie 10: Essais d'irritation et de sensibilisation cutanée
⎯ Partie 11: Essais de toxicité systémique
⎯ Partie 12: Préparation des échantillons et matériaux de référence
⎯ Partie 13: Identification et quantification de produits de dégradation de dispositifs médicaux à base de
polymères
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⎯ Partie 14: Identification et quantification des produits de dégradation des céramiques
⎯ Partie 15: Identification et quantification des produits de dégradation issus des métaux et alliages
⎯ Partie 16: Conception des études toxicocinétiques des produits de dégradation et des substances
relargables
⎯ Partie 17: Établissement des limites admissibles des substances relargables
⎯ Partie 18: Caractérisation chimique des matériaux
⎯ Partie 19: Caractérisations physicochimique, morphologique et topographique des matériaux
[Spécification technique]
⎯ Partie 20: Principes et méthodes relatifs aux essais d'immunotoxicologie des dispositifs médicaux
[Spécification technique]
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Introduction
En raison de l'applicabilité générale des essais de cytotoxicité in vitro et de leur utilisation courante pour
l'évaluation de toute une variété de dispositifs et matériaux, l'objet de la présente partie de l'ISO 10993 est de
définir un schéma des essais qui nécessite la prise de décisions concernant une série de phases, plutôt que
de spécifier un essai unique. Cette démarche doit mener à la sélection de l'essai le plus approprié.
Trois catégories d'essais sont répertoriées: essai d'extrait, essai par contact direct, essai par contact indirect.
Le choix d'une ou de plusieurs de ces catégories dépend de la nature de l'échantillon à évaluer, du site
d'utilisation potentiel et de la nature de l'utilisation.
Ce choix détermine alors les détails de la préparation des échantillons à soumettre à essai, de la préparation
des cellules cultivées et la façon dont les cellules sont exposées aux échantillons ou à leurs extraits.
L'évaluation de la présence et de la mesure de l'effet cytotoxique est entreprise à la fin de la durée
d'exposition. L'intention de la présente partie de l'ISO 10993 est de laisser ouvert le choix du type d'évaluation.
Une telle stratégie laisse à disposition toute une batterie d'essais et reflète l'approche de nombreux groupes
qui recommandent des essais biologiques in vitro.
Les nombreuses méthodes employées et les points finaux mesurés lors de la détermination de cytotoxicité
peuvent être regroupés selon les différentes catégories d'évaluation suivantes:
⎯ évaluation des dommages cellulaires par des observations morphologiques;
⎯ mesurages des dommages cellulaires;
⎯ mesurages de la croissance cellulaire;
⎯ mesurages d'aspects particuliers du métabolisme cellulaire.
Il existe plusieurs moyens d'obtenir des résultats dans chacune de ces quatre catégories. Afin que des
comparaisons avec d'autres résultats intra- et interlaboratoires sur des dispositifs ou matériaux similaires
puissent être faites, il est préférable que l'investigateur connaisse les catégories d'essai à laquelle chaque
technique particulière appartient. Des exemples de protocoles d'essai quantitatif sont donnés dans les
annexes. Les directives d'interprétation des résultats sont données dans la présente partie de l'ISO 10993.
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NORME INTERNATIONALE ISO 10993-5:2009(F)
Évaluation biologique des dispositifs médicaux —
Partie 5:
Essais concernant la cytotoxicité in vitro
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO 10993 spécifie les méthodes d'essai d'évaluation de la cytotoxicité in vitro des
dispositifs médicaux.
Ces méthodes décrivent l'incubation des cellules cultivées en contact avec un dispositif et/ou des extraits de
dispositif, soit directement, soit par diffusion.
Elles sont conçues pour déterminer la réponse biologique in vitro des cellules de mammifère au moyen de
paramètres biologiques adaptés.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 10993-1, Évaluation biologique des dispositifs médicaux — Partie 1: Évaluation et essais au sein d'un
système de gestion du risque
ISO 10993-12, Évaluation biologique des dispositifs médicaux — Partie 12: Préparation des échantillons et
matériaux de référence
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l'ISO 10993-1, ainsi que les
suivants s'appliquent.
3.1
récipients de culture
récipients adaptés à la culture cellulaire tels que les boîtes de Petri en verre, les flacons de culture en
plastique ou les plaques multipuits et les plaques de microtitration en plastique
NOTE Dans ces méthodes, ces récipients de culture peuvent être utilisés de manière interchangeable tant qu'ils
satisfont aux exigences de classe de culture tissulaire et conviennent à la culture cellulaire de mammifère.
3.2
matériau de contrôle positif
matériau qui, soumis à essai conformément à la présente partie de l'ISO 10993, induit une réponse
cytotoxique reproductible
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NOTE L'objet du contrôle positif est de mettre en évidence une réponse adaptée à l'essai choisi. Par exemple, des
1)
polyuréthanes stabilisés à l'étain ont servi de contrôles positifs pour les matériaux solides et les extraits. Des dilutions de
phénol, par exemple, ont servi de contrôle positif pour les extraits. En plus des matériaux, des produits chimiques purs
peuvent aussi être utilisés pour démontrer la performance du système d'essai.
3.3
blanc
véhicule d'extraction ne contenant pas l'échantillon d'essai, contenu dans un récipient identique à celui
renfermant l'échantillon d'essai et soumis à des conditions identiques à ce dernier au cours de son extraction
NOTE L'objet du blanc est d'évaluer les effets trompeurs provoqués par le récipient d'extraction, le véhicule et le
processus d'extraction.
3.4
matériau de contrôle négatif
matériau qui, soumis à essai conformément à la présente partie de l'ISO 10993, n'induit pas de réponse
cytotoxique
NOTE L'objet du contrôle négatif est de mettre en évidence la réponse basale des cellules. Par exemple, du
2)
polyéthylène haute densité , dans le cas des polymères synthétiques, et des tiges de céramique à l'oxyde d'aluminium,
dans le cas des matériaux dentaires, ont servi de contrôles négatifs.
3.5
échantillon d'essai
matériau, dispositif, partie de dispositif, composant, extrait ou partie de composant soumis à des essais ou à
une évaluation biologique ou chimique
3.6
sous-confluence
environ 80 % de la confluence, c'est-à-dire la fin de la phase logarithmique de croissance
4 Préparation des échantillons et des contrôles
4.1 Généralités
L'essai doit être réalisé sur
a) un extrait de l'échantillon d'essai, et/ou
b) l'échantillon d'essai lui-même.
La préparation des échantillons doit être conforme à l'ISO 10993-12.
Des contrôles positif et négatif doivent être incorporés à chaque essai.
1) Les polyuréthanes ZDEC et ZDBC peuvent être obtenus auprès du Food and Drug Safety Center, Hatano Research
Institute, Ochiai 729-5, Hadanoshi, Kanagawa 257, Japon.
2) Le polyéthylène haute densité peut être obtenu auprès de la pharmacopée des États-Unis (Rockville, Maryland, USA)
et du Food and Drug Safety Center, Hatano Research Institute (Ochiai 729-5, Hadanoshi, Kanagawa 257, Japon).
Les informations données en 1) et 2) sont données à l'intention des utilisateurs de la présente partie de l'ISO 10993 et ne
signifient nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits
équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent aux mêmes résultats.
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4.2 Préparation des extraits liquides de matériau
4.2.1 Principes d'extraction
Il convient que les conditions d'extraction simulent ou exagèrent les conditions d'utilisation clinique du
matériau afin de définir le danger potentiel de toxicité sans induire de modifications significatives de
l'échantillon d'essai telles qu'une fusion, un ramollissement ou une altération de sa structure chimique, hors
de celles prévues lors de son utilisation clinique. En raison de la nature de certains matériaux (par exemple
les matériaux biodégradables), une altération de la structure chimique peut se produire au cours du mode
opératoire d'extraction.
NOTE La concentration de toute substance endogène ou exogène dans l'extrait, et donc la quantité de ces
substances mise au contact des cellules utilisées dans l'essai, dépendent de la surface de contact, du volume d'extraction,
du pH, de la solubilité chimique, de la vitesse de diffusion, de l'osmolarité, de l'agitation, de la température, de la durée et
d'autres facteurs.
Pour les dispositifs impliquant un mélange de deux ou de plusieurs composants chez le patient pour obtenir le
dispositif final (ciment à os), il est recommandé de ne pas rincer le dispositif final avant extraction. Le rinçage
du dispositif peut faire disparaître, partiellement ou totalement, les résidus présents sur le dispositif. Si
l'échantillon d'essai est destiné à une utilisation en environnement stérile, il convient d'utiliser un échantillon
d'essai stérilisé pour extraire les constituants chimiques.
4.2.2 Véhicule d'extraction
Le choix du (des) véhicule(s) d'extraction tenant compte des caractéristiques chimiques du matériau doit être
justifié et documenté. Pour les essais de cellules de mammifères, un ou plusieurs des véhicules suivants
doivent être utilisés:
a) milieu de culture avec sérum;
b) solution saline physiologique;
c) autre véhicule adapté.
Il convient que le choix du véhicule reflète l'objectif de l'extraction. L'utilisation d'un véhicule polaire et non
polaire doit aussi être prise en considération. Le milieu de culture avec sérum est le véhicule d'extraction
favori. Il est préféré pour l'extraction à cause de sa capacité à soutenir la croissance cellulaire ainsi qu'à
extraire des substances polaires et non polaires. En plus du milieu de culture avec sérum, il convient de
considérer l'emploi de milieu sans sérum afin d'extraire spécifiquement les substances polaires (par exemple
les composés ioniques). L'eau purifiée et le diméthylesulfoxyde (DMSO) sont également des véhicules
adaptés. Au-delà de 0,5 % (fraction volumique), dans certains systèmes d'essai, le DMSO est connu pour être
cytotoxique. La concentration d'exposition cellulaire des extractibles dans le DMSO sera inférieure à celle
d'une extraction en milieu de culture avec sérum, en raison de la dilution plus importante.
NOTE 1 Différents types de sérum peuvent être utilisés (par exemple sérum fœtal, sérum bovin/du veau, sérum du
veau nouveau-né) et le choix du sérum dépend du type de cellule.
NOTE 2 Il est important de ne pas oublier que le sérum/les protéines sont connus pour se lier, dans une certaine
mesure, aux substances extractibles.
4.2.3 Conditions d'extraction
4.2.3.1 L'extraction doit être effectuée dans des conteneurs stériles, chimiquement inertes et fermés, en
conditions d'asepsie, et en conformité avec l'ISO 10993-12.
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4.2.3.2 À l'exception des circonstances indiquées ci-dessous, l'extraction doit être menée dans l'une des
conditions suivantes et effectuée conformément aux caractéristiques du dispositif et à ses conditions
d'utilisation:
a) (24 ± 2) h à (37 ± 1) °C;
b) (72 ± 2) h à (50 ± 2) °C;
c) (24 ± 2) h à (70 ± 2) °C;
d) (1 ± 0,2) h à (121 ± 2) °C.
Les conditions d'extraction décrites ci-dessus, qui ont servi à établir une mesure du danger potentiel pour
l'estimation du risque du dispositif ou matériau, sont fondées sur des données historiques. D'autres conditions,
par exemple des temps d'extraction à 37 °C rallongés ou raccourcis, stimulant l'extraction se déroulant au
cours de l'utilisation clinique ou fournissant une mesure adéquate du potentiel de danger, peuvent aussi être
utilisées; mais elles doivent être justifiées et documentées. Pour les dispositifs médicaux n'entrant que peu de
temps (pas plus de 4 h) en contact avec la peau ou les muqueuses intactes et non implantés, cela peut
comprendre des temps d'extraction inférieurs à 24 h mais supérieurs à 4 h, comme indiqué de a) à c).
Il convient que le milieu de culture cellulaire avec sérum ne soit utilisé que conformément à a) car des
températures d'extraction supérieures à (37 ± 1) °C peuvent agir de façon négative sur la chimie et/ou la
stabilité du sérum et d'autres constituants du milieu de culture.
Pour les échantillons d'essai polymériques, il est recommandé que la température d'extraction ne dépasse
pas la température de transition vitreuse car une température plus élevée peut changer la composition du
solvant d'extraction.
4.2.3.3 Si l'extrait est filtré, centrifugé ou traité par d'autres méthodes avant d'être mis en contact avec les
cellules, tous ces détails doivent être consignés dans le rapport final, accompagnés des raisons des
manipulations supplémentaires (voir Article 9). Tout ajustement de pH de l'extrait doit être signalé. Il convient
que les manipulations de l'extrait, telles que les ajustements de pH, soient évitées parce qu'elle peuvent
influer sur le résultat.
4.3 Préparation du matériau pour les essais en contact direct
4.3.1 Les matériaux ayant des formes, des tailles ou des états physiques variés (liquide, solide, gels, etc.)
peuvent être soumis à essai sans modification des essais de cytotoxicité.
Il est recommandé que l'échantillon d'essai d'un matériau solide ait au moins une surface plane. Sinon, des
ajustements doivent être faits pour obtenir des surfaces planes.
4.3.2 Stérilité des échantillons d'essai
4.3.2.1 La stérilité de l'échantillon d'essai doit être prise en compte.
4.3.2.2 Les échantillons d'essai issus de dispositifs stérilisés doivent être manipulés en asepsie tout au
long de la réalisation de l'essai.
4.3.2.3 Les échantillons d'essai issus de dispositifs normalement fournis non stériles mais devant être
stérilisés avant utilisation doivent être stérilisés selon la méthode recommandée par le fabricant et manipulés
en asepsie tout au long de la réalisation de l'essai.
Il convient que les effets des méthodes ou des agents de stérilisation sur le dispositif soient pris en compte
lors de la définition de la préparation de l'échantillon d'essai avant sa mise en œuvre dans le système d'essai
choisi.
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4.3.2.4 Les matériaux d'essai issus de dispositifs n'ayant pas besoin d'être stérilisés avant utilisation
doivent être employés tels qu'ils sont fournis et manipulés en asepsie tout au long de la réalisation de l'essai.
La stérilisation de l'échantillon d'essai afin d'éviter toute contamination microbienne de la culture de cellules
peut être justifiée; toutefois, le procédé de stérilisation ne doit pas modifier les propriétés du matériau d'essai.
Si des échantillons d'essai non stériles sont utilisés, il convient que l'absence de contamination bactérienne
sur ceux-ci soit vérifiée car elle peut produire une fausse évaluation de la cytotoxicité.
4.3.3 Échantillons d'essai liquides
Les échantillons d'essai liquides doivent être soumis à essai
a) par apposition directe, ou
b) par apposition sur une matrice absorbante biologiquement inerte.
Les disques pour filtration ont été considérés comme des matrices absorbantes inertes convenables.
4.3.4 Échantillons d'essai absorbants
Le cas échéant, les échantillons d'essai absorbants doivent être imbibés de milieu de culture avant l'essai afin
d'empêcher l'adsorption du milieu de culture dans le récipient d'essai.
4.4 Préparation des contrôles
Il est recommandé que les contrôles soient choisis de sorte à pouvoir être préparés selon le même mode
opératoire que l'échantillon d'essai.
5 Lignées cellulaires
Les lignées cellulaires établies sont préférées et, lorsqu'elles sont utilisées, doivent être obtenues à partir de
3)
sources reconnues .
Lorsqu'une sensibilité spécifique est nécessaire, des cultures primaires, des lignées cellulaires et des cultures
organotypiques obtenues directement à partir de tissus vivants ne doivent être utilisées que si la
reproductibilité et la précision de la réponse peuvent être démontrées.
Si une culture mère d'une lignée cellulaire est conservée, le stockage doit se faire à −80 °C ou moins, dans le
milieu de culture correspondant, en présence d'un cryoprotecteur tel que du diméthylsulfoxyde ou du glycérol.
Un stockage de longue durée (plusieurs mois à plusieurs années) n'est possible qu'à −130 °C ou moins.
Seules les cellules dépourvues de mycoplasme peuvent être utilisées pour l'essai. Avant utilisation, il convient
de vérifier l'absence de mycoplasme dans les cultures mères.
Il est important de contrôler régulièrement les cellules (par exemple leurs morphologie, temps de doublement,
nombre de chromosomes modal) car la sensibilité dans les essais peut varier avec le nombre de passages.
Il convient d'employer les bonnes pratiques de culture cellulaire. Voir Référence [5].
3) Par exemple les lignées de cellules American Type Culture Collection CCL 1 (NCTC clone 929), CCL 163 (Balb/3T3
clone A31), CCL 171 (MRC-5) et CCL 75 (WI-38), CCL 81 (Vero) et CCL 10 [BHK-21 (C 13)] et V-79 379A sont
recommandées par les experts de l'ISO comme adaptées.
Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente partie de l'ISO 10993 et ne signifie nullement que
l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné. D'autres lignées cellulaires peuvent être
utilisées s'il est démontré qu'elles conduisent aux mêmes résultats ou à des résultats meilleurs.
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6 Milieu de culture
Le milieu de culture doit être stérile.
Le milieu de culture, avec ou sans sérum, doit satisfaire aux exigences de croissance de la lignée choisie.
Des antibiotiques peuvent être ajoutés au milieu, à condition qu'ils n'aient pas d'incidence négative sur les
essais.
Les conditions de stockage doivent être validées.
NOTE La stabilité du milieu de culture varie avec sa composition et ses conditions de stockage.
Le milieu de culture doit être conservé à un pH compris entre 7,2 et 7,4.
7 Préparation de la culture cellulaire mère
En utilisant la lignée cellulaire et le milieu de culture choisis, préparer assez de cellules pour réaliser l'essai. Si
les cellules à faire croître proviennent de cultures qui étaient stockées, éliminer le cryoprotecteur, s'il est
présent. Repiquer les cellules au moins une fois avant utilisation.
Lors du repiquage, détacher et mettre les cellules en suspension par désagrégation enzymatique et/ou
mécanique, selon la méthode adaptée à la lignée cellulaire.
8 Modes opératoires d'essai
8.1 Nombre d'exemplaires
Un minimum de trois exemplaires doit être utilisé pour les échantillons d'essai et les contrôles.
8.2 Essais à partir d'extraits
8.2.1 Cet essai permet d'évaluer la cytotoxicité à la fois de façon qualitative et quantitative.
8.2.2 Dans la suspension cellulaire continuellement agitée, pipetter une aliquote et la transférer dans
chacun des récipients en nombre suffisant pour réaliser l'exposition des extraits. Répartir uniformément les
cellules à la surface de chaque récipient par une rotation douce.
8.2.3 Mettre les cultures à incuber à (37 ± 1) °C dans de l'air supplémenté ou non de dioxyde de carbone
selon le système tampon sélectionné pour le milieu de culture.
Il est recommandé que l'essai soit réalisé sur une monocouche sous-confluente ou sur des cellules venant
d'être mises en suspension.
Pour l'essai de formation de colonies, seule une densité cellulaire faible appropriée doit être utilisée.
8.2.4 Avant de commencer l'essai, vérifier la sous-confluence et la morphologie des cultures au microscope.
Dans des cas exceptionnels, il est permis d'ensemencer des cellules à croissance exponentielle (par exemple
des cellules primaires, des cellules à forte prolifération) au départ de l'essai.
8.2.5 Réaliser l'essai sur
a) l'extrait pur, et/ou
b) l'extrait pur et une série de dilutions de l'extrait, en utilisant le véhicule d'extraction comme diluant.
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Autrement, lorsqu'on soupçonne la présence de matériaux à solubilité limitée, il co
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.