ISO 8199:2005
(Main)Water quality - General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture
Water quality - General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture
ISO 8199:2005 presents guidance for carrying out manipulations which are common to each technique for the microbiological examination of water, particularly the preparation of samples, culture media and apparatus. It also describes the various enumeration techniques available and the criteria for the choice of a particular technique. It is mainly intended for bacteria, yeasts and moulds. Some aspects are also applicable to viruses and parasites.
Qualité de l'eau — Lignes directrices générales pour le dénombrement des micro-organismes sur milieu de culture
L'ISO 8199:2005 présente des lignes directrices concernant des manipulations communes à chaque technique d'examen microbiologique de l'eau, en particulier la préparation des échantillons, les milieux de culture et l'appareillage. Elle décrit également les diverses techniques de dénombrement possibles et les critères de choix d'une technique particulière. Elle concerne principalement les bactéries, les levures et les champignons. Certains aspects peuvent aussi s'appliquer aux virus et aux parasites.
General Information
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Frequently Asked Questions
ISO 8199:2005 is a standard published by the International Organization for Standardization (ISO). Its full title is "Water quality - General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture". This standard covers: ISO 8199:2005 presents guidance for carrying out manipulations which are common to each technique for the microbiological examination of water, particularly the preparation of samples, culture media and apparatus. It also describes the various enumeration techniques available and the criteria for the choice of a particular technique. It is mainly intended for bacteria, yeasts and moulds. Some aspects are also applicable to viruses and parasites.
ISO 8199:2005 presents guidance for carrying out manipulations which are common to each technique for the microbiological examination of water, particularly the preparation of samples, culture media and apparatus. It also describes the various enumeration techniques available and the criteria for the choice of a particular technique. It is mainly intended for bacteria, yeasts and moulds. Some aspects are also applicable to viruses and parasites.
ISO 8199:2005 is classified under the following ICS (International Classification for Standards) categories: 07.100.20 - Microbiology of water. The ICS classification helps identify the subject area and facilitates finding related standards.
ISO 8199:2005 has the following relationships with other standards: It is inter standard links to ISO 8199:2018, ISO 8199:1988. Understanding these relationships helps ensure you are using the most current and applicable version of the standard.
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 8199
Second edition
2005-06-15
Corrected version
2005-12-15
Water quality — General guidance on the
enumeration of micro-organisms by
culture
Qualité de l'eau — Lignes directrices générales pour le dénombrement
des micro-organismes sur milieu de culture
Reference number
©
ISO 2005
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Contents Page
Foreword. iv
Introduction . vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Principle. 1
4 General. 1
5 Diluents and culture media. 2
6 Sterilization of apparatus and glassware. 5
7 Samples . 5
8 Enumeration after inoculation of test portions of the sample in (or on) solid media . 6
9 Enumeration by inoculation in liquid media . 15
Annex A (informative) Criteria for the choice of enumeration technique. 22
Annex B (informative) MPN tables. 27
Bibliography . 37
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 8199 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,
Microbiological methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 8199:1988), which has been technically revised.
This corrected version of ISO 8199:2005 incorporates the following major corrections:
5.2.5 [item b), 4th paragraph] moved the 2nd sentence, “If the solution.”, to the paragraph under
“Preparation”;
8.4.2 (Example 1) replaced “and if V is per ml:” with “and if V is 1 ml”;
s s
8.4.2 (Example 2) replaced “and if V is per ml:” with “and if V is 100 ml”;
s s
8.4.3 (example) replaced “and if V is per ml” with “and if V is 1 ml”; and
s s
Bibliography corrected References [14], [16], [17] and [19].
The equations in 8.4.2 and 9.5.2.1 were numbered, which resulted in the following changes:
8.4.2 (unnumbered equations) numbered as Equation (3) and Equation (4);
8.4.3 (equation) renumbered as Equation (5);
8.4.4.1 (equation) renumbered as Equation (6);
9.5.2.1 (unnumbered equation) numbered as Equation (7);
9.5.2.2 (equation) renumbered as Equation (8);
9.6.2 (equation) renumbered as Equation (9); and
9.6.3 (equation) renumbered as Equation (10).
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Several minor corrections were made, including the following:
8.2.3.2 (paragraph 3) replaced “melted” with “molten”;
8.4.2 [under Equation (2)] in the explanation of the symbols “d , d ,., d”, deleted the word
1 2 i
“portion”;
9.3.3 (last paragraph, 7th line) added “wells” after “12 × 5 ml” and “24 × 3 ml”;
9.5.3.2 (example) in the equation at the end of the example, replaced
“1,61/(5 ml) × 100 ml” with “(1,61/5 ml) × 100 ml”;
9.5.3.3 (paragraph 2, 5th line) added parentheses around “3 or 5”;
A.2.1, A.2.2 replaced “uncertainty in” with “uncertainty of”; and
A.2.3.1 replaced “an accepted” with “the accepted”; and “error in” with “error
of”.
Introduction
Techniques for the isolation and enumeration of micro-organisms, based on their ability to grow on specified
culture media, are an important and widely used means of assessing the microbiological quality of water. The
purpose of this guide is to gather in a single document the information common to the various enumeration
techniques so as to avoid repetition of technical details in individual standards and to facilitate the choice of
the technique most suitable for a particular problem.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 8199:2005(E)
Water quality — General guidance on the enumeration of micro-
organisms by culture
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This standard does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with
its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to
ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this International
Standard be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This International Standard presents guidance for carrying out manipulations which are common to each
technique for the microbiological examination of water, particularly the preparation of samples, culture media
and apparatus. It also describes the various enumeration techniques available and the criteria for the choice
of a particular technique. This International Standard is mainly intended for bacteria, yeasts and moulds.
Some aspects are also applicable to viruses and parasites.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis
3 Principle
The general principle of these techniques consists of inoculating a known volume of a water sample on or into
a culture medium (solid or liquid). It is assumed that after incubation each micro-organism present multiplies,
giving either a colony visible directly on the solid medium, or changes in observable properties of the liquid
medium. The choice of a particular method depends not only on the nature of the micro-organisms sought, but
also on the nature of the water and the reasons for the examination.
4 General
Uniformity of temperatures and (incubation) times: The following accepted ranges of temperatures and times
during incubation or storage are applied, when appropriate for the intended target organism, and unless
otherwise stated in the specific standard.
Storage temperatures:
(− 70 ± 10) °C; (− 20 ± 5) °C; (5 ± 3) °C;
Incubation temperatures:
(22 ± 2) °C; (36 ± 2) °C;
Sterilization temperatures:
(115 ± 3) °C; (121 ± 3) °C; (170 ± 10) °C;
Incubation times:
(21 ± 3) h; (44 ± 4) h; (68 ± 4) h.
Other times and temperatures may be specified for specific methods when necessary.
The upper incubation temperature limits are very strict (they can have large influences on the growth). The
lower temperature limits may be exceeded for short periods, e.g. due to opening the door of an incubator, but
recovery shall be rapid.
Tolerances on volumes and masses: Unless otherwise stated, the accepted range of any measured value is:
stated value ± 5 %.
5 Diluents and culture media
5.1 General
5.1.1 Quality requirements
Use constituents of uniform quality and analytical-grade chemicals for the preparation of media. Other grades
of chemical may be used provided they can be shown to produce the same results. Alternatively, dehydrated
complete media or diluents may be used. Follow the manufacturer's instructions strictly.
Use glass-distilled or demineralized water which is free from substances that might affect growth of micro-
organisms under the test conditions. The water shall comply with the requirements of ISO 3696:1987, grade 3.
Unless otherwise stated, the ingredients are added to the volume of water instead of making up to a certain
volume, as is normal in the preparation of microbiological culture media.
Before use, check the quality of the media, diluents and filters, e.g. by following the procedures described in
ISO 7704, ISO/TS 11133-1 or ISO/TS 11133-2.
5.1.2 Sterilization
Dispense diluents and culture media in containers suitable for sterilization by autoclaving. For most purposes,
a temperature of (121 ± 3) °C for 15 min is adequate. However, a different time and temperature may
sometimes be required and details are given in each individual standard.
Alternatively, with thermolabile substances, removal of micro-organisms may be effected by filtration through a
filter with a pore size of 0,2 µm, specified by the manufacturer as being suitable for “sterilization”.
5.2 Diluents
The diluents given in this subclause are commonly used in water microbiology. However, the list is not
exhaustive and other appropriate diluents may be used.
After preparation, distribute each solution into bottles and sterilize, e.g. by autoclaving at (121 ± 3) °C for
15 min. Alternatively, the diluent can be aseptically distributed after sterilization. Store at room temperature or
in a refrigerator at (5 ± 3) °C for a maximum of 6 months. If a diluent shows any change from its normal
appearance, discard it.
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5.2.1 Saline solution
Composition
Sodium chloride (NaCl) 8,5 g
Water (see 5.1.1) 1 000 ml
Preparation
Dissolve the ingredients in the water, if necessary by heating. Adjust the pH by adding sodium hydroxide
solution [c(NaOH) = 1 mol/l] or hydrochloric acid [c(HCI) = 1 mol/l] so that, after sterilization (see 5.1.2), it will
correspond to 7,0 ± 0,5 at 25 °C.
5.2.2 Peptone diluent
Composition
Enzymatic digest of casein (peptone) 1,0 g
Water (see 5.1.1) 1 000 ml
Preparation
Dissolve the ingredients in the water, if necessary by heating. Adjust the pH by adding sodium hydroxide
solution [c(NaOH) = 1 mol/l] or hydrochloric acid [c(HCl) = 1 mol/l] so that, after sterilization (see 5.1.2), it will
correspond to 7,0 ± 0,5 at 25 °C.
5.2.3 Peptone saline solution
Composition
Enzymatic digest of casein (peptone) 1,0 g
Sodium chloride (NaCl) 8,5 g
Water (see 5.1.1) 1 000 ml
Preparation
Dissolve the ingredients in the water, if necessary by heating. Adjust the pH by adding sodium hydroxide
solution [c(NaOH) = 1 mol/l] or hydrochloric acid [c(HCI) = 1 mol/l] so that, after sterilization (see 5.1.2), it will
correspond to 7,0 ± 0,5 at 25 °C.
5.2.4 Ringer's solution, quarter-strength
Composition
Sodium chloride (NaCl) 2,25 g
Potassium chloride (KCl) 0,105 g
Calcium chloride (anhydrous) (CaCl ) 0,12 g
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO ) 0,05 g
Water (see 5.1.1) 1 000 ml
Preparation
Dissolve the ingredients in the water, if necessary by heating. Adjust the pH by adding sodium hydroxide
solution [c(NaOH) = 1 mol/l] or hydrochloric acid [c(HCI) = 1 mol/l] so that, after sterilization (see 5.1.2), it will
correspond to 7,0 ± 0,2 at 25 °C.
5.2.5 Phosphate buffer solution
a) Phosphate solution
Composition
Potassium dihydrogen orthophosphate (KH PO ) 34 g
2 4
Water (see 5.1.1) to 1 000 ml
Preparation
Dissolve the potassium dihydrogen orthophosphate in 500 ml of the water. Adjust the pH to a value of
7,2 ± 0,2 by adding sodium hydroxide solution [c(NaOH) = 1 mol/l] or hydrochloric acid [c(HCI) = 1 mol/l]. Add
more water up to 1 000 ml. If the solution needs to be stored, sterilize it (see 5.1.2) before storage.
b) Magnesium chloride solution
Composition
Magnesium chloride (MgCI ) 38 g
Water (see 5.1.1) 1 000 ml
Alternatively, an equivalent mass (99 g) of magnesium sulfate (MgSO .7H O) may be used.
4 2
Preparation
Dissolve the magnesium chloride in the water. If the solution needs to be stored, sterilize it (see 5.1.2) before
storage.
c) Final solution
Composition
Phosphate solution (a) 1,25 ml
Magnesium chloride solution (b) 5,0 ml
Water (see 5.1.1) 1 000 ml
Preparation
Add the phosphate solution (a) and the magnesium chloride solution (b) to the water, dispense in convenient
volumes and sterilize (see 5.1.2). The final pH should correspond to 7,0 ± 0,2 at 25 °C.
5.3 Culture media
Once a bottle of dehydrated medium (chemical) is opened, date the container and indicate a maximum
storage time.
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In general, most media after sterilization in sealed containers may be stored satisfactorily for several months
at room temperature provided they are kept in the dark and remain sealed. Media dispensed aseptically may
be stored at (5 ± 3) °C for up to 1 month, or longer if approved. Before use, inspect them carefully for
contamination, excessive evaporation, or other evidence of deterioration. Most reagents are best kept at
(5 ± 3) °C. Use culture media supplied pre-poured in accordance with the manufacturer's instructions.
Pre-cool the medium to 45 °C to 50 °C if heat-sensitive supplements need to be added after autoclaving.
6 Sterilization of apparatus and glassware
Sterilize apparatus and glassware which are not supplied sterile by one of the following methods:
a) in an oven, at (170 ± 10) °C for at least 1 h (excluding pre-heating time);
b) in an autoclave, at (121 ± 3) °C for at least 15 min.
If membrane filters are not obtained sterile, sterilize them before use in accordance with the manufacturer's
instructions.
7 Samples
7.1 Sampling
Take samples in accordance with ISO 19458.
7.2 Preparation of test sample
Before examination, mix the sample thoroughly by vigorous agitation to achieve uniform distribution of micro-
organisms and, depending on the nature of the water and the microbial content anticipated, make any
dilutions necessary at this stage.
In the case of plate counts, decimal dilutions can be used. For membrane filtration (with a smaller surface
area), smaller dilution steps are recommended.
For ten-fold dilutions, measure 90 ml or 9 ml of the diluent into sterile dilution bottles or tubes. Alternatively,
volumes of diluent, pre-sterilized in screwcapped bottles, can be used. One or more ten-fold dilutions are
made by transferring one volume of water sample to nine volumes of diluent. Mix the solution thoroughly (with
a fresh pipette or by mechanical means) and transfer one volume of this dilution to another nine volumes of
diluent. These steps are repeated as many times as required. Prepare sufficient volumes of each dilution for
all the tests to be carried out on the sample.
For dilutions other than ten-fold, the volume of diluent to volume of sample shall be adjusted accordingly.
Various approaches can be taken, i.e. 3- or 4-fold dilution series, or decimal dilution series of which both 10 ml
and 30 ml volumes are filtered. Four-fold dilutions can be made as described above for ten-fold dilutions,
except that, in this case, one volume of water sample is mixed with three volumes of diluent.
If the concentration of the target organism is expected to be high, hundred-fold dilution steps can be used.
For general guidance on the preparation of ten-fold dilutions, see ISO 6887-1.
8 Enumeration after inoculation of test portions of the sample in (or on) solid media
8.1 Principle
A test portion of the water sample, or a dilution, is inoculated either directly or concentrated on a membrane
on the surface of a specified solid culture medium or in a molten medium so that, on incubation, micro-
organisms form colonies either on or in the medium.
For practical purposes, each colony is considered to have originated from a single micro-organism or a clump
of micro-organisms present in the test portion at the moment of inoculation. Taking into account the volume of
the test portion and the number of colonies formed, the result can therefore be expressed as a number of
colony-forming units (cfu) or colony-forming particles (cfp) in a given volume of the sample, e.g. 1 ml or 100 ml.
8.2 Procedures
8.2.1 General
Three main procedures may be used for the inoculation of solid media.
a) Pour plate technique.
The test portion is mixed with the medium, which has previously been melted and cooled to a temperature
close to that of solidification; after incubation, the colonies that develop within and on the surface of the
medium are counted.
b) Spread plate technique.
The test portion is spread over the dry surface of an agar medium and, after incubation, colonies that develop
on its surface are counted.
c) Membrane filtration technique.
The test portion is passed through a membrane filter, which retains the micro-organisms sought; the
membrane is then placed on an agar medium or on an absorbent pad impregnated with liquid or rehydrated
medium. On incubation, colonies form on the surface of the membrane. Alternatively, for certain organisms,
such as anaerobes, the membrane may be placed face downwards in a Petri dish and overlaid with molten
agar medium.
8.2.2 Choice of technique
The choice of technique depends on several factors, including the physical and chemical characteristics of the
water as well as the nature of the micro-organisms sought (see Annex A, Clause A.3), their probable
concentration, the effective recovery of stressed or (sub-lethally) injured micro-organisms, the test precision
and the sensitivity required. Indications are given in 8.2.3.1, 8.2.4.1 and 8.2.5.1 of the volumes of water
samples that can be used for each technique and the limits of detection are discussed in Clause A.2. The
accuracy of the techniques is also discussed in Clause A.2. The requirements of regulations may also
influence the choice of technique to be used by indicating, for example, the precision desired or whether the
presence or absence of an organism in a specified test volume will be sufficient.
8.2.3 Pour plate technique
8.2.3.1 Test portion
The volume of the test portion of the sample, or of a dilution of the sample, can vary between 0,1 ml and 5 ml,
depending on the size of the Petri dish and the volume of culture medium used. The dilution should be chosen
so that the expected number of typical colonies formed on plates of diameter 90 mm to 100 mm is between
about 10 and 150. The total number of colonies on the plate (typical and non-typical) should be less than 300
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(see ISO 7218). Note, however, that the total number of countable colonies depends on the size of the
colonies and the number may have to be reduced for large colonies.
8.2.3.2 Inoculation
Melt the medium required in boiling water or by any other suitable process (e.g. an appropriate air incubator, a
steam flow-through autoclave or a microwave oven, if the heating time/temperature combination has been
validated for the medium preparation). Avoid over-heating and remove the medium as soon as it has been
melted. Place the molten medium in a water bath at (45 ± 1) °C for sufficient time so that the medium will
equilibrate to this temperature. It is preferable not to keep a medium molten for more than 4 h. Do not melt
agar media more than once.
Prepare and mark the Petri dishes required. Make any dilutions necessary in accordance with 7.2. Distribute,
after thorough mixing, the test portions into the dishes.
Remove each tube or flask of molten medium in turn from the water bath, dry the outside of the tube or flask
and flame the neck. Add the medium to each Petri dish without delay, avoiding the test portion to minimize
heat shock, and mix carefully so as to obtain a uniform distribution of micro-organisms. Generally, 15 ml of
medium is used for a test portion of 1 ml or 2 ml; for larger test portions, adjust the concentration of the
medium accordingly. Leave the plates to cool on a horizontal surface in order to allow the agar to solidify. As
soon as the agar has solidified, incubate the plates in accordance with 8.2.6.
NOTE Agar preparator pourer-stacker systems can be useful in laboratories analysing large numbers of samples.
8.2.4 Spread plate technique
8.2.4.1 Test portion
For a Petri dish of between 90 mm and 100 mm diameter, the volume of the test portion of the sample, or of a
dilution of the sample, should be 0,1 ml to 0,5 ml. Choose the dilution so that the expected number of typical
colonies formed lies between about 10 and 150. The total number of colonies on the plate (typical and non-
typical) should be less than 200. Note, however, that the total number of countable colonies depends on the
size of the colonies and the number may have to be reduced for large colonies.
8.2.4.2 Inoculation
Prepare and mark plates, each containing about 15 ml of culture medium. Dry the surface of the medium
before use (if necessary). Pipette the test portion on to the surface of the medium and spread over the surface
with a sterile rod or mechanical device. After absorption of the inoculum, incubate the plates in accordance
with 8.2.6.
For the drying of the plates the following points are of importance:
The degree of humidity in culture media is important because optimum growth of bacteria will depend on
the humidity conditions in and on the medium. Extensive humidity loss may lead, for example, to an
increase in the concentrations of inhibitors in selective culture media and a reduction in the water activity
at the surface of the medium.
When bacteria that do not spread rapidly are cultured, and the plates look dry after acclimatization, the
circumstances are such that drying is not always necessary. In that case, drying can be omitted, as it only
increases the likelihood of contamination and unnecessary humidity loss.
Select the temperature and drying time so that the likelihood of contamination is kept as low as possible
and heating will not negatively affect the quality of the culture medium. The drying time will depend on the
degree to which condensation is present in the Petri dish, but shall be kept as short as possible.
In order to avoid contamination, and if the plates are not dried in a laminar-flow cabinet, plates shall always be
dried with the surface of the culture medium to be inoculated turned downwards.
In practice, the plates will be dried by placing them with the agar surfaces downwards and with half-open lids
in an incubator set at a temperature between 25 °C and 50 °C. Dry the plates until the droplets have
disappeared from the surface of the lids. Do not dry any further. The agar plates can also be dried (in the
same way as described above) in a laminar-flow safety cabinet (at room temperature) for 30 min to 60 min, or
overnight at room temperature with the lids in place.
8.2.5 Membrane filtration technique
8.2.5.1 Test portion
The maximum volume of the test portion depends on the filterability of the water sample and on the
membranes used. This technique is suitable for waters that contain little particulate or colloidal (e.g. iron)
matter in suspension, for example drinking water. With membranes of mean pore size 0,45 µm, it may be
possible to filter several litres of such water through a single membrane, and so achieve a high level of test
sensitivity. For some organisms (like Legionella), however, filtration through a membrane with a mean pore
size of 0,2 µm may be necessary.
A test volume of the sample or a dilution of it should be chosen so that the expected number of typical
colonies formed on a membrane of 47 mm to 50 mm in diameter is between about 10 and 100. The total
number of colonies on the filter (typical and non-typical) should be less than about 200. Note, however, that
the total number of countable colonies depends on the size of the colonies and the number may have to be
reduced for large colonies.
8.2.5.2 Filtration
Connect the sterile filtration apparatus to a source of vacuum. Place a sterile membrane filter, grid-side
upwards, on the porous disc of the filter base, with only the outer part of the membrane filter being grasped by
flat-ended sterile forceps. Position the sterile funnel securely on the filter base. Pipette or pour one of the
following into the funnel (with the vacuum stopcock turned off):
a) a known volume of the sample, or dilution of it, carefully mixed (at least 10 ml);
b) the contents of a flask or bottle containing the test portion and sufficient diluent to bring the total volume
to at least 10 ml;
c) at least 10 ml of diluent, to which the test portion, measured with a pipette, is added directly and mixed
with the pipette.
Open the stopcock and apply sufficient vacuum (about 70 kPa) to filter the water through the membrane.
Close the stopcock as soon as the sample has been filtered. It may be advisable to rinse the funnel by filtering
one to three 10 ml to 30 ml portions of sterile diluent while the filter is still in place.
8.2.5.3 Transfer of membrane
Remove the funnel (make sure the stopcock is closed before doing this) and transfer the membrane with
sterile forceps to one of the following, ensuring that no air bubbles are trapped between the membrane and
the medium:
a) an agar medium in a Petri dish;
b) a sterile absorbent pad previously saturated with a liquid medium, or a dehydrated medium pad
reconstituted with sterile water, in a Petri dish (to avoid any confluent growth, pour off any excess medium,
preferably before placing the membrane on the pad);
c) a Petri dish, or on to a little agar medium in a Petri dish, subsequently overlaying the membrane with
molten agar medium at (45 ± 1) °C.
8 © ISO 2005 – All rights reserved
For different volumes of the same sample, the funnel may be re-used without disinfection provided that the
smallest volumes and/or the most diluted sample are filtered first. To filter another sample, either use a
separate sterile apparatus or disinfect the funnel, for example by flaming. Alternatively, follow the
manufacturer's instructions for disinfection.
8.2.6 Incubation
Invert the inoculated plates and place them either in an incubator or in a water-tight container in a water bath.
If necessary, pack the plates in plastic (bags) to prevent desiccation of the medium (e.g. when a fan-assisted
incubator is used). Plates containing membranes on absorbent pads should be placed (not inverted) in an air-
or water-tight container to prevent desiccation of the medium, if necessary. Do not make higher stacks than
6 Petri dishes to ensure that all plates reach incubation temperature rapidly.
Choose the duration and temperature of incubation by consulting a standard method, as they depend on the
micro-organism, or groups of micro-organisms, sought.
Incubation may be carried out in two stages, as follows:
Pre-incubation of variable duration, for example 2 h to 4 h at a lower temperature (e.g. 25 °C to 30 °C), can be
used to permit resuscitation of stressed organisms, followed by a longer period of incubation at the usual
temperature for the organism sought. The change may be effected either by transfer to another incubator or
water bath, or by using apparatus in which the temperature is automatically changed after a given time. Ideally,
place all the plates in the incubator or water bath at the same time.
Alternatively, the membranes may be incubated for a limited period (e.g. 2 h or 4 h) on a resuscitation medium
and then transferred to another medium, which is usually selective, for further incubation.
8.3 Enumeration
8.3.1 General
Examine the plates or membranes immediately after incubation. If this is not possible, they may be kept at
(5 ± 3) °C for short periods (e.g. a few days) provided that this does not affect the numbers, appearance or
subsequent confirmation of the colonies. If the plates or membranes are stored, validate the storage period as
being acceptable for the method and sample type.
8.3.2 Colonies to be counted and confirmed
For “total” counts on a non-selective medium, all the colonies are counted. With selective and differential
media, only those colonies that show the characteristic appearance of the organism sought are counted.
Magnification may be used (unless otherwise stated) when colony size is small and/or when it is otherwise
difficult to differentiate colonies from other particles. In general, it is unusual for such counts to indicate the
organisms belonging only to one taxonomic group, but in practice this discrepancy may be accepted and the
results can be expressed as presumptive. For more precise characterization, confirmatory tests are necessary.
It may be impracticable, however, if there are numerous colonies, to confirm the identity of all of them. In such
instances, examine all typical colonies from a sub-area of the plate or membrane (see also 8.4.3).
8.4 Calculation of results
8.4.1 Principle
A large part of this subclause has been taken from ISO 7218:1996/Amd 1:2001.
The methods of calculation defined below take account of the cases that occur most frequently when tests are
carried out in accordance with the methods of good practice of a laboratory. Rare, special cases may occur
(for example, significant discrepancy between the number of colonies on two plates with the same dilution, or
a very different ratio to that of the dilution factor between the plates of two successive dilutions), and it is
therefore necessary that results obtained from counting be examined, interpreted or even refused by a
qualified microbiologist.
8.4.2 General case
The calculation of results given in this subclause can be used in cases when the total number of colonies on
the plates is between 10 and 200 (spread plate and membrane filtration techniques) or between 10 and 300
(pour plate technique), and where the number of typical colonies is between 10 and 150 (spread plate and
pour plate techniques) or between 10 and 100 (membrane filtration technique).
Since each colony is assumed to have arisen from one micro-organism or from a single aggregate of micro-
organisms, the result is expressed as the number of colony-forming units (cfu) or colony-forming particles (cfp)
in a specified reference volume of the sample (generally 100 ml or 1 ml) by Equation (1):
Z
CV=× (1)
ss
V
tot
where
C is the estimate of the number of cfu or cfp in the reference volume V of the sample;
s s
Z is the sum of colonies counted on plates or on membranes derived from dilutions d , d , ., d , or
1 2 i
derived from separate volumes of the test portion (sample or dilution);
V is the reference volume chosen to express the concentration of the micro-organisms in the sample;
s
V is the calculated total volume of original sample included in the plates enumerated. V is either the
tot tot
sum of the separate volumes from the test portion (sample or dilution) or calculated by Equation (2):
V = (n V d ) + (n V d ) + . + (nVd) (2)
tot 1 1 1 2 2 2 i i i
where
V is the calculated total volume of original sample included in the plates enumerated;
tot
n , n , ., n is the number of plates counted for dilution d , d , ., d ;
1 2 i 1 2 i
V , V , ., V is the test volume used with dilution d , d , ., d ;
1 2 i 1 2 i
d , d , ., d is the dilution used for the test volume V , V , ., V (d = 1 for an undiluted sample,
1 2 i 1 2 i
d = 0,1 for a ten-fold dilution, etc.).
NOTE 1 The final result thus obtained is a function of the weighted average of the counts from each plate.
Unless otherwise stated, round off the calculated results to two significant figures, when reporting final results.
In order to do this, if the third figure is less than 5 do not modify the preceding figure; if the third figure is
greater than or equal to 5, increase the preceding figure by one unit.
Express the result as a number preferably between 1,0 and 9,9 multiplied by the appropriate power of 10, or a
whole number with two significant figures.
10 © ISO 2005 – All rights reserved
An example of the calculation for the pour or spread plate technique (enumerated in duplicate) is as follows:
EXAMPLE 1
If the volume of the test solution used (V ) is 1 ml, and the following counts are obtained at the respective dilutions:
i
Dilution Counts
−2
81 colonies and 97 colonies
−3
9 colonies and 15 colonies
then:
Z = 81 + 97 + 9 + 15 = 202
V = (2 × 1 × 0,01) + (2 × 1 × 0,001) = 0,022
tot
and if V is 1 ml:
s
C=×1= 9 182
s
0,022
then, after rounding off: C = 9,2 × 10 cfu/ml (or cfp/ml).
s
An example of the calculation for the membrane filtration technique (enumerated in singular) is as follows:
EXAMPLE 2
Test volume (V )
Counts
i
100 ml 82 colonies
10 ml 11 colonies
then:
Z = 82 + 11 = 93
V = (1 × 100 × 1) + (1 × 10 × 1) = 110
tot
and if V is 100 ml:
s
C=×100= 84 cfu/100 ml (or cfp/100 ml).
s
It is desirable to report the results of such colony counts together with the 95 % confidence limits, which may
be derived by application of the following equations (see Reference [5]):
When Z W 20, the final result with 95 % confidence interval (CI) is given by Equation (3):
1)
ZZ±22Z Z
CV±=95 % CI ×= ± ×V (3)
ss s
VVV
tot tot tot
where the symbols are as defined above.
2)
When Z < 20, the effect of the increasing skew (asymmetry) of the Poisson distribution on the confidence
limits is approximately taken into account by adding the small corrections included in Equation (4):
ZZ+±22 +1
Upper and lower 95 % CI=× V (4)
s
V
tot
NOTE 2 The last equation gives a mean and 95 % CI even for Z = 0, which may be misleading.
NOTE 3 The number “2” (before the square root) in the equations is a rounding-off of 1,96 (≅ 2).
NOTE 4 The 95 % CI calculations assume a Poisson distribution in all cases.
8.4.3 Case after identification or confirmation
When the method used requires identification or confirmation, all presumed suspect colonies should be
inoculated from each of the plates retained for the counting of colonies. When this is impracticable, all typical
colonies (n) should be examined from a sub-area of the plate or membrane (n may vary from plate to plate).
The main reason for recommending the confirmation of all presumptive colonies from a certain area instead of
a random selection is that laboratories may not be able to isolate an objective random subset of the suspect
colonies. If a reliable random sample is obtainable, then the minimum and at the same time sufficient average
number for routine monitoring is to confirm about n = 5 colonies per plate. The recommended practice is to
isolate all colonies when the number is between 1 and 5. Thereafter, an average of n = 5 is appropriate. (If the
number of presumptive colonies is 6 or 7, it does not make much sense to select only a subset of n = 5.) After
identification or confirmation, calculate for each of the plates the confirmed result as the proportion of
presumptive colonies complying with the identification or confirmation criteria, using Equation (5):
k
xz=× (5)
n
where
x is the estimated number of confirmed colonies per plate;
k is the number of colonies complying with identification or confirmation criteria among the inoculated
colonies n;
n is the number of presumptive positive colonies inoculated from a plate for confirmation;
z is the total number of presumptive positive colonies counted on the plate.
Do not round off the intermediate confirmed test results x.
Calculate the number C of identified or confirmed micro-organisms present in the test sample by replacing Z
s
by X (the sum of x), using Equation (1) given in 8.4.2. Round off and express the result as recommended in
8.4.2.
EXAMPLE
Counting has produced the following result:
Dilution Counts
−3
66 colonies and 80 colonies
−4
4 colonies and 7 colonies
12 © ISO 2005 – All rights reserved
Confirmation of selected colonies was carried out:
of the 66 colonies, 8 colonies were tested, 6 of which complied with the criteria; hence x = ×=66 49,5;
of the 80 colonies, 9 colonies were tested, 6 of which complied with the criteria; hence x = 53,3;
of the 7 colonies, 5 colonies were tested, 4 of which complied with the criteria; hence x = 5,6;
of the 4 colonies, all 4 colonies were tested and all 4 complied with the criteria; hence x = z = 4,0.
4 4
X = 49,5 + 53,3 + 5,6 + 4,0 = 112,4
and if V is 1 ml:
s
X 112,4 112,4
CV=× = ×V= ×1= 51 091
ss s
V (2××1 0,001)+ (2×1× 0,000 1) 0,002 2
tot
After rounding off: C = 5,1 × 10 cfu/ml (or cfp/ml).
s
When partial (fractional) confirmation, like in the example above, is employed, the resulting confirmed results
[5]
do not follow the Poisson distribution. The equations for the 95 % CI as in 8.4.2 are not valid .
8.4.4 Special cases
8.4.4.1 All plates of the test sample containing less than 10 colonies
Counts from 20 up to the (practical) upper limit of each method are in the optimal precision range. Precision is
still acceptable for counts between 10 and 20. Precision decreases rapidly as colony numbers decrease below
10. Depending on the purpose of the test, a lower limit of determination can be defined at a count lower
than 10.
According to ISO/TR 13843, the definition of limit of determination is the “lowest average particle
concentration x per analytical portion where the expected relative standard uncertainty equals a specified
value (RSD)”. RSD is the relative standard deviation, which is calculated by dividing the estimate of the
standard deviation s of a population from a sample by the mean x of that sample. Instead of RSD, the symbol
w is used for the relative standard deviation. Thus, w = s /x .
In the case of a Poisson distribution, x is calculated by Equation (6):
x = (6)
w
If w is set at 0,50 (50 %) as the limit of acceptable relative precision (which seems to be reasonable in
microbiology), the lower limit of determination will be at the colony number given by
x== 4
0,50
Thus results based on counts of less than four should be treated as mere detection of the presence of the
organism.
Summarizing:
If all plates contain less than 10 colonies, but the total number of colonies in all available plates together is 4
or more, the result is calculated as given in the general case (8.4.2), but given as an estimated number. If the
total is from 3 to 1, the precision of the result is so low that it is advisable to report the result as
organism present in the volume studied.
8.4.4.2 No plates containing any colonies
If the plates from the test sample do not contain any colonies, express the result as follows:
less than 1/V cfu (or cfp) per volume of sample
tot
where V is the calculated total volume of original sample included in the plates enumerated (see 8.4.2).
tot
If preferred, it is also possible to report the result as “zero” or “organism non-detectable”. If this is done, also
indicate the volume of sample analysed.
8.4.4.3 More than 200 or 300 colonies with visible typical or confirmed colonies
If the number of all typical and non-typical colonies for all plates containing a first dilution d is greater than
200 (in the case of spread plates and membrane filtration) or greater than 300 (in the case of pour plates) with
visible typical colonies or confirmed colonies and, if, for all plates of the subsequent dilution d containing less
than 200 colonies or less than 300 colonies respectively, no typical or confirmed colony can be counted,
express the result as follows:
less than 1/d cfu (or cfp) per volume of sample and more than 1/d cfu (or cfp) per volume of sample
2 1
where 1/d and 1/d are the dilution factors corresponding to dilutions d and d .
1 2 1 2
EXAMPLE
−2
at the first dilution (10 ): more than 300 colonies on each of the plates, with typical or confirmed colonies present;
−3
at the second dilution (10
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 8199
Deuxième édition
2005-06-15
Qualité de l'eau — Lignes directrices
générales pour le dénombrement des
micro-organismes sur milieu de culture
Water quality — General guidance on the enumeration of
micro-organisms by culture
Numéro de référence
©
ISO 2005
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Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
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Web www.iso.org
Version française parue en 2007
Publié en Suisse
ii © ISO 2005 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . vi
1 Domaine d’application. 1
2 Références normatives . 1
3 Principe. 1
4 Généralités . 2
5 Diluants et milieux de culture. 2
6 Stérilisation des appareils et de la verrerie . 5
7 Échantillons. 5
8 Dénombrement après ensemencement des prises d’essai de l’échantillon sur (ou dans)
un milieu solide. 6
9 Dénombrement par ensemencement en milieu liquide . 16
Annexe A (informative) Critères de choix d’une technique de dénombrement. 24
Annexe B (informative) Tables NPP . 29
Bibliographie . 37
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 8199 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 4, Méthodes
microbiologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 8199:1988) qui a fait l’objet d’une révision
technique.
Cette version corrigée de l’ISO 8199:2005 intègre les principales modifications suivantes:
e
déplacement de la deuxième phrase «Si la solution…» à l’alinéa
⎯ 5.2.5 [point b), 4 alinéa]
«Préparation»;
⎯ 8.4.2 (Exemple 1) remplacement de «et si V est 1 ml» par «et si V est égal à 1 ml»;
s s
remplacement de «et si V est 1 ml» par «et si V est égal à 100 ml»;
⎯ 8.4.2 (Exemple 2)
s s
remplacement de «et si V est 1 ml» par «et si V est égal à 1 ml» et
⎯ 8.4.3 (exemple)
s s
correction des Références [14], [16], [17] et [19].
⎯ Bibliographie
iv © ISO 2005 – Tous droits réservés
Les équations en 8.4.2 et en 9.5.2.1 ont été numérotées, ce qui conduit aux modifications suivantes:
⎯ 8.4.2 (équations non numérotées) numérotation en Équation (3) et Équation (4);
⎯ 8.4.3 (équation) renumérotation en Équation (5);
⎯ 8.4.4.1 (équation) renumérotation en Équation (6);
numérotation en Équation (7);
⎯ 9.5.2.1 (équation non numérotée)
⎯ 9.5.2.2 (équation) renumérotation en Équation (8);
⎯ 9.6.2 (équation) renumérotation en Équation (9); et
⎯ 9.6.3 (équation) renumérotation en Équation (10).
Plusieurs corrections mineures ont été apportées, notamment:
⎯ 8.2.3.2 (alinéa 3) remplacement de «fondu» par «maintenu en surfusion»;
, d , ., d », suppression du mot
⎯ 8.4.2 [sous l’Équation (2)] dans l’explication des symboles «d
1 2 i
«prise d’essai»;
e
ajout du mot «puits» après «12 × 5 ml» et «24 × 3 ml»;
⎯ 9.3.3 (dernier alinéa, 7 ligne)
⎯ 9.5.3.2 (exemple) dans l’équation à la fin de l’exemple, remplacement de
«1,61/(5 ml) × 100 ml» par «(1,61/5 ml) × 100 ml»;
e
ajout de parenthèses à «3 ou 5» et
⎯ 9.5.3.3 (alinéa 2, 5 ligne)
⎯ A.2.3.1 remplacement de «une valeur de référence acceptée» par «la valeur
de référence acceptée».
Introduction
Les techniques d’isolement et de dénombrement des micro-organismes, basées sur la capacité de ces
derniers à se multiplier sur des milieux de culture spécifiques, sont un moyen important et largement utilisé
pour évaluer la qualité microbiologique de l’eau. Le but du présent guide est de réunir en un seul document
les informations communes aux diverses techniques de dénombrement pour éviter la répétition des détails
techniques dans chaque norme et pour faciliter le choix de la technique la plus appropriée à un problème
donné.
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NORME INTERNATIONALE ISO 8199:2005(F)
Qualité de l'eau — Lignes directrices générales pour le
dénombrement des micro-organismes sur milieu de culture
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale connaisse bien
les pratiques courantes de laboratoire. La présente norme n’a pas pour but de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur de la
présente norme d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité, et de
s’assurer de la conformité à la réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est absolument indispensable que les essais menés conformément à la présente
Norme Internationale le soient par du personnel dûment formé.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale présente des lignes directrices concernant des manipulations communes à
chaque technique d’examen microbiologique de l’eau, en particulier la préparation des échantillons, les
milieux de culture et l’appareillage. Elle décrit également les diverses techniques de dénombrement possibles
et les critères de choix d’une technique particulière. La présente Norme internationale concerne
principalement les bactéries, les levures et les champignons. Certains aspects peuvent aussi s’appliquer aux
virus et aux parasites.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l’application du présent document. Pour les
références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence (y compris les éventuels amendements) s’applique.
ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
ISO 19458, Qualité de l'eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique
3 Principe
Le principe général de ces techniques consiste à ensemencer un volume connu d’échantillon d’eau sur ou
dans un milieu de culture (solide ou liquide). Il est supposé qu’au cours de l’incubation, chaque
micro-organisme présent se multiplie pour donner soit une colonie visible directement sur milieu solide, soit
des changements d’aspect dans un milieu liquide. Le choix de telle ou telle méthode ne dépend pas
seulement de la nature des micro-organismes recherchés, mais également de la nature de l’eau et des
raisons à l’origine de l’examen.
4 Généralités
Uniformité des températures et des durées (d’incubation): Les amplitudes acceptées de température et de
durée suivantes sont appliquées pendant l’incubation et la conservation, dans la mesure où elles conviennent
à l’organisme cible prévu et sauf autre indication dans la norme spécifique.
Températures de conservation: (−70 ± 10) °C, (− 20 ± 5) °C, (5 ± 3) °C;
Températures d’incubation: (22 ± 2) °C, (36 ± 2) °C;
Températures de stérilisation: (115 ± 3) °C, (121 ± 3) °C, (170 ± 10) °C;
Durées d’incubation: (21 ± 3) h, (44 ± 4) h, (68 ± 4) h.
Le cas échéant, d’autres durées et d’autres températures peuvent être spécifiées pour des méthodes
données.
Les limites supérieures de la température d’incubation sont très strictes (elles peuvent avoir une grande
influence sur la croissance). Les limites inférieures de température peuvent être dépassées pendant de
courtes périodes, par exemple lors de l’ouverture de la porte de l’incubateur, mais elles doivent rapidement
être rétablies.
Tolérances sur les volumes et les masses: Sauf indication contraire, l’amplitude de toute valeur mesurée est
de: valeur citée ± 5 %.
5 Diluants et milieux de culture
5.1 Généralités
5.1.1 Exigences de qualité
Les composants entrant dans la préparation des milieux de culture doivent être de qualité constante et les
produits chimiques de qualité analytique reconnue. Des produits chimiques de qualité différente peuvent être
utilisés à condition de pouvoir prouver qu’ils donnent les mêmes résultats. Il est également possible d’utiliser
des milieux complets ou des diluants déshydratés. Les instructions du fabricant doivent être suivies
scrupuleusement.
L’eau utilisée doit être de l’eau distillée sur verre ou déminéralisée, exempte de substances susceptibles
d’inhiber la croissance de micro-organismes dans les conditions de l’essai. Elle doit être conforme aux
spécifications de l’ISO 3696:1987, qualité 3.
Sauf indication contraire, les ingrédients sont ajoutés au volume d’eau au lieu de venir compléter un certain
volume, conformément à la pratique en microbiologie pour la préparation des milieux de culture.
Vérifier la qualité des milieux de culture, des diluants et des filtres avant utilisation, par exemple en suivant le
mode opératoire décrit dans l’ISO 7704, l’ISO/TS 11133-1 ou l’ISO/TS 11133-2.
5.1.2 Stérilisation
Les diluants et les milieux de culture doivent être répartis dans des récipients supportant la stérilisation en
autoclave. Dans la plupart des cas, une température de (121 ± 3) °C durant 15 min est appropriée. Toutefois,
une durée et une température différentes peuvent parfois s’avérer nécessaires et les indications sont alors
données dans chaque norme.
La stérilisation par filtration est également possible pour les substances thermolabiles, avec un filtre de
diamètre moyen de pores de 0,2 µm, spécifié comme adapté à la stérilisation par le fabricant.
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5.2 Diluants
Les diluants indiqués dans ce paragraphe sont d’usage courant en microbiologie de l’eau. Toutefois, la liste
n’est pas exhaustive et il est possible d’utiliser d’autres diluants adaptés.
Après la préparation, répartir chaque solution dans les bouteilles et stériliser, par exemple, en autoclave à
(121 ± 3) °C durant 15 min. Il est aussi possible de répartir le diluant en observant la meilleure asepsie après
sa stérilisation. Conserver à température ambiante ou au réfrigérateur à (5 ± 3) °C durant 6 mois au plus. Si le
diluant prend un aspect anormal, le mettre au rebut.
5.2.1 Solution saline
Composition
Chlorure de sodium (NaCl) 8,5 g
Eau (voir 5.1.1) 1 000 ml
Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau, en chauffant si nécessaire. Ajuster le pH en ajoutant une solution
d’hydroxyde de sodium [c(NaOH) = 1 mol/l] ou une solution d’acide chlorhydrique [c(HCI) = 1 mol/l] de sorte
qu’après stérilisation (voir 5.1.2) le pH soit de 7,0 ± 0,5 à 25 °C.
5.2.2 Eau peptonée
Composition
Hydrolysat enzymatique de caséine (peptone) 1,0 g
Eau (voir 5.1.1) 1 000 ml
Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau, en chauffant si nécessaire. Ajuster le pH en ajoutant une solution
d’hydroxyde de sodium [c(NaOH) = 1 mol/l] ou une solution d’acide chlorhydrique [c(HCI) = 1 mol/l] de sorte
qu’après stérilisation (voir 5.1.2) le pH soit de 7,0 ± 0,5 à 25 °C.
5.2.3 Solution peptonée saline
Composition
Hydrolysat enzymatique de caséine (peptone) 1,0 g
Chlorure de sodium (NaCl) 8,5 g
Eau (voir 5.1.1) 1 000 ml
Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau, en chauffant si nécessaire. Ajuster le pH en ajoutant une solution
d’hydroxyde de sodium [c(NaOH) = 1 mol/l] ou une solution d’acide chlorhydrique [c(HCI) = 1 mol/l] de sorte
qu’après stérilisation (voir 5.1.2) le pH soit de 7,0 ± 0,5 à 25 °C.
5.2.4 Solution de Ringer, quart de concentration
Composition
Chlorure de sodium (NaCl) 2,25 g
Chlorure de potassium (KCl) 0,105 g
Chlorure de calcium (anhydre) (CaCl) 0,12 g
Hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO) 0,05 g
Eau (voir 5.1.1) 1 000 ml
Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau, en chauffant si nécessaire. Ajuster le pH en ajoutant une solution
d’hydroxyde de sodium [c(NaOH) = 1 mol/l] ou une solution d’acide chlorhydrique [c(HCI) = 1 mol/l] de sorte
qu’après stérilisation (voir 5.1.2) le pH soit de 7,0 ± 0,2 à 25 °C.
5.2.5 Solution tampon de phosphate
a) Solution de phosphate
Composition
Dihydrogéno-orthophosphate de potassium (KH PO) 34 g
2 4
Eau (voir 5.1.1) (q.s.p.) 1 000 ml
Préparation
Dissoudre le dihydrogéno-orthophosphate de potassium dans 500 ml d’eau. Ajuster le pH à 7,2 ± 0,2 avec
une solution d’hydroxyde de sodium [c(NaOH) = 1 mol/l] ou une solution d’acide chlorhydrique
[c(HCI) = 1 mol/l]. Compléter avec de l’eau à 1 000 ml. Si la solution doit être conservée, la stériliser (voir
5.1.2) auparavant.
b) Solution de chlorure de magnésium
Composition
Chlorure de magnésium (MgCl) 38 g
Eau (voir 5.1.1) 1 000 ml
Il est aussi possible d’utiliser une masse équivalente (99 g) de sulfate de magnésium (MgSO ,7H O).
4 2
Préparation
Dissoudre le chlorure de magnésium dans l’eau. Si la solution doit être conservée, la stériliser (voir 5.1.2)
auparavant.
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c) Solution finale
Composition
Solution de phosphate (a) 1,25 ml
Solution de chlorure de magnésium (b) 5,0 ml
Eau (voir 5.1.1) 1 000 ml
Préparation
Ajouter la solution de phosphate (a) et la solution de chlorure de magnésium (b) à l’eau, répartir en volumes
adéquats et stériliser (voir 5.1.2). Il convient que le pH final soit de 7,0 ± 0,2 à 25 °C.
5.3 Milieux de culture
Lorsqu’un flacon de milieu de culture déshydraté (produit chimique) est ouvert, noter la date sur le récipient et
y indiquer une durée de conservation maximale.
En général, après stérilisation en récipients hermétiques, la plupart des milieux de culture peuvent être
conservés dans des conditions satisfaisantes pendant plusieurs mois à température ambiante, à condition
d’être tenus à l’abri de la lumière et maintenus hermétiquement fermés. Les milieux répartis stérilement
peuvent être conservés à (5 ± 3) °C pendant 1 mois au maximum, ou plus si cela est autorisé. Avant
utilisation, les examiner avec soin afin de détecter toute contamination, évaporation excessive ou tout autre
signe de détérioration. La plupart des réactifs se conservent mieux à (5 ± 3) °C. Les milieux de culture fournis
préconditionnés doivent être utilisés selon les instructions du fabricant.
Prérefroidir le milieu de culture entre 45 °C et 50 °C, s’il est nécessaire d’y ajouter des substances
thermosensibles après la stérilisation en autoclave.
6 Stérilisation des appareils et de la verrerie
Les appareils et la verrerie qui ne sont pas fournis stériles doivent être stérilisés selon l’une des méthodes
suivantes:
a) dans un four, à (170 ± 10) °C durant 1 h au minimum (hormis la durée de préchauffage);
b) dans un autoclave, à (121 ± 3) °C durant 15 min au minimum.
Lorsque les membranes filtrantes ne sont pas stériles, les stériliser avant utilisation selon les instructions du
fabricant.
7 Échantillons
7.1 Échantillonnage
Effectuer l’échantillonnage selon l’ISO 19458.
7.2 Préparation de l’échantillon
Avant l’examen, homogénéiser l’échantillon en agitant vigoureusement pour obtenir une répartition uniforme
des micro-organismes et, selon la nature de l’eau et la teneur en bactéries attendue, faire toutes les dilutions
nécessaires à ce stade.
Dans le cas des numérations sur gélose, il est possible d’utiliser des dilutions décimales. Dans le cas de la
filtration sur membrane (surface plus réduite), il est recommandé d’appliquer des facteurs de dilution moindres.
Pour les dilutions décimales, répartir 90 ml ou 9 ml de diluant et transvaser dans des flacons ou des tubes de
dilution stériles. Il est également possible d’utiliser des quantités de diluant préalablement stérilisé dans des
flacons à bouchon à vis. Procéder à une ou à plusieurs dilutions décimales en ajoutant un volume
d’échantillon d’eau à neuf volumes de diluant. À l’aide d’une autre pipette ou par un moyen mécanique,
homogénéiser et prélever un volume de cette dilution pour l’ajouter à un nouveau tube contenant neuf
volumes de diluant. Répéter ces opérations autant de fois que nécessaire. Préparer une quantité suffisante de
chaque dilution pour tous les essais à effectuer avec le même échantillon.
Pour les dilutions autres que les dilutions décimales, le volume de diluant doit être ajusté en fonction du
volume d’échantillon. Plusieurs approches sont possibles, par exemple des séries de dilutions d’ordre 3 ou 4
ou des séries de dilutions décimales pour lesquelles sont filtrés des volumes de 10 ml et de 30 ml. Des
dilutions d’ordre 4 peuvent être effectuées en suivant la méthode décrite plus haut pour les dilutions
décimales, en mélangeant alors un volume d’échantillon d’eau avec trois volumes de diluant.
Si de hautes concentrations de l’organisme cible sont attendues, il est possible d’utiliser des facteurs de
dilution d’ordre 100.
Pour les lignes directrices générales concernant la préparation des dilutions décimales, se reporter à
l’ISO 6887-1.
8 Dénombrement après ensemencement des prises d’essai de l’échantillon sur (ou
dans) un milieu solide
8.1 Principe
Une prise d’essai de l’échantillon d’eau, ou une dilution, est ensemencée directement ou après concentration
sur une membrane sur la surface d’un milieu de culture solide spécifique ou dans un milieu maintenu en
surfusion de sorte qu’après incubation, les micro-organismes forment des colonies dans ou sur le milieu.
Pour des raisons pratiques, chaque colonie est considérée comme provenant d’un seul micro-organisme ou
d’un agrégat de micro-organismes présents dans la prise d’essai au moment de l’ensemencement. En tenant
compte du volume de la prise d’essai et du nombre de colonies formées, le résultat peut donc être exprimé
comme le nombre d’unités formant colonies (ufc) ou de particules formant colonies (pfc) dans un volume
donné de l’échantillon, par exemple 1 ml ou 100 ml.
8.2 Modes opératoires
8.2.1 Généralités
Trois modes opératoires fondamentaux peuvent être utilisés pour l’ensemencement en milieu solide.
a) Technique par incorporation
La prise d’essai est mélangée au milieu qui a été préalablement fondu et refroidi à une température proche de
la température de solidification. Après incubation, les colonies qui se développent à la surface et à l’intérieur
du milieu sont dénombrées.
b) Technique par étalement
La prise d’essai est étalée à la surface d’un milieu gélosé sans trace d’humidité et, après incubation, les
colonies qui se développent à la surface sont dénombrées.
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c) Technique par filtration sur membrane
La prise d’essai est filtrée à travers une membrane qui retient les micro-organismes recherchés. La
membrane est alors placée sur un milieu gélosé ou sur un coussin en papier absorbant imprégné de milieu de
culture liquide ou réhydraté. Durant l’incubation, des colonies se forment à la surface de la membrane. Pour
certains organismes, comme les anaérobies, la membrane peut également être placée, face vers le bas, dans
une boîte de Petri et recouverte de milieu gélosé fondu.
8.2.2 Choix de la technique
Le choix de la technique dépend de plusieurs facteurs, notamment des caractéristiques physiques et
chimiques de l’eau, ainsi que de la nature des micro-organismes recherchés (voir Annexe A, Article A.3), de
leur concentration probable, de la récupération effective des micro-organismes en état de stress ou abîmés
de manière sublétale ainsi que de la fidélité et de la sensibilité requises pour l’essai. Les indications
concernant les volumes d’échantillon d’eau qui peuvent être utilisés pour chaque technique sont données en
8.2.3.1, en 8.2.4.1 et en 8.2.5.1 et les limites de détection sont mentionnées dans l'Article A.2. De plus,
l’exactitude des techniques est traitée dans l'Article A.2. Les exigences réglementaires peuvent également
influer sur le choix de la technique à utiliser en indiquant, par exemple, la fidélité souhaitée ou si la
détermination de la présence ou de l’absence d’un organisme dans un volume donné est suffisante.
8.2.3 Technique par incorporation
8.2.3.1 Prise d’essai
Le volume de la prise d’essai de l’échantillon, ou d’une dilution de l’échantillon, peut varier de 0,1 ml à 5 ml
selon la dimension de la boîte de Petri et le volume de milieu de culture utilisé. Il convient de choisir la dilution
de sorte que le nombre présumé de colonies formées sur les boîtes de 90 mm à 100 mm de diamètre soit
compris entre 10 et 150. Il convient que le nombre total de colonies (typiques et atypiques) dans la boîte soit
inférieur à 300 (voir l’ISO 7218). Noter toutefois que le nombre total de colonies dénombrables dépend de la
taille des colonies et qu’il peut être nécessaire de le réduire dans le cas de colonies de taille importante.
8.2.3.2 Ensemencement
Faire fondre la quantité de milieu nécessaire à l’eau bouillante ou par un autre procédé adapté [par exemple
enceinte thermostatée (synonymes: étuve, incubateur), stérilisateur vapeur (autoclave) ou four à micro-ondes,
à condition que la combinaison durée/température ait été validée pour la préparation du milieu concerné].
Éviter la surchauffe et retirer le milieu dès qu’il est fondu. Placer le milieu fondu dans un bain d’eau
thermostaté à (45 ± 1) °C pendant un temps suffisant pour qu’il s’équilibre à cette température. Il est
recommandé de ne pas maintenir un milieu en surfusion pendant plus de 4 h. Ne pas faire fondre les milieux
gélosés plus d’une fois.
Préparer et marquer les boîtes de Petri requises. Effectuer toutes les dilutions nécessaires conformément à
7.2 et, après avoir vigoureusement mélangé, répartir les prises d’essai dans les boîtes.
Retirer l’un après l’autre du bain d’eau thermostaté les tubes ou les flacons de milieu maintenu en surfusion,
sécher l’extérieur des tubes ou des flacons et flamber le col. Ajouter immédiatement le milieu dans chaque
boîte de Petri, en évitant de le verser sur la prise d’essai afin de réduire le choc thermique et mélanger
soigneusement afin d’obtenir une répartition homogène des micro-organismes. En règle générale, un volume
de 15 ml de milieu est utilisé pour une prise d’essai de 1 ml ou de 2 ml. Pour des prises d’essai plus
importantes, la concentration du milieu doit être ajustée en conséquence. Laisser refroidir les boîtes sur une
surface horizontale pour laisser la gélose se solidifier. Dès que la gélose s’est solidifiée, incuber les boîtes
conformément à 8.2.6.
NOTE Dans le cas de laboratoires analysant un grand nombre d’échantillons, des systèmes de préparation, de
versement et d’empilement de la gélose peuvent se révéler utiles.
8.2.4 Technique par étalement
8.2.4.1 Prise d’essai
Pour une boîte de Petri de diamètre compris entre 90 mm et 100 mm, il convient que le volume de la prise
d’essai d’échantillon, ou d’une dilution de l’échantillon, soit de 0,1 ml à 0,5 ml. La dilution doit être choisie de
sorte que le nombre présumé de colonies formées soit compris entre 10 et 150. Il convient que le nombre
total de colonies (typiques et atypiques) dans la boîte soit inférieur à 200. Noter toutefois que le nombre total
de colonies dénombrables dépend de la taille des colonies et qu’il peut être nécessaire de le réduire dans le
cas de colonies de taille importante.
8.2.4.2 Ensemencement
Préparer et marquer des boîtes, contenant chacune environ 15 ml de milieu de culture. Sécher la surface du
milieu de culture avant utilisation (si nécessaire). À l’aide d’une pipette, transférer la prise d’essai à la surface
du milieu et l’étaler sur toute la surface à l’aide d’une baguette stérile ou de tout autre instrument. Après
absorption de l’inoculum, incuber les boîtes conformément à 8.2.6.
Les points suivants sont importants pour le séchage des boîtes:
⎯ Le degré d’humidité du milieu de culture est important car la croissance optimale des bactéries dépend
des conditions hygrométriques dans et sur le milieu de culture. Une perte excessive d’humidité peut
entraîner, par exemple, une augmentation des concentrations des inhibiteurs dans des milieux de culture
sélectifs et une réduction de l’activité de l’eau à la surface du milieu de culture.
⎯ Dans le cas de bactéries qui ne prolifèrent pas rapidement et si les boîtes semblent sèches à
température ambiante, le séchage peut ne pas être indispensable. Dans ce cas, il est possible d’omettre
le séchage, qui ne fait qu’accroître la possibilité de contamination et qui entraîne une perte d’humidité
inutile.
⎯ Sélectionner la température et la durée de séchage de façon à réduire le plus possible le risque de
contamination et de sorte que le chauffage n’ait pas un effet négatif sur la qualité du milieu de culture. La
durée du séchage dépend de l’importance de la condensation dans la boîte de Petri, mais doit être la
plus courte possible.
Pour éviter la contamination, et si les boîtes ne sont pas séchées dans une hotte à flux laminaire, les boîtes
doivent toujours être séchées avec la surface du milieu de culture à inoculer tournée vers le bas.
Dans la pratique, les boîtes sont séchées avec les surfaces gélosées vers le bas et les couvercles à moitié
ouverts, dans un incubateur réglé sur une température comprise entre 25 °C et 50 °C. Sécher les boîtes
jusqu’à ce que les gouttelettes à la surface des couvercles aient disparu. Ne pas poursuivre le séchage. Les
boîtes de milieu gélosé peuvent également être séchées (tout comme ci-dessus) dans une hotte à flux
laminaire (à température ambiante) durant 30 min à 60 min, ou toute la nuit à température ambiante avec les
couvercles en place.
8.2.5 Technique par filtration sur membrane
8.2.5.1 Prise d’essai
Le volume maximal de prise d’essai dépend de la filtrabilité de l’échantillon d’eau et des membranes utilisées.
Cette technique convient aux eaux contenant peu de matières particulaires ou colloïdales en suspension (par
exemple du fer), comme l’eau potable. Avec des membranes dont les pores ont un diamètre moyen de
0,45 µm, il est possible de filtrer plusieurs litres d’eau de ce type à travers une même membrane et d’obtenir
ainsi une très grande sensibilité pour l’essai. Toutefois, pour certains organismes (comme la Legionella), la
filtration sur membrane dont les pores ont un diamètre moyen de 0,2 µm peut être nécessaire.
8 © ISO 2005 – Tous droits réservés
Il convient de choisir un volume de prise d’essai d’échantillon, ou d’une dilution de celui-ci, de façon à obtenir
entre environ 10 et 100 colonies formées sur une membrane de diamètre de 47 mm à 50 mm. Il convient que
le nombre total de colonies (typiques et atypiques) sur le filtre soit inférieur à 200. Noter toutefois que le
nombre total de colonies dénombrables dépend de la taille des colonies et qu’il peut être nécessaire de le
réduire dans le cas de colonies de taille importante.
8.2.5.2 Filtration
Relier l’appareillage de filtration stérile à une source de vide. Placer une membrane stérile, côté quadrillé vers
le haut, sur le disque poreux de la base de l’appareil en ne saisissant que le bord extérieur de la membrane à
l’aide d’une pince à bords plats stérile. Repositionner correctement l’entonnoir stérile sur la base de l’appareil.
Le robinet reliant au vide étant fermé, verser ou transférer à l’aide d’une pipette soit:
a) un volume connu d’échantillon, ou d’une dilution de celui-ci, soigneusement homogénéisé (10 ml au
moins);
b) le contenu d’un flacon ou d’une bouteille contenant la prise d’essai additionné d’une quantité suffisante
de diluant pour obtenir un volume total d’au moins 10 ml;
c) au moins 10 ml de diluant, auquel est ajoutée directement dans l’entonnoir puis mélangée à l’aide d’une
pipette la prise d’essai mesurée.
Ouvrir le robinet et faire un vide suffisant (environ 70 kPa) pour filtrer lentement l’eau à travers la membrane.
Refermer le robinet aussitôt que l’échantillon est filtré. Il peut être avisé de rincer l’entonnoir en filtrant une à
trois portions de 10 ml à 30 ml de diluant stérile, le filtre étant encore en place.
8.2.5.3 Transfert de la membrane
Retirer l’entonnoir (s’assurer auparavant que le robinet reliant au vide est fermé) et transférer la membrane à
l’aide d’une pince stérile, en s’assurant qu’il n’y a pas de bulles d’air entre la membrane et le milieu, sur l’un
des milieux suivants:
a) un milieu gélosé dans une boîte de Petri;
b) un coussin en papier absorbant stérile préalablement saturé avec un milieu liquide ou un coussin de
milieu déshydraté reconstitué avec de l’eau stérile dans une boîte de Petri (pour éviter toute croissance
en nappe, éliminer l’excès de milieu, de préférence avant de placer la membrane sur le coussin);
c) une boîte de Petri ou un peu de milieu gélosé dans une boîte de Petri dans laquelle la membrane est
ensuite recouverte de milieu gélosé fondu à (45 ± 1) °C.
Pour différentes quantités d’un même échantillon, l’entonnoir peut être réutilisé sans être désinfecté sous
réserve que les volumes les moins importants et/ou les échantillons les plus dilués soient filtrés en premier.
Pour filtrer un autre échantillon, utiliser un autre appareillage stérile ou décontaminer l’entonnoir en le passant
à la flamme, par exemple. Il est également possible de suivre les instructions du fabricant concernant la
désinfection.
8.2.6 Incubation
Retourner les boîtes ensemencées et les placer dans un incubateur ou dans un récipient étanche dans un
bain d’eau thermostaté. Au besoin, envelopper les boîtes dans des sachets en plastique pour éviter toute
dessiccation du milieu de culture (par exemple lorsqu’un incubateur ventilé est utilisé). Il convient que les
boîtes contenant des membranes sur coussin en papier absorbant soient placées (non retournées) si
nécessaire dans un récipient étanche à l’air ou à l’eau pour éviter toute dessiccation du milieu. Ne pas empiler
plus de 6 boîtes de Petri pour s’assurer que toutes atteignent rapidement la température d’incubation.
Choisir la durée et la température d’incubation en se référant à une méthode normalisée, puisque celles-ci
dépendent du micro-organisme ou des groupes de micro-organismes recherchés.
L’incubation peut être effectuée en deux étapes, comme suit:
Une préincubation d’une durée variable, de 2 h à 4 h par exemple, à une température moins élevée (par
exemple de 25 °C à 30 °C), peut être utilisée pour permettre une revivification des organismes en état de
stress, suivie d’une période plus longue d’incubation à la température appropriée à l’organisme recherché. Le
changement peut être effectué soit en transférant les cultures dans un autre incubateur ou un autre bain d’eau,
soit en utilisant un appareillage qui règle automatiquement la température après une période donnée. L’idéal
est de placer toutes les boîtes en même temps dans l’incubateur ou le bain d’eau thermostaté.
Il est également possible d’incuber les membranes durant une période limitée (2 h ou 4 h, par exemple) sur
milieu de revivification, puis de les transférer sur un autre milieu, généralement sélectif, pour poursuivre
l’incubation.
8.3 Dénombrement
8.3.1 Généralités
Les boîtes de Petri ou les membranes doivent être examinées immédiatement après l’incubation. Si cela n’est
pas possible, elles peuvent être conservées à (5 ± 3) °C durant de courtes périodes (quelques jours, par
exemple), à condition que cela n’influe pas sur le nombre, l’aspect ou la confirmation ultérieure des colonies.
En cas de conservation des boîtes ou des membranes, valider la durée acceptable de conservation pour une
méthode et un type d’échantillons donnés.
8.3.2 Dénombrement et confirmation des colonies
Pour le dénombrement «total» sur milieu non sélectif, toutes les colonies sont comptées. Avec des milieux
sélectifs et différenciés, ne compter que les colonies qui présentent l’aspect caractéristique de l’organisme
recherché. Il est possible d’avoir recours à un grossissement (sauf indication contraire) lorsque la taille de la
colonie est réduite et/ou quand il est difficile de différencier les colonies d’autres particules. Lors de ces
dénombrements, il est en général rare de compter des organismes n’appartenant qu’à un seul groupe
taxonomique, mais, en pratique, cette divergence peut être acceptée et le résultat exprimé comme résultat
présumé. Pour une caractérisation plus précise, des examens de confirmation sont nécessaires.
Toutefois, si les colonies sont très nombreuses, il peut ne pas être possible de confirmer l’identité de la totalité
d’entre elles. Dans ce cas, examiner toutes les colonies typiques dans une portion de surface donnée de la
boîte ou de la membrane (voir également en 8.4.3).
8.4 Calcul des résultats
8.4.1 Principe
Une grande partie de ce paragraphe provient de l’ISO 7218:1996/Amd.1:2001.
Les méthodes de calcul définies ci-dessous tiennent compte des cas les plus fréquents lorsque les essais
sont effectués selon les bonnes pratiques de laboratoire. Quelques cas rares et particuliers peuvent survenir
(par exemple des différences significatives entre le nombre de colonies dans deux boîtes de dilution identique,
ou un rapport très différent du facteur de dilution entre les boîtes de deux dilutions successives) et il est alors
nécessaire que les résultats du dénombrement soient analysés, interprétés ou même infirmés par un
microbiologiste qualifié.
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8.4.2 Cas général
Le calcul des résultats exposé dans ce paragraphe peut être utilisé quand le nombre total de colonies dans
les boîtes est compris entre 10 et 200 (techniques par étalement et par filtration sur membrane) ou entre 10 et
300 (technique par incorporation), et lorsque le nombre de colonies typiques est compris entre 10 et 150
(techniques par étalement et par incorporation) ou entre 10 et 100 (technique par filtration sur membrane).
Étant entendu que chaque colonie est supposée provenir d’un seul micro-organisme ou d’un seul agrégat de
micro-organismes, le résultat est exprimé en nombre d’unités formant colonies (ufc) ou de particules formant
colonies (pfc) dans un volume de référence spécifié d’échantillon (généralement 100 ml ou 1 ml), selon
l’Équation (1):
Z
CV=× (1)
ss
V
tot
où
C est l’estimation du nombre d’ufc ou de pfc dans le volume de référence V d’échantillon;
s s
Z est la somme de toutes les colonies dénombrées dans les boîtes ou sur les membranes provenant
des dilutions d , d , ., d , ou obtenues dans les volumes séparés de prise d’essai (échantillon ou
1 2 i
dilution);
V est le volume de référence choisi pour exprimer la concentration de micro-organismes dans
s
l’échantillon;
V est le volume total calculé d’échantillon d’origine inoculé dans les boîtes dénombrées. V est soit la
tot tot
somme des volumes séparés de prise d’essai (échantillon ou dilution), soit calculé par l’Équation (2):
V = (n V d ) + (n V d ) + . + (nVd) (2)
tot 1 1 1 2 2 2 i i i
où
V est le volume total calculé d’échantillon d’origine inoculé dans les boîtes
tot
dénombrées;
n , n , ., n est le nombre de boîtes dénombrées pour les dilutions d , d , ., d ;
1 2 i 1 2 i
V , V , ., V est le volume de prise d’essai pour les dilutions d , d , ., d ;
1 2 i 1 2 i
d , d , ., d est la dilution utilisée pour les volumes d’essai V , V , ., V (d = 1 pour un
1 2 i 1 2 i
échantillon non dilué, d = 0,1 pour une dilution décimale, etc.).
NOTE 1 Le résultat final ainsi obtenu est la moyenne pondérée des dénombrements effectués sur chaque boîte.
Sauf indication contraire, arrondir les résultats calculés à deux chiffres significatifs lors de l’expression des
résultats finals. Pour ce faire, si le troisième chiffre est inférieur à 5, ne pas modifier le chiffre précédent; s’il
est supérieur ou égal à 5, augmenter le chiffre précédent d’une unité.
De préférence, exprimer le résultat sous la forme d’un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par la
puissance de 10 adéquate ou par un nombre entier à deux chiffres significatifs.
Ce qui suit est un exemple de calcul pour les techniques par incorporation ou par étalement (dénombrement à
partir de duplicata).
EXEMPLE 1
Si le volume de solution d’essai utilisé (V ) est de 1 ml et si les dénombrements suivants sont obtenus avec les dilutions
i
respectives:
Dilution Dénombrements
−2
10 81 et 97 colonies
−3
10 9 et 15 colonies
alors:
Z = 81 + 97 + 9 + 15 = 202
V = (2 × 1 × 0,01) + (2 × 1 × 0,001) = 0,022
tot
et si V est égal à 1 ml:
s
C=×19= 182
s
0,022
alors, après arrondi: C = 9,2 × 10 ufc/ml (ou pfc/ml).
s
Ce qui suit est un exemple de calcul pour la technique par filtration sur membrane (dénombrement simple).
EXEMPLE 2
Volume d’essai (V ) Dénombrements
i
100 ml 82 colonies
10 ml 11 colonies
alors:
Z = 82 + 11 = 93
V = (1 × 100 × 1) + (1 × 10 × 1) = 110
tot
et si V est égal à 100 ml:
s
C=× 100= 84 ufc/100 ml (ou pfc/100 ml).
s
Il est souhaitable de noter les résultats d’un tel dénombrement de colonies avec des limites de confiance à
95 %, qui peuvent être obtenues en appliquant les équations suivantes (voir la Référence [5]):
1) Si Z W 20, le résultat final avec l’intervalle de confiance (IC) à 95 % est donné par l’Équation (3):
⎛⎞ ⎛ ⎞
ZZ±22Z Z
CV±=IC à 95 % ×=± ×V (3)
⎜⎟ ⎜ ⎟
ss s
⎜⎟ ⎜ ⎟
VVV
tot tot tot
⎝⎠ ⎝ ⎠
où les symboles ont la même signification que ci-dessus.
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2) Si Z < 20, l’effet de l’asymétrie croissante de la loi de Poisson sur les limites de confiance est plus ou
moins pris en compte en ajoutant les petites corrections de l’Équation (4):
⎛⎞
ZZ+±22 +1
IC à 95 % sup. et inf. =⎜ ⎟ (4)
⎜⎟
V
tot
⎝⎠
NOTE 2 La dernière équation donne une moyenne et un IC à 95 % même pour Z = 0, ce qui peut induire en erreur.
NOTE 3 Dans les équations, le chiffre «2» (avant la racine carrée) est un arrondi de 1,96 (≅ 2).
NOTE 4 Les calculs de l’IC à 95 % supposent une distribution selon la loi de Poisson dans tous les cas.
8.4.3 Cas après identification ou confirmation
Lorsque la méthode utilisée exige une identification ou une confirmation, il convient que toutes les colonies
considérées comme caractéristiques soient repiquées à partir de chacune des boîtes retenues pour le
dénombrement des colonies. Lorsque cela est irréalisable, il convient que toutes les colonies typiques (n)
d’une portion de surface donnée de la boîte ou de la membrane soient examinées (n peut varier d’une boîte à
l’autre). La confirmation recommandée de toutes les colonies présumées à partir d’une portion de surface
donnée au lieu d’effectuer une sélection aléatoire se justifie principalement par le fait que les laboratoires
peuvent ne pas arriver à isoler un sous-ensemble objectif aléatoire des colonies suspectes. S’il est possible
d’obtenir un échantillon aléatoire fiable, alors le nombre minimal et en même temps le nombre moyen
suffisant pour un contrôle de routine est d’environ n = 5 colonies par boîte. La pratique recommandée consiste
à isoler toutes les colonies quand le nombre est compris entre 1 et 5. Au-delà, une moyenne de n = 5 convient.
(Si le nombre de colonies présumées est de 6 ou 7, il n’est pas très judicieux de ne sélectionner qu’un
sous-ensemble de n = 5.) Après identification ou confirmation, calculer le résultat confirmé, pour chacune des
boîtes, en tant que proportion des colonies présumées satisfa
...
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