ISO 10705-4:2001

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10705-4
First edition
2001-12-15
Water quality — Detection and enumeration
of bacteriophages —
Part 4:
Enumeration of bacteriophages infecting
Bacteroides fragilis
Qualité de l'eau — Détection et dénombrement des bactériophages —
Partie 4: Dénombrement des bactériophages infectant Bacteroides fragilis

Reference number
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ISO 2001
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Contents Page
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Term and definition . 1
4 Safety precautions . 2
5 Principle . 2
6 Reagents . 2
7 Apparatus . 2
8 Microbiological reference cultures . 3
9 Sampling . 4
10 Preparation of test materials . 4
11 Procedure . 7
12 Expression of results . 9
13 Test report . 10
Annexes
A General description of bacteriophages infecting Bacteroides fragilis. 11
B Culture media and diluents . 12
C Alternative method for preparing inoculum cultures. 17
D Culturing of Bacteriophage B56-3. 18
Bibliography. 19
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Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this part of ISO 10705 may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
International Standard ISO10705-4 was prepared by Technical Committee ISO/TC147, Water quality,
Subcommittee SC 4, Microbiological methods.
ISO 10705 consists of the following parts, under the general title Water quality — Detection and enumeration of
bacteriophages:
— Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages
— Part 2: Enumeration of somatic coliphages
— Part 3: Validation of methods for concentration of bacteriophages from water
— Part 4: Enumeration of bacteriophages infecting Bacteroides fragilis
Annexes A, B, C and D of this part of ISO 10705 are for information only.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 10705-4:2001(E)
Water quality — Detection and enumeration of bacteriophages —
Part 4:
Enumeration of bacteriophages infecting Bacteroides fragilis
1 Scope
This part of ISO 10705 specifies a method for the detection and enumeration of bacteriophages infecting Bacteroides
fragilis by incubating the sample with an appropriate host-strain. The method is applicable to all kinds of water,
sediments and sludge extracts, where necessary after dilution. In the case of low phage numbers, a pre-
concentration step may be necessary for which a separate International Standard has been developed. The method
is also applicable to shellfish extracts.
NOTE It is desirable for International Standards to be adopted as widely as possible. This part of ISO 10705 includes reference
to alternative procedures which obviate the need for expensive materials or equipment which may not be readily available in
developing countries. Use of these alternatives will not affect the performance of this method.
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this part of ISO 10705. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these publications
do not apply. However, parties to agreements based on this part of ISO 10705 are encouraged to investigate the
possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For undated references,
the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC maintain registers of
currently valid International Standards.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 5667-1, Water quality — Sampling — Part 1: Guidance on the design of sampling programmes
ISO 5667-2, Water quality — Sampling — Part 2: Guidance on sampling techniques
ISO 5667-3, Water quality — Sampling — Part 3: Guidance on the preservation and handling of samples
ISO 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension
and decimal dilutions
ISO 8199, Water quality — General guide to the enumeration of micro-organisms by culture
3 Term and definition
For the purposes of this part of ISO 10705, the following term and definition applies.
3.1
bacteriophage infecting Bacteroides fragilis
bacterial virus which is capable of infecting selected Bacteroides fragilis host strains by attachment to the bacterial
cell wall as the first step of the infectious process
NOTE 1 Such bacteriophages produce visible plaques (clearance zones) in a confluent lawn of host bacteria grown under
appropriate culture conditions.
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NOTE 2 A general description of bacteriophages infecting B. fragilis is given in annex A.
4 Safety precautions
The host strain used in this part of ISO 10705 is non-pathogenic to man and animals and should be handled in
accordance with the normal (national or international) safety procedures for bacteriological laboratories.
Bacteriophages infecting Bacteroides fragilis are non-pathogenic for man and animals, but some types are very
resistant to drying. Appropriate precautions shall be taken to prevent cross-contamination of test materials,
particularly when examining or handling cultures of high titre or when inoculating cultures of the host strains. Such
procedures shall be carried out in a biohazard cabinet or a separate area of the laboratory. Chloroform is a
carcinogenic substance. Observe relevant safety precautions or use an alternative method of equal efficacy.
It is recommended that personnel using this method have or acquire some experience in handling anaerobic
bacteria.
5Principle
The sample is mixed with a small volume of semi-solid nutrient medium. A culture of host-strain is added and plated
on a solid nutrient medium. After this, incubation and reading of plaques take place. The results are expressed as the
number of plaque-forming particles (also named plaque-forming units, pfu) per unit of volume (pfp/ml, pfp/l, etc.).
6Reagents
6.1 Basic materials.
Use ingredients of uniform quality and chemicals of analytical grade for the preparation of culture media and
reagents and follow the instructions given in annex B. For information on storage see ISO 8199, except where
indicated in this part of ISO10705. Alternatively, use dehydrated complete media and follow strictly the
manufacturer's instructions.
Other grades of chemicals may be used provided they can be shown to lead to the same results.
6.2 Water, for the preparation of media, glass-distilled or deionized, free from substances which might inhibit
bacterial growth under the conditions of the test, and complying with ISO 3696.
6.3 Diluent, for making sample dilution, such as peptone-saline solution or another diluent complying with
ISO 6887-1.
7 Apparatus
Apart from apparatus supplied sterile, sterilize any glassware and other equipment in accordance with ISO 8199.
Usual sterile, microbiological laboratory equipment and glassware or disposable plastics-ware in accordance with
ISO 8199 and including the following:
7.1 Hot-air oven, for dry-heat sterilization, and an autoclave.
◦
7.2 Incubator or water bath, thermostatically maintained at (36± 2) C.
◦
7.3 Incubator or water bath, thermostatically maintained at (36± 2) C with a shaking device.
◦
7.4 Water bath or heating block, thermostatically maintained at (45± 1) C.
7.5 Water bath or equivalent device, for melting of agar media.
7.6 pH meter, and pH paper.
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7.7 Counting apparatus, with indirect, oblique light.
◦
7.8 Deep freezer, thermostatically maintained at (−20± 5) C.
◦
7.9 Deep freezer, thermostatically maintained at (−70± 10) C or liquid nitrogen storage vessel.
7.10 Spectrophotometer, equipped with a filter for the range of 500 nm to 650 nm with a maximum bandwidth of
± 10 nm, capable of holding cuvettes (7.21) having an optical path length of 1 cm or Hungate glass tubes (7.20) with
butyl rubber stopper and screw cap or screw-capped glass culture tubes.
7.11 Anaerobic cabinet, or jars or bags, as well as anaerobiosis generators and anaerobiosis indicators.
◦
7.12 Refrigerator, temperature set at (5± 3) C.
7.13 Petri dishes, having a diameter of 9cm, and vented.
7.14 Graduated pipettes, having a capacity of 0,1 ml, 1 ml, 5 ml and 10 ml and Pasteur pipettes.
7.15 Glass bottles, of suitable volumes.
7.16 Screw-capped glass bottles, of suitable volumes.
7.17 Culture tubes, with caps or suitable alternatives.
7.18 Screw-capped glass culture tubes.
7.19 Measuring cylinders, of suitable capacity.
7.20 Hungate glass tubes, with butyl rubber stopper and screw cap or screw-capped glass culture tubes which
can fit in the spectrophotometer (see Figure 1).
7.21 Cuvettes, having an optical path length of 1cm.
7.22 Membrane filter units, for decontamination, having a pore size of 0,2µm, preferably low protein-binding
membranes, as for example, those composed of polyvinylidene difluoride.
7.23 Plastics vials, lidded, having a capacity of 3ml.
7.24 Glass vials, screw-capped, having a capacity of 3ml.
7.25 Syringes and needles.
7.26 Cotton swabs.
8 Microbiological reference cultures
[1]
The recommended host strain is Bacteroides fragilis RYC2056 (ATCC 700786).
Use bacteriophage B56-3 (ATCC 700786-B1) infecting Bacteroides fragilis RYC2056 for the preparation of reference
materials (11.4).
NOTE The ATCC strains are available from American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas,
VA 20110-2209, USA. This information is given for the convenience of users of this part of ISO 10705 and does not constitue an
endorsement by ISO of the product named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same re
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 10705-4
Première édition
2001-12-15
Qualité de l'eau — Détection et
dénombrement des bactériophages —
Partie 4:
Dénombrement des bactériophages
infectant Bacteroides fragilis
Water quality — Detection and enumeration of bacteriophages —
Part 4: Enumeration of bacteriophages infecting Bacteroides fragilis

Numéro de référence
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ISO 2001
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Imprimé en Suisse
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Sommaire Page
1 Domaine d'application . 1
2 Références normatives . 1
3 Terme et définition . 2
4 Précautions relatives à la sécurité . 2
5 Principe . 2
6 Réactifs . 2
7 Appareillage . 3
8 Cultures microbiologiques de référence . 5
9 Échantillonnage . 5
10 Préparation des matériaux d'essai . 5
11 Mode opératoire . 7
12 Expression des résultats . 10
13 Rapport d'essai . 11
Annexes
A Description générale des bactériophages infectant Bacteroides fragilis. 12
B Milieux de culture et diluants. 13
C Méthode alternative pour la préparation des précultures. 18
D Mise en culture du bactériophage B56-3 . 19
Bibliographie. 20
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ISO 2001 – Tous droits réservés iii

Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison
avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique
internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments de la présente partie de l'ISO 10705 peuvent faire l'objet
de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas
avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
La Norme internationale ISO 10705-4 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-
comité SC 4, Méthodes microbiologiques.
L'ISO 10705 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l'eau — Détection et
dénombrement des bactériophages:
— Partie 1: Dénombrement des bactériophages ARN F spécifiques
— Partie 2: Dénombrement des coliphages somatiques
— Partie 3: Validation des méthodes de concentration des bactériophages dans l'eau
— Partie 4: Dénombrement des bactériophages infectant Bacteroides fragilis
Les annexes A, B, C et D de la présente partie de l'ISO 10705 sont données uniquement à titre d'information.
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NORME INTERNATIONALE ISO 10705-4:2001(F)
Qualité de l'eau — Détection et dénombrement des
bactériophages —
Partie 4:
Dénombrement des bactériophages infectant Bacteroides fragilis
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO 10705 spécifie une méthode de détection et de dénombrement des bactériophages
infectant la bactérie Bacteroides fragilis par incubation de l'échantillon avec une souche-hôte appropriée. La
méthode est applicable à tous les types d'eaux, aux extraits de sédiments et de boues si nécessaire après dilution.
Dans le cas de faibles populations de phages, une étape de préconcentration peut s'avérer nécessaire pour laquelle
une Norme internationale distincte a été élaborée. La méthode est également applicable aux extraits de coquillages.
NOTE Il est souhaitable que les Normes internationales soient adoptées le plus largement possible. La présente partie de
l'ISO 10705 comporte des références à des procédures alternatives qui évitent d'avoir à utiliser du matériel ou des équipements
coûteux qui peuvent ne pas être aisément disponibles dans les pays en voie de développement. L'utilisation de ces procédures
alternatives n'affectera pas les performances de la présente méthode.
2Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente partie de l'ISO 10705. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s'appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
aux accords fondés sur la présente partie de l'ISO 10705 sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les
éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s'applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur.
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
ISO 5667-1, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 1: Guide général pour l'établissement des programmes
d'échantillonnage
ISO 5667-2, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 2: Guide général sur les techniques d'échantillonnage
ISO 5667-3, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 3: Guide général pour la conservation et la manipulation
des échantillons
ISO 6887-1, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions
décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de la suspension
mère et des dilutions décimales
ISO 8199, Qualité de l'eau — Guide général pour le dénombrement des micro-organismes sur milieu de culture
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3 Terme et définition
Pour les besoins de la présente partie de l'ISO 10705, le terme et la définition suivants s'appliquent.
3.1
bactériophage infectant Bacteroides fragilis
virus des bactéries capable d'infecter certaines souches-hôtes sélectionnées de Bacteroides fragilis en se fixant sur
la paroi cellulaire au début du processus d'infection
NOTE 1 De tels bactériophages provoquent l'apparition de plages visibles (zones de lyse) sur un tapis confluent de bactéries-
hôtes cultivées dans des conditions appropriées.
NOTE 2 Une description générale des bactériophages infectant B. fragilis est donnée dans l’annexe A.
4Précautions relatives à la sécurité
La souche-hôte utilisée pour les besoins de la présente partie de l'ISO 10705 est une souche non pathogène pour
l'homme et l'animal, et qu'il convient de manipuler conformément aux procédures normales (nationales ou
internationales) des laboratoires d'analyses bactériologiques. Les bactériophages infectant Bacteroides fragilis ne
sont pathogènes ni pour l'homme ni pour l'animal, mais certains types sont très résistants à la dessiccation. Des
précautions appropriées doivent être prises pour éviter tout risque de contamination croisée des échantillons, en
particulier lors de l'examen ou de la manipulation de cultures de concentration élevée ou lors de l'ensemencement
de cultures de souches-hôtes. Ces opérations doivent être réalisées dans une enceinte pour risque biologique ou
dans une zone séparée du laboratoire. Le chloroforme est une substance cancérigène. Prendre les précautions de
sécurité applicables ou utiliser une autre méthode d'efficacité égale.
Il est recommandé que le personnel en charge d'appliquer la présente méthode ait acquis ou acquière un certain
niveau d'expérience dans la manipulation des bactéries anaérobies.
5Principe
L'échantillon est mélangé à un faible volume de milieu de culture nutritif semi-solide. Une culture de la souche-hôte
y est ajoutée et le mélange est coulé dans une boîte contenant du milieu de culture nutritif solide. Après cela, les
boîtes sont incubées et examinées pour y repérer l'apparition de plages. Les résultats son exprimés en nombre de
particules formant plages (également identifiées par unités formant plages, ufp) par unité de volume (ufp/ml, ufp/l,
etc.).
6Réactifs
6.1 Matériaux de base.
Pour la préparation des milieux de culture et des réactifs, utiliser des produits de qualité constante ainsi que des
réactifs de qualité analytique, et suivre les instructions données dans l'annexe B. Pour toute information relative à la
conservation, se reporter à l’ISO 8199, sauf indication spécifique donnée dans la présente partie de l'ISO 10705.
Des milieux de culture complets déshydratés peuvent également être utilisés. Dans ce cas, suivre scrupuleusement
les instructions du fabricant.
Des produits chimiques d'autres qualités peuvent être utilisés, pourvu qu’il puisse être démontré qu’ils conduisent
aux mêmes résultats.
6.2 Eau, pour la préparation des milieux de culture, distillée dans des récipients en verre ou déminéralisée,
exempte de substances susceptibles d'inhiber la croissance des bactéries dans les conditions de l'essai, et conforme
à l’ISO 3696.
6.3 Diluant, pour faire des dilutions d'échantillon, tel qu’une solution peptonée saline ou tout autre diluant
conforme à l’ISO 6887-1.
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2 ISO 2001 – Tous droits réservés

7 Appareillage
En dehors des appareils fournis sous forme stérile, stériliser la verrerie et les autres matériels conformément à
l'ISO 8199.
Matériel et verrerie de laboratoire stériles d'usage courant en microbiologie, ou matériel à usage unique en plastique
conformes à l'ISO 8199, et comprenant notament les éléments suivants:
7.1 Étuve à air chaud, pour stérilisation en chaleur sèche, et autoclave.
◦
7.2 Incubateur ou bain d'eau, maintenu thermostatiquement à .(36± 2) C
◦
7.3 Incubateur ou bain d'eau, maintenu thermostatiquement à (36± 2) Cet équipé d'un agitateur.
◦
7.4 Bain d'eau ou bloc chauffant, maintenu thermostatiquement à .(45± 1) C
7.5 Bain d'eau ou dispositif équivalent, pour faire fondre la gélose.
7.6 pH-mètre et papier indicateur de pH.
7.7 Appareil de comptage, équipé d'une source de lumière indirecte, oblique.
◦
7.8 Congélateur, maintenu thermostatiquement à .(−20± 5) C
◦
7.9 Congélateur, maintenu thermostatiquement à (−70± 10) Cou réservoir de stockage à azote liquide.
7.10 Spectrophotomètre, équipé d'un filtre pour la gamme de longueurs d'onde allant de 500 nm à 650 nmavec
± 10 nm 1 cm
une largeur de bande maximale de , capable de contenir des cuves de de trajet optique (7.21) ou des
tubes en verre de Hungate (7.20) avec un bouchon en caoutchouc butyle et une capsule à vis, ou encore des tubes
de
...