ISO 19238:2004
(Main)Radiation protection - Performance criteria for service laboratories performing biological dosimetry by cytogenetics
Radiation protection - Performance criteria for service laboratories performing biological dosimetry by cytogenetics
ISO 19238:2004 provides criteria for quality assurance and quality control, evaluation of the performance and the accreditation of biological dosimetry by cytogenetic service laboratories.
Radioprotection — Critères de performance pour les laboratoires de service pratiquant la dosimétrie biologique par cytogénétique
L'ISO 19238:2004 fournit des critères pour l'assurance qualité et le contrôle de qualité, l'évaluation des performances et l'accréditation des laboratoires de service pratiquant la dosimétrie biologique par cytogénétique.
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ISO 19238:2004 is a standard published by the International Organization for Standardization (ISO). Its full title is "Radiation protection - Performance criteria for service laboratories performing biological dosimetry by cytogenetics". This standard covers: ISO 19238:2004 provides criteria for quality assurance and quality control, evaluation of the performance and the accreditation of biological dosimetry by cytogenetic service laboratories.
ISO 19238:2004 provides criteria for quality assurance and quality control, evaluation of the performance and the accreditation of biological dosimetry by cytogenetic service laboratories.
ISO 19238:2004 is classified under the following ICS (International Classification for Standards) categories: 13.280 - Radiation protection; 17.240 - Radiation measurements. The ICS classification helps identify the subject area and facilitates finding related standards.
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 19238
First edition
2004-08-01
Radiation protection — Performance
criteria for service laboratories
performing biological dosimetry by
cytogenetics
Radioprotection — Critères de performance pour les laboratoires de
service pratiquant la dosimétrie biologique par cytogénétique
Reference number
©
ISO 2004
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Contents Page
Foreword. v
Introduction . vi
1 Scope. 1
2 Terms and definitions. 1
3 Dicentric assay. 3
4 Confidentiality of personal information. 4
4.1 Overview. 4
4.2 Applications of the principle of confidentiality. 4
4.2.1 Delegation of responsibilities within the aboratory . 4
4.2.2 Requests for analysis . 4
4.2.3 Transmission of confidential information . 4
4.2.4 Anonymity of samples. 4
4.2.5 Reporting of results . 5
4.2.6 Storage. 5
5 Laboratory safety requirements . 5
5.1 Overview. 5
5.2 Microbiological safety requirements. 5
5.3 Chemical safety requirements. 5
5.4 Optical safety requirements. 6
5.5 Safety plan. 6
6 Calibration source(s), calibration curve(s) and minimum detection levels. 7
6.1 Calibration source(s). 7
6.2 Calibration curve(s). 7
6.3 Minimum detection levels . 7
7 Responsibility of the customer . 7
8 Responsibility of the service laboratory. 8
9 Scoring unstable chromosome aberrations.8
9.1 Procedure for scoring first-division metaphases. 8
9.2 Criteria for scoring. 9
9.2.1 Coding of samples and slides . 9
9.2.2 Scoring techniques. 9
9.2.3 Laboratory scoring expertise. 9
10 Criteria for converting a measured aberration frequency into an estimate of absorbed
dose. 9
10.1 Overview. 9
10.2 Comparison with controls. 9
10.3 Determination of estimated dose and confidence limits . 10
10.4 Acute and non-acute exposure cases . 10
10.5 Partial-body and prior-exposure cases . 10
11 Reporting of results . 11
11.1 Identification of the exposed subject. 11
11.2 Description of the case. 11
11.3 Task of the service laboratory . 11
11.4 Results of the service laboratory . 11
11.5 Interpretation of the results . 11
11.6 Contact person. 12
11.7 Summary.12
12 Quality assurance and quality control .12
12.1 Overview.12
12.2 Quality assurance.12
12.2.1 Quality assurance plan .13
12.2.2 Responsible quality assurance person or organization .14
12.3 Quality control.14
12.3.1 Quality control procedures .14
12.3.2 Performance checks of sample transport integrity .14
12.3.3 Performance checks of sample integrity by service laboratory.14
12.3.4 Performance checks of instrumentation .15
12.3.5 Performance checks of sample protocol.15
12.3.6 Performance checks of sample scoring .15
12.3.7 Performance checks of dose and confidence limits estimation .15
12.3.8 Performance checks of result-report generation.15
Annex A (informative) Sample instructions for customer .16
Annex B (informative) Sample questionnaire .17
Annex C (informative) Sample data sheet for recording aberrations.19
Annex D (informative) Sample of report .20
Bibliography.21
iv © ISO 2004 – All rights reserved
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 19238 was prepared by Technical Committee ISO/TC 85, Nuclear energy, Subcommittee SC 2, Radiation
protection.
Introduction
The wide use of ionising radiations, for medical, industrial, agricultural, research and military purposes
increases the risk of overexposure of radiation workers and individuals of the general population. Biological
dosimetry, based on the study of chromosomal aberrations, mainly the dicentric assay, has become a routine
component of accidental dose assessment. Experience with its application in hundreds of cases of suspected
or verified overexposures has proved the value of this method and also defined its limitations. It should be
emphasised that cytogenetic analysis is used as a dosemeter and provides one input into the compendium of
information needed for assessment of a radiological accident.
Many studies on animals and man have shown that one could establish a good correlation between the
results obtained in vivo and in vitro, so that in vitro established dose-effect relationships from irradiated blood
samples can be used as calibration curves. The dicentric yield is dependent on radiation quality and dose rate
so that information about these variables needs to be established for each investigation. If known, these
exposure characteristics are important for refining the dose estimates. The specificity of this technique is
enhanced by the fact that generally 1 dicentric is observed per 1 000 metaphase spreads in the normal
population, and that this frequency is approximatively independent of age and sex. The precision of the
technique thus depends on the number of cells observed, the background level and the calibration curve used.
Theoretically, it is possible to detect exposure as low as 0,01 Gy. However, for these very low doses, it is
necessary to analyse tens of thousands of metaphase spreads. In practice, this level of detection is neither
feasible nor necessary. The upper limits to dose detection extend well into the range of doses that are lethal to
humans.
The primary purpose of this International Standard is to provide a guideline to all laboratories in order to
perform the dicentric assay using documented and validated procedures. Secondly, it can facilitate the
comparison of results obtained in different laboratories, particularly for international collaborations or
intercomparison. Finally, laboratories newly commissioned to carry out the dicentric assay should conform to
this International Standard in order to perform it reproducibly and accurately.
The International Standard is written in the form of procedures to be adopted for biological dosimetry for
overexposures involving at most a few casualties. The criteria required for such measurements will usually
depend upon the application of the results: radiation protection management, medical management when
appropriate, record keeping and legal requirements. In the special situation of a mass radiation casualty and
limited resources, the technique can be applied for emergency triage analysis. The standard recommended
scoring criteria would then be relaxed as appropriate to the situation.
A part of the information in this International Standard is contained in other international guidelines and
scientific publications, primarily in the International Atomic Energy Agency’s (IAEA) Technical Reports Series
on Biological Dosimetry. However, this International Standard expands and standardizes the quality
assurance and quality control, the criteria of accreditation and the evaluation of performance. This
International Standard is generally compliant with ISO/IEC 17025, with particular consideration given to the
specific needs of biological dosimetry. The expression of uncertainties in dose estimations given in this
International Standard comply with the ISO Guide to the expression of uncertainty in measurement (GUM)
and the ISO 5725 on accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results.
vi © ISO 2004 – All rights reserved
INTERNATIONAL STANDARD ISO 19238:2004(E)
Radiation protection — Performance criteria for service
laboratories performing biological dosimetry by cytogenetics
1 Scope
This International Standard provides criteria for quality assurance and quality control, evaluation of the
performance and the accreditation of biological dosimetry by cytogenetic service laboratories.
This International Standard addresses
a) the confidentiality of personal information, for the customer and the service laboratory,
b) the laboratory safety requirements,
c) the calibration sources and calibration dose ranges useful for establishing the reference dose-effect
curves allowing the dose estimation from chromosome aberration frequency, and the minimum detection
levels,
d) the scoring procedure for unstable chromosome aberrations used for biological dosimetry,
e) the criteria for converting a measured aberration frequency into an estimate of absorbed dose,
f) the reporting of results,
g) the quality assurance and quality control,
h) informative annexes containing examples of a questionnaire, instructions for customers, a data sheet for
recording aberrations and a sample report.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
acentric
terminal or interstitial chromosome fragment of varying size
NOTE When it is formed independently of a dicentric or centric ring chromosome aberration, it is usually referred to
as an excess acentric
2.2
background level
spontaneous frequency (or number) of chromosome aberrations recorded in control samples or individuals
2.3
bias
statistical sampling or testing error caused by systematically favouring some outcomes over others
2.4
centric ring
aberrant circular chromosome resulting from the joining of two breaks on separate arms of the same
chromosome
NOTE It is generally accompanied by an acentric fragment.
2.5
centromere
specialized constricted region of a chromosome that appears during mitosis joining together the chromatid
pair
2.6
confidence interval
statistical range about an estimated quantity within which the value of the quantity is expected to occur, with a
specified probability
2.7
chromosome
structure that carries genetic information
NOTE Normally, 46 such structures are contained in the human cell nucleus. During nuclear division, they condense
to form characteristically shaped bodies.
2.8
chromatid
either of the two strands of a duplicated chromosome that are joined by a single centromere and separate
during cell division to become individual chromosomes
2.9
dicentric
aberrant chromosome bearing two centromeres derived from the joining of parts from two broken
chromosomes
NOTE It is generally accompanied by an acentric fragment.
2.10
FISH
fluorescence in situ hybridization
technique that uses specific sequences of DNA as probes to particular parts of the genome, allowing the
chromosomal regions to be highlighted or “painted” in different colours by attachment of various
fluorochromes
NOTE This technique permits the detection of damage involving exchanges between differently painted pieces of
DNA (usually whole chromosomes)
2.11
interphase
period of a cell cycle between the mitotic divisions
2.12
LET
linear energy transfer
quotient of dE/dl, as defined by the International Commission on Radiation Units and Measurements (ICRU),
where dE is the average energy locally imparted to the medium by a charged particle of specific energy in
traversing a distance of dl
NOTE In other words, it is the rate at which the energy of the radiation is transferred to tissues.
2 © ISO 2004 – All rights reserved
2.13
metaphase
stage of mitosis when the nuclear membrane is dissolved, the chromosomes condensed to their minimum
lengths and aligned for division
2.14
minimum detection level
MDL
smallest measurable amount (e.g. frequency or dose) that will be detected with a probability β of non-
detection (Type II error) while accepting a probability α of erroneously deciding that a positive (non-zero)
quantity is present in an appropriate background sample (Type I error)
2.15
precision
concept employed to describe dispersion of measurements with respect to a measure of location or central
tendency
2.16
quality assurance
planned and systematic actions necessary to provide adequate confidence that a process, measurement or
service will satisfy given requirements for quality in, for example, those specified in a licence
2.17
quality control
part of quality assurance intended to verify that systems and components conform with predetermined
requirements
2.18
service laboratory
laboratory performing biological dosimetry measurements
3 Dicentric assay
The frequency of dicentric chromosomal aberrations seen at metaphase in cultured human peripheral blood
lymphocytes is the recommended method for biological dosimetry.
Lymphocytes are cultured by a method that permits first-division metaphases to be recognised for analysis
(see 9.1). This requires whole blood, or lymphocytes separated from the other blood components, to be
incubated in culture medium that would enable scoring of first-generation metaphase cells. A mitotic blocking
agent, colcemid or colchicine, is added to arrest dividing lymphocytes in metaphase. The duration of the cell
culture and the timing of addition of the arresting agent is optimised to ensure an adequate mitotic index and
predominance of first-division metaphases.
Metaphases are recovered from the cultures by centrifugation, placing in a hypotonic salt solution and fixing in
a mixture of alcohol and acetic acid. Fixed cells are placed on microscope slides and stained. The exact
protocol for cell culture, harvesting metaphases and staining employed by a service laboratory should be
formally documented (see Clause 12).
Stained microscope slides are methodically scanned to identify dicentric aberrations (see 9.2). The frequency
of dicentrics observed in an appropriate number of scored metaphases is converted to an estimate of radiation
dose by reference to calibration data (see Clause 10).
4 Confidentiality of personal information
4.1 Overview
Biological dosimetry investigations made by a service laboratory must be undertaken in accordance with
national regulations regarding confidentiality. This would normally include the maintenance of confidentiality of
the patient's identity, medical data and social status. In addition, the commercial confidentiality of the patient's
employer and any other organizations involved in a radiological accident/incident should be observed.
This requirement extends to
a) written, electronic or verbal communications between the laboratory and the person/organization
requesting the analysis and receiving the report, and
b) the secure protection of confidential information held within the organization where the service laboratory
is located.
4.2 Applications of the principle of confidentiality
4.2.1 Delegation of responsibilities within the aboratory
The head of the laboratory may authorise a limited number of laboratory staff to deal with documents related
to the analysis. Persons with this authority shall have signed a commitment to confidentiality regarding their
duties within the laboratory.
The laboratory head shall maintain the signed confidentiality agreements and ensure the security and safety
of all confidential documents.
4.2.2 Requests for analysis
Depending on national regulations, the request for an analysis should normally be made by a doctor
representing the patient, by the patient him/herself or could be requested due to legal claims. In all cases, the
blood sampling for chromosome analysis must be made with the patient’s informed consent. The laboratory
head, depending on the national regulations, may be required to maintain the record of the patient's informed
consent.
4.2.3 Transmission of confidential information
Whatever the chosen means of communication, confidentiality must be ensured during the exchange of
information and reports between the service laboratory and the requestor of the analysis.
The laboratory head needs to define all processes for information transmission and assurance of
confidentiality.
4.2.4 Anonymity of samples
The laboratory head needs to have established protocols for maintaining the anonymity of samples. To avoid
the identification of the patient while guaranteeing the tracability of the analysis, the blood samples should be
coded upon arrival in the service laboratory. The coding is performed in an unambiguous way according to a
standard procedure. The same code is to be used for all the stages of the analysis. The code is assigned by
an authorized person as defined in 4.2.1. Decoding, interpretation of results and compiling the report are also
to be performed by an authorized person.
4 © ISO 2004 – All rights reserved
4.2.5 Reporting of results
The final report containing the results and their interpretation (when needed) is communicated to the requestor
of the analysis. Depending on national regulations, further copies may, with appropriate approvals, be passed
to other responsible persons.
4.2.6 Storage
The laboratory head shall define how data and results are stored. All laboratory documents relating to a case,
and which could permit the patient and/or employer to be identified, must be stored in a place only accessible
to the authorized persons. Documents must be retained in an appropriate place for at least 30 years for
possible medico-legal re-evaluation of the case. Final disposal of documents must be by secure means such
as shredding.
5 Laboratory safety requirements
5.1 Overview
Staff shall conform to their national legislation and institutional regulations regarding safety in the laboratories.
There are some particular features concerning safety in service laboratories that are worth highlighting. These
include microbiological, chemical and optical considerations.
5.2 Microbiological safety requirements
Handling human blood poses some risk of blood-borne parasites and infections being transmitted to
laboratory staff. All specimens should be regarded as being potentially infectious, even if they are known to be
derived from apparently healthy persons. Specimens must be unpacked and manipulated in a class 2
microbiological safety cabinet. Setting up cultures in such a cabinet has the added benefit of minimising
culture failure due to microbial contamination. Use of sharps, e.g. hypodermic needles, should be kept to a
minimum to reduce the risk of injuries. Suitable disinfectants must be available to deal with spills. All biological
waste and used disposable plastic ware must be sterilised, for example by autoclaving or incineration, before
final disposal.
Staff should be offered available vaccinations against blood-borne diseases. The legal and ethical position
regarding HIV testing of blood samples upon receipt differs between countries and researchers should follow
their national requirements. It should be noted that, when blood samples are accepted from abroad,
depending on the country of origin, airlines might require the sender to provide a certificate confirming that the
samples have been tested and are HIV negative.
5.3 Chemical safety requirements
Certain chemicals and pharmaceuticals are used routinely in the procedures covered in this International
Standard. When present in cultures or used in staining procedures, they are mostly used in small volumes and
in dilutions that generally present no health hazard. They are, however, prepared and stored in concentrated
stock solutions. The main reagents of concern and their internationally agreed risk phrases (R numbers) are
listed below :
Benzylpenicillin R 42; 43;
Bromodeoxyuridine R 20; 21; 22; 46; 61;
Colcemid R 25;63;
Cytochalasin B R 26; 27; 28; 63;
Giemsa stain R 20; 21; 22; 40; 41;
Heparin R 36; 37; 38;
Hoechst stain R23; 24; 25; 36; 37; 38;
Phytohaemagglutinin R20, 21; 22; 43;
Streptomycin sulfate R 20; 21; 61.
Keys
R20 Harmful by inhalation;
R21 Harmful in contact with skin;
R22 Harmful if swallowed;
R23 Toxic by inhalation;
R24 Toxic in contact with skin;
R25 Toxic if swallowed;
R26 Very toxic by inhalation;
R27 Very toxic in contact with skin;
R28 Very toxic if swallowed;
R36 Irritating to eyes;
R37 Irritating to respiratory system;
R38 Irritating to skin;
R40 Possible risk of irreversible effects;
R41 Risk of serious damage to eyes;
R42 May cause sensitisation by inhalation;
R43 May cause sensitisation by skin contact;
R46 May cause heritable genetic damage;
R61 May cause harm to the unborn child;
R63 Possible risk of harm to the unborn child.
5.4 Optical safety requirements
When ultraviolet lamps are used in sterilising the interior of microbiological safety cabinets or exposing slides
during the FPG staining procedure, shielding and working procedures must be in place to avoid direct
irradiation of the skin or eyes of laboratory staff.
5.5 Safety plan
The laboratory head shall define written safety procedures for protection against microbiological, chemical and
optical hazards.
6 © ISO 2004 – All rights reserved
The laboratory head shall maintain a record of accidents and protocols or procedures to avoid repeating
similar accidents.
6 Calibration source(s), calibration curve(s) and minimum detection levels
6.1 Calibration source(s)
The service laboratory shall provide a report, reviewed and endorsed by a qualified expert (i.e., radiation
physicist or the service laboratory head) that addresses the following issues:
a) characterization of the radiation calibration source(s) used to generate each in vitro calibration curve and
traceability to a national/international radiation standard;
b) description of the dosimetry protocol, the procedure to certify that the dosimetry method is calibrated to a
standard, the method used to measure dose uniformity in the experimental array, and the written
procedures and documentation to verify dose and dose-rate determinations for individual experiments;
c) provision of a summary dosimetry report for each calibration-source dose-response curve.
6.2 Calibration curve(s)
The selection of the calibration dose range will depend on the radiation quality. In the case of low-LET photon
radiation, more than 7 doses should be selected, distributed equally among the linear and quadratic
component of the dose response curve. The typical doses for a low-LET calibration curve range from 0,25 to 4
Gy, although data at lower doses are highly desirable, e.g. 0,1 or 0,15 Gy. Any substantial deviations from this
dose range shall be justified.
The service laboratory shall provide a report, reviewed and endorsed by a qualified expert (i.e., service
laboratory radiobiologist or equivalent) that addresses the following issues:
a) description of the experimental exposure set-up (sample holder, temperature control, etc.) and
procedures to verify reproducibility of exposure set-up for individual experiments;
b) detailing the in vitro calibration data and their fitting to a calibration curve.
6.3 Minimum detection levels
The minimum testing or detection level of dose is a function of the laboratory’s measured control background
levels of dicentrics, the calibration curve coefficients, and the number of cells scored in an analysis. An
accredited laboratory may be able to detect a dose as low as 100 mGy.
7 Responsibility of the customer
This clause includes items that are not controlled by the service laboratory. Prior to blood sampling,
coordination between the customer and the service laboratory should occur. Essential requirements should be
explained to the customer and this may be by a standardized instruction sheet as illustrated in Annex A. The
essential features are the following.
a) Blood sampling should use the collection system, containing lithium heparin as an anticoagulant, which
has been sent or specified by the service laboratory.
b) Blood should be collected (ideally about 10 ml), labelled accurately and unambiguously, maintained at
room temperature (around 20 °C) and sent to the service laboratory as soon as possible.
c) Precautions to ensure the integrity of the container and prevent leakage during shipment shall be
observed. Packaging and labelling shall conform with national and international regulations. If air
transportation is involved, a sheet of X-ray film should be included to monitor whether the sample was
exposed in transit.
d) A questionnaire provided by the service laboratory should be completed and returned promptly.
e) The service laboratory should be alerted about biologically contaminated samples.
8 Responsibility of the service laboratory
The service laboratory shall provide a report, reviewed and endorsed by a qualified expert (i.e., service
laboratory radiobiologist or equivalent) that addresses the following issues.
a) Written procedures shall include an instruction sheet (see Annex A) and pro-forma questionnaire (Annex
B) for the customer, plus all steps from receipt of the sample at the service laboratory through preparation
and scoring of slides for chromosome analysis.
b) This questionnaire should elicit information on whole or partial body exposure, source and quality of the
radiation, circumstances of the exposure, exposure location (country, city, company, etc.), date and time
of exposure, previous occupational or medical exposures to radiation, intake of pharmaceuticals, infection,
smoking habit, and significant exposures to any other DNA-damaging agents (such as organic solvents or
heavy metals).
c) Send the instruction sheet and the questionnaire to the customer.
d) Send, if required, a blood collection system (10 ml) containing lithium heparin as the anticoagulant to the
customer, and if necessary also include the appropriately labelled and addressed packaging material for
the return of the sample to the service laboratory. The packaging should conform to national and/or
international regulations for the transit of potentially infectious pathological specimens (refer to 12.3.2).
e) Handling the blood sample after receipt:
1) document the receipt of the blood sample (date, time, consignee);
2) code the blood sample;
3) document the place of storage until setting up cultures;
4) set up cultures in parallel as soon as possible and document the date, time and operator;
5) document with batch numbers, as appropriate, all reagents used for culturing;
6) document end of culture (date, time, operator);
7) store slides and case documents in an appropriate place for at least 30 years for possible medico-
legal re-evaluation of the case.
9 Scoring unstable chromosome aberrations
9.1 Procedure for scoring first-division metaphases
An important aspect of culturing blood samples for dose estimation by the dicentric plus ring chromosome
aberrations bioassay is the harvest time for metaphase collection. The maximal frequency of unstable
chromosomal aberrations in lymphocytes collected from radiation-exposed individuals occurs in the
first-generation, post-exposure metaphase cells. The standard method used to ensure that only first-
8 © ISO 2004 – All rights reserved
generation metaphase cells are scored is based on the fluorescence plus Giemsa staining (FPG) technique.
An acceptable procedure is to check a replicate slide of the same culture with FPG and, if the frequency of
second or later metaphases is low (below 5 %), a replicate slide stained with Giemsa alone may be scored.
For cultures containing more than 5 % second divisions, only the FPG stained material should be scored.
Alternative techniques are acceptable as long as the methodology is documented and validated. For long-term
storage, mounting the stained slides is required.
9.2 Criteria for scoring
9.2.1 Coding of samples and slides
All samples, slides, and intra- or inter-laboratory validation standards shall be coded. Complete records of
coding shall be maintained.
9.2.2 Scoring techniques
The laboratory head shall establish and implement procedures for the scoring techniques used. When scoring
is at least partially performed with computer-assisted metaphase finding and/or image analysis, the system
used should have been previously subjected to quality assurance trials with results documented.
Methodical scanning of slides is crucial to ensure complete analysis without duplication.
Whilst dicentrics (or dicentrics and centric rings) are invariably used for dose estimation, it is standard practice
in service laboratories for all chromosomal abnormalities to be recorded. A standardized scoring sheet shall
be used with data recorded such that the aberrations in each cell scored are derivable (Annex C). When more
than one scorer contributes to the analysis, each shall analyse a comparable number of metaphases.
9.2.3 Laboratory scoring expertise
Metaphase analyses are to be conducted by trained and experienced observers fully familiar with the scoring
of unstable chromosome aberrations used in biological dosimetry. Documentation validating their expertise
must be maintained.
The laboratory head is responsible for maintaining the scoring criteria and the qualifications of the individual
scorers. All scorers shall participate in intra- and inter-laboratory comparisons.
For an observer to be considered qualified, he/she should normally achieve a dicentric yield that falls within
20 % of the test reference value.
10 Criteria for converting a measured aberration frequency into an estimate of
absorbed dose
10.1 Overview
The measured dicentric (or dicentric plus centric ring) frequency is converted to absorbed dose by reference
to an appropriate in vitro calibration curve produced in the same laboratory with radiation of comparable
quality. This provides an estimate of the average whole body dose. At least 500 cells should be scored from
the case specimen, unless the aberration yield is high, in which case it is not necessary to proceed beyond
100 dicentrics (or dicentric plus centric rings).
10.2 Comparison with controls
The service laboratory shall provide in-case reports (an example is provided in Annex D) of the laboratory’s
background dicentric (or dicentric plus centric ring) level. If the measured aberration yield is not significantly
different from the control frequency, the best estimate of dose should be quoted as zero with its upper
confidence limit. If the measured aberration yield is significantly higher than the control level, a dose estimate
with its uncertainties is derived and reported.
10.3 Determination of estimated dose and confidence limits
The service laboratory shall provide, in result reports, the estimated whole body dose and confidence limits.
Uncertainties would usually be expressed as 95 % confidence limits, although other percentage values may
be quoted, if judged appropriate to a particular case. If the lower confidence limit falls below zero dose, only
the upper limit needs to be quoted.
There is no absolute method for deriving confidence limits; the method is always an approximation because
the uncertainties on the calibration curve are distributed as a normal probability function whilst those on the
measured aberration yield are usually Poissonian or overdispersed. Confidence limits on Poisson
observations may be obtained by calculation or from standard tables. If a measured aberration is
overdispersed with respect to Poisson, the Poisson-derived uncertainty should be increased by the square
root of the ratio of variance to mean.
The most formal method is to express algebraically the derived dose in terms of the measured yield and the
coefficients of the calibration curve. The uncertainty of the dose can then be related to the variances and
covariance of the yield and the coefficients. Such a formula would apply only when the standard error on
curves are small i.e., below 10 %. This procedure is in accordance with the ISO Guide to the expression of
uncertainty in measurement (GUM), for determining combined standard uncertainties.
In practice, this procedure may be simplified by ignoring the uncertainty of the calibration curve, provided that
the standard error is less than 30 % of the standard error on the measured yield. If the curve’s uncertainty is
30 % or more, it should be included when deriving the uncertainty of the dose. This is achieved by combining
the percentage standard errors of the yield and the curve.
The service laboratory will describe, in result reports, the method used to determine the expanded uncertainty
e.g. the 95 % confidence interval, as defined in ISO 5725-1.
The laboratory head shall define the methods used to determine confidence limits.
10.4 Acute and non-acute exposure cases
If an overexposure is known to have been received acutely, i.e. below 0,5 h, the dose estimate may be
obtained by reference to an acute in vitro calibration curve. If an overexposure is known to have been
protracted beyond 24 h, the dose estimate may be obtained by reference to just the background level and
linear coefficients of the acute calibration curve. For exposures of 0,5 to 24 h, if available, the measured yield
may be interpreted from an appropriate non-acute calibration curve. Alternatively, the full acute curve may be
used but with a reduction of the dose-squared coefficient. This may be calculated by the G-function method.
Further explanations of the G-function can be found in the IAEA technical reports.
If an overexposure is known to have been intermittent, its individual fractions may be assumed to be
independent i.e., their effects are additive, if the interfraction interval is above 5 h. If below 5 h, an interaction
factor should be estimated using a 2 h time constant.
The service laboratory shall state, in result reports, the method used to correct for non-acute exposure dose
estimates and, when appropriate, also justify its assumptions.
10.5 Partial-body and prior-exposure cases
In the event of a partial-body exposure to low LET radiation, it may be possible, depending on the particular
circumstances, to interpret the measured aberration yield in terms of an irradiated fraction and its mean dose.
These can be derived by using one or both of two techniques, the Qdr and the Contaminated Poisson
methods. These techniques are detailed in the IAEA technical reports.
Exposure occurring a long time prior to analysis may be underestimated by the dicentric assay. The scoring of
stable chromosome aberrations painted by FISH migh
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 19238
Première édition
2004-08-01
Radioprotection — Critères de
performance pour les laboratoires de
service pratiquant la dosimétrie
biologique par cytogénétique
Radiation protection — Performance criteria for service laboratories
performing biological dosimetry by cytogenetics
Numéro de référence
©
ISO 2004
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Publié en Suisse
ii © ISO 2004 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos. v
Introduction . vi
1 Domaine d'application. 1
2 Termes et définitions . 1
3 Dénombrement des dicentriques . 3
4 Confidentialité des informations personnelles. 4
4.1 Généralités. 4
4.2 Applications du principe de confidentialité . 4
4.2.1 Délégation de responsabilités au sein du laboratoire .4
4.2.2 Demandes d'analyses. 4
4.2.3 Transmission d'informations confidentielles . 4
4.2.4 Anonymat des échantillons. 5
4.2.5 Présentation des résultats . 5
4.2.6 Conservation des données . 5
5 Exigences de sécurité du laboratoire . 5
5.1 Généralités. 5
5.2 Exigences de sécurité microbiologique . 5
5.3 Exigences de sécurité chimique . 5
5.4 Exigences de sécurité optique . 7
5.5 Procédures de sécurité . 7
6 Source(s) d'étalonnage, courbes(s) d'étalonnage et seuils de détection. 7
6.1 Source(s) d'étalonnage. 7
6.2 Courbe(s) d'étalonnage. 7
6.3 Seuils limite de détection. 7
7 Responsabilité du demandeur. 8
8 Responsabilité du laboratoire de service. 8
9 Dénombrement des aberrations chromosomiques instables. 9
9.1 Procédure pour l'analyse des métaphases en première division. 9
9.2 Critères pour le dénombrement . 9
9.2.1 Codage des échantillons et des lames . 9
9.2.2 Techniques de dénombrement. 9
9.2.3 Compétence du laboratoire pour le dénombrement . 9
10 Critères pour convertir une fréquence d'aberration mesurée en une estimation de dose
absorbée . 10
10.1 Généralités. 10
10.2 Comparaison avec les valeurs témoins. 10
10.3 Détermination de l'estimation de dose et des limites de l'intervalle de confiance. 10
10.4 Cas d'exposition aiguë et non aiguë. 11
10.5 Cas d'exposition hétérogène ou ancienne. 11
11 Compte rendu des résultats. 11
11.1 Identification du sujet exposé . 11
11.2 Description du cas . 12
11.3 Obligations du laboratoire de service. 12
11.4 Résultats du laboratoire de service . 12
11.5 Interprétation des résultats. 12
11.6 Responsable du rapport. 12
11.7 Résumé.12
12 Assurance de la qualité et contrôle de la qualité.13
12.1 Généralités.13
12.2 Assurance de la qualité .13
12.2.1 Plan d'assurance de la qualité .14
12.2.2 Personne ou organisation responsable de l'assurance de la qualité.14
12.3 Contrôle de la qualité.15
12.3.1 Procédures de contrôle de la qualité .15
12.3.2 Contrôle de performance du transport des prélèvements.15
12.3.3 Contrôle de performance de l'intégrité des prélèvements par le laboratoire de service .15
12.3.4 Contrôle de performance de l'appareillage .15
12.3.5 Contrôle de performance des protocoles expérimentaux .16
12.3.6 Contrôle de performance de la qualité de dénombrement .16
12.3.7 Contrôle de performance de l'évaluation de la dose et de l'intervalle de confiance.16
12.3.8 Contrôle de performance du rapport d'expertise.16
Annexe A (informative) Instructions pour le demandeur (exemple).17
Annexe B (informative) Exemple de questionnaire .18
Annexe C (informative) Tableau type pour le dénombrement des aberrations chromosomiques .20
Annexe D (informative) Exemple de rapport .21
Bibliographie.22
iv © ISO 2004 – Tous droits réservés
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 19238 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 85, Énergie nucléaire, sous-comité SC 2,
Radioprotection.
Introduction
L'utilisation fréquente de rayonnements ionisants pour des applications médicales, industrielles, agricoles, de
recherche et militaires augmente le risque de surexposition des travailleurs et des personnes du public. La
dosimétrie biologique, basée sur l'étude des aberrations chromosomiques, essentiellement le dénombrement
des dicentriques, est devenue un élément de routine pour l'estimation dosimétrique en cas de surexposition
accidentelle. L'expérience acquise par son utilisation dans des centaines de cas de surexpositions
suspectées ou avérées a prouvé la valeur de cette méthode et a également défini ses limites. Il convient de
souligner que l'analyse cytogénétique est utilisée comme un dosimètre et fournit un des éléments
d'information nécessaires pour évaluer la sévérité d'un accident radiologique.
De nombreuses études chez l'animal et l'homme ont montré qu'il était possible d'établir une bonne corrélation
entre les résultats obtenus in vivo et in vitro. Les relations dose-effet établies in vitro sur des échantillons de
sang irradié peuvent donc être utilisées comme courbes d'étalonnage. Le taux de dicentriques dépendant du
type de rayonnement et du débit de dose, les informations relatives à ces paramètres doivent donc être
précisées pour chaque détermination. Lorsqu'elles sont connues, ces caractéristiques d'exposition sont
importantes pour affiner les estimations de dose. La spécificité de cette technique est renforcée par le fait
qu'on observe en général 1 dicentrique pour 1 000 métaphases dans la population normale, et que cette
fréquence est apparemment indépendante de l'âge et du sexe. La précision de la technique dépend donc du
nombre de cellules observées, du taux de base et de la courbe d'étalonnage utilisée. En théorie, il est
possible de détecter des expositions aussi faibles que 0,01 Gy. Toutefois, pour ces très faibles doses il est
nécessaire d'analyser des dizaines de milliers de métaphases. En pratique, ce niveau de détection n'est ni
faisable, ni nécessaire. La limite supérieure de détection en dose est bien au-delà des niveaux de doses
létales pour les humains.
L'objectif premier de la présente Norme internationale est de fournir des lignes directrices pour tous les
laboratoires de façon à pratiquer la technique des dicentriques en utilisant des procédures documentées et
validées. Deuxièmement, elle peut faciliter la comparaison des résultats obtenus dans différents laboratoires,
en particulier lors de collaborations ou d'intercomparaisons internationales. Enfin, il convient que les
laboratoires récemment désignés pour pratiquer la technique des dicentriques se conforment à la présente
Norme internationale pour l'exécuter de façon reproductible et fiable.
La présente Norme internationale est écrite sous forme de procédures à adopter pour la dosimétrie biologique
en cas de surexpositions impliquant peu de personnes. Les critères requis pour de telles mesures dépendront
le plus souvent des applications des résultats: application en radioprotection, prise en charge médicale si
nécessaire, enregistrement et exigences légales. Dans le cas particulier d'un accident d'irradiation impliquant
de très nombreuses personnes, et en présence de ressources limitées, la technique peut être utilisée pour un
tri en urgence. Les critères recommandés dans la présente Norme internationale pour le dénombrement
seraient alors assouplis en fonction de la situation.
Une partie de l'information contenue dans la présente Norme internationale est incluse dans d'autres guides
et publications scientifiques internationales et principalement dans le document sur la Dosimétrie Biologique
dans la Série de Rapports Techniques de l'Agence Internationale de l'Énergie Atomique (AIEA). Malgré cela,
la présente Norme internationale développe et normalise l'assurance de la qualité et le contrôle qualité, les
critères d'accréditation et l'évaluation des performances. La présente Norme internationale se conforme en
général avec l'ISO/IEC 17025, avec une attention particulière portée aux besoins spécifiques de la dosimétrie
biologique. L'expression des incertitudes dans les estimations de dose indiquée dans la présente Norme
internationale est en accord avec le «Guide pour l'expression de l'incertitude de mesure» (GUM) et l'ISO 5725,
portant sur l'exactitude (justesse et fidélité) des résultats et des méthodes de mesure.
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NORME INTERNATIONALE ISO 19238:2004(F)
Radioprotection — Critères de performance pour les
laboratoires de service pratiquant la dosimétrie biologique par
cytogénétique
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale fournit des critères pour l'assurance de la qualité et le contrôle de qualité,
l'évaluation des performances et l'accréditation des laboratoires de service pratiquant la dosimétrie biologique
par cytogénétique.
La présente Norme internationale porte sur
a) la confidentialité des informations personnelles pour le demandeur et le laboratoire de service,
b) les exigences en sécurité pour le laboratoire,
c) les sources d'étalonnage et les gammes de doses d'étalonnage utiles pour établir les courbes dose-effet
de référence permettant l'estimation de dose à partir de la fréquence des aberrations chromosomiques,
et les seuils de détection,
d) la procédure de dénombrement des aberrations chromosomiques instables utilisées pour la dosimétrie
biologique,
e) les critères pour convertir une fréquence mesurée d'aberrations en une estimation de dose absorbée,
f) la présentation des résultats,
g) l'assurance de la qualité et le contrôle de qualité, et
h) ses annexes informatives présentent des exemples de questionnaire, d'instructions pour les demandeurs,
de feuille de résultats pour enregistrer les aberrations et de rapport.
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
acentrique
fragment chromosomique terminal ou interstitiel de taille variable
NOTE Quand il est formé indépendamment d'une aberration chromosomique sous la forme d'un dicentrique ou d'un
anneau centrique, il est habituellement considéré comme un acentrique en excès.
2.2
taux de base
fréquence spontanée (ou nombre) d'aberrations chromosomiques dénombrées sur des échantillons ou des
individus témoins
2.3
biais
erreur statistique à l'échantillonnage ou lors de la mesure qui est due au fait de favoriser systématiquement
certaines issues par rapport à d'autres
2.4
anneau centrique
chromosome circulaire aberrant résultant de la jonction de deux points de cassures sur les différents bras
d'un même chromosome
NOTE Il est généralement accompagné par un fragment acentrique.
2.5
centromère
région spécialisée sous forme d'une constriction d'un chromosome, qui apparaît pendant la mitose comme
réunissant les paires chromatidiennes
2.6
intervalle de confiance
intervalle statistique autour d'une quantité estimée à l'intérieur de laquelle la valeur de la quantité est attendue
avec une certaine probabilité spécifiée
2.7
chromosome
structure qui porte l'information génétique
NOTE Normalement, 46 de ces structures sont contenues dans le noyau d'une cellule humaine. Pendant la division
nucléaire ils se condensent pour former des éléments de forme caractéristique.
2.8
chromatide
un des deux brins d'un chromosome dupliqué qui sont réunis par un seul centromère et se séparent pendant
la division cellulaire pour s'individualiser comme des chromosomes
2.9
dicentrique
chromosome aberrant portant deux centromères résultant de la jonction de morceaux de deux chromosomes
cassés
NOTE Il est en général accompagné par un fragment acentrique.
2.10
FISH
hybridation in situ fluorescente
technique basée sur l'utilisation de séquences spécifiques d'ADN comme sondes pour des régions
particulières du génome, permettant de surligner ou «peindre» des régions chromosomiques en différentes
couleurs par la fixation de divers fluorochromes
NOTE Cette technique permet la détection de dommages impliquant des échanges entre des morceaux d'ADN
(habituellement des chromosomes entiers) peints différemment
2.11
interphase
période d'un cycle cellulaire entre deux divisions mitotiques
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2.12
TLE
transfert linéique d'énergie
quotient de dE/dl, défini par la Commission Internationale sur les Unités et les Mesures de Rayonnement
(ICRU) comme l'énergie moyenne (dE) localement déposée dans le milieu par une particule chargée, par
unité de longueur de la trajectoire parcourue (dl)
NOTE En d'autres termes, c'est le taux de transfert d'une énergie radiative aux tissus
2.13
métaphase
étape de la mitose quand la membrane nucléaire est dissoute, les chromosomes condensés au maximum et
alignés pour la division
2.14
seuil limite de détection
SLD
quantité la plus faible mesurable (par exemple fréquence ou dose) qui sera détectée avec une probabilité β de
non-détection (erreur de Type II) tout en acceptant une probabilité α de décider par erreur qu'une quantité
positive (différente de zéro) est présente dans un échantillon témoin approprié (erreur de Type I)
2.15
précision
concept utilisé pour décrire la dispersion des mesures par rapport à une valeur moyenne ou une tendance
centrale
2.16
assurance de la qualité
actions planifiées et systématiques nécessaires pour apporter l'assurance qu'un procédé, une mesure ou un
service satisferont à des exigences spécifiées de qualité, comme, par exemple, celles spécifiées dans la
pratique du laboratoire de service
2.17
contrôle de la qualité
partie de l'assurance de la qualité qui a pour objectif de vérifier que les systèmes et les composants sont en
conformité avec les exigences prédéfinies
2.18
laboratoire de service
laboratoire pratiquant des expertises par dosimétrie biologique
3 Dénombrement des dicentriques
Le dénombrement des aberrations chromosomiques dicentriques observées dans les lymphocytes humains
cultivés au stade de la métaphase est la méthode recommandée en dosimétrie biologique.
Les lymphocytes sont cultivés suivant un procédé qui permet de reconnaître les cellules en première division
(voir 9.1). Cela nécessite du sang total ou des lymphocytes isolés des autres éléments du sang, incubés dans
un milieu de culture permettant le dénombrement des métaphases de première génération. Un agent
mitotique, colcémide ou colchicine, est ajouté pour arrêter la division des lymphocytes en métaphase. La
durée de la culture et la période d'incubation de l'agent bloquant sont optimisés pour assurer un index
mitotique adéquat et une majorité de métaphases de première division.
Les métaphases sont recueillies par centrifugation, placées dans une solution hypotonique et fixées dans un
mélange d'alcool et d'acide acétique. Les cellules fixées sont étalées sur des lames de microscope et
colorées. Il convient que le protocole exact de la culture des cellules, du recueil des métaphases et de leur
coloration, qui est employé par le laboratoire de service, soit clairement formalisé (voir l'Article 12).
Les lames de microscope colorées sont méthodiquement parcourues pour identifier des chromosomes
dicentriques (voir 9.2). La fréquence de dicentriques dénombrés dans un nombre approprié de métaphases
est convertie en une estimation de dose de rayonnement ionisant par référence à une courbe d'étalonnage
(voir l'Article 10).
4 Confidentialité des informations personnelles
4.1 Généralités
Les investigations par la méthode de dosimétrie biologique pratiquées par un laboratoire de service doivent
être effectuées en accord avec les réglementations nationales concernant la confidentialité. Cela inclut
normalement la confidentialité de l'identité du patient, de ses données médicales et de son statut social. De
plus il convient de maintenir la confidentialité commerciale de l'employeur du patient et de toutes les autres
organisations impliquées dans un accident/incident radiologique.
Cette exigence s'étend
a) aux communications écrites, électroniques ou verbales entre le laboratoire et la personne/organisation
demandant l'analyse et recevant le rapport, et
b) à la protection des informations confidentielles détenues au sein de l'organisation à laquelle appartient le
laboratoire de service.
4.2 Applications du principe de confidentialité
4.2.1 Délégation de responsabilités au sein du laboratoire
Le chef du laboratoire peut autoriser un nombre limité de membres du laboratoire à manipuler des documents
en relation avec l'analyse. Les personnes ayant cette autorisation doivent avoir signé un engagement de
confidentialité concernant leurs activités au sein du laboratoire.
Le chef du laboratoire doit conserver les engagements de confidentialité signés et assurer la sécurité de tous
les documents confidentiels.
4.2.2 Demandes d'analyses
En fonction de la réglementation nationale, il convient que la demande d'analyse soit normalement faite par
un médecin représentant le patient ou par le patient lui-même, ou encore soit requise dans un cadre légal.
Dans tous les cas le prélèvement de sang pour l'analyse chromosomique doit être effectué avec le
consentement informé du patient. Le chef du laboratoire, en fonction de la réglementation nationale, peut être
obligé de garder une trace du consentement informé du patient.
4.2.3 Transmission d'informations confidentielles
Quel que soit le moyen de communication choisi, la confidentialité doit être assurée pendant l'échange
d'informations et dans les rapports entre le laboratoire de service et le demandeur de l'analyse.
Le chef de laboratoire doit avoir préalablement défini tous les moyens pour transmettre les informations en
garantissant leur confidentialité.
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4.2.4 Anonymat des échantillons
Le chef de laboratoire doit avoir établi des protocoles pour préserver l'anonymat des échantillons. Pour éviter
l'identification du patient tout en garantissant la traçabilité de l'analyse, il convient de coder les échantillons de
sang dès leur arrivée dans le laboratoire de service. Le codage est effectué de façon à éviter toute ambiguïté
selon une procédure standardisée. Le même code doit être utilisé pour toutes les étapes de l'analyse. Le
code est attribué par une personne autorisée comme défini en 4.2.1. Le décodage, l'interprétation des
résultats et la rédaction du rapport doivent également être effectués par une personne autorisée.
4.2.5 Présentation des résultats
Le rapport final contenant les résultats et leur interprétation (si nécessaire) est communiqué au demandeur de
l'analyse. En fonction de la réglementation nationale, des copies peuvent, avec les accords appropriés, être
transmises à d'autres personnes responsables.
4.2.6 Conservation des données
Le chef de laboratoire doit définir la manière de stocker les données et les résultats. Tous les documents du
laboratoire en relation avec une expertise et qui pourraient permettre l'identification du patient et/ou de
l'employeur doivent être placés dans un lieu accessible seulement aux personnes autorisées. Les documents
doivent être conservés dans un endroit approprié pendant au minimum 30 ans pour une possible nouvelle
évaluation médico-légale du cas. L'élimination des documents doit être effectuée par des moyens sûrs,
comme le déchiquetage.
5 Exigences de sécurité du laboratoire
5.1 Généralités
Le personnel devra se conformer à la législation nationale et aux bonnes pratiques concernant la sûreté dans
les laboratoires. Il y a quelques aspects particuliers concernant la sûreté dans les laboratoires de service qui
méritent d'être soulignés. Ils portent sur des considérations microbiologique, chimique, et optique.
5.2 Exigences de sécurité microbiologique
La manipulation de sang humain expose le personnel du laboratoire au risque de transmission de parasites et
d'infections véhiculés par le sang. Il convient que tous les échantillons soient considérés comme
potentiellement infectieux, même lorsqu'on sait qu'ils proviennent de personnes apparemment en bonne santé.
Les échantillons doivent être déballés et manipulés sous une hotte microbiologique de classe 2. La mise en
culture dans une telle enceinte a de plus l'avantage de minimiser les échecs de culture dus à une
contamination microbienne. Il convient que l'utilisation d'objets pointus, par exemple aiguilles hypodermiques,
soit la plus rare possible pour réduire les risques de blessures. Des désinfectants adaptés doivent être
disponibles pour limiter les conséquences des disséminations accidentelles. Tous les déchets biologiques et
le matériel plastique jetable utilisé doivent être stérilisés, par exemple à l'autoclave ou par incinération, avant
leur élimination finale.
Il convient de proposer au personnel les vaccinations disponibles contre les maladies transmissibles par le
sang. La position légale et éthique concernant le test VIH des échantillons de sang dès réception diffère selon
les pays et il convient que les chercheurs suivent les exigences nationales. Il faut noter que lorsque des
échantillons de sang proviennent de l'étranger, selon le pays d'origine, les compagnies aériennes peuvent
exiger de l'expéditeur un certificat attestant que les échantillons ont été testés et sont négatifs pour VIH.
5.3 Exigences de sécurité chimique
Certains produits chimiques et pharmaceutiques sont utilisés en routine dans les procédures couvertes par la
présente Norme internationale. Lorsqu'ils sont présents dans les cultures ou employés pour les procédés de
coloration, ils sont le plus souvent utilisés en faible volume et avec des dilutions telles qu'ils ne présentent
généralement aucun risque pour la santé. Ils sont toutefois préparés et stockés sous forme de solutions
mères concentrées. Les principaux réactifs d'intérêt et leurs phrases de risque selon la convention
internationale (nombres R) sont listés ci-après:
Benzylpénicilline R 42; 43;
Bromodéoxyuridine R 20; 21; 22; 46; 61;
Colcémide R 25;63;
Cytochalasine B R 26; 27; 28; 63;
Colorant Giemsa R 20; 21; 22; 40; 41;
Héparine R 36; 37; 38;
Colorant Hoechst R23; 24; 25; 36; 37; 38;
Phytohémagglutinine R20; 21; 22; 43;
Sulfate de streptomycine R 20; 21; 61.
Clés
R20 Nocif par inhalation;
R21 Nocif par contact avec la peau;
R22 Nocif en cas d'ingestion;
R23 Toxique par inhalation;
R24 Toxique par contact avec la peau;
R25 Toxique en cas d'ingestion;
R26 Très toxique par inhalation;
R27 Très toxique par contact avec la peau;
R28 Très toxique en cas d'ingestion;
R36 Irritant pour les yeux;
R37 Irritant pour les voies respiratoires;
R38 Irritant pour la peau;
R40 Possible risque d'effets irréversibles;
R41 Risque de lésions oculaires graves;
R42 Peut entraîner une sensibilisation en cas d'inhalation;
R43 Peut entraîner une sensibilisation par contact avec la peau;
R46 Peut provoquer des altérations génétiques héréditaires;
R61 Risque pendant la grossesse d'effets néfastes pour l'enfant;
R63 Possible risque pendant la grossesse d'effets néfastes pour l'enfant.
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5.4 Exigences de sécurité optique
Lorsque des lampes à ultraviolet sont utilisées pour stériliser l'intérieur des hottes de microbiologie ou pour
exposer les lames lors de la procédure de coloration FPG, des protections et les procédures de travail
adaptées doivent être mises en œuvre pour éviter l'exposition directe de la peau ou des yeux des personnels
du laboratoire.
5.5 Procédures de sécurité
Le chef de laboratoire doit établir des procédures écrites pour la protection contre les risques
microbiologiques, chimiques, et optiques.
Le chef de laboratoire doit conserver une trace des accidents et proposer des protocoles ou procédures pour
éviter que des accidents semblables ne se reproduisent.
6 Source(s) d'étalonnage, courbes(s) d'étalonnage et seuils de détection
6.1 Source(s) d'étalonnage
Le laboratoire de service doit fournir un rapport, revu et signé par un expert qualifié (physicien des radiations
ou chef du laboratoire de service), qui porte sur les points suivants:
a) caractérisation de la (des) source(s) de rayonnements utilisée(s) pour obtenir chaque courbe
d'étalonnage in vitro et la traçabilité par référence à un rayonnement étalon national/international;
b) description du protocole de dosimétrie, de la procédure certifiant que la méthode dosimétrique est
calibrée à partir d'un standard, de la méthode utilisée pour mesurer l'homogénéité de la dose dans le
dispositif expérimental, ainsi que des procédures écrites et de la documentation pour vérifier les
déterminations de doses et débit de dose pour chaque expérience;
c) rédaction d'un bref rapport sur la dosimétrie pour chaque courbe d'étalonnage.
6.2 Courbe(s) d'étalonnage
La sélection de la gamme de dose pour l'étalonnage dépendra du type de rayonnement. En cas de
rayonnement photonique de faible TLE, il convient de sélectionner au moins 7 doses, réparties à part égale
entre les régions linéaire et quadratique de la courbe dose-réponse. Les doses classiques pour une courbe
d'étalonnage à faible TLE vont de 0,25 à 4 Gy, bien qu'il soit souhaitable de disposer de données pour des
doses plus faibles, par exemple 0,1 ou 0,15 Gy. Toute déviation notable par rapport à cette gamme de dose
devra être justifiée.
Le laboratoire de service doit fournir un rapport, revu et signé par un expert qualifié (par exemple
radiobiologiste du laboratoire de service ou équivalent), qui donne les informations suivantes:
a) description du dispositif expérimental d'exposition (support d'échantillon, contrôle de température, etc.) et
procédures pour vérifier la reproductibilité du dispositif d'exposition pour chaque expérience;
b) description des données d'étalonnage in vitro et de leur ajustement pour établir la courbe d'étalonnage.
6.3 Seuils limite de détection
Le seuil limite de test ou de détection de la dose dépend du taux de base de dicentriques mesuré par le
laboratoire des coefficients de la courbe d'étalonnage; et du nombre de cellules comptées pour une analyse.
Un laboratoire accrédité doit être capable de détecter une dose aussi faible que 100 mGy.
7 Responsabilité du demandeur
Cet article inclut des points qui ne sont pas contrôlés par le laboratoire de service. Avant le prélèvement de
sang, il convient qu'une coordination entre le demandeur et le laboratoire de service ait lieu. Il convient
d'expliquer les exigences fondamentales au demandeur, et ceci peut se faire par une feuille d'instructions
standardisée comme celle présentée en Annexe A. Les points essentiels sont les suivants.
a) Il convient de prélever le sang à l'aide d'un dispositif contenant de l'héparine de lithium comme
anticoagulant qui a été envoyé ou spécifié par le laboratoire de service.
b) Il convient de récolter le sang (idéalement environ 10 ml), étiqueté de façon fiable et sans ambiguïté,
conservé à température ambiante (environ 20 °C) et envoyé au laboratoire de service dès que possible.
c) Des précautions doivent être prises pour assurer l'intégrité du conteneur de transport et éviter les fuites
pendant l'expédition. L'emballage et l'étiquetage doivent être conformes aux réglementations nationales
et internationales. En cas de transport aérien, il convient qu'un film sensible aux rayons X soit inclus pour
vérifier si l'échantillon a été exposé pendant le transit.
d) Il convient qu'un questionnaire fourni par le laboratoire de service soit complété et retourné rapidement.
e) Il convient d'alerter le laboratoire de service en cas de contamination biologique.
8 Responsabilité du laboratoire de service
Le laboratoire de service doit fournir un rapport, revu et signé par un expert qualifié (par exemple un
radiobiologiste ou le chef du laboratoire de service), qui porte sur les points suivants.
a) Les procédures écrites doivent comporter une feuille d'instructions (voir l'Annexe A) et un questionnaire
proforma (voir l'Annexe B) pour le demandeur, plus la description de toutes les étapes depuis la réception
de l'échantillon au laboratoire de service jusqu'à la préparation des lames pour l'analyse des
chromosomes.
b) Il convient que ce questionnaire apporte des informations sur l'exposition globale ou partielle du corps, la
source et la nature du rayonnement, les circonstances de l'exposition, le lieu de l'exposition (pays, ville,
entreprise, etc.), la date et l'heure de l'exposition, les expositions antérieures aux rayonnements ionisants,
qu'il s'agisse d'expositions professionnelles ou médicales, la prise de médicaments, les infections, la
consommation de tabac, et toute exposition significative à d'autres agents génotoxiques (tels que des
solvants organiques ou des métaux lourds).
c) Envoyer la feuille d'instructions et le questionnaire au demandeur.
d) Si nécessaire, envoyer au demandeur un dispositif de prélèvement de sang (10 ml) contenant de
l'héparine de lithium comme anticoagulant, et si nécessaire également, un emballage correctement
étiqueté et adressé pour l'envoi de l'échantillon au laboratoire de service. Il convient que l'emballage soit
conforme aux règlements nationaux et/ou internationaux pour le transfert d'échantillons biologiques
potentiellement infectieux (se référer à 12.3.2).
e) Le traitement de l'échantillon de sang doit comporter les étapes suivantes dès sa réception:
1) documentation de la réception de l'échantillon de sang (date, heure, destinataire, nom de la
personne qui réceptionne le colis);
2) codage de l'échantillon de sang;
3) documentation du lieu de stockage jusqu'à la mise en culture;
4) mise en culture en parallèle dès que possible et documentation de la date, de l'heure et du nom du
manipulateur;
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5) documentation de tous les réactifs utilisés pour la culture en indiquant les numéros de lots (si
justifié);
6) documentation de la fin de la culture (date, heure et nom du manipulateur);
7) conservation des lames et des documents concernant le cas dans un endroit adapté pendant au
minimum 30 ans pour une possible nouvelle évaluation médico-légale du cas.
9 Dénombrement des aberrations chromosomiques instables
9.1 Procédure pour l'analyse des métaphases en première division
Un aspect important de la culture d'échantillons de sang pour une estimation dosimétrique par la technique
des aberrations chromosomiques, dicentriques et anneaux centriques est le temps d'arrêt pour collecter les
métaphases. La fréquence maximale des aberrations chromosomiques instables dans les lymphocytes
prélevés sur des personnes irradiées est observée dans les cellules en métaphase de première génération
après l'exposition. La méthode standard, utilisée pour vérifier que seules les métaphases de première
génération sont analysées, est basée sur la technique de coloration «fluorescence plus Giemsa» (FPG). Une
procédure acceptable est d'analyser une lame de la même culture avec la technique FPG et, si la fréquence
de métaphases de seconde génération ou plus est faible (inférieure à 5 %), une autre lame colorée seulement
au Giemsa peut être analysée. Pour les cultures contenant plus de 5 % de métaphases de deuxième division,
il convient d'analyser seulement le matériel coloré FPG. D'autres techniques sont acceptables pour autant
que la méthodologie soit documentée et validée. Pour la conservation à long terme, les lames colorées
doivent être montées avec une lamelle couvre-objet.
9.2 Critères pour le dénombrement
9.2.1 Codage des échantillons et des lames
Tous les échantillons, lames et étalons de validation intralaboratoire ou interlaboratoire doivent être codés. Un
enregistrement complet du codage doit être conservé.
9.2.2 Techniques de dénombrement
Le chef de laboratoire devra établir et mettre en œuvre des procédures pour les techniques de dénombrement
utilisées. Lorsque le dénombrement est partiellement effectué à l'aide d'une reconnaissance automatique de
métaphases et/ou d'un système d'analyse d'images, il convient que le système utilisé soit, au préalable,
soumis à des tests d'assurance de la qualité avec des résultats documentés.
Il est indispensable que les lames soient lues méthodiquement pour assurer une analyse complète sans
duplication.
Bien que les dicentriques (ou les dicentriques et anneaux centriques) soient toujours utilisés pour l'estimation
dosimétrique, il est habituel dans les laboratoires de service de noter toutes les anomalies chromosomiques.
Une feuille standardisée de décompte doit être utilisée pour enregistrer les résultats de telle sorte que les
aberrations dans chaque cellule analysée puissent être retrouvées (voir l'Annexe C). Lorsque plus d'une
personne contribue à l'analyse, chacune d'entre elles doit analyser un nombre comparable de métaphases.
9.2.3 Compétence du laboratoire pour le dénombrement
L'analyse des métaphases doit être effectuée par des observateurs entraînés et expérimentés parfaitement
familiarisés avec le dénombrement des aberrations chromosomiques instables utilisées pour la dosimétrie
biologique. Les documents attestant leur expertise doivent être conservés.
Le chef de laboratoire est responsable de la conservation des résultats de dénombrement et des
qualifications de chaque observateur. Tous les observateurs doivent participer à des comparaisons
intralaboratoire et interlaboratoires.
Pour qu'un observateur soit considéré comme qualifié, il convient qu'il/elle obtienne un taux de dicentriques
situé à moins de 20 % de la valeur de référence test.
10 Critères pour convertir une fréquence d'aberration mesurée en une estimation
de dose absorbée
10.1 Généralités
La fréquence observée de dicentriques (ou de dicentriques plus anneaux centriques) est convertie en une
dose absorbée par référence à une courbe d'étalonnage produite in vitro dans le même laboratoire avec un
rayonnement de qualité comparable. Cela permet une estimation de la dose moyennée au corps entier. Il
convient de conserver au moins 500 cellules pour chaque cas, à moins que la fréquence d'aberration ne soit
élevée. Dans ce cas, il n'est pas nécessaire d'aller au-delà de 100 dicentriques (ou dicentriques plus anneaux
centriques).
10.2 Comparaison avec les valeurs témoins
Le laboratoire de service fournit dans son rapport (pour un exemple voir l'Annexe D), le niveau du bruit de
fond du laboratoire pour les dicentriques (ou dicentriques plus anneaux centriques). Si la fréquence
d'aberr
...
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