ISO 11063:2012

NORME ISO
INTERNATIONALE 11063
Première édition
2012-02-01
Qualité du sol — Méthode pour extraire
directement l’ADN d’échantillons de sol
Soil quality — Method to directly extract DNA from soil samples
Numéro de référence
©
ISO 2012
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction . v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Matériel d’essai . 2
5.1 Sol . 2
5.2 Substances chimiques . 2
5.3 Tampons et réactifs . 3
6 Appareillage . 4
7 Modes opératoires . 4
7.1 Préparation des échantillons de sol . 4
7.2 Lyse mécano-chimique . 4
7.3 Précipitation des protéines . 4
7.4 Précipitation et rinçage des acides nucléiques . 4
7.5 Conservation des acides nucléiques . 4
8 Estimation de la qualité et de la quantité d’ADN du sol . 5
8.1 Qualité et pureté de l’ADN du sol . 5
8.2 Quantité d’ADN du sol. 5
9 Validation du mode opératoire d’extraction . 5
10 Étude interlaboratoires internationale . 5
11 Rapport d’essai . 5
Annexe A (informative) Étude interlaboratoires internationale pour évaluer le mode opératoire
d’extraction de l’ADN du sol . 7
Bibliographie .22
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits
de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir
identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 11063 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Méthodes biologiques.
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Introduction
L’ADN (acide désoxyribonucléique) est un composant essentiel des organismes vivants codant pour les
enzymes responsables de leurs activités biologiques. L’étude des séquences d’ADN extraits de différentes
matrices biologiques, à l’aide de nombreuses approches moléculaires, permet de fournir des marqueurs
moléculaires qui peuvent être utilisés pour différencier et identifier clairement différents organismes (bactéries,
archées et eucaryotes).
Jusqu’à présent, la plupart des études visant à développer des indicateurs microbiens de la qualité du sol et
applicables aux milieux complexes, tels que le sol, étaient biaisées par la nature incultivable de nombreux micro-
[16]
organismes et par le manque de sensibilité des méthodes microbiologiques classiques . Le développement
récent de nombreuses méthodes de biologie moléculaire reposant principalement sur l’amplification des acides
nucléiques extraits du sol a permis de proposer une alternative pertinente à la microbiologie pasteurienne,
pour fournir des informations précieuses sur la composition, la richesse et la structure des communautés
[15], [18], [26], [27], [36]
microbiennes . Les approches reposant sur l’ADN sont désormais bien établies dans le
domaine de l’écologie microbienne des sols et servent de marqueurs génotypiques (= marqueurs moléculaires)
permettant d’évaluer la diversité microbienne.
Les résultats d’analyses moléculaires des communautés et/ou populations microbiennes du sol reposent sur
deux paramètres principaux:
a) l’extraction d’ADN représentatif de la composition de la communauté bactérienne indigène;
b) les biais introduits par la PCR, notamment le choix des amorces oligonucléotidiques, la concentration en
[23], [26], [38], [40]
ADN amplifié, les erreurs de la PCR ou encore la méthode d’analyse choisie . Récemment,
de nombreuses études ont été menées sur de nouvelles méthodes permettant d’améliorer l’extraction, la
[20]
purification, l’amplification et la quantification de l’ADN des sols .
L’objectif de la présente Norme internationale est de décrire le mode opératoire utilisé pour extraire directement
l’ADN des échantillons de sol. La reproductibilité de ce mode opératoire d’extraction de l’ADN du sol a été
évaluée dans le cadre d’une étude interlaboratoires internationale (Annexe A). La reproductibilité de ce mode
opératoire d’extraction de l’ADN du sol a été évaluée avec succès aussi bien par des approches moléculaires
quantitatives (q-PCR) que qualitatives (A-RISA).
NORME INTERNATIONALE ISO 11063:2012(F)
Qualité du sol — Méthode pour extraire directement l’ADN
d’échantillons de sol
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode pour extraire directement l’ADN d’échantillons de
sol en vue d’analyser la structure globale et l’abondance des communautés microbiennes du sol en utilisant
des techniques de PCR. Cette méthode est principalement destinée aux sols agricoles et forestiers. Cette
méthode peut ne pas être appropriée aux sols riches en matières organiques (par exemple sols de tourbières)
ou aux sols très pollués par des polluants organiques ou des métaux lourds.
L’extraction directe de l’ADN d’échantillons de sol fournit des informations précieuses sur l’abondance et
la structure des communautés microbiennes qui sont des paramètres clés pour estimer la biodiversité des
communautés microbiennes telluriques. Les approches moléculaires utilisant l’amplification PCR (amplification
en chaîne par polymérisation) de l’ADN extrait du sol offrent des perspectives prometteuses et peuvent
contribuer, dans un futur proche, au développement d’outils de routine permettant de surveiller la qualité de la
composante microbienne des sols.
L’utilisateur de la méthode doit savoir que, même si le sol soumis au mode opératoire d’extraction de l’ADN
est soigneusement tamisé (mailles de 2 mm, mode opératoire décrit en 5.1), des résidus végétaux peuvent
demeurer dans les échantillons de sol et de ce fait, l’extrait d’ADN prélevé du sol peut être contaminé par des
traces d’ADN végétal.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l’application du présent document. Pour les
références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence (y compris les éventuels amendements) s’applique.
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage ― Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l’évaluation en laboratoire des processus,
de la biomasse et de la diversité microbiens
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
ADN du sol
ADN extrait de micro-organismes vivant dans le sol et ADN de micro-organismes morts persistant
4 Principe
L’ADN est directement extrait d’échantillons de sol de 0,25 g en appliquant le mode opératoire d’extraction
suivant. Cette méthode a permis d’analyser avec fiabilité la structure globale des communautés bactériennes
et archées et peut être adaptée (extraction à partir d’un échantillon de sol de 1 g) pour évaluer la structure
[32]
globale des communautés fongiques . Les échantillons de sol mélangés avec un tampon d’extraction sont
soumis à une lyse mécano-chimique. L’étape de lyse, à l’aide par exemple d’un broyeur à billes est une étape
cruciale pour extraire l’ADN, même de micro-organismes difficiles à lyser. Après une brève centrifugation,
les débris de sol sont éliminés et les protéines sont précipitées avec de l’acétate de potassium. Après
centrifugation, le surnageant est récupéré et les acides nucléiques sont précipités avec de l’isopropanol froid.
Après centrifugation, le culot d’acides nucléiques est rincé avec de l’éthanol à 70 % et est repris dans de l’eau
stérile de qualité biologie moléculaire. La qualité de l’ADN est ensuite contrôlée par électrophorèse en gel
d’agarose et la quantité d’ADN est estimée à l’aide d’un spectrofluorimètre. Une représentation schématique
du mode opératoire est donnée à la Figure 1.
5 Matériel d’essai
5.1 Sol
Il convient de prélever des échantillons de sol et de les tamiser (mailles de 2 mm). Si les échantillons ne sont
pas immédiatement traités, il est recommandé de les conserver pendant deux ans maximum à -20 °C ou
pendant 10 ans maximum à -80 °C ou dans de l’azote liquide (-180 °C) comme spécifié dans l’ISO 10381-6.
Si les échantillons de sol sont congelés, ils ne peuvent être décongelés qu’une seule fois. Certaines de ces
conditions de stockage sont actuellement en cours d’évaluation.
Échantillon de sol
Ajout du tampon d’homogénéisation
Broyage à billes
(30 s, 1 600 g)
1/ Lyse mécano-chimique
Incubation à 70 °C pendant 10 min
Centrifugation
(1 min, 14 000 g, 4 °C)
Lysat de sol
Incubation dans un
Ajout d’acétate de sodium 5 mol/l (1/10 V)
bain de glace
2/ Précipitation des
pendant 10 min
protéines
Centrifugation (5 min, 14 000 g, 4 °C)
Extrait brut
Ajout d’isopropanol glacé (1 V)
3/ Précipitation et
Incubation à -20 °C
rinçage des acides
pendant 15 min
nucléiques
Centrifugation (30 min, 14 000 g, 4 °C)
Ajout d’éthanol glacé
à 70 %
Centrifugation (15 min, 14 000 g, 4 °C)
ADN du sol
Figure 1 — Représentation schématique du mode opératoire d’extraction de l’ADN du sol
5.2 Substances chimiques
5.2.1 Tris[hydroxyméthyl]aminométhane, C H NO (n° CAS 77-86-1).
4 11 3
5.2.2 Sel disodique de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), C H N O Na , 2H O
10 14 2 8 2 2
(n° CAS 6381-92-6).
5.2.3 Chlorure de sodium, NaCl (n° CAS 7647-14-5).
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5.2.4 Dodécylsulfate de sodium (SDS), CH (CH ) OSO Na (n° CAS 151-21-3).
3 2 11 3
5.2.5 Polyvinylpyrrolidone (PVP), [C H NO] (n° CAS 9003-39-8).
6 9 n
5.2.6 Acétate de sodium, CH COONa (n° CAS 6131-90-4).
5.2.7 Acide acétique ou acide acétique glacial, CH COOH (n° CAS 64-19-7).
5.2.8 Isopropanol, CH CHOHCH (n° CAS 67-63-0).
3 3
5.2.9 Éthanol, CH CH OH (n° CAS 64-17-5).
3 2
5.2.10 Eau, qualité biologie moléculaire, H O.
5.3 Tampons et réactifs
Les tampons et les réactifs (à l’exception des agents intercalants) utilisés pour l’extraction de l’ADN du sol
sont stérilisés (120 °C pendant 20 min) et stockés à température ambiante. L’éthanol et l’isopropanol sont
stockés à -20 °C.
5.3.1 Tris-HCl 1 mol/l, 121,14 g de tris dans 1 000 ml de H O, en ajustant avec du HCl 4 mol/l à pH 8,0.
5.3.2 EDTA 0,5 mol/l, 186,10 g d’EDTA dans 1 000 ml de H O, en ajustant avec du NaOH (10 mol/l) à pH 8,0.
5.3.3 NaCl 1 mol/l, 58,44 g de NaCl dans 1 000 ml de H O.
5.3.4 PVP 40 à 20 %, 200 g de PVP dans 1 000 ml de H O.
5.3.5 SDS à 20 %, 200 g de SDS dans 1 000 ml de H O.
5.3.6 Tampon d’homogénéisation (fraîchement préparé juste avant utilisation), 100 ml de tris-HCl 1 mol/l
(pH 8,0), 200 ml d’EDTA 0,5 mol/l (pH 8,0), 100 ml de NaCl 1 mol/l, 50 ml de PVP 40 à 20 %, 100 ml de SDS à
20 % dans 450 ml de H O.
5.3.7 Acétate de sodium 5 mol/l (pH 5,5), 410,15 g de CH COONa dans 800 ml de H O. Ajouter 120 ml
3 2
d’acide acétique et ajuster le pH à 5,5 avec de l’acide acétique glacial. Compléter à 1 000 ml en ajoutant de l’eau.
5.3.8 Éthanol à 70 %, 700 ml d’éthanol pur dans 300 ml de H O.
5.3.9 Tampon TE, pH 8,0, tris-HCl 10 mmol/l, EDTA 1 mmol/l.
5.3.10 Billes de verre (106 µm).
5.3.11 Billes de verre (2 mm).
5.3.12 Bromure d’éthidium, 5 mg de bromure d’éthidium dans 1 000 ml de H O.
5.3.13 Agent intercalant fluorescent des acides nucléiques, excitation à 480 nm et émission à 520 nm.
5.3.14 ADN pur (100 ng/µl).
5.3.15 Tampon TBE × 10, pH 8,0, 108 g de base tris, 55 g d’acide borique, 40 ml d’EDTA 0,5 mol/l (pH 8,0)
dans 1 000 ml de H O.
5.3.16 Tampon TBE × 1, 100 ml de tampon TBE × 10 dans 900 ml de H O.
6 Appareillage
Utiliser un matériel de laboratoire courant, notamment pipettes, centrifugeuse, hotte chimique, système
d’électrophorèse horizontale, ainsi que les éléments suivants.
-1 -1
6.1 Broyeur à billes, avec une fréquence de broyage oscillant par exemple entre 100 min et 2 600 min
avec une amplitude d’agitation de 16 mm.
6.2 Spectrofluorimètre, permettant de quantifier l’ADN double brin avec un agent intercalant fluorescent
(excitation à 480 nm et émission à 520 nm).
7 Modes opératoires
7.1 Préparation des échantillons de sol
Peser 0,25 g de sol tamisé (équivalent masse sèche) dans des microtubes de 2 ml juste avant l’extraction ou
congeler immédiatement l’échantillon de sol dans de l’azote liquide et le conserver au congélateur à -80 °C
jusqu’à ce qu’il soit utilisé.
7.2 Lyse mécano-chimique
Ajouter 0,5 g de billes de verre de 106 µm (porter un masque de protection) et deux billes de verre (2 mm de
diamètre) à l’échantillon de sol. Ajouter 1 ml de tampon d’homogénéisation (composition indiquée en 5.3.6).
Agiter les échantillons de sol à 1 600g pendant 30 s (16 mm d’amplitude) à l’aide d’un broyeur à billes (support
de tube préalablement placé à -20 °C). Incuber à 70 °C pendant 10 min. Centrifuger pendant 1 min à 14 000g
(4 °C). Récupérer soigneusement le surnageant et le transférer dans un nouveau microtube de 2 ml.
7.3 Précipitation des protéines
Ajouter au surnageant obtenu en 7.2 de l’acétate de sodium 5 mol/l (pH 5,5) (composition indiquée en 5.3.7)
dans une proportion de 1/10 du volume de surnageant. Mélanger au vortex et incuber dans un bain de glace
pendant 10 min. Centrifuger pendant 5 min à 14 000g (4 °C). Récupérer soigneusement le surnageant et le
transférer dans un nouveau microtube de 1,5 ml.
7.4 Précipitation et rinçage des acides nucléiques
Réaliser l’ensemble de ces étapes sous une hotte chimique en raison de la dangerosité des vapeurs
d’isopropanol. Les déchets liquides et solides doivent être éliminés comme des déchets chimiques.
Ajouter au surnageant obtenu en 7.3 de l’isopropanol glacé (-20 °C) dans une proportion de 1/1 du volume de
surnageant. Incuber les échantillons à -20 °C pendant 15 min. Centrifuger pendant 30 min à 14 000g (4 °C).
Éliminer soigneusement le surnageant. Rincer le culot d’acides nucléiques avec de l’éthanol glacé à 70 % (ne pas
remettre le culot en suspension). Centrifuger pendant 15 min à 14 000g (4 °C). Éliminer toutes traces d’éthanol
et laisser le culot d’acides nucléiques sécher pendant 15 min à 37 °C. Mettre le culot en suspension dans 100 µl
d’eau stérile de qualité biologie moléculaire ou de tampon TE (pH 8,0) (composition indiquée en 5.3.9).
7.5 Conservation des acides nucléiques
Aliquoter l’ADN du sol (4 × 25 µl) et conserver les échantillons d’ADN à -20 °C jusqu’à ce qu’ils soient utilisés.
Il convient d’éviter la répétition de cycles de décongélation/congélation des extraits d’ADN.
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8 Estimation de la qualité et de la quantité d’ADN du sol
8.1 Qualité et pureté de l’ADN du sol
La qualité et la taille de l’ADN du sol sont contrôlées par électrophorèse en gel d’agarose à 1 % dans du
tampon TBE. Les gels sont colorés avec un agent intercalant approprié (par exemple bromure d’éthidium,
5 mg/l). La pureté de l’ADN du sol est évaluée par spectrophotométrie à 260 nm pour l’analyse de l’ADN et à
[11]
400 nm pour les substances acides humiques .
L’étape de lyse mécano-chimique étant essentielle, il convient qu’elle soit appropriée pour lyser une partie
[39]
représentative des micro-organismes mais qu’elle évite la fragmentation de l’ADN .
Les extraits d’ADN qui demeurent légèrement brunâtres doivent faire l’objet d’une purification.
8.2 Quantité d’ADN du sol
La teneur en ADN du sol est déterminée en utilisant un agent intercalant (5.3.13) qui devient fluorescent lorsqu’il
est intercalé dans la double hélice d’ADN. Une courbe d’étalonnage mettant en correspondance la quantité
d’ADN étalon (5 ng, 10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 150 ng et 200 ng d’ADN pur) et la quantité de fluorescence
quantifiée est établie et utilisée pour estimer la quantité d’ADN extrait du sol. Les mesurages sont effectués à
l’aide d’un spectrofluorimètre (6.2). L’analyse est réalisée avec un logiciel approprié.
La teneur en ADN du sol peut aussi être déterminée en séparant les extraits d’ADN du sol par électrophorèse
en gel d’agarose à 1 %, coloré au bromure d’éthidium et photographié à l’aide d’un système de prise de vue. Des
dilutions d’ADN pur sont incluses dans chaque gel pour établir une courbe d’étalonnage de la concentration en
ADN (1 000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng, 62,5 ng à 31,25 ng). L’intensité du bromure d’éthidium est intégrée afin
d’établir une courbe d’étalonnage pour estimer la concentration en ADN du sol comme décrit précédemment
par la Référence [32].
Enfin, la teneur en ADN du sol peut aussi être déterminée par spectrophotométrie à 260 nm lorsque l’ADN du
sol est faiblement contaminé par des substances acides humiques (400 nm) et des protéines (rapport moyen
A260/A280 de 1,6).
9 Validation du mode opératoire d’extraction
Le laboratoire peut valider le mode opératoire d’extraction de l’ADN du sol en extrayant l’ADN d’un sol de
référence et en comparant le rendement obtenu avec le résultat attendu.
10 Étude interlaboratoires internationale
Cette méthode d’extraction de l’ADN du sol a été évaluée dans le cadre d’une étude interlaboratoires
internationale impliquant neuf laboratoires différents travaillant sur six sols européens d’origine différente. Le
rapport de cette étude interlaboratoires est fourni dans l’Annexe A.
11 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit comprendre les informations suivantes:
a) une référence à la présente Norme internationale, c’est-à-dire l’ISO 11063:2012;
b) le prélèvement du sol, comprenant la date et le lieu (coordonnées GPS) du prélèvement;
c) le traitement et la conservation de l’échantillon de sol (par exemple méthode de tamisage, conditions et
durée de conservation);
d) les caractéristiques physiques et chimiques du sol;
e) la quantité de sol utilisé pour l’extraction de l’ADN;
f) la ou les dates d’extraction;
g) la durée de conservation des acides nucléiques (le cas échéant);
h) les tableaux des résultats comprenant la concentration en extraits d’ADN du sol et la quantité d’ADN
extrait par gramme de sol (équivalent masse sèche);
i) tous détails non spécifiés dans la présente Norme internationale ou qui sont facultatifs ainsi que tous
incidents susceptibles d’avoir affecté les résultats.
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Annexe A
(informative)
Étude interlaboratoires internationale pour évaluer le mode opératoire
d’extraction de l’ADN du sol
A.1 Introduction
Jusqu’à présent, la plupart des études portant sur la diversité microbienne d’écosystèmes complexes, tels que
le sol, étaient biaisées par la nature incultivable de nombreux micro-organismes et par le manque de sensibilité
des méthodes microbiologiques classiques. Au cours des dix dernières années, l’application de nombreuses
méthodes de biologie moléculaire reposant principalement sur l’amplification des acides nucléiques (ADN ou
ADN/ARN) extraits du sol de manière indirecte ou directe a permis de proposer une alternative pertinente
aux méthodes microbiologiques classiques permettant de mieux décrire la composition, la richesse et la
[15], [18], [26], [27], [36]
structure des communautés microbiennes . Les approches reposant sur l’analyse de l’ADN
sont désormais bien établies dans le domaine de l’écologie des sols et servent de marqueurs génotypiques
(= marqueurs génétiques) permettant d’évaluer la diversité microbienne.
Toutefois, les résultats de l’analyse moléculaire des communautés microbiennes reposent principalement sur
deux paramètres cruciaux:
a) l’extraction d’ADN représentatif de la composition de la communauté bactérienne indigène;
b) les biais introduits par la PCR, notamment le choix des amorces oligonucléotidiques, la concentration en
ADN amplifié, les erreurs de la PCR ou encore la méthode d’analyse choisie. Récemment, de nombreuses
études ont été menées sur de nouvelles méthodes permettant d’améliorer l’extraction, la purification,
l’amplification et la quantification de l’ADN des sols.
Bien que des études comparatives aient été effectuées pour analyser l’efficacité des méthodes d’extraction et
de purification de l’ADN récupéré du sol, la reproductibilité de l’extraction de l’ADN du sol au sein de différents
laboratoires n’a pas encore été évaluée. Dans ce contexte, l’objectif de cette étude était par conséquent
d’évaluer la reproductibilité d’une méthode d’extraction de l’ADN du sol développée par la Référence [20].
A.2 Matériel et méthodes
A.2.1 Laboratoires participant à l’étude
Neuf laboratoires situés dans six pays européens (France, Finlande, Allemagne, Espagne, Italie et Suède)
ont participé à l’étude interlaboratoires internationale selon l’organisation suivante. Laboratoire en charge
du programme: INRA/Université de Bourgogne, Laboratoire de Microbiologie du Sol et de l’Environnement,
(Dijon, France). Les laboratoires participants sont énumérés ci-après: Institut National de l’Environnement
Industriel et des Risques, INERIS (Verneuil-en-Halatte, France); IPL santé, environnement durables Est,
Laboratoire Études et Expertises (Nancy, France); Swedish University of Agricultural Sciences (Uppsala,
Suède); GSF Munich (Munich, Allemagne); Julius Kühn-Institut Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen,
JKI (Braunschweig, Allemagne); Università di Catania, DACPA-Sezione Scienze Agrochimiche (Catane, Italie);
CSIC, Estación Experimental del Zaidín (Grenade, Espagne); University of Helsinki (Helsinki, Finlande).
Un groupe de travail composé de chaque scientifique responsable de chaque laboratoire de recherche a été
constitué. Les principaux objectifs du groupe de travail étaient les suivants:
— mise en place de l’étude interlaboratoires;
— analyse et discussion des résultats tirés de cette étude.
Le mode opératoire utilisé pour l’étude interlaboratoires internationale est décrit ci-dessous. Le groupe de
travail a décidé que cette étude ne concernerait que l’évaluation de la reproductibilité de l’extraction d’ADN
du sol. Pour cela, le groupe de travail a décidé que chaque laboratoire devait extraire l’ADN de différents
échantillons de sol en suivant le même protocole. L’analyse approfondie des extraits d’ADN (purification et
analyses de l’ADN) a été conduite par le laboratoire en charge de ce projet (Laboratoire de Microbiologie du
Sol et de l’Environnement, Dijon, France) afin d’éviter tous biais dus à ces deux étapes supplémentaires.
Par conséquent, après extraction de l’ADN du sol, chaque laboratoire participant à ce projet a envoyé ses
extraits au Laboratoire de Microbiologie du Sol et de l’Environnement en vue d’analyses supplémentaires. Dès
réception, les échantillons d’ADN du sol ont été purifiés comme décrit en A.2.4. Les extraits d’ADN du sol ont
été quantifiés sur du gel d’agarose coloré au bromure d’éthidium. Après purification, l’ADN extrait du sol a fait
l’objet d’une analyse par PCR:
a) analyse par PCR quantitative de l’ADNr 16S pour estimer l’abondance totale de la communauté bactérienne
dans les sols étudiés;
b) analyse par PCR quantitative des séquences pcaH et narG pour estimer l’abondance des communautés
microbiennes pcaH et narG dans les sols étudiés;
c) A-RISA (analyse automatique des empreintes RISA) pour étudier la structure globale de la communauté
bactérienne.
A.2.2 Propriétés physico-chimiques du sol et préparation
Le groupe de travail a choisi six sols différents, appelés sols A, B, C, F, M et S (voir Tableau A.1), prélevés dans
différents pays européens. Un sol était contaminé par les HAP (celui prélevé en Finlande), quatre étaient des sols
agricoles (ceux prélevés en Suède et en France) et le dernier était un sol forestier (celui prélevé en Allemagne).
Des échantillons de sols frais ont été tamisés (mailles de 2 mm) et des aliquotes de 250 mg ont été préparées
dans des tubes de 2 ml. Ces aliquotes ont été immédiatement congelées dans de l’azote liquide et conservées
à -80 °C jusqu’à ce qu’elles soient expédiées. Cinq aliquotes de chaque sol ont été envoyées à chaque
laboratoire dans de la glace carbonique où elles ont été conservées à -80 °C jusqu’à ce que l’extraction de
l’ADN soit effectuée.
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Tableau A.1 — Caractéristiques physico-chimiques des sols étudiés
Sol
A B C F M S
Sol Sol Sol Sol Sol Sol
forestier agricole agricole contaminé agricole agricole
par les HAP
% d’argile 17,6 nd 43,2 15,5 43,2 47,8
% de limon 26,9 nd 50,3 26,2 23,7 26,8
% de sable 55,5 nd 6,5 58,3 33,1 25,4
% de C organique 7,55 1,45 1,29 1,12 3,27 1,53
% de N total 0,46 0,12 0,14 0,33 0,36 0,16
C/N 16,5 11,7 9,21 33,5 9,11 9,7
% de matière organique 13,1 2,51 3,25 19,3 5,65 2,66
pH 3.76 6,41 7,50 6,22 7,88 7,99
+
CEC Metson (cmol /kg) 17,8 8,09 nd 10,7 19,9 12,6
% de P O Olsen nd 0,09 0,03 nd 0,26 nd
2 5
nd = non déterminé.
CEC = capacité d’échange cationique.
A.2.3 Extraction de l’ADN du sol
Le mode opératoire utilisé pour l’extraction de l’ADN du sol est conforme à la présente Norme internationale.
Pour résumer, 1 ml d’une solution contenant du tris 100 mmol/l (pH 8,0), de l’EDTA 100 mmol/l, du NaCl
100 mmol/l, de la polyvinylpyrrolidone à 1 % (fraction massique) et du dodécylsulfate de sodium à 2 % (fraction
massique) a été ajouté à 250 mg de sol dans un microtube pour broyeur à billes de 2 ml contenant 0,5 g
de billes de verre de 106 mm et deux billes de verre de 2 mm de diamètre. Les échantillons ont ensuite
été homogénéisés pendant 30 s à 1 600g dans un broyeur à billes (6.1), après quoi les échantillons ont été
centrifugés à 14 000g pendant 1 min à 4 °C. Les surnageants collectés ont été incubés pendant 10 min sur
de la glace avec un volume 1/10 d’acétate de sodium 5 mol/l et centrifugés à 14 000g pendant 5 min. Après
précipitation avec un volume d’isopropanol refroidi à la glace, les acides nucléiques ont été ajoutés avec de
l’éthanol à 70 %. Les extraits d’ADN du sol ont ensuite été envoyés au Laboratoire de Microbiologie du Sol et
de l’Environnement (Dijon, France) dans de la glace carbonique.
Il faut noter que l’ensemble des extractions de l’ADN du sol a été effectué avec deux broyeurs à billes présentant
les mêmes caractéristiques techniques et partagés entre les différents laboratoires participant à ce projet.
A.2.4 Purification de l’ADN du sol
Le mode opératoire utilisé pour la purification de l’ADN du sol comprend deux étapes.
a) Une colonne d’affinité constituée de polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) qui fixe spécifiquement les
acides humiques.
1)
b) Une colonne d’exclusion constituée de Sepharose 4B comme décrit en Référence [20]. Brièvement, les
colonnes de PVPP ont été préparées en plaçant 92 mg à 95 mg (soit 1,2 cm) de poudre de PVPP dans des
2)
colonnes de chromatographie Micro-Spin , après quoi 400 µl de H O ont été ajoutés et les tubes ont été
centrifugés (2 min à 1 000g). L’opération a été répétée deux fois. Pour les colonnes de Sepharose, 1 ml de
Sepharose 4B a été placé dans des colonnes de chromatographie Micro-Spin et centrifugé (2 min à 1 100g),
après quoi les colonnes ont été rincées en ajoutant 500 µl de tampon TE (tris-EDTA, pH 8) et en centrifugeant
les colonnes (2 min à 1 100g). Une fois les colonnes préparées, les extraits d’ADN du sol ont été purifiés en
centrifugeant d’abord l’échantillon à travers une colonne de PVPP (1 000g pendant 4 min à 10 °C). L’éluat a
été collecté puis centrifugé à travers une colonne de Sepharose à 1 500g pendant 4 min (10 °C).
A.2.5 Quantification de l’ADN du sol
La quantité d’ADN extrait du sol a été déterminée après séparation électrophorétique des échantillons dans
des gels d’agarose à 1 %. Après l’électrophorèse, les gels ont été colorés au bromure d’éthidium. Des dilutions
3)
d’ADN de thymus de veau ont été incluses dans chaque gel et une courbe d’étalonnage des concentrations
en ADN (60 ng, 30 ng, 15 ng, 7,5 ng et 3,25 ng) a été utilisée pour estimer la quantité d’ADN dans les extraits
4)
de sol. Les photographies des gels obtenues ont été analysées à l’aide du logiciel ImageQuaNT . La quantité
d’ADN a été déterminée en utilisant la courbe d’étalonnage en mettant en correspondance l’intensité de la
bande d’ADN et la quantité d’ADN, en ng. Le rendement de l’extraction de l’ADN a été calculé d’après les
valeurs par le calcul suivant:
[rendement d’ADN, µg/g de sol] = ADN (ng/µl) × 0,4
Les données ont été analysées en appliquant le test non paramétrique de Kruskal-Wallis (p < 0,05).
A.2.6 Essai d’inhibition
La présence d’inhibiteurs de PCR dans les extraits d’ADN de sol a été étudiée par analyse qPCR en les
5)
mélangeant avec de l’ADN plasmidique utilisé comme contrôle (pGEM-T Easy Vector ). L’essai a été réalisé
sur les extraits d’ADN du sol purifiés et dilués à quatre concentrations différentes: 1 ng/µl, 0,5 ng/µl, 0,1 ng/µl et
0,01 ng/µl. Le plasmide de référence a été amplifié en utilisant les amorces universelles Sp6 et T7, conformément
[13]
au mode opératoire décrit précédemment .
A.2.7 PCR quantitative
L’abondance de la communauté bactérienne totale a été estimée en quantifiant le nombre de séquences
d’ADNr 16S avec des amorces universelles spécifiques des eubactéries: 341f (5’-CCT ACG GGA GGC AGC
1) Sepharose 4B est l’appellation commerciale d’un produit fourni par GE Healthcare Europe GmbH. Cette information
est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande
l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent
aux mêmes résultats.
2) Les colonnes de chromatographie Micro-Spin sont l’appellation commerciale d’un produit fourni par Bio-Rad, États-
Unis. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO
approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est
démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
3) L’ADN de thymus de veau fourni par Bio-Rad, États-Unis, est un exemple de produit approprié disponible sur le
marché. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO
approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est
démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
4) ImageQuaNT est l’appellation commerciale d’un produit fourni par Molecular Dynamics, Ca, États-Unis. Cette
information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou
recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils
conduisent aux mêmes résultats.
5) pGEM-T Easy Vector est l’appellation commerciale d’un produit fourni par Promega, France. Cette information est
donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande
l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent
aux mêmes résultats.
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AG-3’) et 534r (5’-ATT ACC GCG GCT GCT GGC A-3’). Les conditions de PCR étaient les suivantes: 15 min
à 95 °C; 30 cycles de 15 s à 95°C, 30 s à 60 °C, 30 s à 72 °C et 30 s à 80 °C.
L’abondance des communautés bactériennes narG et pcaH a été estimée en quantifiant le nombre de séquences
narG et pcaH, respectivement. Pour l’amplification de narG, les amorces dégénérées narGf (5’-TCG CCS ATY
[30]
CCG GCS ATG TC-3’) et narGr (5’-GAG TTG TAC CAG TCR GCS GAY TCS G-3’) ont été utilisées . Les
conditions de PCR étaient les suivantes: 15 min à 95 °C; 6 cycles de 15 s à 95 °C, 30 s à 63 °C, avec un touch-
down de 1 °C par cycle, et 30 s à 72 °C; 40 cycles de 15 s à 95 °C, 30 s à 58 °C, 30 s à 72 °C et 30 s à 80 °C.
Pour l’amplification des séquences pcaH, les amorces dégénérées de pcaHf (5’-GAG RTS TGG CAR GCS
AAY-3’) et pcaHr (5’-CCG YSS AGC ACG ATG TC-3’) ont été utilisées avec les conditions de PCR suivantes:
15 min à 95 °C; 8 cycles de 15 s à 95 °C, 30 s à 64 °C, avec un touch-down de 0,5 °C par cycle, et 30 s à 72 °C;
[9]
30 cycles de 15 s à 95 °C, 30 s à 60 °C, 30 s à 72 °C et 30 s à 80 °C .
Toutes les analyses qPCR ont été effectuées dans un volume réactionnel final de 15 µl contenant le tampon
6) 7)
PCR SYBR Green (Absolute QPCR SYBR Green Rox ), 100 ng de T4 gp32 , 2 µl d’extrait d’ADN de sol
(0,01 ng/µl) et 2 µmol/l de chaque amorce, excepté pour l’analyse pcaH dans laquelle les amorces ont été
utilisées dans différentes concentrations (pcaHf 2 µmol/l et pcaHr 1,2 µmol/l). Les analyses qPCR ont été
réalisées pour chaque sous-échantillon (n = 5, n = 270). Des contrôles négatifs étaient également inclus dans
tot
toutes les analyses PCR. Pour toutes les analyses, des courbes d’étalonnage ont été obtenues en utilisant
une série de dilutions au dixième d’un plasmide pGEM-T linéarisé (102 à 107 copies) contenant une séquence
d’ARNr 16S ou narG provenant de Pseudomonas aeruginosa PAO1 ou, pour l’analyse pcaH, une séquence
pcaH provenant d’un clone amplifié de l’environnement. Après amplification, des courbes de fusion ont été
produites en augmentant la température de 80 °C à 95 °C.
Les données qPCR ont été analysées en utilisant:
a) le test paramétrique de comparaison multiple de Tukey-Kramer,
b) le test non paramétrique de Kruskal-Wallis, et
c) le test de corrélation de Mantel.
A.2.8 Empreinte génétique par RISA automatique
L’analyse automatique des profils RISA (Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis, A-RISA) a été
utilisée pour étudier la structure des communautés bactériennes dans les six sols analysés au cours de l’étude
interlaboratoires internationale. L’A-RISA a été effectuée sur l’ADN de sol purifié dilué à 0,01 ng/µl. La séquence
intergénique 16S-23S cible de l’ADNr a été amplifiée dans un volume final de 25 µl avec 0,5 µmol/l d’amorces
universelles A-RISA-1552f (5’-TCG GGC TGG ATG ACC TCC TT-3’) et A-RISA-132r (5’-CCG GGT TTC CCC
8)
ATT CGC-3’), 2,5 U d’ADN polymérase Taq et 2 µl de matrice d’ADN.
6) Absolute QPCR SYBR Green Rox est l’appellation commerciale d’un produit fourni par ABgene, France. Cette
information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou
recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils
conduisent aux mêmes résultats.
7) T4 gp32 est l’appellation commerciale d’un produit fourni par QBiogene, France. Cette information est donnée à
l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif
du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes
résultats.
8) ADN polymérase Taq est l’appellation commerciale d’un produit fourni par Appligene Oncor, France. Cette information
est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande
l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent
aux mêmes résultats.
9)
L’amorce A-RISA-1552f a été marquée en 5’ avec l’IRD 800, un fluorochrome . L’amplification PCR a été
10)
effectuée dans un thermocycleur à gradient VentiTM dans les conditions suivantes: 5 min à 94 °C; 35 cycles
de 1 min à 94 °C, 1 min à 55 °C et 2 min à 72 °C; plus un cycle supplémentaire de 15 min à 72 °C.
La qualité des produits PCR A-RISA a été contrôlée par électrophorèse en gel d’agarose à 1 % avec le
11)
marqueur d’ADN Smart Ladder . Les produits ont ensuite été chargés sur un gel de polyacrylamide à 6,5 %
12)
(25 cm de longueur) et séparés dans un système d’analyse d’ADN LiCor 4 300 . Avant de les charger sur le
gel de polyacrylamide, les échantillons ont été dénaturés à 90 °C pendant 3 min. La séparation des fragments
A-RISA a été effectuée pendant 4 h dans les conditions suivantes: 2 000 V, 25 mA et 45 W.
13)
Les données ont été analysées à l’aide du logiciel 1D-Scan . Le logiciel a converti les données brutes de
fluorescence en électrophorégrammes où les pics représentaient les fragments PCR. L’intensité relative des
pics a été calculée en combinant l’option filtre médian et l’intégration gaussienne du logiciel 1D-Scan afin de
calculer la part relative de chaque bande par rapport à l’ensemble des bandes. La taille des fragments PCR
(en paires de base) a été calculée par comparaison avec une gamme étalon constituée de 15 bandes allant
de 206 à 1 119 pb. Les données provenant du logiciel 1D-Scan ont été converties en une matrice rapportant
la présence de bandes (c’est-à-dire les pics) et leur intensité (c’est-à-dire la hauteur des pics) à l’aide du
programme PrepRISA (http://pbil.univ-lyon1.fr/ADE-4/microb/). Une analyse en composantes principales
(ACP) sur la matrice de covariance A-RISA a été réalisée à l’aide du logiciel ADE-4 (http://pbil.univ-lyon1.
fr/ADE-4/home.php).
A.3 Résultats
A.3.1 Rendements d’extraction de l’ADN du sol
Le rendement d’extraction de l’ADN du sol obtenu par chacun des neuf laboratoires participants et provenant
des six sols étudiés est présenté dans le Tableau A.2.
9) Fluorochrome IRD 800 est l’appellation commerciale d’un produit fourni par MWG SA Biotech, Ebersberg, Allemagne.
Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve
ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré
qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
10) VentiTM est l’appellation commerciale d’un produit fourni par Applied Biosystems, États-Unis. Cette information est
donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande
l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent
aux mêmes résultats.
11) Smart Ladder est l’appellation commerciale d’un produit fourni par Eurogentec, Belgique. Cette information est donnée
à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi
exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux
mêmes résultats.
12) Le système d’analyse d’ADN LiCor 4 300 est l’appellation commerciale d’un produit fourni par Biosciences, États-Unis.
Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO a
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