ISO 11063:2012
(Main)Soil quality — Method to directly extract DNA from soil samples
Soil quality — Method to directly extract DNA from soil samples
This International Standard specifies a method for direct extraction of DNA from soil samples to analyse the global structure and the abundance of soil bacterial communities using PCR-based technologies. This method is mainly dedicated to agricultural and forest soils. This method can possibly not be suitable for soils rich in organic matter (e.g. peat soils) or soils heavily polluted with organic pollutants or heavy metals. The direct extraction of DNA from soil samples provides unique insight into the richness and structure of microbial communities which are key parameters to estimate the biodiversity of soil microbiota. Molecular approaches based on PCR (polymerase chain reaction) amplification of soil DNA constitute a promising domain and can contribute in the near future to the development of routine tools to monitor the microbiota of soil environments. Users of the method ought to be aware that although soil submitted to the DNA extraction procedure is sieved thoroughly (2 mm mesh, procedure described in 5.1), plant residues can still remain in soil samples and, as a result, traces of plant DNA can contaminate the soil DNA extract.
Qualité du sol — Méthode pour extraire directement l'ADN d'échantillons de sol
La présente Norme internationale spécifie une méthode pour extraire directement l'ADN d'échantillons de sol en vue d'analyser la structure globale et l'abondance des communautés microbiennes du sol en utilisant des techniques de PCR. Cette méthode est principalement destinée aux sols agricoles et forestiers. Cette méthode peut ne pas être appropriée aux sols riches en matières organiques (par exemple sols de tourbières) ou aux sols très pollués par des polluants organiques ou des métaux lourds. L'extraction directe de l'ADN d'échantillons de sol fournit des informations précieuses sur l'abondance et la structure des communautés microbiennes qui sont des paramètres clés pour estimer la biodiversité des communautés microbiennes telluriques. Les approches moléculaires utilisant l'amplification PCR (amplification en chaîne par polymérisation) de l'ADN extrait du sol offrent des perspectives prometteuses et peuvent contribuer, dans un futur proche, au développement d'outils de routine permettant de surveiller la qualité de la composante microbienne des sols. L'utilisateur de la méthode doit savoir que, même si le sol soumis au mode opératoire d'extraction de l'ADN est soigneusement tamisé (mailles de 2 mm, mode opératoire décrit en 5.1), des résidus végétaux peuvent demeurer dans les échantillons de sol et de ce fait, l'extrait d'ADN prélevé du sol peut être contaminé par des traces d'ADN végétal.
General Information
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11063
First edition
2012-02-01
Soil quality — Method to directly extract
DNA from soil samples
Qualité du sol — Méthode pour extraire directement l’ADN
d’échantillons de sol
Reference number
©
ISO 2012
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Published in Switzerland
ii © ISO 2012 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Test materials . 2
5.1 Soil . 2
5.2 Chemicals . 2
5.3 Buffers and reagents . 3
6 Apparatus . 4
7 Procedures . 4
7.1 Preparation of soil samples . 4
7.2 Mechanical and chemical lyses . 4
7.3 Protein precipitation . 4
7.4 Nucleic acid precipitation and washing . 4
7.5 Nucleic acid storage . 4
8 Estimation of soil DNA quality and quantity . 5
8.1 Soil DNA quality and purity. 5
8.2 Soil DNA quantity . 5
9 Validation of the extraction procedure . 5
10 International ring test . 5
11 Test report . 5
Annex A (informative) International ring test for evaluating soil DNA extraction procedure . 7
Bibliography .21
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International
Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 11063 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological methods.
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Introduction
DNA (deoxyribonucleic acid) is an essential component of any living organism coding for enzymes responsible
for any biological activities. The study of DNA sequences from DNA sources extracted from different matrixes,
by means of numerous molecular approaches, provides molecular markers that can be used to sharply
distinguish and identify different organisms (bacteria, archaea and eucaryotes).
Up to now, most of the studies aiming to develop microbial soil quality indicators applicable to complex
environments, such as soil, were biased by the unculturability of many microorganisms and the lack of sensitivity
[16]
of traditional microbiological methods . The recent development of numerous molecular biology methods
based primarily on amplification of soil-extracted nucleic acids have provided a pertinent alternative to classical
culture-based microbiological methods, providing unique insight into the composition, richness, and structure
[15], [18], [26], [27], [36]
of microbial communities . DNA-based approaches are now well-established in soil ecology
and serve as genotypic (= molecular genetic) markers for determining microbial diversity.
The results of molecular analyses of soil microbial communities and/or populations rely on two main parameters:
a) the extraction of DNA representative of the indigenous bacterial community composition;
b) PCR bias, such as the choice of primers, the concentration of amplified DNA, errors in the PCR, or
[23], [26], [38], [40]
even the method chosen for analysis . Recently, numerous studies have investigated new
[20]
methods to improve extraction, purification, amplification, and quantification of DNA from soils .
The aim of this International Standard is to describe the procedure used to extract DNA directly from soil
samples. The reproducibility of this soil DNA extraction procedure was assessed in an international ring-test
study (Annex A). The reproducibility of this soil DNA extraction procedure was successfully evaluated on both
quantitative (q-PCR) and qualitative (A-RISA) approaches.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 11063:2012(E)
Soil quality — Method to directly extract DNA from soil samples
1 Scope
This International Standard specifies a method for direct extraction of DNA from soil samples to analyse the
global structure and the abundance of soil bacterial communities using PCR-based technologies. This method
is mainly dedicated to agricultural and forest soils. This method can possibly not be suitable for soils rich in
organic matter (e.g. peat soils) or soils heavily polluted with organic pollutants or heavy metals.
The direct extraction of DNA from soil samples provides unique insight into the richness and structure of
microbial communities which are key parameters to estimate the biodiversity of soil microbiota. Molecular
approaches based on PCR (polymerase chain reaction) amplification of soil DNA constitute a promising
domain and can contribute in the near future to the development of routine tools to monitor the microbiota of
soil environments.
Users of the method ought to be aware that although soil submitted to the DNA extraction procedure is sieved
thoroughly (2 mm mesh, procedure described in 5.1), plant residues can still remain in soil samples and, as a
result, traces of plant DNA can contaminate the soil DNA extract.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document
(including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under
aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
soil DNA
DNA extracted from soil-living microorganisms and remaining DNA from dead microorganisms
4 Principle
DNA is directly extracted from 0,25 g soil samples using the following extraction procedure. This method
reliably allowed analysing the global structure of bacterial and archeal communities and could be adapted
[32]
(extraction from a 1 g soil sample) to assess the global structure of fungal communities . Soil samples added
with an extraction buffer are submitted to mechanical and chemical lyses. The lysis step, e.g. by bead beating,
is a crucial step to also extract DNA from microbes that are difficult to lyse. After a brief centrifugation, soil
debris are removed and proteins are precipitated with potassium acetate. After centrifugation, the supernatant
is recovered and nucleic acids are precipitated with ice-cold isopropanol. After centrifugation, the nucleic acids
pellet is washed with 70 % ethanol and suspended in sterile ultra-pure water. DNA quality is then checked by
electrophoresis on an agarose gel and the DNA quantity is estimated using a spectro-fluorimeter. A schematic
overview of the procedure is given in Figure 1.
5 Test materials
5.1 Soil
Soil samples should be collected and sieved (2 mm mesh). If samples are not immediately processed, they
should be stored for up to two years at −20 °C or up to 10 years at −80 °C or in liquid nitrogen (−180 °C) as
specified in ISO 10381-6. If soil samples are frozen, they may be thawed only once. Some of these storage
conditions are currently under testing.
Figure 1 — Schematic overview of soil DNA extraction procedure
5.2 Chemicals
5.2.1 Tris[hydroxymethyl]aminomethane, C H NO (CAS No. 77-86-1).
4 11 3
5.2.2 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA), C H N O Na ·2 H O (CAS No. 6381-92 6).
10 14 2 8 2 2
5.2.3 Sodium chloride, NaCl (CAS No. 7647-14-5).
2 © ISO 2012 – All rights reserved
5.2.4 Sodium dodecyl sulfate (SDS), CH (CH ) OSO Na (CAS No. 151-21-3).
3 2 11 3
5.2.5 Polyvinylpyrrolidone (PVP), [C H NO] (CAS No. 9003-39-8).
6 9 n
5.2.6 Sodium acetate, CH COONa (CAS No. 6131-90-4).
5.2.7 Acetic acid or glacial acetic acid, CH COOH (CAS No. 64-19-7).
5.2.8. Isopropanol, CH CHOHCH (CAS No. 67-63-0).
3 3
5.2.9 Ethanol, CH CH OH (CAS No. 64-17-5).
3 2
5.2.10 Molecular-biology-grade water, H O.
5.3 Buffers and reagents
Buffers and reagents (except intercalent molecules) used for soil DNA extraction are sterilized (120 °C for
20 min) and stored at room temperature. Ethanol and isopropanol are stored at −20 °C.
5.3.1 Tris-HCl, 1 mol/l, 121,14 g of tris in 1 000 ml of H O, adjusting with 4 mol/l HCl to pH 8,0.
5.3.2 EDTA, 0,5 mol/l, 186,10 g of EDTA in 1 000 ml of H O, adjusting with NaOH (10 mol/l) to pH 8,0.
5.3.3 NaCl, 1 mol/l, 58,44 g of NaCl in 1 000 ml of H O.
5.3.4 PVP 40, 20 %, 200 g of PVP in 1 000 ml of H O.
5.3.5 SDS, 20 %, 200 g of SDS in 1 000 ml of H O.
5.3.6 Homogenization buffer (newly prepared just before being used), 100 ml of 1 mol/l tris-HCl (pH 8,0), 200 ml
of 0,5 mol/l EDTA (pH 8,0), 100 ml of 1 mol/l NaCl, 50 ml of 20 % PVP 40, 100 ml of 20 % SDS in 450 ml of H O.
5.3.7 Sodium acetate, 5 mol/l (pH 5,5), 410,15 g of CH COONa in 800 ml of H O. Add 120 ml of acetic acid
3 2
and then adjust the pH to 5,5 with glacial acetic acid. Add water to make up to 1 000 ml.
5.3.8 Ethanol, 70 %, 700 ml of pure ethanol in 300 ml of H O.
5.3.9 TE buffer, pH 8,0, 10 mmol/l tris-HCl, 1 mmol/l EDTA.
5.3.10 Glass beads (106 µm).
5.3.11 Glass beads (2 mm).
5.3.12 Ethidium bromide, 5 mg of ethidium bromide in 1 000 ml of H O.
5.3.13 Fluorescent nucleic acid stain, excitation at 480 nm and emission at 520 nm.
5.3.14 Pure DNA (100 ng/µl)
5.3.15 TBE buffer × 10, pH 8,0, 108 g of tris base, 55 g of boric acid, 40 ml of 0,5 mol/l EDTA (pH 8,0) in
1 000 ml of H O.
5.3.16 TBE buffer × 1, 100 ml of TBE buffer × 10 in 900 ml of H O.
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11063
Première édition
2012-02-01
Qualité du sol — Méthode pour extraire
directement l’ADN d’échantillons de sol
Soil quality — Method to directly extract DNA from soil samples
Numéro de référence
©
ISO 2012
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Publié en Suisse
ii © ISO 2012 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction . v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Matériel d’essai . 2
5.1 Sol . 2
5.2 Substances chimiques . 2
5.3 Tampons et réactifs . 3
6 Appareillage . 4
7 Modes opératoires . 4
7.1 Préparation des échantillons de sol . 4
7.2 Lyse mécano-chimique . 4
7.3 Précipitation des protéines . 4
7.4 Précipitation et rinçage des acides nucléiques . 4
7.5 Conservation des acides nucléiques . 4
8 Estimation de la qualité et de la quantité d’ADN du sol . 5
8.1 Qualité et pureté de l’ADN du sol . 5
8.2 Quantité d’ADN du sol. 5
9 Validation du mode opératoire d’extraction . 5
10 Étude interlaboratoires internationale . 5
11 Rapport d’essai . 5
Annexe A (informative) Étude interlaboratoires internationale pour évaluer le mode opératoire
d’extraction de l’ADN du sol . 7
Bibliographie .22
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits
de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir
identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 11063 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Méthodes biologiques.
iv © ISO 2012 – Tous droits réservés
Introduction
L’ADN (acide désoxyribonucléique) est un composant essentiel des organismes vivants codant pour les
enzymes responsables de leurs activités biologiques. L’étude des séquences d’ADN extraits de différentes
matrices biologiques, à l’aide de nombreuses approches moléculaires, permet de fournir des marqueurs
moléculaires qui peuvent être utilisés pour différencier et identifier clairement différents organismes (bactéries,
archées et eucaryotes).
Jusqu’à présent, la plupart des études visant à développer des indicateurs microbiens de la qualité du sol et
applicables aux milieux complexes, tels que le sol, étaient biaisées par la nature incultivable de nombreux micro-
[16]
organismes et par le manque de sensibilité des méthodes microbiologiques classiques . Le développement
récent de nombreuses méthodes de biologie moléculaire reposant principalement sur l’amplification des acides
nucléiques extraits du sol a permis de proposer une alternative pertinente à la microbiologie pasteurienne,
pour fournir des informations précieuses sur la composition, la richesse et la structure des communautés
[15], [18], [26], [27], [36]
microbiennes . Les approches reposant sur l’ADN sont désormais bien établies dans le
domaine de l’écologie microbienne des sols et servent de marqueurs génotypiques (= marqueurs moléculaires)
permettant d’évaluer la diversité microbienne.
Les résultats d’analyses moléculaires des communautés et/ou populations microbiennes du sol reposent sur
deux paramètres principaux:
a) l’extraction d’ADN représentatif de la composition de la communauté bactérienne indigène;
b) les biais introduits par la PCR, notamment le choix des amorces oligonucléotidiques, la concentration en
[23], [26], [38], [40]
ADN amplifié, les erreurs de la PCR ou encore la méthode d’analyse choisie . Récemment,
de nombreuses études ont été menées sur de nouvelles méthodes permettant d’améliorer l’extraction, la
[20]
purification, l’amplification et la quantification de l’ADN des sols .
L’objectif de la présente Norme internationale est de décrire le mode opératoire utilisé pour extraire directement
l’ADN des échantillons de sol. La reproductibilité de ce mode opératoire d’extraction de l’ADN du sol a été
évaluée dans le cadre d’une étude interlaboratoires internationale (Annexe A). La reproductibilité de ce mode
opératoire d’extraction de l’ADN du sol a été évaluée avec succès aussi bien par des approches moléculaires
quantitatives (q-PCR) que qualitatives (A-RISA).
NORME INTERNATIONALE ISO 11063:2012(F)
Qualité du sol — Méthode pour extraire directement l’ADN
d’échantillons de sol
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode pour extraire directement l’ADN d’échantillons de
sol en vue d’analyser la structure globale et l’abondance des communautés microbiennes du sol en utilisant
des techniques de PCR. Cette méthode est principalement destinée aux sols agricoles et forestiers. Cette
méthode peut ne pas être appropriée aux sols riches en matières organiques (par exemple sols de tourbières)
ou aux sols très pollués par des polluants organiques ou des métaux lourds.
L’extraction directe de l’ADN d’échantillons de sol fournit des informations précieuses sur l’abondance et
la structure des communautés microbiennes qui sont des paramètres clés pour estimer la biodiversité des
communautés microbiennes telluriques. Les approches moléculaires utilisant l’amplification PCR (amplification
en chaîne par polymérisation) de l’ADN extrait du sol offrent des perspectives prometteuses et peuvent
contribuer, dans un futur proche, au développement d’outils de routine permettant de surveiller la qualité de la
composante microbienne des sols.
L’utilisateur de la méthode doit savoir que, même si le sol soumis au mode opératoire d’extraction de l’ADN
est soigneusement tamisé (mailles de 2 mm, mode opératoire décrit en 5.1), des résidus végétaux peuvent
demeurer dans les échantillons de sol et de ce fait, l’extrait d’ADN prélevé du sol peut être contaminé par des
traces d’ADN végétal.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l’application du présent document. Pour les
références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence (y compris les éventuels amendements) s’applique.
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage ― Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l’évaluation en laboratoire des processus,
de la biomasse et de la diversité microbiens
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
ADN du sol
ADN extrait de micro-organismes vivant dans le sol et ADN de micro-organismes morts persistant
4 Principe
L’ADN est directement extrait d’échantillons de sol de 0,25 g en appliquant le mode opératoire d’extraction
suivant. Cette méthode a permis d’analyser avec fiabilité la structure globale des communautés bactériennes
et archées et peut être adaptée (extraction à partir d’un échantillon de sol de 1 g) pour évaluer la structure
[32]
globale des communautés fongiques . Les échantillons de sol mélangés avec un tampon d’extraction sont
soumis à une lyse mécano-chimique. L’étape de lyse, à l’aide par exemple d’un broyeur à billes est une étape
cruciale pour extraire l’ADN, même de micro-organismes difficiles à lyser. Après une brève centrifugation,
les débris de sol sont éliminés et les protéines sont précipitées avec de l’acétate de potassium. Après
centrifugation, le surnageant est récupéré et les acides nucléiques sont précipités avec de l’isopropanol froid.
Après centrifugation, le culot d’acides nucléiques est rincé avec de l’éthanol à 70 % et est repris dans de l’eau
stérile de qualité biologie moléculaire. La qualité de l’ADN est ensuite contrôlée par électrophorèse en gel
d’agarose et la quantité d’ADN est estimée à l’aide d’un spectrofluorimètre. Une représentation schématique
du mode opératoire est donnée à la Figure 1.
5 Matériel d’essai
5.1 Sol
Il convient de prélever des échantillons de sol et de les tamiser (mailles de 2 mm). Si les échantillons ne sont
pas immédiatement traités, il est recommandé de les conserver pendant deux ans maximum à -20 °C ou
pendant 10 ans maximum à -80 °C ou dans de l’azote liquide (-180 °C) comme spécifié dans l’ISO 10381-6.
Si les échantillons de sol sont congelés, ils ne peuvent être décongelés qu’une seule fois. Certaines de ces
conditions de stockage sont actuellement en cours d’évaluation.
Échantillon de sol
Ajout du tampon d’homogénéisation
Broyage à billes
(30 s, 1 600 g)
1/ Lyse mécano-chimique
Incubation à 70 °C pendant 10 min
Centrifugation
(1 min, 14 000 g, 4 °C)
Lysat de sol
Incubation dans un
Ajout d’acétate de sodium 5 mol/l (1/10 V)
bain de glace
2/ Précipitation des
pendant 10 min
protéines
Centrifugation (5 min, 14 000 g, 4 °C)
Extrait brut
Ajout d’isopropanol glacé (1 V)
3/ Précipitation et
Incubation à -20 °C
rinçage des acides
pendant 15 min
nucléiques
Centrifugation (30 min, 14 000 g, 4 °C)
Ajout d’éthanol glacé
à 70 %
Centrifugation (15 min, 14 000 g, 4 °C)
ADN du sol
Figure 1 — Représentation schématique du mode opératoire d’extraction de l’ADN du sol
5.2 Substances chimiques
5.2.1 Tris[hydroxyméthyl]aminométhane, C H NO (n° CAS 77-86-1).
4 11 3
5.2.2 Sel disodique de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), C H N O Na , 2H O
10 14 2 8 2 2
(n° CAS 6381-92-6).
5.2.3 Chlorure de sodium, NaCl (n° CAS 7647-14-5).
2 © ISO 2012 – Tous droits réservés
5.2.4 Dodécylsulfate de sodium (SDS), CH (CH ) OSO Na (n° CAS 151-21-3).
3 2 11 3
5.2.5 Polyvinylpyrrolido
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.