SIST ISO 12824:2017

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 12824
First edition
2016-09-15
Royal jelly — Specifications
Gelée royale — Spécifications
Reference number
©
ISO 2016
© ISO 2016, Published in Switzerland
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ii © ISO 2016 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Requirements . 2
4.1 Description . 2
4.2 Odour and taste . 2
4.3 Chemical requirements. 2
4.4 Hygienic requirements . 2
5 Test methods . 3
5.1 General . 3
5.2 Sample collection . 3
5.3 Test methods of chemical requirements . 3
6 Packaging, marking, storage and transportation . 3
6.1 Packaging . 3
6.2 Marking . 3
6.3 Storage and transportation . 4
Annex A (normative) Determination of moisture content . 5
Annex B (normative) Determination of 10-HDA . 8
Annex C (normative) Determination of protein.13
Annex D (normative) Determination of sugar .20
Annex E (normative) Determination of total acidity .26
Annex F (normative) Determination of total lipid .27
Annex G (normative) Determination of C13 isotopic ratio .29
Annex H (informative) Determination of furosine .30
Annex I (informative) Pollen screening .32
Bibliography .35
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical
Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information.
The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products.
iv © ISO 2016 – All rights reserved

INTERNATIONAL STANDARD ISO 12824:2016(E)
Royal jelly — Specifications
1 Scope
This International Standard specifies the production and sanitary requirements for royal jelly
and establishes a series of organoleptic and chemical test methods to control royal jelly quality. It
also specifies the requirements of transport, storage, packaging and marking for royal jelly. This
International Standard applies to the royal jelly production (collecting, preliminary processing and
packaging) and trade links. This International Standard is not applicable to royal jelly products in
which other foods are mixed.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 4833-1, Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of microorganisms —
Part 1: Colony count at 30 °C by the pour plate technique
ISO 21528-2, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal methods for the detection and
enumeration of Enterobacteriaceae – Part 2: Colony-count method
ISO 6579, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of
Salmonella spp.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
royal jelly
mixture of secretions from hypopharyngeal and mandibular glands of worker bees, free from any
additive
Note 1 to entry: It is the food of larval and adult queens. It is a raw and natural food, unprocessed except for
filtration which does not undergo addition of substances. The colour, the taste and the chemical composition
of royal jelly are determined by absorption and transformation by the bees fed with the following two types of
foods during the royal jelly production time:
— type 1: only bee’s natural foods (pollen, nectar and honey);
— type 2: bee’s natural food and other nutrients (proteins, carbohydrates, etc.).
3.2
10-HDA
10-hydroxy-2-decenoic acid
characteristic material of royal jelly
4 Requirements
4.1 Description
Royal jelly is milky white, pale yellow, with luster. It is pasty or jelly-like at room temperature with
fluidity and shall be free from bubbles and foreign substances. Minor crystallization phenomena can
occur naturally in royal jelly during storage.
4.2 Odour and taste
It is pungent, unfermented and shall not be rancescent. It is acerb, spicy and it brings acrid taste to
palate and throat.
4.3 Chemical requirements
Royal jelly shall comply with the requirements given in Table 1.
Table 1 — Chemical requirements of royal jelly
Characteristic Requirement Analysis method
Type 1 Type 2
Moisture content (%) min. 62,0 Annex A
max. 68,5
10-HDA(%) min. 1,4 Annex B
Protein % min. 11 Annex C
max. 18
Total sugar % min. 7 Annex D
max. 18
Fructose % 2–9 Annex D
Glucose % 2–9 Annex D
a
Sucrose % <3,0 Na Annex D
a
Erlose % <0,5 Na Annex D
a
Maltose % <1,5 Na Annex D
a
Maltotriose % <0,5 Na Annex D
Total acidity [(1 mol/l NaOH) ml/100g] min. 30,0 Annex E
max. 53,0
Total lipid (%) 2 Annex F
C13/C12 Isotopic ratio (δ ‰) −29 to −20 −29 to −14 Annex G
a
Na = Not applicable.
Furosine is an additional, optional quality parameter which shows freshness of royal jelly (see
informative method in Annex H).
NOTE A value is to be specified in the next revision of this International Standard.
Pollen screening may be used to determine geographical origin of royal jelly (see informative method
in Annex I).
4.4 Hygienic requirements
Royal jelly shall comply with the requirements given in Table 2.
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Table 2 — Hygienic requirements of royal jelly
Characteristic Requirement Analysis method
Colony count (cfu/g) max. 500 ISO 4833-1
Pathogenic bacteria:
Enterobacteriaceae (cfu/g) absent in 10 g ISO 21528-2
Salmonella (cfu/g) absent in 25 g ISO 6579
5 Test methods
5.1 General
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled water or
water of equivalent purity.
5.2 Sample collection
Sample collector shall use stainless steel bar, tube or spoon. Put the sample into the sterile sample
bottle, stir sufficiently in order to mix it evenly, and put it aside as the sample to be tested. Each sample
shall not be less than 20 g.
The sample shall be tested immediately or it shall be stored in a refrigerator below 5 °C.
5.3 Test methods of chemical requirements
Samples shall be tested according to the test methods specified in Annex A, Annex B, Annex C, Annex D,
Annex E, Annex F and Annex G or any other test methods with performances recognized as at least
equivalent according to recognized standards.
6 Packaging, marking, storage and transportation
6.1 Packaging
Packaging in contact with royal jelly shall be of food grade.
6.2 Marking
At least the following information shall be marked on each package or on a label:
a) the name of the product, and trade name or brand name, if any;
b) the name and address of the producer or packer;
c) the net weight;
d) the harvesting country/countries;
e) the harvesting year;
f) the date of minimum durability;
g) the storage mode and instructions;
h) the freezing month if any;
i) the type, according to this International Standard;
k) the batch number.
6.3 Storage and transportation
The temperature for storage shall be between +2 °C and +5 °C or, preferably, less than −18 °C for long-
term storage.
Royal jelly produced in different areas and times should be stored separately in giving them different
batch numbers (in bottle or in box).
It shall be transported at low temperature and shall not be stored and transported with toxic, corrosive
material or material with peculiar smell or that might cause contamination.
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Annex A
(normative)
Determination of moisture content
A.1 Vacuum drying oven method (Reference method)
A.1.1 Apparatus
A.1.1.1 Vacuum drying oven.
A.1.1.2 Weighing dish, of height 25 mm to ~30 mm, of diameter 35 mm to 50 mm.
A.1.1.3 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,000 1 g.
A.1.2 Procedure
Weigh approximately 0,5 g of the royal jelly sample, put it in the weighing dish which is dried to
constant weight, spread evenly, weigh accurately and put it in the vacuum drying oven, dry for 4 h
at 75 °C and under the pressure between 0,000 MPa and 0,005 MPa, take out the weighing dish and put
it in the drying oven or desiccator, weigh after it has been cooled for 30 min, redry for 2 h and repeat the
process until the weight difference between two consecutive times is no more than 2 mg, namely, until
a constant weight is achieved.
A.1.3 Calculation
The moisture content in royal jelly, X , expressed as a percentage by mass, is given by Formula (A.1):
mm−
X = ×100 (A.1)
mm−
where
X is the moisture content in royal jelly, %;
m is the mass of the weighing dish and the sample, in grams;
m is the mass of the weighing dish and the sample that is dried until a constant weight is
achieved, in grams;
m is the mass of the weighing dish, in grams.
A.1.4 Precision
Relative deviation of parallel experiments shall not be more than 0,8 %.
A.2 Karl Fisher
A.2.1 Apparatus
1)
A.2.1.1 Karl Fischer titration system, Mettler DL 18 titrator or equivalent.
A.2.1.2 Analytical balance, capable of weighing, to the nearest 0,000 01 g.
1)
A.2.1.3 Hydranal Composite 5 R.D.H. , as titrating solution or equivalent.
A.2.1.4 Methanol, UV purity or analytical purity, as solvent.
A.2.2 Procedure
Prior to titration of a sample, each working day, the titre of the employed one-component reagent
[e.g. Hydranal(R)-Composite 5] is determined. A suitable water standard [e.g. Hydranal(R) -Water
Standard 10,0, ultrapure water or terpine hydrate with a moisture content well defined at 10,46 %] is
determined in triplicate in the employed titration medium.
Weigh a 1 ml syringe. Weigh approximately 30 mg of the royal jelly sample in the syringe.
Introduce the sample into the titration cell of the titrator containing about 40 ml of methanol.
Weigh again the syringe.
The weighing of royal jelly exactly introduced in the titration cell in calculated by the difference of the
two weighings of the syringe.
After 600 s of stirring, the moisture content is determined and automatically calculated by the titrator
in % and mg/kg.
The determined titre shall be taken into account for the calculation of the water content in the sample.
A.2.3 Precision
Each sample shall be analysed twice and the relative deviation between both measures shall not be
more than 0,4 %.
A.3 Lyophilization
See Reference [1].
A.3.1 Apparatus
A.3.1.1 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,000 1 g.
A.3.1.2 Centrifuge tubes.
A.3.1.3 Lyophilizer.
A.3.1.4 Freezer.
1) Example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of users of
this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
6 © ISO 2016 – All rights reserved

A.3.2 Procedure
Weigh a centrifuge tube with its cap. Weigh exactly around 1 g of royal jelly in it. Lyophilize at least 36 h,
without the cap. As soon as the lyophilization process is stopped, put the cap and weigh the sample
immediately.
A.3.3 Calculation
The percentage of dry matter is calculated using Formula (A.2):
% dry matter = 100 × (m – m )/m (A.2)
1 0
where
m is the mass of the tube after the lyophilization process with the cap, in grams;
m is the mass of the empty tube with its cap, in grams;
m is the mass of the sample, in grams.
The moisture content in royal jelly is calculated using Formula (A.3):
% moisture content = 100 - % dry matter (A.3)
A.3.4 Precision
Relative deviation of parallel experiments shall not be more than 0,8 %.
Annex B
(normative)
Determination of 10-HDA
B.1 HPLC-UV External Standard (Reference method)
B.1.1 Reagents
Use only ultrapure water.
B.1.1.1 Methanol, UV purity or analytical purity with light transmittance above 30 % at detection
wavelength.
B.1.1.2 10-HDA reference standard, of purity above 99,0 % (certificate of analysis of supplier).
B.1.1.3 10-HDA S standard stock solution, c = 0,13 mg/ml.
For example, accurately weigh approximately 6,50 mg reference substance into 50 ml measuring flask,
dissolve in methanol and fill up to volume with methanol.
For dilution: factor x (standard S ) = 0,13 (mg/ml)/calculated concentration S (mg/ml). The calculated
0 0
concentration shall be corrected for the purity of the reference material.
B.1.1.4 25 mm phosphate buffer pH 2,5, as Eluent A, for extraction solution and sample solvent).
For example, weigh 6,90 g sodium dihydrogen phosphate monohydrate (M = 137,99 g/mol) into 2l
measuring flask, dissolve in approximately 1 800 ml H O, adjust pH to 2,5 with 85 % H PO and fill up
2 3 4
to volume with H O.
B.1.1.5 Extraction solution, 55 % 25 mm phosphate buffer pH 2,5/45 % methanol (v:v).
For example, mix 550 ml 25 mm phosphate buffer pH 2,5 with 450 ml methanol, equilibrate to room
temperature.
B.1.1.6 Sample solvent, 70 % 25 mm phosphate buffer pH 2,5/30 % methanol (v:v).
For example, mix 700 ml 25 mm phosphate buffer pH 2,5 with 300 ml methanol, equilibrate to room
temperature.
B.1.2 Apparatus
B.1.2.1 HPLC with ultraviolet detector, recorder or microprocessor.
B.1.2.2 Chromatographic column, Zorbax SB-CN 150 × 3,0 mm; 3,5 μm or equivalent.
B.1.2.3 Ultrasonic bath.
B.1.2.4 Homogenizer, Ultraturrax or equivalent.
B.1.2.5 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,000 01 g.
8 © ISO 2016 – All rights reserved

B.1.3 Procedure
B.1.3.1 Sample treatment
Exactly weigh approximately 80,00 mg lyophiliated royal jelly or 200 mg fresh royal jelly into a 50 ml
centrifuge tube.
Add 40,0 ml extraction solution. Homogenize for approximately 10 s to 20 s using an ultraturrax
at 15 000 rpm until all royal jelly material is emulsified. Treat for 10 min in ultrasonic bath.
Pipette 1 ml of the homogeneous extract into a 10 ml measuring flask and fill up to volume with sample
solvent. Filter an aliquot of the diluted extract through membrane filter (0,45 μm).
B.1.3.2 Chromatography conditions
Detection wavelength: 216 nm
Eluent A: 25 mm phosphate buffer pH 2,5
Eluent B: Methanol
Gradient: 34 % B, 0-2,0 min
34-43 % B, 2,0-9,0 min
43-80 % B, 9,0-10,0 min
34 % B 10,1 min-16,0 min
B.1.3.3 External calibration
Realize an external standard calibration curve (solutions corresponding to concentration of 10-HDA:
1,0 g/100 ml, 1,5 g/100 ml, 2,0 g/100 ml, 2,5 g/100 ml).
The calibration curve shall be linear by visual assessment with a coefficient of correlation r > 0,99.
Standard dilutions for calibration curve:
Standard 10-HDA 1,0 g/100 ml: Pipette (x * 385) μl 10-HDA-S standard stock
solution into a 10 ml measuring flask and dilute to
c = 5 μg/ml
volume with sample solvent
(corresponds to 1,0 g/100 g in sample)
Standard 10-HDA 1,5 g/100 ml: Pipette (x * 578) μl 10-HDA-S standard stock
solution into a 10 ml measuring flask and dilute to
c = 7,5 μg/ml
volume with sample solvent
(corresponds to 1,5 g/100 g in sample)
Standard 10-HDA 2,0 g/100 ml: Pipette (x * 770) μl 10-HDA-S standard stock
solution into a 10 ml measuring flask and dilute to
c = 10 μg/ml
volume with sample solvent
(corresponds to 2,0 g/100 g in sample)
Standard 10-HDA 2,5 g/100 ml: Pipette (x * 963) μl 10-HDA-S standard stock
solution into a 10 ml measuring flask and dilute to
c = 12,5 μg/ml
volume with sample solvent
(corresponds to 2,5 g/100 g in sample)
x = factor of 10-HDA-S stock solution (see B.1.1.3)
B.1.3.4 Sample determination
Inject 20 μl into the chromatograph.
Measure filtered (diluted) extract by HPLC at 216 nm against an external standard calibration curve.
B.1.4 Calculation
1) Standard calibration curve
Determine the equation of the straight line for a plot of peak area versus purity corrected
concentration [μg/ml] of the 10-HDA standard solutions of the form:
y = ax + b (B.1)
where
y is the area of the 10-HDA peak;
a is the slope of the standard curve;
x is the purity corrected concentration of the standard;
b is the y-intercept of the standard calibration curve.
2) Using the 10-HDA peak area from the sample, calculate the amount of 10-HDA in the measuring
solution from the calibration curve as follows:
x’ = (y’ – b) / a (B.2)
where
x’ is the concentration [μg/ml] of 10-HDA in the measuring solution of the sample;
y’ is the area of the 10-HDA peak in the sample.
The 10-HDA content (C ) in royal jelly (sample in g/100 g) is given by Formula (B.3):
10-HDA
C = x’ × 40/m (B.3)
10-HDA
where
x’ is the calculated concentration [μg/ml] of 10-HDA in the measuring solution of the sample;
40 is the dilution factor considering the extraction volume of 40 ml, the pipette volume used for
dilution (1ml) and the volume of the measuring flask used for dilution (10 ml);
m is the actual mass of the royal jelly sample, in mg.
B.1.5 Precision
Relative deviation of parallel experiments shall not be more than 2,0 % (lyophylisates) and 5,0 % (fresh
royal jelly).
10 © ISO 2016 – All rights reserved

B.2 HPLC-UV internal standard (Alternative method)
B.2.1 Reagents
Use only double distilled water.
B.2.1.1 Methanol, UV purity or analytical purity with light transmittance above 30 % at detection
wavelength (210 nm).
B.2.1.2 Anhydrous alcohol, GR.
B.2.1.3 Internal standard substance, trans-2-hexenoic acid, of 99,0 % purity.
B.2.1.4 10-HDA standard, of purity above 99,0 %. Decompress and dry for 24 h in the vacuum drying
oven or desiccator with concentrated sulfuric acid before it is used.
B.2.1.5 10-HDA standard solution. Weigh approximately 12,5 mg dried 10-HDA standard sample,
weigh accurately, dissolve with anhydrous alcohol and transfer it to a 25 ml volumetric flask, dilute to the
mark with anhydrous alcohol and mix evenly.
The concentration of 10-HDA obtained in solution is 0,5 mg/ml.
B.2.1.6 Internal standard solution. Weigh approximately 650 mg of trans-2-hexenoic acid, weigh
accurately, dissolve with anhydrous alcohol and transfer it to a 1 000 ml volumetric flask, dilute to the
mark with anhydrous alcohol and mix evenly.
The concentration of internal standard solution obtained in solution is 0,65 mg/ml.
B.2.1.7 Hydrochloric acid (c = 0,03 mol/l). Take 100 ml of 0,1 mol/l hydrochloric acid, add 200 ml
double distilled water.
B.2.1.8 Mobile phase, Φ (CH OH + 0,03 mol/l HCl+H O) = 55 + 10 + 35 or (CH OH + 25 mmol/l
3 2 3
phosphate buffer pH 2,5) = 55 + 45.
B.2.2 Apparatus
B.2.2.1 HPLC, with ultraviolet detector, recorder or microprocessor.
B.2.2.2 Chromatographic column, 4,6 mm × 250 mm stainless steel, fill amorphous silica gel with
C18 bonded stationary phase, of 5 μm or 10 μm particle size.
B.2.2.3 Ultrasonic cleaner.
B.2.2.4 Mixer, Vortex mixer or equivalent.
B.2.2.5 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,000 01 g.
B.2.3 Procedure
B.2.3.1 Sample treatment
Defreeze the sample to the room temperature and stir evenly with glass rod, weigh approximately
0,5 g, and put it in a 50 ml volumetric flask that has been weighed already, weigh accurately, add 1 ml of
0,03 mol/l hydrochloric acid and 2 ml water, put it on the vortex mixer and mix to dissolve the sample,
add anhydrous alcohol 30 ml add while shaking lightly, add 10 ml internal standard solution accurately,
dilute to the mark with anhydrous alcohol and mix evenly, put it in the ultrasonic bath for 15 min
immediately, or put it on the vortex mixer and shake for 15 min, take out, test after centrifugation for 10
min at 3 000 r/min and filtration with 0,45 μm membrane filter, if necessary. Put it in a refrigerator if it
shall not be tested immediately.
B.2.3.2 Chromatography condition
Test wavelength: 210 nm; column temperature: 35 °C; mobile phase velocity of flow: 1 ml/min.
B.2.3.3 Determination of correction factor
Weigh 10-HDA standard solution 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0 mL separately and transfer them to
respective 10 ml volumetric flasks. Add accurately 2 ml internal standard solution, dilute to the mark
with anhydrous alcohol, and mix evenly. Weigh respectively 10 μl of these solutions, inject it into the
chromatograph, plot the mass ratio of 10-HDA per internal standard against the peak area ratio of
that, and draw a linear calibration curve. Calculate the correction factor, F, which is the slope of the
calibration curve.
B.2.3.4 Sample determination
Weigh 10 μl sample solution, inject it into the chromatograph, and correct the measurement by “internal
standard method”.
B.2.4 Calculation
The 10-HDA content in royal jelly, is given by Formula (B.4):
Ai ms
XF=× ××100 (B.4)
As mi
where
X is the 10-HDA content in royal jelly, %;
F is the correction factor;
A is the peak area of tested group in sample;
i
A is the peak area of internal standard in sample;
s
m is the mass of the internal standard, in grams;
s
m is the mass of sample, in grams.
i
B.2.5 Precision
Relative deviation of parallel experiments shall not be more than 2,0 %.
12 © ISO 2016 – All rights reserved

Annex C
(normative)
Determination of protein
C.1 Kjeldahl method (automatic) (Reference method)
C.1.1 Reagents
C.1.1.1 Concentrated sulfuric acid, 95 % to 98 %, reagent grade.
C.1.1.2 Catalyst. Weigh 7,0 g potassium sulfate and 0,4 g copper sulfate.
C.1.1.3 Mixed indicator. Dissolve 100 mg methyl red in 100 ml methanol and 100 mg bromocresol
green in 100 ml methanol.
When potentiometric titration is used, no indicator is required.
C.1.1.4 Boric acid solution, 4 % (w/v). Dissolve 400 g boric acid in 5 to 6 l hot deionized water. Mix
and add more hot deionized water to a volume of about 9 l.
Cool to room temperature, add 100 ml bromocresol green solution and 70 ml methyl red solution, and
dilute to a final volume of 10 l. Adjust the pH of the boric acid solution to 4,6 to 4,8, using 0.1 mol/l NaOH
or 0,1 mol/l HCl. Or 25 ml Sher mixed indicator and dilute to a final volume.
C.1.1.5 Sodium hydroxide solution. Weigh 32 g sodium hydroxide, dilute to 100 ml with distilled water.
C.1.1.6 Hydrochloric acid standard solution, 0,1 mol/l.
C.1.2 Apparatus
C.1.2.1 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,000 1 g.
C.1.2.2 Digestion block. Aluminium alloy block with adjustable temperature device for measuring and
2)
2)
controlling block temperature (Tecator Digestion System 20, 1015 Digestor or KjelDigester K-449 ,
2)
SpeedDigester K-439 or equivalent).
C.1.2.3 Digestion tubes, 250 ml to 300 ml.
2) 2)
C.1.2.4 Distillation units, Foss Tecator 2200 , BUCHI KjelMaster K-375 or equivalent, to accept
250 ml to 300 ml.
C.1.2.5 Titration flask, 500 ml graduated Erlenmeyer flask (for collection and titration of distillate).
C.1.2.6 Fume exhaust manifold, with polytetrafluoroethylene (PTFE) ring seals, connected to a water
aspirator in a hooded sink.
2) Example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of users of
this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
C.1.2.7 Nitrogen free weighing boats.
C.2.1.8 Pipetting dispenser, −25 ml, adjustable volume, attached to a 2,4 l acid bottle.
C.1.3 Procedure
C.1.3.1 Digestion
Weigh approximately 1 g of royal jelly sample onto a tared, N free weighing boat. Fold paper around
material and drop into a Kjeldahl tube.
Add the catalyst, add 12 ml of sulfuric acid, using pipetting dispenser. Hold the mixture overnight.
Place fume manifold tightly on tubes, and turn water aspirator on completely. Place rack of tubes in
preheated block (at 420 °C). After 10 min, and turn on water aspirator or scrubber. A condensation zone
should be maintained within the tubes. After bulk of sulfur oxides fumes are produced during initial
stages of digestion, reduce vacuum source to prevent loss of sulfuric acid. Digest additional 50 min.
Total digestion time is approximately 60 min.
Let tubes cool. Add deionized water to each tube to a total volume of approximately 80 ml.
C.1.3.2 Distillation
Place 32 % NaOH in alkali tank of distillation unit. Adjust volume dispensed to 50 ml. Attach digestion
tube containing diluted digest to distillation unit, or use automatic dilution feature. 60 ml H BO
3 3
solution are added to the receiving vessel with indicator on receiving platform, and immerse tube from
condenser below surface of
...

PROJET
NORME ISO/FDIS
FINAL
INTERNATIONALE 12824
ISO/TC 34
Gelée royale — Spécifications
Secrétariat: AFNOR
Début de vote: Royal jelly — Specifications
2016-04-18
Vote clos le:
2016-06-18
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT
INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSER-
VATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT
CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMEN-
TATION EXPLICATIVE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS
INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET COM-
Numéro de référence
MERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
ISO/FDIS 12824:2016(F)
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR POSSI-
BILITÉ DE DEVENIR DES NORMES POUVANT
SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA RÉGLEMENTA-
©
TION NATIONALE. ISO 2016
ISO/FDIS 12824:2016(F)
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ISO/FDIS 12824:2016(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Exigences . 2
4.1 Description . 2
4.2 Odeur et goût . 2
4.3 Exigences chimiques . 2
4.4 Exigences sanitaires . 3
5 Méthodes d’essai . 3
5.1 Généralités . 3
5.2 Prélèvement de l’échantillon . 3
5.3 Méthodes d’essai des exigences chimiques . 3
6 Emballage, étiquetage, stockage et transport . 3
6.1 Emballage . 3
6.2 Étiquetage . 3
6.3 Stockage et transport . 4
Annexe A (normative) Détermination du taux d’humidité . 5
Annexe B (normative) Détermination de la teneur en 10-HDA . 8
Annexe C (normative) Détermination de la teneur en protéines .14
Annexe D (normative) Détermination de la teneur en sucres .21
Annexe E (normative) Détermination de l’acidité totale.27
Annexe F (normative) Détermination de la teneur en lipides totaux .28
Annexe G (normative) Détermination du rapport des isotopes C .30
Annexe H (informative) Détermination de la teneur en furosine .31
Annexe I (informative) Analyse pollinique .33
Bibliographie .36
ISO/FDIS 12824:2016(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires.
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PROJET FINAL DE NORME INTERNATIONALE ISO/FDIS 12824:2016(F)
Gelée royale — Spécifications
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie les exigences de production et les règles sanitaires pour la
gelée royale et établit une série de méthodes d’analyses organoleptiques et chimiques pour contrôler
la qualité de la gelée royale. Elle donne également les exigences de transport, de stockage, d’emballage
et d’étiquetage de la gelée royale. La présente Norme internationale s’applique à la production de gelée
royale (récolte, traitement préliminaire et emballage) et aux liens commerciaux. Elle ne s’applique pas
aux produits à base de gelée royale dans lesquels d’autres aliments sont mélangés.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 4833-1, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour le dénombrement des
micro-organismes — Partie 1: Comptage des colonies à 30 degrés C par la technique d’ensemencement en
profondeur
ISO 21528-2, Microbiologie des aliments — Méthodes horizontales pour la recherche et le dénombrement
des Enterobacteriaceae — Partie 2:Méthode par comptage des colonies
ISO 6579, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche des Salmonella spp.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions suivants s’appliquent.
3.1
gelée royale
mélange de sécrétions de glandes hypopharyngiennes et mandibulaires d’abeilles ouvrières, sans
aucun additif
Note 1 à l’article: Elle constitue la nourriture des reines au stade larvaire et au stade adulte. Il s’agit d’un aliment
brut et naturel, non transformé (hormis la filtration) et exempt d’additifs. La couleur, le goût et la composition
chimique de la gelée royale sont déterminés par l’absorption et la transformation par les abeilles nourries avec
les deux types d’aliments suivants pendant la période de production de gelée royale:
— type 1: uniquement les aliments naturels de l’abeille (pollen, nectar et miel);
— type 2: les aliments naturels de l’abeille et d’autres nutriments (protéines, hydrates de carbone, etc.).
3.2
10-HDA
acide 10-hydroxy-2-décénoïque
composé caractéristique de la gelée royale
ISO/FDIS 12824:2016(F)
4 Exigences
4.1 Description
La gelée royale est une substance nacrée de couleur blanc laiteux à jaune pâle. Elle est pâteuse ou
gélatineuse mais fluide à température ambiante et doit être exempte de bulles et de substances
étrangères. Des phénomènes de cristallisation mineurs peuvent se produire naturellement pendant la
période de stockage de la gelée royale.
4.2 Odeur et goût
La gelée royale est piquante, elle ne doit pas fermenter ni devenir rance. Elle est de saveur acide, épicée
et laisse un goût âcre dans le palais et la gorge.
4.3 Exigences chimiques
La gelée royale doit être conforme aux exigences données dans le Tableau 1.
Tableau 1 — Exigences chimiques relatives à la gelée royale
Caractéristique Exigence Méthode d’analyse
Type 1 Type 2
Taux d’humidité (%) min. 62,0 Annexe A
max. 68,5
10-HDA (%) min. 1,4 Annexe B
Protéines (%) min. 11 Annexe C
max. 18
Sucres totaux (%) min. 7 Annexe D
max. 18
Fructose (%) 2–9 Annexe D
Glucose (%) 2–9 Annexe D
a
Saccharose (%) <3,0 Na Annexe D
a
Erlose (%) <0,5 Na Annexe D
a
Maltose (%) <1,5 Na Annexe D
a
Maltotriose %() <0,5 Na Annexe D
Acidité totale [(1 mol/l NaOH) ml/100g] min. 30,0 Annexe E
max. 53,0
Lipides totaux (%) 2,0 Annexe F
8,0
13 12
Rapport des isotopes C/ C (δ ‰) −29 à −20 −29 à −14 Annexe G
a
Na = Non applicable.
La furosine est un paramètre qualitatif complémentaire facultatif qui indique la fraîcheur de la gelée
royale (voir la méthode dans l’Annexe informative H).
NOTE Une valeur devra être spécifiée lors de la prochaine révision de la présente Norme internationale.
L’analyse pollinique peut être utilisée pour déterminer l’origine géographique de la gelée royale (voir la
méthode dans l’Annexe informative I).
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ISO/FDIS 12824:2016(F)
4.4 Exigences sanitaires
La gelée royale doit être conforme aux exigences données dans le Tableau 2.
Tableau 2 — Exigences sanitaires relatives à la gelée royale
Caractéristique Exigence Méthode d’analyse
Comptage des colonies (UFC/g) max. 500 ISO 4833-1
Bactéries pathogènes: absentes dans 10 g ISO 21528-2
Enterobacteriaceae (UFC/g) absentes dans 25 g ISO 6579
Salmonelles (UFC/g)
5 Méthodes d’essai
5.1 Généralités
Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue ainsi que de
l’eau distillée ou de l’eau de pureté équivalente.
5.2 Prélèvement de l’échantillon
Le préleveur d’échantillons doit utiliser une barre, un tube ou une cuillère en acier inoxydable. Placer
l’échantillon dans le flacon d’échantillons stérile, agiter suffisamment pour le mélanger de façon
homogène, et le mettre de côté en tant qu’échantillon à soumettre à essai. Chaque échantillon doit peser
plus de 20 g.
L’échantillon doit être immédiatement soumis à essai ou doit être conservé au réfrigérateur à une
température inférieure à 5 °C.
5.3 Méthodes d’essai des exigences chimiques
Les échantillons doivent être analysés conformément aux méthodes d’essai spécifiées dans les
Annexes A, B, C, D, E, F et G ou à toutes les autres méthodes d’essai dont les performances sont reconnues
comme étant au moins équivalentes selon les normes homologuées.
6 Emballage, étiquetage, stockage et transport
6.1 Emballage
Tout emballage en contact avec la gelée royale doit être apte au contact avec les denrées alimentaires.
6.2 Étiquetage
Au moins les informations suivantes doivent figurer sur chaque emballage ou sur une étiquette:
a) le nom du produit et la marque ou l’appellation commerciale, le cas échéant;
b) le nom et l’adresse du producteur ou de l’emballeur;
c) la masse nette;
d) le(s) pays récoltant(s);
e) l’année de la récolte;
f) la date de durabilité minimale;
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g) le mode et les instructions de stockage;
h) le mois de congélation, le cas échéant;
i) le type, selon la présente Norme internationale;
k) le numéro de lot.
6.3 Stockage et transport
La température de stockage doit être comprise entre +2 °C et +5 °C, ou en cas de stockage à long terme,
doit être de préférence inférieure à 18 °C.
Il convient de stocker séparément la gelée royale produite dans différentes régions et à différentes
périodes en lui attribuant différents numéros de lot (dans des flacons ou des boîtes).
Elle doit être transportée à basse température et ne doit pas être stockée et transportée avec des
substances corrosives toxiques ou avec des substances ayant une odeur singulière ou susceptibles
d’être polluantes.
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ISO/FDIS 12824:2016(F)
Annexe A
(normative)
Détermination du taux d’humidité
A.1 Méthode de l’étuve sous vide (méthode de référence)
A.1.1 Appareillage
A.1.1.1 Étuve sous vide
A.1.1.2 Coupelle de pesée, hauteur de 25 mm à 30 mm, diamètre de 35 mm à 50 mm.
A.1.1.3 Balance analytique, précise à 0,000 1 g près.
A.1.2 Mode opératoire
Peser environ exactement 0,5 g de l’échantillon de gelée royale, le placer dans la coupelle de pesée qui
est séchée jusqu’à obtention d’une masse constante, répartir uniformément et placer dans l’étuve sous
vide. Sécher pendant 4 h à 75 °C et, sous une pression comprise entre 0,000 MPa et 0,005 MPa, sortir la
coupelle de pesée et la placer dans l’étuve ou dans le dessiccateur, la peser après l’avoir refroidie pendant
30 min. Sécher à nouveau pendant 2 h et répéter l’opération jusqu’à ce que la différence de masse entre
deux cycles consécutifs soit inférieure à 2 mg, à savoir jusqu’à l’obtention d’une masse constante.
A.1.3 Calcul
Le taux d’humidité dans la gelée royale, X , exprimé en pourcentage en masse, est donné par la
Formule (A.1):
mm−
X = ×100 (A.1)
mm−
où
X est le taux d’humidité dans la gelée royale, en %;
m est la masse de la coupelle de pesée et de l’échantillon, en grammes;
m est la masse de la coupelle de pesée et de l’échantillon séché jusqu’à l’obtention d’une masse
constante, en grammes;
m est la masse de la coupelle de pesée, en grammes.
A.1.4 Fidélité
L’écart relatif entre réplicats ne doit pas dépasser 0,8 %.
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A.2 Karl Fisher
A.2.1 Appareillage
1)
A.2.1.1 Système de titrage Karl Fischer: titrateur Mettler DL 18 ou équivalent.
A.2.1.2 Balance analytique, précise à 0,000 01 g près.
1)
A.2.1.3 Hydranal Composite 5 R.D.H. comme solution de titrage ou équivalent.
A.2.1.4 Méthanol (pureté UV ou pureté analytique) comme milieu de travail.
A.2.2 Mode opératoire
Avant de titrer un échantillon, le titre du réactif titrant utilisé (par exemple, Hydranal(R)-Composite 5)
est déterminé chaque jour de travail. La teneur en eau d’une solution étalon appropriée (par exemple,
Hydranal(R)-Water Standard 10.0, eau ultra-pure ou hydrate de terpine avec un taux d’humidité bien
défini à 10,46 %) est déterminée en triplicat dans le milieu de titrage utilisé.
Peser une seringue de 1 ml. Peser environ 30 mg de l’échantillon de gelée royale et les introduire dans
la seringue.
Introduire l’échantillon dans la cellule de titrage du titrateur contenant environ 40 ml de méthanol.
Peser à nouveau la seringue.
La masse de gelée royale exactement introduite dans la cellule de titrage est obtenue en calculant la
différence entre les deux pesées de la seringue.
Après 600 s d’agitation, le taux d’humidité est déterminé et calculé automatiquement par le titrateur en
% et en mg/kg.
Le titre déterminé doit être pris en compte pour calculer la teneur en eau de l’échantillon.
A.2.3 Fidélité
Chaque échantillon est analysé deux fois et l’écart relatif entre les deux mesures ne doit pas
dépasser 0,4 %.
A.3 Lyophilisation
Voir la Référence [1].
A.3.1 Appareillage
A.3.1.1 Balance analytique, précise à 0,000 1 g près.
A.3.1.2 Tubes à centrifuger
A.3.1.3 Lyophilisateur
A.3.1.4 Congélateur
1) Ceci est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci de
commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à
l’égard de ce produit.
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ISO/FDIS 12824:2016(F)
A.3.2 Mode opératoire
Peser un tube à centrifuger avec son bouchon. Peser environ exactement 1 g de gelée royale et
l’introduire dans ce tube. Lyophiliser pendant au moins 36 h, sans le bouchon. Dès que la lyophilisation
est terminée, remettre le bouchon et peser l’échantillon immédiatement.
A.3.3 Calcul
Le pourcentage de matière sèche est calculé d’après la Formule (A.2):
% matière sèche = 100 × (m – m )/m (A.2)
1 0
où
m est la masse du tube après lyophilisation, avec son bouchon, en grammes;
m est la masse du tube à vide avec son bouchon, en grammes;
m est la masse de l’échantillon, en grammes.
Le taux d’humidité dans la gelée royale est calculé d’après la Formule (A.3):
Taux d’humidité = 100 - % matière sèche (A.3)
A.3.4 Fidélité
L’écart relatif entre réplicats ne doit pas dépasser 0,8 %.
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Annexe B
(normative)
Détermination de la teneur en 10-HDA
B.1 Étalonnage externe par CLHP-UV (méthode de référence)
B.1.1 Réactifs
Utiliser uniquement de l’eau ultra-pure.
B.1.1.1 Méthanol: pureté UV ou pureté analytique avec transmission de la lumière supérieure à 30 % à
la longueur d’onde de détection.
B.1.1.2 Étalon de référence 10-HDA: pur à plus de 99,0 % (certificat d’analyse du fournisseur).
B.1.1.3 Solution mère étalon 10-HDA S : c = 0,13 mg/ml.
Par exemple, peser environ exactement 6,50 mg de substance de référence dans une fiole jaugée de
50 ml, dissoudre dans du méthanol et compléter au volume avec du méthanol.
Pour la dilution: facteur x (étalon S ) = 0,13 (mg/ml)/concentration calculée S (mg/ml). La concentration
0 0
calculée doit être corrigée en fonction de la pureté de la substance de référence.
B.1.1.4 Tampon phosphate à 25 mmol, pH 2,5: (en tant qu’éluant A, pour la solution d’extraction et le
solvant de l’échantillon).
Par exemple, peser 6,90 g de dihydrogénophosphate de sodium monohydraté (M = 137,99 g/mol) dans
une fiole jaugée de 2 l, dissoudre dans environ 1 800 ml de H O, ajuster le pH à 2,5 avec 85 % de H PO
2 3 4
et compléter au volume avec du H O.
B.1.1.5 Solution d’extraction: 55 % de tampon phosphate à 25 mmol, pH 2,5 / 45 % de méthanol (v/v).
Par exemple, mélanger 550 ml de tampon phosphate à 25 mmol, pH 2,5, avec 450 ml de MeOH, équilibrer
à température ambiante.
B.1.1.6 Solvant de l’échantillon: 70 % de tampon phosphate à 25 mmol, pH 2,5/30 % de méthanol (v/v).
Par exemple, mélanger 700 ml de tampon phosphate à 25 mmol, pH 2,5, avec 300 ml de méthanol,
équilibrer à température ambiante.
B.1.2 Appareillage
B.1.2.1 CLHP avec détecteur UV, enregistreur ou microprocesseur.
B.1.2.2 Colonne de chromatographie: Zorbax SB-CN 150 × 3,0 mm; 3,5 μm ou un équivalent.
B.1.2.3 Bain à ultrasons.
B.1.2.4 Homogénéisateur: Ultraturrax ou équivalent.
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ISO/FDIS 12824:2016(F)
B.1.2.5 Balance analytique: précise à 0,000 01 g près.
B.1.3 Mode opératoire
B.1.3.1 Traitement de l’échantillon
Peser environ exactement 80,00 mg de gelée royale lyophilisée ou 200 mg de gelée royale fraîche dans
un tube à centrifuger de 50 ml.
Ajouter 40,0 ml de solution d’extraction. Homogénéiser pendant environ 10 s à 20 s à l’aide d’un
Ultraturrax à 15 000 tr/min jusqu’à émulsion de toute la gelée royale. Traiter pendant 10 min dans un
bain à ultrasons.
À l’aide d’une pipette, prélever 1 ml de l’extrait homogène et le transférer dans une fiole jaugée de 10 ml
puis compléter au volume avec le solvant de l’échantillon. Filtrer une portion aliquote de l’extrait dilué à
travers une membrane filtrante (0,45 μm).
B.1.3.2 Conditions chromatographiques
Longueur d’onde de détection: 216 nm
Éluant A: tampon phosphate à 25 mmol, pH 2,5
Éluant B: méthanol
Gradient: 34 % de B, 0-2,0 min
34-43 % de B, 2,0-9,0 min
43-80 % de B, 9,0-10,0 min
34 % de B, 10,1-16,0 min
B.1.3.3 Étalonnage externe
Tracer une courbe d’étalonnage externe (solutions correspondant aux concentrations en 10-HAD
suivantes: 1,0 %, 1,5 %, 2,0 %, 2,5 %).
La courbe d’étalonnage doit être linéaire avec un coefficient de corrélation r > 0,99.
Dilutions des étalons pour la courbe d’étalonnage:
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Étalon 10-HDA à 1,0 %: À l’aide d’une pipette, transférer (x * 385) μl de solution
mère étalon 10-HDA-S dans une fiole jaugée de 10 ml
c = 5 μg/ml
et compléter au volume avec le solvant de l’échantillon
(correspond à 1,0 g/100 g dans l’échantillon)
Étalon 10-HDA à 1,5 %: À l’aide d’une pipette, transférer (x * 578) μl de solu-
tion mère étalon 10-HDA-S dans une fiole jaugée de
c = 7,5 μg/ml
10 ml et compléter au trait de jauge avec le solvant
(correspond à 1,5 g/100 g dans l’échantillon) de l’échantillon
Étalon 10-HDA à 2,0 %: À l’aide d’une pipette, transférer (x * 770) μl de solu-
tion mère étalon 10-HDA-S dans une fiole jaugée de
c = 10 μg/ml
10 ml et compléter au trait de jauge avec le solvant
(correspond à 2,0 g/100 g dans l’échantillon)
de l’échantillon
Étalon 10-HDA à 2,5 %: À l’aide d’une pipette, transférer (x * 963) μl de solu-
tion mère étalon 10-HDA-S dans une fiole jaugée de
c = 12,5 μg/ml
10 ml et compléter au trait de jauge avec le solvant
(correspond à 2,5 g/100 g dans l’échantillon)
de l’échantillon
x = facteur de la solution mère 10-HDA-S (voir en B.1.1.3)
B.1.3.4 Détermination de l’échantillon
Injecter 20 μl dans le chromatographe.
Déterminer la concentration de l’extrait filtré (dilué) par CLHP à 216 nm avec la courbe d’étalonnage
externe.
B.1.4 Calcul
1) Courbe d’étalonnage
Déterminer l’équation de la droite représentant graphiquement l’aire du pic chromatographique du 10-
HDA en fonction de la concentration corrigée par la pureté [μg/ml] des solutions étalons sous forme:
y = ax + b (B.2)
où
y est l’aire du pic du 10-HDA;
a est la pente de la courbe d’étalonnage;
x est la concentration corrigée par la pureté de l’étalon;
b est l’ordonnée à l’origine de la courbe d’étalonnage.
2) En utilisant la surface du pic du 10-HDA de l’échantillon, calculer la quantité de 10-HDA dans la
solution de mesure d’après la courbe d’étalonnage de la façon suivante:
x’ = (y’ – b) / a (B.3)
où
x’ est la concentration [μg/ml] en 10-HDA de la solution de mesure de l’échantillon;
y’ est l’aire du pic du 10-HDA dans l’échantillon;
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La teneur en 10-HDA (C ) de la gelée royale (échantillon en g/100 g) est donnée par la Formule (B.4):
10-HDA
C = x’ × 40 / m (B.4)
10-HDA
où
x’ est la concentration calculée [μg/ml] en 10-HDA de la solution de mesure de l’échantillon;
40 est le facteur de dilution tenant compte du volume d’extraction de 40 ml, du volume de la
pipette utilisée pour la dilution (1 ml) et du volume de la fiole jaugée utilisée pour la dilution
(10 ml);
m est la masse réelle de l’échantillon de gelée royale, en mg.
B.1.5 Fidélité
L’écart relatif entre réplicats ne doit pas dépasser 2,0 % (lyophilisats) et 5,0 % (gelée royale fraîche).
B.2 Étalonnage interne par CLHP-UV (méthode de référence)
B.2.1 Réactifs
Utiliser uniquement de l’eau bidistillée.
B.2.1.1 Méthanol: pureté UV ou pureté analytique avec transmission de la lumière supérieure à 30 % à
la longueur d’onde de détection (210 nm).
B.2.1.2 Alcool anhydre: GR.
B.2.1.3 Substance étalon interne: acide trans-2-hexénoïque, pur à 99,0 %.
B.2.1.4 Étalon 10-HDA: pur à plus de 99,0 %. Le décompresser et le sécher pendant 24 h dans l’étuve
sous vide ou dans le dessiccateur avec de l’acide sulfurique concentré avant de l’utiliser.
B.2.1.5 Solution étalon 10-HDA: peser environ exactement 12,5 mg d’échantillon d’étalon 10-HDA
séché, dissoudre avec de l’alcool anhydre et transférer dans une fiole jaugée de 25 ml. Diluer jusqu’au
trait de jauge avec de l’alcool anhydre et mélanger de façon homogène.
La concentration en 10-HDA obtenue dans la solution est de 0,5 mg/ml.
B.2.1.6 Solution étalon interne: peser environ exactement 650 mg d’acide trans-2-hexénoïque,
dissoudre avec de l’alcool anhydre et transférer dans une fiole jaugée de 1 000 ml. Diluer jusqu’au trait
de jauge avec de l’alcool anhydre et mélanger de façon homogène.
La concentration en solution étalon interne obtenue dans la solution est de 0,65 mg/ml.
B.2.1.7 Acide chlorhydrique, (c = 0,03 mol/l): prélever 100 ml d’acide chlorhydrique à 0,1 mol/l et
ajouter 200 ml d’eau bidistillée.
B.2.1.8 Phase mobile, Φ (CH OH + 0,03 mol/l HCl+H O) = 55 + 10 + 35 ou (CH OH + tampon phosphate
3 2 3
à 25 mmol/l pH 2,5) = 55 + 45.
B.2.2 Appareillage
B.2.2.1 CLHP avec détecteur UV, enregistreur ou microprocesseur.
ISO/FDIS 12824:2016(F)
B.2.2.2 Colonne de chromatographie: 4,6 mm × 250 mm, acier inoxydable, phase stationnaire C ,
granulométrie 5 μm ou 10 μm.
B.2.2.3 Bains à ultrasons.
B.2.2.4 Mélangeur: Vortex ou équivalent;
B.2.2.5 Balance analytique, précise à 0,000 01 g près.
B.2.3 Mode opératoire
B.2.3.1 Traitement de l’échantillon
Décongeler l’échantillon à température ambiante et agiter de façon homogène avec une tige en verre,
peser environ exactement 0,5 g de gelée royale et mettre dans une fiole jaugée de 50 ml préalablement
pesée, ajouter 1 ml d’acide chlorhydrique à 0,03 mol/l et 2 ml d’eau, mettre sur le l’agitateur Vortex
et mélanger pour dissoudre l’échantillon. Ajouter 30 ml d’alcool anhydre, ajouter exactement 10 ml
de solution d’étalon interne, tout en agitant doucement, diluer jusqu’au trait de jauge avec de l’alcool
anhydre et mélanger de façon homogène. Mettre immédiatement dans le bain à ultrasons pendant
15 min ou sur l’agitateur Vortex et agiter pendant 15 min. Retirer, effectuer un dosage après 10 min de
centrifugation à 3 000 tr/min puis filtrer sur une membrane filtrante de 0,45 µm si nécessaire. Placer
au réfrigérateur si le dosage n’est pas effectué immédiatement.
B.2.3.2 Condition chromatographique
Longueur d’onde de mesure: 210 nm; température de la colonne: 35 °C; débit: 1 ml/min.
B.2.3.3 Détermination du facteur de correction
Prélever séparément 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml et 5,0 ml de solution étalon 10-HDA et
transférer ces fractions dans des fioles jaugées de 10 ml. Ajouter exactement 2 ml de solution étalon
interne, diluer jusqu’au trait de jauge avec de l’alcool anhydre et mélanger de façon homogène. Peser
respectivement 10 μl de ces solutions, les injecter dans le chromatographe, représenter graphiquement
le rapport massique du 10-HDA selon la méthode de l’étalonnage interne, en fonction du rapport de
l’aire du pic de celui-ci, et tracer une courbe d’étalonnage linéaire. Calculer le facteur de correction F,
qui est la pente de la courbe d’étalonnage.
B.2.3.4 Détermination de l’échantillon
Peser 10 μl de solution d’échantillon, les injecter dans le chromatographe et corriger la mesure selon la
«méthode de l’étalonnage interne».
B.2.4 Calcul
La teneur en 10-HDA de la gelée royale est donnée par la Formule (B.2):
Ai ms
XF2 =× ××100 (B.1)
As mi
où
X est la teneur en 10-HDA de la gelée royale, en %;
F est le facteur de correction;
A est l’aire du pic du groupe soumis à essai dans l’échantillon;
i
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ISO/FDIS 12824:2016(F)
A est l’aire du pic de l’étalon interne dans l’échantillon;
s
m est la masse de l’étalon interne, en grammes;
s
m est la masse de l’échantillon, en grammes.
i
B.2.5 Fidélité
L’écart relatif entre réplicats ne doit pas dépasser 2,0 %.
ISO/FDIS 12824:2016(F)
Annexe C
(normative)
Détermination de la teneur en protéines
C.1 Méthode de Kjeldahl (automatique) (méthode de référence)
C.1.1 Réactifs
C.1.1.1 Acide sulfurique concentré (pureté de 95 % à 98 %).
C.1.1.2 Catalyseur: peser 7,0 g de sulfate de potassium et 0,4 g de sulfate de cuivre.
C.1.1.3 Indicateur mixte: dissoudre 100 mg de rouge de méthyle dans 100 ml de méthanol et 100 mg
de vert de bromocrésol dans 100 ml de méthanol.
Lorsque le titrage potentiométrique est utilisé, aucun indicateur n’est requis.
C.1.1.4 Solution d’acide borique à 4 % (m/v): dissoudre 400 g d’acide borique dans 5 l à 6 l d’eau
chaude déionisée. Mélanger et ajouter encore de l’eau chaude déionisée jusqu’à atteindre un volume
d’environ 9 l.
Refroidir à température ambiante, ajouter 100 ml de solution de vert de bromocrésol et 70 ml de
solution de rouge de méthyle, et diluer à un volume final de 10 l. Ajuster le pH de la solution d’acide
borique entre 4,6 et 4,8, en utilisant 0,1 mol/l de NaOH ou 0,1 mol/l de HCl. Il est également possible
d’utiliser 25 ml d’indicateur mixte Sher et de diluer au volume final.
C.1.1.5 Solution d’hydroxyde de sodium: peser 32 g d’hydroxyde de sodium et diluer à 100 ml avec de
l’eau distillée.
C.1.1.6 Solution étalon d’acide chlorhydrique: 0,1 mol/l.
C.1.2 Appareillage
C.1.2.1 Balance analytique: précise à 0,000 1 g près.
C.1.2.2 Bloc de minéralisation: bloc en alliage d’aluminium avec thermomètre réglable pour mesurer
2) 2)
et régler la température du bloc (Tecator Digestion System 20, 1015 Digestor ou KjelDigester K-449 ,
2)
SpeedDigester K-439 ou équivalent).
C.1.2.3 Tubes de minéralisation: 250 ml à 300 ml.
2) 2)
C.1.2.4 Unités de distillation: Foss Tecator 2200 , BUCHI KjelMaster K-375 ou équivalent, pour
accepter des tubes de minéralisation de 250 ml à 300 ml.
C.1.2.5 Flacon de titrage: Erlenmeyer gradué de 500 ml (pour prélever et titrer le distillat).

2) Ceci est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci de
commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à
l’égard de ce produit.
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ISO/FDIS 12824:2016(F)
C.1.2.6 Tubulure d’évacuation des vapeurs: avec joints en polytétrafluoroéthylène (PTFE), raccordée à
une trompe à eau sous hotte.
C.1.2.7 Coupelles de pesée exemptes d’azote.
C.2.1.8 Distributeur automatique: −25 ml, volume réglable, fixé à un flacon d’acide de 2,4 l.
C.1.3 Mode opératoire
C.1.3.1 Minéralisation
Peser environ 1 g d’échantillon de gelée royale dans une coupelle de pesée tarée exempte d’azote.
Enrouler la substance dans du papier et placer dans un tube de Kjeldahl.
À l’aide d’un distributeur automatique, ajouter le catalyseur et 12 ml d’acide sulfurique. Conserver le
mélange toute une nuit.
Placer la tubulure d’évacuation des vapeurs sur les tubes et ouvrir la trompe à eau à fond. Positionner le
portoir de tubes dans le bloc préchauffé (à 420 °C). Après 10 min, allumer la trompe à eau ou l’épurateur.
Il convient de maintenir une zone de condensation à l’intérieur les tubes. Après la production de la
majeure partie des vapeurs d’oxydes de soufre au début de la minéralisation, réduire la source de vide
pour empêcher toute perte d’acide sulfurique. Effectuer une minéralisation supplémentaire de 50 min.
La durée de minéralisation totale est d’environ 60 min.
Laisser les tubes refroidir. Ajouter de l’eau déionisée dans chaque tube jusqu’à un volume total
d’environ 80 ml.
C.1.3.2 Distillation
Placer 32 % de NaOH dans un réservoir alcalin de distillation. Régler le volume distribué sur 50 ml. Fixer
le tube de minéralisation contenant le digestat dilué à l’unité de distillation, ou utiliser un dispositif de
dilution automatique. Ajouter 60 ml de solution de H BO dans le flacon récepteur avec indicateur sur
3 3
la plate-forme réceptrice et immerger le tube du condenseur sous la surface de la solution de H BO .
3 3
Distiller à la vapeur jusqu’à ce qu’au moins 150 ml de distillat soient collectés et retirer le flacon
récepteur.
C.1.3.3 Titrage
Titrer la solution réceptrice de H BO avec 0,1 mol/l d’étalon HCl jusqu’à atteindre le point d’équivalence
3 3
violet ou gris. Rapporter le volume de HCl à 0,05 ml près.
C.1.4 Calcul
La teneur en protéines de la gelée royale est donnée par la Formule (C.1):
Vs −Vb ××M 14,01
()
N = ×62, 5 (C.1)
W ×10
où
N est la teneur en protéines de la gelée royale, en fraction massique, %;
V est le volume d’acide de référence consommé lors du titrage de l’échantillon, en millilitres;
s
V est le volume d’acide de référence consommé lors du titrage du blanc, en millilitres;
b
M est la concentration en solution étalon d’acide chlorhydrique, en mol/l;
ISO/FDIS 12824:2016(F)
14,01 est la masse atomique de l’azote;
W est la masse de l’échantillon, en grammes;
10 est le facteur de conversion des mg/g en %;
6,25 est le facteur de conversion de l’azote en protéines.
C.2 Méthode de Kjeldahl (classique)
C.2.1 Réactifs
C.2.1.1 Acide sulfurique concentré (ω = 95 % à 98 %).
C.2.1.2 Réactif mixte à base de sulfate de cuivre et de sulfate de potassium: peser 1 g de sulfate de
cuivre et 10 g de sulfate de potassium, placer dans le mortier, mélanger de façon homogène et broyer
finement pour pouvoir l’utiliser.
C.2.1.3 Indicateur mixte: peser deux échantillons de solution éthanolique de rouge de méthyle
(ρ = 1 g/l) et trois échantillons de solution éthanolique de vert de bromocrésol (ρ = 2 g/l) et mélanger de
façon homogène, ou utiliser l’indicateur mixte Sher.
C.2.1.4 Solution d’absorption d’acide borique (ρ = 20 g/l): peser 2,0 g d’acide borique, placer dans
l’éprouvette graduée de 100 ml, ajouter 20 ml d’éthanol, diluer jusqu’au trait de jauge avec de l’eau
distillée, agiter jusqu’à dissolution de l’acide borique et mettre de côté en vue d’une utilisation ultérieure.
C.2.1.5 Solution d’hydroxyde de sodium (ρ = 400 g/l): peser 32 g d’hydroxyde de sodium et diluer à
100 ml avec de l’eau distillée.
C.2.1.6 Acide chlorhydrique dilué: peser 5,7 ml d’acide sulfurique concentré et diluer à 100 ml avec de
l’eau distillée.
C.2.1.7 Solution étalon d’acide chlorhydrique (0,1 mol/l): diluer 10 fois avant utilisation.
C.2.2 Appareillage
C.2.2.1 Appareil de minéralisation adapté à la méthode de Kjeldahl (détermination de la teneur en
azote), ballon de Kjeldahl de 50 ml (si un four électrique de minéralisation à infrarouge lointain est
utilisé, un tube de minéralisation de 50 ml et un entonnoir doivent être installés).
C.2.2.2 Burette d’acide de 10 ml.
C.2.2.3 Balance analytique: précise à 0,000 01 g.
Unité de distillation adaptée à la méthode semi-micro (voir la Figure C.1).
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ISO/FDIS 12824:2016(F)
Légende
A Ballon à fond rond de 1 000 ml F Fiole conique de 100 ml
B Flacon de sécurité G, H Pincement pour tube en caoutchouc
C Distillateur raccordé à la boule d’azote I Tube de sécurité
D Entonnoir J Eau
E Tube du condensateur
Figure C.1 — Unité de distillation adaptée à la méthode semi-micro pour déterminer la teneur
en protéines
C.2.3 Mode opératoire
C.2.3.1 Nettoyage de l’unité de distillation
Raccorder l’unité de distillation, ajouter la quantité appropriée d’eau distillée et quelques gouttes
d’indicateur rouge de méthyle dans le flacon A, ajouter de l’acide sulfurique dilué pour le rendre acide,
ajouter quelques granulés de billes de verre et de zéolites, ajouter 50 ml d’eau distillée provenant de
l’entonnoir D, fermer le pincement G, ouvrir l’eau du condensateur et faire bouillir l’eau distillée dans
le flacon A. Lorsque la vapeur sort par le sommet du tube du condensateur, arrêter le brûleur, fermer
le pincement H et renvoyer l’eau distillée du flacon C vers le flacon B. Ouvrir le pincement G, évacuer
l’eau distillée du flacon B et fermer les pincements B et G. Immerger le sommet du tube du condensateur
dans environ 50 ml d’eau distillée, renvoyer l’eau distillée vers le flacon C depuis le sommet du tube
du condensateur puis vers le flacon B et évacuer l’eau distillée selon la méthode ci-dessus. Nettoyer
l’appareil deux ou trois fois de cette manière.
C.2.3.2 Minéralisation
Peser environ exactement 1 g de gelée royale, le disposer sur un papier-filtre ou sur un papier paraffiné
pesé, bien l’emballer après l’avoir pesé exactement et placer dans un flacon de Kjeldahl ou dans un
tube de minéralisation. Ajouter 2 g de réactif mixte constitué de sulfate de cuivre et de sulfate de
potassium, ajouter lentement 10 ml d’acide sulfurique concentré le long de la paroi du flacon, mélanger
suffisamment, placer un petit entonnoir au niveau de l’embouchure du flacon, laisser reposer le flacon
incliné à un angle de 45 °C, chauffer lentement à faible température d’abord, maintenir la température
ISO/FDIS 12824:2016(F)
de la solution au-dessous du point d’ébullition et augmenter la puissance électrique progressivement
jusqu’à l’arrêt de l’ébullition. Lorsque la solution de minéralisation bout, maintenir cet état et s’assurer
que la solution ne déborde pas, chauffer pendant 30 min de plus après que la solution ait pris une
couleur vert clair, transférer dans une fiole jaugée de 100 ml après refroidissement, diluer jusqu’au trait
de jauge avec de l’eau distillée et agiter de façon homogène en vue d’une utilisation ultérieure.
C.2.3.3 Distillation
Peser 10 ml d’acide borique à 20 g/l, les placer dans une fiole conique de 100 ml, ajouter cinq gouttes
d’indicateur mixte, immerger le sommet du tube du condensateur dans la solution, prélever exactement
5 ml de la solution de minéralisation précédente, transvaser dans un tube de réaction par l’entonnoir D,
puis ajouter 10 ml d’hydroxyde de sodium à 400 g/l. Nettoyer l’entonnoir D avec un peu d’eau distillée,
fermer le pincement G et ajouter quelques millilitres d’eau distillée dans l’entonnoir D pour fermer le
tube. Chauffer le flacon A (l’acide sulfurique dilué doit être ajouté goutte à goutte à l’eau distillée dans
le flacon de façon à préserver son acidité) et distiller. Lorsque la solution d’acide borique commence à
passer de la couleur lie de vin à bleu cyan, continuer de distiller pendant 10 min, soulever le sommet
du tube condensateur de la solution, laisser la vapeur agir pendant 1 min, laver le sommet en faisant
dégouliner un peu d’eau distillée et arrêter la distillation.
C.2.3.4 Titrage
La solution d’absorption doit être titrée avec la solution étalon d’acide chlorhydrique à 0,01 mol/l.
Lorsque la couleur passe de cyan à gris-violet, cela signifie que le point d’équivalence a été atteint.
C.2.4 Calcul
La teneur en protéines de la gelée royale est donnée par la Formule (C.2):
VV− ××c 0,014
()
10 1
X = ××62, 5 100 (C.2)
m ×5/100
où
X est la teneur en protéines de la gelée royale, en fraction massique, %;
V est le volume de solution étalon d’acide chlorhydrique à 0,01 mol/l consommé lors du
titrage de l’échantillon, en millilitres;
V est le volume de solution étalon d’acide chlorhydrique à 0,01 mol/l consommé lors du
titrage du blanc, en millilitres;
c est la concentration en solution étalon d’acide chlorhydrique, en mol/l;
0,014 est la masse millimolaire d’azote, en grammes;
m est la masse de l’échantillon, en grammes;
6,25 est le coefficient de conversion de l’azote en protéines.
C.2.5 Fidélité
L’écart relatif entre réplicats ne doit pas dépasser 3,0 %.
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ISO/FDIS 12824:2016(F)
C.3 Analyseur élémentaire
C.3.1 Appareillage
C.3.1.1 Balance analytique: précise à 0,000 01 g près.
C.3.1.2 Analyseur élémentaire
Voir la Figure C.2.
Légende
1 Unité de combustion 5 Débitmètre massique d’hélium (à 50 ml/min)
2 Unité de post-combustion 6 Détendeur d’oxygène (à environ 1,5 bar)
3 Four de réduction 7 Débitmètre massique d’oxygène (à 2 ml/min)
4 Hélium (à environ 1,5 bar)
Figure C.2 — Analyseur élémentaire
C.3.2 Mode opératoire de détermination de la teneur en azote
Peser environ exactement 2 mg de gelée royale lyophilisée dans une capsule en argent. Les introduire
dans une unité de combustion maintenue à 1 050 °C. Un flux d’hélium contenant 5 % d’oxygène
transporte les gaz issus de la combustion dans une unité de post-combustion remplie d’oxyde de cuivre
et maintenue à 850 °C. L’azote est alors converti en oxyde d’azote et les (NO ) sont réduits en N dans un
x 2
four de réduction du cuivre maintenu à 450 °C.
©
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 12824
Première édition
2016-09-15
Gelée royale — Spécifications
Royal jelly — Specifications
Numéro de référence
©
ISO 2016
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© ISO 2016, Publié en Suisse
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www.iso.org
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Exigences . 2
4.1 Description . 2
4.2 Odeur et goût . 2
4.3 Exigences chimiques . 2
4.4 Exigences sanitaires . 3
5 Méthodes d’essai . 3
5.1 Généralités . 3
5.2 Prélèvement de l’échantillon . 3
5.3 Méthodes d’essai des exigences chimiques . 3
6 Emballage, étiquetage, stockage et transport . 3
6.1 Emballage . 3
6.2 Étiquetage . 3
6.3 Stockage et transport . 4
Annexe A (normative) Détermination du taux d’humidité . 5
Annexe B (normative) Détermination de la teneur en 10-HDA . 8
Annexe C (normative) Détermination de la teneur en protéines .14
Annexe D (normative) Détermination de la teneur en sucres .21
Annexe E (normative) Détermination de l’acidité totale.27
Annexe F (normative) Détermination de la teneur en lipides totaux .28
Annexe G (normative) Détermination du rapport des isotopes C .30
Annexe H (informative) Détermination de la teneur en furosine .31
Annexe I (informative) Analyse pollinique .33
Bibliographie .36
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires.
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NORME INTERNATIONALE ISO 12824:2016(F)
Gelée royale — Spécifications
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie les exigences de production et les règles sanitaires pour la
gelée royale et établit une série de méthodes d’analyses organoleptiques et chimiques pour contrôler la
qualité de la gelée royale. Elle spécifie également les exigences de transport, de stockage, d’emballage
et d’étiquetage de la gelée royale. La présente Norme internationale s’applique à la production de gelée
royale (récolte, traitement préliminaire et emballage) et aux liens commerciaux. Elle ne s’applique pas
aux produits à base de gelée royale dans lesquels d’autres aliments sont mélangés.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 4833-1, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour le dénombrement des
micro-organismes — Partie 1: Comptage des colonies à 30 degrés C par la technique d’ensemencement en
profondeur
ISO 21528-2, Microbiologie des aliments — Méthodes horizontales pour la recherche et le dénombrement
des Enterobacteriaceae — Partie 2:Méthode par comptage des colonies
ISO 6579, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche des Salmonella spp.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions suivants s’appliquent.
3.1
gelée royale
mélange de sécrétions de glandes hypopharyngiennes et mandibulaires d’abeilles ouvrières, sans
aucun additif
Note 1 à l’article: Elle constitue la nourriture des reines au stade larvaire et au stade adulte. Il s’agit d’un aliment
brut et naturel, non transformé (hormis la filtration) et exempt d’additifs. La couleur, le goût et la composition
chimique de la gelée royale sont déterminés par l’absorption et la transformation par les abeilles nourries avec
les deux types d’aliments suivants pendant la période de production de gelée royale:
— type 1: uniquement les aliments naturels de l’abeille (pollen, nectar et miel);
— type 2: les aliments naturels de l’abeille et d’autres nutriments (protéines, hydrates de carbone, etc.).
3.2
10-HDA
acide 10-hydroxy-2-décénoïque
composé caractéristique de la gelée royale
4 Exigences
4.1 Description
La gelée royale est une substance nacrée de couleur blanc laiteux à jaune pâle. Elle est pâteuse ou
gélatineuse mais fluide à température ambiante et doit être exempte de bulles et de substances
étrangères. Des phénomènes de cristallisation mineurs peuvent se produire naturellement pendant la
période de stockage de la gelée royale.
4.2 Odeur et goût
La gelée royale est piquante, elle ne doit pas fermenter ni devenir rance. Elle est de saveur acide, épicée
et laisse un goût âcre dans le palais et la gorge.
4.3 Exigences chimiques
La gelée royale doit être conforme aux exigences données dans le Tableau 1.
Tableau 1 — Exigences chimiques relatives à la gelée royale
Caractéristique Exigence Méthode d’analyse
Type 1 Type 2
Taux d’humidité (%) min. 62,0 Annexe A
max. 68,5
10-HDA (%) min. 1,4 Annexe B
Protéines (%) min. 11 Annexe C
max. 18
Sucres totaux (%) min. 7 Annexe D
max. 18
Fructose (%) 2–9 Annexe D
Glucose (%) 2–9 Annexe D
a
Saccharose (%) <3,0 Na Annexe D
a
Erlose (%) <0,5 Na Annexe D
a
Maltose (%) <1,5 Na Annexe D
a
Maltotriose %() <0,5 Na Annexe D
Acidité totale [(1 mol/l NaOH) ml/100g] min. 30,0 Annexe E
max. 53,0
Lipides totaux (%) 2 Annexe F
13 12
Rapport des isotopes C/ C (δ ‰) −29 à −20 −29 à −14 Annexe G
a
Na = Non applicable.
La furosine est un paramètre qualitatif complémentaire facultatif qui indique la fraîcheur de la gelée
royale (voir la méthode pour information dans l’Annexe H).
NOTE Une valeur devra être spécifiée lors de la prochaine révision de la présente Norme internationale.
L’analyse pollinique peut être utilisée pour déterminer l’origine géographique de la gelée royale (voir la
méthode pour information dans l’Annexe I).
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4.4 Exigences sanitaires
La gelée royale doit être conforme aux exigences données dans le Tableau 2.
Tableau 2 — Exigences sanitaires relatives à la gelée royale
Caractéristique Exigence Méthode d’analyse
Comptage des colonies (UFC/g) max. 500 ISO 4833-1
Bactéries pathogènes:
Enterobacteriaceae (UFC/g) absentes dans 10 g ISO 21528-2
Salmonelles (UFC/g) absentes dans 25 g ISO 6579
5 Méthodes d’essai
5.1 Généralités
Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue ainsi que de
l’eau distillée ou de l’eau de pureté équivalente.
5.2 Prélèvement de l’échantillon
Le préleveur d’échantillons doit utiliser une barre, un tube ou une cuillère en acier inoxydable. Placer
l’échantillon dans le flacon d’échantillons stérile, agiter suffisamment pour le mélanger de façon
homogène, et le mettre de côté en tant qu’échantillon à soumettre à essai. Chaque échantillon doit peser
plus de 20 g.
L’échantillon doit être immédiatement soumis à essai ou doit être conservé au réfrigérateur à une
température inférieure à 5 °C.
5.3 Méthodes d’essai des exigences chimiques
Les échantillons doivent être analysés conformément aux méthodes d’essai spécifiées dans les
Annexes A, B, C, D, E, F et G ou à toute autre méthode d’essai de performances reconnues comme
équivalentes selon des normes reconnues.
6 Emballage, étiquetage, stockage et transport
6.1 Emballage
Tout emballage en contact avec la gelée royale doit être apte au contact avec les denrées alimentaires.
6.2 Étiquetage
Au moins les informations suivantes doivent figurer sur chaque emballage ou sur une étiquette:
a) le nom du produit et la marque ou l’appellation commerciale, le cas échéant;
b) le nom et l’adresse du producteur ou de l’emballeur;
c) la masse nette;
d) le(s) pays de récolte;
e) l’année de la récolte;
f) la date de durabilité minimale;
g) le mode et les instructions de stockage;
h) le mois de congélation, le cas échéant;
i) le type, selon la présente Norme internationale;
k) le numéro de lot.
6.3 Stockage et transport
La température de stockage doit être comprise entre +2 °C et +5 °C, ou en cas de stockage à long terme,
doit être de préférence inférieure à −18 °C.
Il convient de stocker séparément la gelée royale produite dans différentes régions et à différentes
périodes en lui attribuant différents numéros de lot (dans des flacons ou des boîtes).
Elle doit être transportée à basse température et ne doit pas être stockée et transportée avec des
substances corrosives toxiques ou avec des substances ayant une odeur singulière ou susceptibles
d’entraîner une contamination.
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Annexe A
(normative)
Détermination du taux d’humidité
A.1 Méthode de l’étuve sous vide (méthode de référence)
A.1.1 Appareillage
A.1.1.1 Étuve sous vide.
A.1.1.2 Coupelle de pesée, hauteur de 25 mm à 30 mm, diamètre de 35 mm à 50 mm.
A.1.1.3 Balance analytique, précise à 0,000 1 g près.
A.1.2 Mode opératoire
Peser exactement environ 0,5 g de l’échantillon de gelée royale, le placer dans la coupelle de pesée qui
est séchée jusqu’à obtention d’une masse constante, répartir uniformément et placer dans l’étuve sous
vide. Sécher pendant 4 h à 75 °C et, sous une pression comprise entre 0,000 MPa et 0,005 MPa, sortir la
coupelle de pesée et la placer dans l’étuve ou dans le dessiccateur, la peser après l’avoir refroidie pendant
30 min. Sécher à nouveau pendant 2 h et répéter l’opération jusqu’à ce que la différence de masse entre
deux cycles consécutifs soit inférieure à 2 mg, à savoir jusqu’à l’obtention d’une masse constante.
A.1.3 Calcul
Le taux d’humidité dans la gelée royale, X , exprimé en pourcentage en masse, est donné par la
Formule (A.1):
mm−
X = ×100 (A.1)
mm−
où
X est le taux d’humidité dans la gelée royale, en %;
m est la masse de la coupelle de pesée et de l’échantillon, en grammes;
m est la masse de la coupelle de pesée et de l’échantillon séché jusqu’à l’obtention d’une masse
constante, en grammes;
m est la masse de la coupelle de pesée, en grammes.
A.1.4 Fidélité
L’écart relatif entre répétitions ne doit pas dépasser 0,8 %.
A.2 Karl Fisher
A.2.1 Appareillage
1)
A.2.1.1 Système de titrage Karl Fischer, titrateur Mettler DL 18 ou équivalent.
A.2.1.2 Balance analytique, précise à 0,000 01 g près.
1)
A.2.1.3 Hydranal Composite 5 R.D.H. comme solution de titrage ou équivalent.
A.2.1.4 Méthanol (pureté UV ou pureté analytique) comme solvant.
A.2.2 Mode opératoire
Avant l’analyse d’un échantillon, le titre du réactif utilisé [par exemple, Hydranal(R)-Composite 5] est
déterminé le jour même de l’analyse. La teneur en eau d’une solution étalon appropriée [par exemple,
Hydranal(R)-Water Standard 10.0, eau ultra-pure ou hydrate de terpine avec un taux d’humidité bien
défini à 10,46 %] est vérifiée sur trois répétitions.
Peser une seringue de 1 ml. Peser environ 30 mg de l’échantillon de gelée royale et les introduire dans
la seringue.
Introduire l’échantillon dans la cellule de titrage du titrateur contenant environ 40 ml de méthanol.
Peser à nouveau la seringue.
La masse de gelée royale exactement introduite dans la cellule de titrage est obtenue en calculant la
différence entre les deux pesées de la seringue.
Après 600 s d’agitation, le taux d’humidité est déterminé et calculé automatiquement par le titrateur en
% et en mg/kg.
Le titre déterminé doit être pris en compte pour calculer la teneur en eau de l’échantillon.
A.2.3 Fidélité
Chaque échantillon est analysé deux fois et l’écart relatif entre les deux mesures ne doit pas
dépasser 0,4 %.
A.3 Lyophilisation
Voir la Référence [1].
A.3.1 Appareillage
A.3.1.1 Balance analytique, précise à 0,000 1 g près.
A.3.1.2 Tubes à centrifuger.
A.3.1.3 Lyophilisateur.
A.3.1.4 Congélateur.
1) Exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci de commodité
à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ce
produit.
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A.3.2 Mode opératoire
Peser un tube à centrifuger avec son bouchon. Peser exactement environ 1 g de gelée royale et
l’introduire dans ce tube. Lyophiliser pendant au moins 36 h, sans le bouchon. Dès que la lyophilisation
est terminée, remettre le bouchon et peser l’échantillon immédiatement.
A.3.3 Calcul
Le pourcentage de matière sèche est calculé d’après la Formule (A.2):
% matière sèche = 100 × (m – m )/m (A.2)
1 0
où
m est la masse du tube après lyophilisation, avec son bouchon, en grammes;
m est la masse du tube vide avec son bouchon, en grammes;
m est la masse de l’échantillon, en grammes.
Le taux d’humidité dans la gelée royale est calculé d’après la Formule (A.3):
Taux d’humidité = 100 - % matière sèche (A.3)
A.3.4 Fidélité
L’écart relatif entre répétitions ne doit pas dépasser 0,8 %.
Annexe B
(normative)
Détermination de la teneur en 10-HDA
B.1 Étalonnage externe par CLHP-UV (méthode de référence)
B.1.1 Réactifs
Utiliser uniquement de l’eau ultra-pure.
B.1.1.1 Méthanol, pureté UV ou pureté analytique avec transmission de la lumière supérieure à 30 % à
la longueur d’onde de détection.
B.1.1.2 Étalon de référence 10-HDA, pur à plus de 99,0 % (certificat d’analyse du fournisseur).
B.1.1.3 Solution mère étalon 10-HDA S , c = 0,13 mg/ml.
Par exemple, peser exactement environ 6,50 mg de substance de référence dans une fiole jaugée de
50 ml, dissoudre dans du méthanol et compléter au volume avec du méthanol.
Pour la dilution: facteur x (étalon S ) = 0,13 (mg/ml)/concentration calculée S (mg/ml). La concentration
0 0
calculée doit être corrigée en fonction de la pureté de la substance de référence.
B.1.1.4 Tampon phosphate à 25 mmol, pH 2,5, en tant qu’éluant A, pour la solution d’extraction et le
solvant de l’échantillon.
Par exemple, peser 6,90 g de dihydrogénophosphate de sodium monohydraté (M = 137,99 g/mol) dans
une fiole jaugée de 2 l, dissoudre dans environ 1 800 ml de H O, ajuster le pH à 2,5 avec 85 % de H PO
2 3 4
et compléter au volume avec du H O.
B.1.1.5 Solution d’extraction, 55 % de tampon phosphate à 25 mmol, pH 2,5/45 % de méthanol (v/v).
Par exemple, mélanger 550 ml de tampon phosphate à 25 mmol, pH 2,5, avec 450 ml de MeOH, équilibrer
à température ambiante.
B.1.1.6 Solvant de l’échantillon, 70 % de tampon phosphate à 25 mmol, pH 2,5/30 % de méthanol
(v/v).
Par exemple, mélanger 700 ml de tampon phosphate à 25 mmol, pH 2,5, avec 300 ml de méthanol,
équilibrer à température ambiante.
B.1.2 Appareillage
B.1.2.1 CLHP avec détecteur UV, enregistreur ou microprocesseur.
B.1.2.2 Colonne de chromatographie, Zorbax SB-CN 150 × 3,0 mm; 3,5 μm ou un équivalent.
B.1.2.3 Bain à ultrasons.
B.1.2.4 Homogénéisateur, Ultraturrax ou équivalent.
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B.1.2.5 Balance analytique, précise à 0,000 01 g près.
B.1.3 Mode opératoire
B.1.3.1 Traitement de l’échantillon
Peser exactement environ 80,00 mg de gelée royale lyophilisée ou 200 mg de gelée royale fraîche dans
un tube à centrifuger de 50 ml.
Ajouter 40,0 ml de solution d’extraction. Homogénéiser pendant environ 10 s à 20 s à l’aide d’un
Ultraturrax à 15 000 tr/min jusqu’à émulsion de toute la gelée royale. Traiter pendant 10 min dans un
bain à ultrasons.
À l’aide d’une pipette, prélever 1 ml de l’extrait homogène et le transférer dans une fiole jaugée de 10 ml
puis compléter au volume avec le solvant de l’échantillon. Filtrer une portion aliquote de l’extrait dilué à
travers une membrane filtrante (0,45 μm).
B.1.3.2 Conditions chromatographiques
Longueur d’onde de détection: 216 nm
Éluant A: tampon phosphate à 25 mmol, pH 2,5
Éluant B: méthanol
Gradient: 34 % de B, 0-2,0 min
34-43 % de B, 2,0-9,0 min
43-80 % de B, 9,0-10,0 min
34 % de B, 10,1-16,0 min
B.1.3.3 Étalonnage externe
Tracer une courbe d’étalonnage externe (solutions correspondant aux concentrations en 10-HAD
suivantes: 1,0 g/100 ml, 1,5 g/100 ml, 2,0 g/100 ml, 2,5 g/100 ml).
La courbe d’étalonnage doit être linéaire avec un coefficient de corrélation r > 0,99.
Dilutions des étalons pour la courbe d’étalonnage:
Étalon 10-HDA à 1,0 g/100 ml: À l’aide d’une pipette, transférer (x * 385) μl de solution
mère étalon 10-HDA-S dans une fiole jaugée de 10 ml
c = 5 μg/ml
et compléter au volume avec le solvant de l’échantillon
(correspond à 1,0 g/100 g dans l’échantillon)
Étalon 10-HDA à 1,5 g/100 ml: À l’aide d’une pipette, transférer (x * 578) μl de solu-
tion mère étalon 10-HDA-S dans une fiole jaugée de
c = 7,5 μg/ml
10 ml et compléter au trait de jauge avec le solvant
(correspond à 1,5 g/100 g dans l’échantillon) de l’échantillon
Étalon 10-HDA à 2,0 g/100 ml: À l’aide d’une pipette, transférer (x * 770) μl de solu-
tion mère étalon 10-HDA-S dans une fiole jaugée de
c = 10 μg/ml
10 ml et compléter au trait de jauge avec le solvant
(correspond à 2,0 g/100 g dans l’échantillon)
de l’échantillon
Étalon 10-HDA à 2,5 g/100 ml: À l’aide d’une pipette, transférer (x * 963) μl de solu-
tion mère étalon 10-HDA-S dans une fiole jaugée de
c = 12,5 μg/ml
10 ml et compléter au trait de jauge avec le solvant
(correspond à 2,5 g/100 g dans l’échantillon)
de l’échantillon
x = facteur de la solution mère 10-HDA-S (voir en B.1.1.3)
B.1.3.4 Détermination de l’échantillon
Injecter 20 μl dans le chromatographe.
Déterminer la concentration de l’extrait filtré (dilué) par CLHP à 216 nm avec la courbe d’étalonnage
externe.
B.1.4 Calcul
1) Courbe d’étalonnage
Déterminer l’équation de la droite représentant graphiquement l’aire du pic chromatographique du 10-
HDA en fonction de la concentration corrigée par la pureté [μg/ml] des solutions étalons sous forme:
y = ax + b (B.1)
où
y est l’aire du pic du 10-HDA;
a est la pente de la courbe d’étalonnage;
x est la concentration corrigée par la pureté de l’étalon;
b est l’ordonnée à l’origine de la courbe d’étalonnage.
2) En utilisant la surface du pic du 10-HDA de l’échantillon, calculer la quantité de 10-HDA dans la
solution de mesure d’après la courbe d’étalonnage de la façon suivante:
x’ = (y’ – b) / a (B.2)
où
x’ est la concentration [μg/ml] en 10-HDA de la solution de mesure de l’échantillon;
y’ est l’aire du pic du 10-HDA dans l’échantillon;
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La teneur en 10-HDA (C ) de la gelée royale (échantillon en g/100 g) est donnée par la Formule (B.3):
10-HDA
C = x’ × 40/m (B.3)
10-HDA
où
x’ est la concentration calculée [μg/ml] en 10-HDA de la solution de mesure de l’échantillon;
40 est le facteur de dilution tenant compte du volume d’extraction de 40 ml, du volume de la
pipette utilisée pour la dilution (1 ml) et du volume de la fiole jaugée utilisée pour la dilution
(10 ml);
m est la masse réelle de l’échantillon de gelée royale, en mg.
B.1.5 Fidélité
L’écart relatif entre répétitions ne doit pas dépasser 2,0 % (lyophilisats) et 5,0 % (gelée royale fraîche).
B.2 Étalonnage interne par CLHP-UV (méthode alternative)
B.2.1 Réactifs
Utiliser uniquement de l’eau bidistillée.
B.2.1.1 Méthanol, pureté UV ou pureté analytique avec transmission de la lumière supérieure à 30 % à
la longueur d’onde de détection (210 nm).
B.2.1.2 Alcool anhydre, GR.
B.2.1.3 Substance étalon interne, acide trans-2-hexénoïque, pur à 99,0 %.
B.2.1.4 Étalon 10-HDA, pur à plus de 99,0 %. Le décompresser et le sécher pendant 24 h dans l’étuve
sous vide ou dans le dessiccateur avec de l’acide sulfurique concentré avant de l’utiliser.
B.2.1.5 Solution étalon 10-HDA. Peser exactement environ 12,5 mg d’échantillon d’étalon 10-HDA
séché, dissoudre avec de l’alcool anhydre et transférer dans une fiole jaugée de 25 ml. Diluer jusqu’au
trait de jauge avec de l’alcool anhydre et mélanger de façon homogène.
La concentration en 10-HDA obtenue dans la solution est de 0,5 mg/ml.
B.2.1.6 Solution étalon interne. Peser exactement environ 650 mg d’acide trans-2-hexénoïque,
dissoudre avec de l’alcool anhydre et transférer dans une fiole jaugée de 1 000 ml. Diluer jusqu’au trait
de jauge avec de l’alcool anhydre et mélanger de façon homogène.
La concentration en solution étalon interne obtenue dans la solution est de 0,65 mg/ml.
B.2.1.7 Acide chlorhydrique, (c = 0,03 mol/l). Prélever 100 ml d’acide chlorhydrique à 0,1 mol/l et
ajouter 200 ml d’eau bidistillée.
B.2.1.8 Phase mobile, Φ (CH OH + 0,03 mol/l HCl+H O) = 55 + 10 + 35 ou (CH OH + tampon
3 2 3
phosphate à 25 mmol/l pH 2,5) = 55 + 45.
B.2.2 Appareillage
B.2.2.1 CLHP avec détecteur UV, enregistreur ou microprocesseur.
B.2.2.2 Colonne de chromatographie, 4,6 mm × 250 mm, acier inoxydable, phase stationnaire C ,
granulométrie 5 μm ou 10 μm.
B.2.2.3 Bains à ultrasons.
B.2.2.4 Mélangeur, Vortex ou équivalent.
B.2.2.5 Balance analytique, précise à 0,000 01 g près.
B.2.3 Mode opératoire
B.2.3.1 Traitement de l’échantillon
Décongeler l’échantillon à température ambiante et agiter de façon homogène avec une tige en verre,
peser exactement environ 0,5 g de gelée royale et mettre dans une fiole jaugée de 50 ml préalablement
pesée, ajouter 1 ml d’acide chlorhydrique à 0,03 mol/l et 2 ml d’eau, mettre sur le l’agitateur Vortex
et mélanger pour dissoudre l’échantillon. Ajouter 30 ml d’alcool anhydre, ajouter exactement 10 ml
de solution d’étalon interne, tout en agitant doucement, diluer jusqu’au trait de jauge avec de l’alcool
anhydre et mélanger de façon homogène. Mettre immédiatement dans le bain à ultrasons pendant
15 min ou sur l’agitateur Vortex et agiter pendant 15 min. Retirer, effectuer un dosage après 10 min de
centrifugation à 3 000 tr/min puis filtrer sur une membrane filtrante de 0,45 µm si nécessaire. Placer
au réfrigérateur si le dosage n’est pas effectué immédiatement.
B.2.3.2 Condition chromatographique
Longueur d’onde de mesure: 210 nm; température de la colonne: 35 °C; débit: 1 ml/min.
B.2.3.3 Détermination du facteur de correction
Prélever séparément 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml et 5,0 ml de solution étalon 10-HDA et
transférer ces fractions dans des fioles jaugées de 10 ml. Ajouter exactement 2 ml de solution étalon
interne, diluer jusqu’au trait de jauge avec de l’alcool anhydre et mélanger de façon homogène. Peser
respectivement 10 μl de ces solutions, les injecter dans le chromatographe, représenter graphiquement
le rapport massique du 10-HDA selon la méthode de l’étalonnage interne, en fonction du rapport de
l’aire du pic de celui-ci, et tracer une courbe d’étalonnage linéaire. Calculer le facteur de correction F,
qui est la pente de la courbe d’étalonnage.
B.2.3.4 Détermination de l’échantillon
Peser 10 μl de solution d’échantillon, les injecter dans le chromatographe et corriger la mesure selon la
«méthode de l’étalonnage interne».
B.2.4 Calcul
La teneur en 10-HDA de la gelée royale est donnée par la Formule (B.4):
Ai ms
XF=× ××100 (B.4)
As mi
où
X est la teneur en 10-HDA de la gelée royale, en %;
F est le facteur de correction;
A est l’aire du pic du groupe soumis à essai dans l’échantillon;
i
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A est l’aire du pic de l’étalon interne dans l’échantillon;
s
m est la masse de l’étalon interne, en grammes;
s
m est la masse de l’échantillon, en grammes.
i
B.2.5 Fidélité
L’écart relatif entre répétitions ne doit pas dépasser 2,0 %.
Annexe C
(normative)
Détermination de la teneur en protéines
C.1 Méthode de Kjeldahl (automatique) (méthode de référence)
C.1.1 Réactifs
C.1.1.1 Acide sulfurique concentré, pureté de 95 % à 98 %.
C.1.1.2 Catalyseur. Peser 7,0 g de sulfate de potassium et 0,4 g de sulfate de cuivre.
C.1.1.3 Indicateur mixte. Dissoudre 100 mg de rouge de méthyle dans 100 ml de méthanol et 100 mg
de vert de bromocrésol dans 100 ml de méthanol.
Lorsque le titrage potentiométrique est utilisé, aucun indicateur n’est requis.
C.1.1.4 Solution d’acide borique à 4 % (m/v). Dissoudre 400 g d’acide borique dans 5 l à 6 l d’eau
chaude déionisée. Mélanger et ajouter encore de l’eau chaude déionisée jusqu’à atteindre un volume
d’environ 9 l.
Refroidir à température ambiante, ajouter 100 ml de solution de vert de bromocrésol et 70 ml de
solution de rouge de méthyle, et diluer à un volume final de 10 l. Ajuster le pH de la solution d’acide
borique entre 4,6 et 4,8, en utilisant 0,1 mol/l de NaOH ou 0,1 mol/l de HCl. Il est également possible
d’utiliser 25 ml d’indicateur mixte Sher et de diluer au volume final.
C.1.1.5 Solution d’hydroxyde de sodium. Peser 32 g d’hydroxyde de sodium et diluer à 100 ml avec
de l’eau distillée.
C.1.1.6 Solution étalon d’acide chlorhydrique, 0,1 mol/l.
C.1.2 Appareillage
C.1.2.1 Balance analytique, précise à 0,000 1 g près.
C.1.2.2 Bloc de minéralisation. Bloc en alliage d’aluminium avec thermomètre réglable pour mesurer
2) 2)
et régler la température du bloc (Tecator Digestion System 20, 1015 Digestor ou KjelDigester K-449 ,
2)
SpeedDigester K-439 ou équivalent).
C.1.2.3 Tubes de minéralisation, 250 ml à 300 ml.
2) 2)
C.1.2.4 Unités de distillation, Foss Tecator 2200 , BUCHI KjelMaster K-375 ou équivalent, pour
accepter des tubes de minéralisation de 250 ml à 300 ml.
C.1.2.5 Flacon de titrage, Erlenmeyer gradué de 500 ml (pour prélever et titrer le distillat).
2) Exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci de commodité
à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ce
produit.
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C.1.2.6 Tubulure d’évacuation des vapeurs, avec joints en polytétrafluoroéthylène (PTFE), raccordée
à une trompe à eau sous hotte.
C.1.2.7 Coupelles de pesée exemptes d’azote.
C.2.1.8 Distributeur automatique, −25 ml, volume réglable, fixé à un flacon d’acide de 2,4 l.
C.1.3 Mode opératoire
C.1.3.1 Minéralisation
Peser environ 1 g d’échantillon de gelée royale dans une coupelle de pesée tarée exempte d’azote.
Enrouler la substance dans du papier et placer dans un tube de Kjeldahl.
À l’aide d’un distributeur automatique, ajouter le catalyseur et 12 ml d’acide sulfurique. Conserver le
mélange toute une nuit.
Placer la tubulure d’évacuation des vapeurs sur les tubes et ouvrir la trompe à eau à fond. Positionner le
portoir de tubes dans le bloc préchauffé (à 420 °C). Après 10 min, allumer la trompe à eau ou l’épurateur.
Il convient de maintenir une zone de condensation à l’intérieur les tubes. Après la production de la
majeure partie des vapeurs d’oxydes de soufre au début de la minéralisation, réduire la source de vide
pour empêcher toute perte d’acide sulfurique. Effectuer une minéralisation supplémentaire de 50 min.
La durée de minéralisation totale est d’environ 60 min.
Laisser les tubes refroidir. Ajouter de l’eau déionisée dans chaque tube jusqu’à un volume total
d’environ 80 ml.
C.1.3.2 Distillation
Placer 32 % de NaOH dans un réservoir alcalin de distillation. Régler le volume distribué sur 50 ml. Fixer
le tube de minéralisation contenant le digestat dilué à l’unité de distillation, ou utiliser un dispositif de
dilution automatique. Ajouter 60 ml de solution de H BO dans le flacon récepteur avec indicateur sur
3 3
la plate-forme réceptrice et immerger le tube du condenseur sous la surface de la solution de H BO .
3 3
Distiller à la vapeur jusqu’à ce qu’au moins 150 ml de distillat soient collectés et retirer le flacon
récepteur.
C.1.3.3 Titrage
Titrer la solution réceptrice de H BO avec 0,1 mol/l d’étalon HCl jusqu’à atteindre le point d’équivalence
3 3
violet ou gris. Rapporter le volume de HCl à 0,05 ml près.
C.1.4 Calcul
La teneur en protéines de la gelée royale est donnée par la Formule (C.1):
VV− ××M 14,01
()
sb
N = ×62, 5 (C.1)
m×10
où
N est la teneur en protéines de la gelée royale, en fraction massique, %;
V est le volume d’acide de référence consommé lors du titrage de l’échantillon, en millilitres;
s
V est le volume d’acide de référence consommé lors du titrage du blanc, en millilitres;
b
M est la concentration en solution étalon d’acide chlorhydrique, en mol/l;
14,01 est la masse atomique de l’azote;
m est la masse de l’échantillon, en grammes;
10 est le facteur de conversion des mg/g en %;
6,25 est le facteur de conversion de l’azote en protéines.
C.2 Méthode de Kjeldahl (classique)
C.2.1 Réactifs
C.2.1.1 Acide sulfurique concentré, w = 95 % à 98 %.
C.2.1.2 Catalyseur mixte à base de sulfate de cuivre et de sulfate de potassium. Peser 1 g de sulfate
de cuivre et 10 g de sulfate de potassium, placer dans le mortier, mélanger de façon homogène et broyer
finement pour pouvoir l’utiliser.
C.2.1.3 Indicateur mixte. Peser deux volumes de solution éthanolique de rouge de méthyle (ρ = 1 g/l)
et trois volumes de solution éthanolique de vert de bromocrésol (ρ = 2 g/l) et mélanger de façon
homogène, ou utiliser l’indicateur mixte Sher.
C.2.1.4 Solution d’absorption d’acide borique (ρ = 20 g/l). Peser 2,0 g d’acide borique, placer dans
l’éprouvette graduée de 100 ml, ajouter 20 ml d’éthanol, diluer jusqu’au trait de jauge avec de l’eau
distillée, agiter jusqu’à dissolution de l’acide borique et mettre de côté en vue d’une utilisation ultérieure.
C.2.1.5 Solution d’hydroxyde de sodium (ρ = 400 g/l). Peser 32 g d’hydroxyde de sodium et diluer à
100 ml avec de l’eau distillée.
C.2.1.6 Acide sulfurique dilué. Prélever à la pipette 5,7 ml d’acide sulfurique concentré et diluer à
100 ml avec de l’eau distillée.
C.2.1.7 Solution étalon d’acide chlorhydrique (0,1 mol/l). Diluer 10 fois avant utilisation.
C.2.2 Appareillage
C.2.2.1 Appareil de minéralisation adapté à la méthode de Kjeldahl (détermination de la teneur
en azote), ballon de Kjeldahl de 50 ml (si un four électrique de minéralisation à infrarouge lointain est
utilisé, un tube de minéralisation de 50 ml et un entonnoir doivent être installés).
C.2.2.2 Burette d’acide, de 10 ml.
C.2.2.3 Balance analytique, précise à 0,000 01 g.
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C.2.2.4 Unité de distillation adaptée à la méthode semi-micro (voir la Figure C.1).
Légende
A Ballon à fond rond de 1 000 ml F Fiole conique de 100 ml
B Flacon de sécurité G, H Pincement pour tube en caoutchouc
C Distillateur raccordé à la boule d’azote I Tube de sécurité
D Entonnoir J Eau
E Tube du condensateur
Figure C.1 — Unité de distillation adaptée à la méthode semi-micro pour déterminer la teneur
en protéines
C.2.3 Mode opératoire
C.2.3.1 Nettoyage de l’unité de distillation
Raccorder l’unité de distillation, ajouter la quantité appropriée d’eau distillée et quelques gouttes
d’indicateur rouge de méthyle dans le flacon A, ajouter de l’acide sulfurique dilué pour le rendre acide,
ajouter quelques granulés de billes de verre et de zéolites, ajouter 50 ml d’eau distillée provenant de
l’entonnoir D, fermer le pincement G, ouvrir l’eau du condensateur et faire bouillir l’eau distillée dans
le flacon A. Lorsque la vapeur sort par le sommet du tube du condensateur, arrêter le brûleur, fermer
le pincement H et renvoyer l’eau distillée du flacon C vers le flacon B. Ouvrir le pincement G, évacuer
l’eau distillée du flacon B et fermer les pincements B et G. Immerger le sommet du tube du condensateur
dans environ 50 ml d’eau distillée, renvoyer l’eau distillée vers le flacon C depuis le sommet du tube
du condensateur puis vers le flacon B et évacuer l’eau distillée selon la méthode ci-dessus. Nettoyer
l’appareil deux ou trois fois de cette manière.
C.2.3.2 Minéralisation
Peser exactement environ 1 g de gelée royale, le disposer sur un papier-filtre ou sur un papier paraffiné
pesé, bien l’emballer après l’avoir pesé exactement et placer dans un flacon de Kjeldahl ou dans un
tube de minéralisation. Ajouter 2 g de catalyseur mixte constitué de sulfate de cuivre et de sulfate de
potassium, ajouter lentement 10 ml d’acide sulfurique concentré le long de la paroi du flacon, mélanger
suffisamment, placer un petit entonnoir au niveau de l’embouchure du flacon, laisser reposer le flacon
incliné à un angle de 45 °C, chauffer lentement à faible température d’abord, maintenir la température
de la solution au-dessous du point d’ébullition et augmenter la puissance électrique progressivement
jusqu’à l’arrêt de l’ébullition. Lorsque la solution de minéralisation bout, maintenir cet état et s’assurer
que la solution ne déborde pas, chauffer pendant 30 min de plus après que la solution ait pris une
couleur vert clair, transférer dans une fiole jaugée de 100 ml après refroidissement, diluer jusqu’au trait
de jauge avec de l’eau distillée et agiter de façon homogène en vue d’une utilisation ultérieure.
C.2.3.3 Distillation
Peser 10 ml d’acide borique à 20 g/l, les placer dans une fiole conique de 100 ml, ajouter cinq gouttes
d’indicateur mixte, immerger le sommet du tube du condensateur dans la solution, prélever exactement
5 ml de la solution de minéralisation précédente, transvaser dans un tube de réaction par l’entonnoir D,
puis ajouter 10 ml d’hydroxyde de sodium à 400 g/l. Nettoyer l’entonnoir D avec un peu d’eau distillée,
fermer le pincement G et ajouter quelques millilitres d’eau distillée dans l’entonnoir D pour fermer le
tube. Chauffer le flacon A (l’acide sulfurique dilué doit être ajouté goutte à goutte à l’eau distillée dans
le flacon de façon à préserver son acidité) et distiller. Lorsque la solution d’acide borique commence à
passer de la couleur lie de vin à bleu cyan, continuer de distiller pendant 10 min, soulever le sommet
du tube condensateur de la solution, laisser la vapeur agir pendant 1 min, laver le sommet en faisant
dégouliner un peu d’eau distillée et arrêter la distillation.
C.2.3.4 Titrage
La solution d’absorption doit être titrée avec la solution étalon d’acide chlorhydrique à 0,01 mol/l.
Lorsque la couleur passe de cyan à gris-violet, cela signifie que le point d’équivalence a été atteint.
C.2.4 Calcul
La teneur en protéines de la gelée royale est donnée par la Formule (C.2):
VV− ××c 0,014
()
10 1
X = ××62, 5 100 (C.2)
m ×5/100
où
X est la teneur en protéines de la gelée royale, en fraction massique, %;
V est le volume de solution étalon d’acide chlorhydrique à 0,01 mol/l consommé lors du
titrage de l’échantillon, en millilitres;
V est le volume de solution étalon d’acide chlorhydrique à 0,01 mol/l consommé lors du
titrage du blanc, en millilitres;
c est la concentration en solution étalon d’acide chlorhydrique, en mol/l;
0,014 est la masse millimolaire d’azote, en grammes;
m est la masse de l’échantillon, en grammes;
6,25 est le coefficient de conversion de l’azote en protéines.
C.2.5 Fidélité
L’écart relatif entre répétitions ne doit pas dépasser 3,0 %.
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C.3 Analyseur élémentaire
C.3.1 Appareillage
C.3.1.1 Balance analytique, précise à 0,000 01 g près.
C.3.1.2 Analyseur élémentaire.
Voir la Figure C.2.
Légende
1 Unité de combustion 5 Débitmètre massique d’hélium (à 50 ml/min)
2 Unité de post-combustion 6 Détendeur d’oxygène (à environ 1,5 bar)
3 Four de réduction 7 Débitmètre massique d’oxygène (à 2 ml/min)
4 Hélium (à environ 1,5 bar)
Figure C.2 — Analyseur élémentaire
C.3.2 Mode opératoire de détermination de la teneur en azote
Peser exactement environ 2 mg de gelée royale lyophilisée dans une capsule en argent. Les introduire
dans une unité de combustion maintenue à 1 050 °C. Un flux d’hélium contenant 5 % d’oxygène
transporte les gaz issus de la combustion dans une unité de post-combustion remplie d’oxyde de cuivre
et maintenue à 850 °C. L’azote est alors converti en oxyde d’azote et les (NO ) sont réduits en N dans un
x 2
four de réduction du cuivre maintenu à 450 °C.
L’eau est retenue avec du perchlorate de magnésium anhydre.
Le N est séparé du CO et de l’eau en utilisant une colonne de chromatographie en phase gazeuse
2 2
3)
(Hayesep Q tamis 60/80, Supelco , 3,5 m × 0,63 cm) maintenue à 45 °C. La teneur en azote est ensuite
quantifiée avec un catharomètre (intensité du pont de Wheatstone: 200 mA).
C.3.3 Étalonnage
Étalonner l’analyseur tous les jours avec des étalons d’une pureté supérieure à 99,5 %.
C.3.4 Fidélité
Les résultats entre répétitions ne doivent différer de plus de 0,3 %.
C.3.5 Calcul
La teneur en azote (%N) de la gelée royale est donnée par la Formule (C.3):
m
azote
%N =×100 (C.3)
m
total
où
%N est la teneur en azot
...