ISO 10705-2:2000

SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 10705-2:2000
01-december-2000
Kakovost vode - Ugotavljanje prisotnosti in števila bakteriofagov - 2. del:
Ugotavljanje števila somatskih kolifagov
Water quality -- Detection and enumeration of bacteriophages -- Part 2: Enumeration of
somatic coliphages
Qualité de l'eau -- Détection et dénombrement des bactériophages -- Partie 2:
Dénombrement des coliphages somatiques
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 10705-2:2000
ICS:
07.100.20 Mikrobiologija vode Microbiology of water
SIST ISO 10705-2:2000 en
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.

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SIST ISO 10705-2:2000

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SIST ISO 10705-2:2000
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10705-2
First edition
2000-04-01
Water quality — Detection and enumeration
of bacteriophages —
Part 2:
Enumeration of somatic coliphages
Qualité de l'eau — Détection et dénombrement des bactériophages —
Partie 2: Dénombrement des coliphages somatiques
Reference number
ISO 10705-2:2000(E)
©
ISO 2000

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SIST ISO 10705-2:2000
ISO 10705-2:2000(E)
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SIST ISO 10705-2:2000
ISO 10705-2:2000(E)
Contents Page
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Terms and definitions .1
4 Safety precautions.2
5 Principle.2
6 Diluent, culture media and reagents.2
6.1 Basic materials.2
6.2 Diluent.2
7 Apparatus and glassware .2
8 Microbiological reference cultures .4
9 Sampling.4
10 Preparation of test material .5
10.1 Culturing and maintenance of host strains .5
10.2 Calibration of absorbance measurements for counts of viable microorganisms .6
11 Procedure .6
11.1 Preparation of inoculum cultures .6
11.2 Standard procedure.7
11.3 Method for samples with high bacterial background flora .7
11.4 Samples with low phage counts .7
11.5 Presence/absence test .8
11.6 Quality assurance.8
12 Expression of results .9
12.1 Plaque count procedures (11.2 to 11.4).9
12.2 Presence/absence test (11.5).9
13 Test report .10
Annex A (normative) Culture media, reagents and diluent.11
Annex B (informative) General description of somatic bacteriophages .14
Annex C (informative) Culturing of bacteriophage ��X174.15
��
Bibliography.16
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SIST ISO 10705-2:2000
ISO 10705-2:2000(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this part of ISO 10705 may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
International Standard ISO 10705-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality,
Subcommittee SC 4, Microbiological methods.
ISO 10705 consists of the following parts, under the general title Water quality — Detection and enumeration of
bacteriophages:
� Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages
� Part 2: Enumeration of somatic coliphages
� Part 3: Concentration methods
� Part 4: Enumeration of bacteriophages infecting Bacteroides fragilis
Annex A forms a normative part of this part of ISO 10705. Annexes B and C are for information only.
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SIST ISO 10705-2:2000
INTERNATIONAL STANDARD ISO 10705-2:2000(E)
Water quality — Detection and enumeration of bacteriophages —
Part 2:
Enumeration of somatic coliphages
1 Scope
This part of ISO 10705 specifies a method for the detection and enumeration of somatic coliphages by incubating the
sample with an appropriate host strain. The method is applicable to all kinds of water, sediments and sludge extracts,
where necessary after dilution. The method is also applicable to shellfish extracts.
In the case of low phage numbers, a preconcentration step may be necessary for which a separate International
Standard will be developed.
NOTE It is desirable for International Standards to be adopted as widely as possible. This part of ISO 10705 includes
reference to alternative procedures which obviate the need for expensive materials or equipment which may not be readily
available in developing countries. Use of these alternatives will not affect the performance of this method.
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this part of ISO 10705. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these publications
do not apply. However, parties to agreements based on this part of ISO 10705 are encouraged to investigate the
possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For undated
references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC maintain
registers of currently valid International Standards.
ISO 31-0:1992, Quantities and units — Part 0: General principles.
ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods.
ISO 5667-1:1980, Water quality — Sampling — Part 1: Guidance on the design of sampling programmes.
ISO 5667-2:1991, Water quality — Sampling — Part 2: Guidance on sampling techniques.
ISO 5667-3:1994, Water quality — Sampling — Part 3: Guidance on the preservation and handling of samples.
ISO 6887:1983, Microbiology — General guidance for the preparation of dilutions for microbiological examination.
ISO 8199:1988, Water quality — General guide to the enumeration of micro-organisms by culture.
ISO/IEC Guide 2, Standardization and related activities — General vocabulary.
3 Terms and definitions
For the purposes of this part of ISO 10705, the terms and definitions given in ISO/IEC Guide 2 and the following
apply.
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SIST ISO 10705-2:2000
ISO 10705-2:2000(E)
3.1
somatic coliphage
bacterial virus which is capable of infecting selected Escherichia coli host strains (and related strains) by
attachment to the bacterial cell wall as the first step of the infection process
NOTE Somatic coliphages produce visible plaques (clearance zones) in a confluent lawn of host bacteria grown under
appropriate culture conditions.
4 Safety precautions
The host strain used in this standard is non-pathogenic to man and animals, and should be handled in accordance
with the normal (national or international) safety procedures for bacteriological laboratories. Somatic coliphages are
also non-pathogenic to man and animals, but some types are very resistant to drying. Appropriate precautions should
therefore be taken to prevent cross-contamination of test materials, particularly when examining or handling cultures
of high titre or when inoculating cultures of the host strain. Such procedures shall be carried out in a biohazard cabinet
or a separate area of the laboratory.
Chloroform is a carcinogenic substance. Observe relevant safety precautions or use an alternative method of equal
efficacy.
5Principle
The sample is mixed with a small volume of semi-solid nutrient medium. A culture of host strain is added and plated
on a solid nutrient medium. After this, incubation and reading of plates for visible plaques takes place. The results are
expressed as the number of plaque-forming particles, pfp (also termed plaque-forming units, pfu), per unit of sample
volume.
6 Diluent, culture media and reagents
6.1 Basic materials
Use ingredients of uniform quality and chemicals of analytical grade for the preparation of culture media and reagents
and follow the instructions given in annex A. For information on storage see ISO 8199, except where indicated in this
part of ISO 10705. Alternatively, use dehydrated complete media and follow strictly the manufacturer's instructions.
For the preparation of media, use glass-distilled water or deionized water free from substances which might inhibit
bacterial growth under the conditions of the test, and complying with ISO 3696.
NOTE Use of other grades of chemicals is permissible providing they are shown to be of equal performance in the test.
6.2 Diluent
For making sample dilutions, use peptone-saline solution (A.7) or another diluent complying with ISO 6887.
7 Apparatus and glassware
Usual microbiological laboratory equipment, including
7.1 Hot-air oven for dry-heat sterilization and an autoclave. Apart from apparatus supplied sterile, glassware
and other equipment shall be sterilized according to the instructions given in ISO 8199.
7.2 Incubator or water bath, thermostatically controlled at (36� 2) °C.
2 © ISO 2000 – All rights reserved

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SIST ISO 10705-2:2000
ISO 10705-2:2000(E)
7.3 Incubator or water bath, thermostatically controlled at (36� 2) °C and equipped with a shaking device, for
example a rotating platform at (100� 10) r/min.
7.4 Water bath or heating block, thermostatically controlled at (45 � 1) °C.
7.5 Water bath or equivalent device for melting of agar media.
7.6 pH meter.
7.7 Counting apparatus with indirect, oblique light.
7.8 Deep freezer, thermostatically controlled at (�20� 5) °C.
7.9 Deep freezer, thermostatically controlled at (�70� 10) °C or liquid nitrogen storage vessel.
7.10 Spectrophotometer, capable of holding cuvettes of 1 cm optical path length or side-arm of nephelometric
flasks (7.17) and equipped with a filter for the range 500 nm to 650 nm with a maximum bandwidth of � 10 nm.
Usual sterile, microbiological laboratory glassware or disposable plasticsware according to ISO 8199 and including
7.11 Petri dishes of 9 cm or 14 cm to 15 cm diameter, vented.
7.12 Graduated pipettes of 0,1 ml, 1 ml, 5 ml and 10 ml capacity and Pasteur pipettes.
7.13 Glass bottles of suitable volume.
7.14 Culture tubes with caps or suitable alternative.
7.15 Measuring cylinders of suitable capacity.
7.16 Conical flasks of 250 ml to 300 ml capacity, with cotton wool plugs or suitable alternative.
7.17 Cuvettes of optical path length 10 mm or nephelometric conical flasks with cylindrical side-arms which fit
in the spectrophotometer (7.10) (see Figure 1); capacity 250 ml to 300 ml with cotton wool plugs or suitable
alternative.
7.18 Membrane filter units for decontamination, pore size 0,2 μm.
7.19 Plastics vials, lidded, of 1,5 ml to 3 ml capacity.
7.20 Refrigerator, temperature set at (5� 3) °C.
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SIST ISO 10705-2:2000
ISO 10705-2:2000(E)
Figure 1 — Nephelometric conical flask for culturing the host strain
8 Microbiological reference cultures
For samples with low bacterial content (drinking water, unpolluted natural waters), use Escherichia coli strain C,
ATCC 13706. Samples containing large numbers of bacteria (polluted natural waters, wastewater) should be
[1] [2]
examined using the nalidixic acid resistant mutant E. coli strain CN (ATCC 700078 ), also known as WG5 .
Use bacteriophage �X174 (ATCC 13706-B1) for the preparation of reference material (11.6.1).
NOTE The ATCC strains are available from the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas,
VA 20110.
9 Sampling
Take samples and deliver them to the laboratory in accordance with ISO 8199, ISO 5667-1, ISO 5667-2 and
ISO 5667-3.
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SIST ISO 10705-2:2000
ISO 10705-2:2000(E)
10 Preparation of test material
10.1 Culturing and maintenance of host strains
10.1.1 General
The culturing and maintenance of host strains involves several stages which are summarized in Figure 2.
For culturing of the host strains in the several stages, it is best to gently shake the cultures. In addition to increasing
the growth rate of bacteria, shaking ensures that all the cells are actively growing and no stationary-phase cells
develop, which could decrease the efficiency of plating. Therefore, inoculum cultures should be repeatedly shaked
by hand if a shaker is not available.
Figure 2 — Scheme for culture and maintenance of host strains
10.1.2 Preparation of stock cultures
Rehydrate the contents of a lyophilized ampoule of the reference culture of the host strains in a small amount (ca.
3 ml) of Modified Scholtens' Broth (M.S.B.) (A.1) using a Pasteur pipette (7.12). Transfer the suspension to a 300 ml
conical flask (7.16) containing (50 � 5) ml of MSB. Incubate for (20� 4) h at (36� 2) �C while gently shaking using an
incubator or water bath (7.3). Add 10 ml [i.e. a final concentration of 15 % to 20 % (volume fraction)] of sterile glycerol
(A.5) and mix well. Distribute into plastics vials (7.19) in ca. 0,5 ml aliquots and store at (�70� 10) �C or in liquid
nitrogen.
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SIST ISO 10705-2:2000
ISO 10705-2:2000(E)
NOTE This first passage of the host strains should be stored as a reference in the laboratory.
10.1.3 Preparation of working cultures
Remove a vial of stock culture (10.1.2) from frozen storage, allow to equilibrate to room temperature (15 °C to 30 °C)
and inoculate on a plate of McConkey agar (A.6) or another lactose-containing medium in such a way that single
colonies are obtained. Incubate at (36� 2) �Cfor(20 � 4) h. The remaining content of the vial of stock culture can be
used to inoculate more plates on the same working day (if necessary), otherwise it should be treated as contaminated
waste.
Add (50 � 5) ml of MSB to a conical flask of 300 ml (7.16) and warm to at least room temperature (faster growth will
occur if the broth is prewarmed to 37�C). Select three to five lactose-positive colonies from the McConkey agar and
inoculate material from each of these colonies in the flask with MSB. Incubate for (5� 1) h at (36 � 2)�C while gently
shaking using an incubator or water bath (7.3). Add 10 ml of sterile glycerol (A.5) and mix well. Distribute in plastics
vials (7.19) in ca. 1,2 ml aliquots and store in a deep freezer at (�70 � 10) �C (7.9) for a maximum of two years.
NOTE If a great number of tests is anticipated, several conical flasks can be inoculated in parallel.
10.2 Calibration of absorbance measurements for counts of viable microorganisms
Remove a vial of working culture from the deep freeze (7.9) and allow to equilibrate to room temperature (15 °C to
30 °C). Add (50 � 5) ml of MSB to a nephelometric conical flask (7.17), warm to at least room temperature (faster
growth will occur if the broth is prewarmed to 37�C). Adjust the spectrophotometer reading to zero on the filled flask
side-arm. Alternatively, add (50� 5) ml of MSB (A.1) to a plain conical flask (7.16) and aseptically transfer a portion to
a cuvette (7.17). Using this cuvette, adjust the spectrophotometer reading to zero. Discard the broth transferred to the
cuvettes used to measure absorbance.
Inoculate MSB with 0,5 ml of working culture. Incubate at (36� 2) �C with gentle shaking in an incubator or water bath
(7.3) for up to 3,5 h. Every 30 min measure absorbance as indicated above and withdraw a 1 ml aliquot for viable
counts, ensuring that the flask is removed from the incubator for as short a time as possible.
�7 �5 �6 �7
Dilute aliquots to 10 and count colony-forming units (cfu) in 1 ml volume
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 10705-2
Première édition
2000-04-01
Qualité de l’eau — Détection et
dénombrement des bactériophages —
Partie 2:
Dénombrement des coliphages somatiques
Water quality — Detection and enumeration of bacteriophages
Part 2: Enumeration of somatic coliphages
Numéro de référence
ISO 10705-2:2000(F)
©
ISO 2000

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ISO 10705-2:2000(F)
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ImpriméenSuisse
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ISO 10705-2:2000(F)
Sommaire Page
1 Domaine d'application.1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions.2
4 Précautions relatives à la sécurité.2
5 Principe.2
6 Diluant, milieux de culture et réactifs.2
6.1 Matériaux de base.2
6.2 Diluant.3
7 Appareillage et verrerie.3
8 Cultures microbiologiques de référence.4
9 Échantillonnage .4
10 Préparation des matériaux d'essai .5
10.1 Mise en culture et entretien des souches-hôtes .5
10.2 Étalonnage des mesurages d’absorbance pour le dénombrement des micro-organismes
cultivables .6
11 Mode opératoire.7
11.1 Préparation des précultures.7
11.2 Mode opératoire normalisé.7
11.3 Mode opératoire pour les échantillons présentant une abondante flore bactérienne .8
11.4 Mode opératoire pour les échantillons contenant un faible nombre de phages .8
11.5 Essai de présence/absence.8
11.6 Assurance qualité.9
12 Expression des résultats .10
12.1 Modes opératoires de comptage des plages (11.2 à 11.4) .10
12.2 Essai de présence/absence (11.5).10
13 Rapport d'essai .10
Annexe A (normative) Milieux de culture, réactifs et diluant .11
Annexe B (informative) Description générale des bactériophages somatiques .14
Annexe C (informative) Mise en culture du bactériophage ����X174 .15
Bibliographie .16
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ISO 10705-2:2000(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments de la présente partie de l’ISO 10705 peuvent faire
l’objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
La Norme internationale ISO 10705-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau,
sous-comité SC 4, Méthodes microbiologiques.
L'ISO 10705 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l’eau — Détection et
dénombrement des bactériophages:
� Partie 1: Dénombrement des bactériophages ARN F spécifiques
� Partie 2: Dénombrement des coliphages somatiques
� Partie 3: Méthodes par concentration
� Partie 4: Dénombrement des bactériophages infectants des Bacteroides fragilis
L’annexe A constitue un élément normatif de la présente partie de l'ISO 10705. Les annexes B et C sont données
uniquement à titre d’information.
iv © ISO 2000 – Tous droits réservés

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NORME INTERNATIONALE ISO 10705-2:2000(F)
Qualité de l’eau — Détection et dénombrement des
bactériophages —
Partie 2:
Dénombrement des coliphages somatiques
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO 10705 spécifie une méthode de détection et de dénombrement des coliphages
somatiques par incubation de l'échantillon avec une souche-hôte appropriée. La méthode est applicable à tous les
types d'eaux, aux extraits de sédiments et de boues, si nécessaire après dilution. La méthode est également
applicable aux extraits de coquillages.
Dans le cas d'une faible population de phages, une étape de préconcentration peut s'avérer nécessaire pour
laquelle une Norme internationale distincte sera élaborée ultérieurement.
NOTE Il est souhaitable que les Normes Internationales soient adoptées le plus largement possible. La présente partie de
l’ISO 10705 comporte des références à des procédures alternatives qui parent à la nécessité d’utiliser du matériel ou des
équipements coûteux qui peuvent ne pas être aisément disponibles dans les pays en développement. L’utilisation de ces
procédures alternatives n’affecte pas les performances de la présente méthode.
2 Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente partie de l'ISO 10705. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
aux accords fondés sur la présente partie de l'ISO 10705 sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les
éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s’applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur.
ISO 31-0:1992, Grandeurs et unités — Partie 0: Principes généraux.
ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai.
ISO 5667-1:1980, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 1: Guide général pour l'établissement des
programmes d'échantillonnage.
ISO 5667-2:1991, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 2: Guide général sur les techniques
d'échantillonnage.
ISO 5667-3:1994, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 3: Guide général pour la conservation et la
manipulation des échantillons.
ISO 6887:1983, Microbiologie — Directives générales pour la préparation des dilutions en vue de l'examen
microbiologique.
ISO 8199:1988, Qualité de l'eau — Guide général pour le dénombrement des micro-organismes sur milieu de
culture.
© ISO 2000 – Tous droits réservés 1

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ISO 10705-2:2000(F)
Guide ISO/CEI 2, Normalisation et activités connexes — Vocabulaire général.
3 Termes et définitions
Pour les besoins de la présente partie de l'ISO 10705, les termes et définitions donnés dans le Guide ISO/CEI 2
ainsi que la définition suivante s'appliquent.
3.1
coliphage somatique
virus des bactéries capable d'infecter certaines souches-hôtes d'Escherichia coli (et des souches apparentées) en
se fixant sur la paroi bactérienne au début du processus d'infection
NOTE Les coliphages somatiques provoquent l'apparition de plages visibles (zones de lyse) sur un tapis confluent de
bactéries-hôtes cultivées dans des conditions appropriées.
4 Précautions relatives à la sécurité
La souche-hôte utilisée pour les besoins de la présente partie de l'ISO 10705 est une souche non pathogène pour
l'homme et l'animal. Il convient de la manipuler conformément aux procédures normales (nationales et
internationales) de sécurité des laboratoires d'analyses bactériologiques. Les coliphages somatiques ne sont
pathogènes ni pour l'homme ni pour l'animal, mais certains d'entre eux sont très résistants à la dessiccation. Il
convient donc de prendre les précautions appropriées pour éviter les contaminations croisées des échantillons,
plus particulièrement lors de la manipulation ou de l'examen de cultures de concentration élevée ou lors de
l'ensemencement de cultures de souches-hôtes. Ces opérations doivent être réalisées dans une enceinte pour
risque biologique ou dans une zone séparée du laboratoire.
Le chloroforme est une substance cancérigène. Prendre les précautions de sécurité qui s'imposent ou utiliser une
autre méthode d’égale efficacité.
5Principe
L'échantillon est mélangé à un faible volume de milieu de culture nutritif semi-solide. Une culture de la souche-hôte
y est ajoutée et le mélange est coulé dans une boîte contenant du milieu de culture nutritif solide. Après cela, les
boîtes sont incubées et examinées pour y repérer l'apparition de plages. Les résultats sont exprimés en nombre de
particules formant des plages, pfp (également identifiées par unités formant des plages, ufp), par unité de volume
d'échantillon.
6 Diluant, milieux de culture et réactifs
6.1 Matériaux de base
Pour la préparation des milieux de culture et des réactifs, utiliser des produits de qualité constante ainsi que des
réactifs de qualité analytique, et suivre les instructions indiquées dans l'annexe A. Pour toute information relative à
la conservation, se reporter à l'ISO 8199, sauf si une indication est précisée dans la présente partie de l'ISO 10705.
Des milieux de culture complets déshydratés peuvent également être utilisés. Dans ce cas, suivre
scrupuleusement les instructions du fabricant.
Pour la préparation des milieux de culture, utiliser de l'eau distillée dans des récipients en verre ou de l'eau
déionisée, exempte de substances susceptibles d'inhiber la croissance des bactéries dans les conditions de l'essai
et conforme à l'ISO 3696.
NOTE L’utilisation de produits chimiques d’autres qualités est permise, sous réserve de démontrer qu’ils ont une
performance égale pour l’essai.
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6.2 Diluant
Pour diluer l'échantillon, utiliser une solution peptonée saline (A.7) ou tout autre diluant conforme à l'ISO 6887.
7 Appareillage et verrerie
Matériel courant de laboratoire d'analyses microbiologiques, et
7.1 Étuve à air chaud pour stérilisation en chaleur sèche et autoclave. À l'exception des appareillages
fournis sous forme stérile, la verrerie et les autres matériels doivent être stérilisés conformément aux instructions
indiquées dans l'ISO 8199.
7.2 Incubateur ou bain d'eau, contrôlé thermostatiquement à (36� 2) °C.
7.3 Incubateur ou bain d'eau, contrôlé thermostatiquement à (36� 2) °C et équipé d’un dispositif d’agitation,
par exemple un plateau tournant à (100� 10) tr/min.
7.4 Bain d'eau ou bloc chauffant, contrôlé thermostatiquement à (45� 1) °C.
7.5 Bain d'eau ou dispositif équivalent, permettant de faire fondre la gélose.
7.6 pH-mètre.
7.7 Appareil de comptage, équipé d'une source de lumière indirecte, oblique.
7.8 Congélateur, contrôlé thermostatiquement à (�20� 5) °C.
7.9 Congélateur, contrôlé thermostatiquement à (�70� 10) °C ou réservoir de stockage à azote liquide.
7.10 Spectrophotomètre, capable de contenir des cuves de 1 cm de trajet optique ou le tube latéral d'une fiole
néphélométrique (7.17), et muni d'un filtre de longueur d'onde allant de 500 nm à 650 nm avec une largeur de
bande maximale de � 10 nm.
Verrerie de laboratoire stérile d'usage courant en microbiologie ou matériel à usage unique stérile en plastique,
conforme à l'ISO 8199, et
7.11 Boîtes de Petri, ventilées, de 9 cm ou 14 cm à 15 cm de diamètre.
7.12 Pipettes graduées, de 0,1 ml, 1 ml, 5 ml et 10 ml de capacité et pipettes Pasteur.
7.13 Flacons en verre, de volume approprié.
7.14 Tubes de culture, avec bouchons ou dispositifs équivalents.
7.15 Éprouvettes graduées, de capacité appropriée.
7.16 Fioles coniques, de 250 ml à 300 ml de capacité, munies de bouchons en ouate ou de tout autre matériau
approprié.
7.17 Cuves optiques,de10mm detrajetoptique ou fioles coniques néphélométriques, de 250 ml à 300 ml de
capacité, munies de tubes latéraux pouvant être adaptés sur un spectrophotomètre (7.10) (voir la Figure 1) et de
bouchons en ouate ou de tout autre matériau approprié.
7.18 Unités de filtration sur membrane, pour la décontamination, de 0,2 μm de porosité.
7.19 Tubes en plastique, bouchés, de 1,5 ml à 3 ml de capacité.
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7.20 Réfrigérateur, réglé à une température de (5� 3) °C.
Figure 1 — Fiole conique néphélométrique pour la mise en culture des souches-hôtes
8 Cultures microbiologiques de référence
Pour les échantillons contenant une faible flore bactérienne (eau potable, eaux naturelles non polluées), utiliser la
souche Escherichia coli C, ATCC 13706. Pour les échantillons contenant une abondante flore bactérienne (eaux
naturelles polluées, eaux usées), il convient d’utiliser le mutant résistant à l'acide nalidixique, souche Escherichia
coli CN (ATCC 700078 [1]), également connue sous le nom de souche WG5 [2].
Utiliser le bactériophage �X174 (ATCC 13706-B1) pour la préparation du témoin de référence (11.6.1).
NOTE Les souches ATCC sont disponibles à l'American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas,
VA 20110.
9 Échantillonnage
Prélever des échantillons et les transporter au laboratoire conformément à l'ISO 8199, l'ISO 5667-1, l'ISO 5667-2
et l'ISO 5667-3.
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10 Préparation des matériaux d'essai
10.1 Mise en culture et entretien des souches-hôtes
10.1.1 Généralités
La mise en culture et l'entretien des souches-hôtes impliquent différentes étapes résumées à la Figure 2.
Figure 2 — Schéma de la mise en culture et de l'entretien des souches-hôtes
Pour la mise en culture des souches-hôtes lors des différentes étapes, il est recommandé d’agiter légèrement les
cultures. Outre l’augmentation du taux de croissance des bactéries, l’agitation permet de s’assurer que toutes les
cellules se développent activement et qu’aucune cellule en phase stationnaire ne se développe, ce qui pourrait
diminuer l’efficacité de l’ensemencement. En conséquence, il convient d’agiter manuellement à plusieurs reprises
les précultures en l’absence d’agitateur.
10.1.2 Préparation des cultures mères
Réhydrater le contenu d'une ampoule lyophilisée de la culture de référence des souches-hôtes dans un faible
volume (environ 3 ml) de bouillon de Scholten modifié (MSB) (A.1) à l'aide d'une pipette Pasteur (7.12). Transvaser
la suspension dans une fiole conique de 300 ml (7.16) contenant (50� 5) ml de milieu MSB. Incuber pendant
(20� 4) h à (36� 2) °C en maintenant une légère agitation en utilisant un incubateur ou un bain d'eau (7.3). Ajouter
10 ml (c’est-à-dire une quantité permettant d'obtenir une concentration finale de 15 % à 20 % en volume) de
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glycérol stérile (A.5) et mélanger soigneusement. Répartir ensuite dans des tubes en plastique (7.19) par portions
aliquotes de 0,5 ml environ et conserver à (�70� 10) °C ou dans de l'azote liquide.
NOTE Il convient de conserver cette première culture de souches-hôtes comme référence dans le laboratoire.
10.1.3 Préparation des cultures d'essai
Retirer un tube de culture mère (10.1.2) du congélateur, laisser s’équilibrer à température ambiante (15 °C à 30 °C)
et ensemencer dans une boîte contenant une gélose de Mc Conkey (A.6) ou un autre milieu contenant du lactose
de façon à obtenir des colonies isolées. Incuber à (36� 2) °C pendant (20� 4) h. Le contenu restant dans le tube
de culture mère peut être utilisé pour ensemencer plusieurs boîtes le même jour (si nécessaire), sinon il convient
de le traiter comme résidu contaminé.
Ajouter (50� 5) ml de milieu MSB dans une fiole conique de 300 ml (7.16) et le réchauffer au moins jusqu'à
température ambiante (la croissance sera plus rapide si le bouillon de culture est préalablement chauffé à une
température de 37 °C). Choisir de trois à cinq colonies lactose positives à partir de la gélose de Mc Conkey et
ensemencer conjointement le matériel bactérien issu de ces colonies dans la fiole contenant le milieu MSB.
Incuber pendant (5�1)hà(36� 2) °C tout en maintenant une légère agitation en utilisant un incubateur ou un
bain d'eau (7.3). Ajouter 10 ml de glycérol stérile (A.5) et mélanger soigneusement. Répartir ensuite dans des
tubes en plastique (7.19) par portions aliquotes de 1,2 ml environ et conserver à (�70� 10) °C au congélateur (7.9)
pendant deux ans au plus.
NOTE S'il est prévu de réaliser un grand nombre d'essais, plusieurs fioles coniques peuvent être ensemencées en
parallèle.
10.2 Étalonnage des mesurages d’absorbance pour le dénombrement des micro-organismes
cultivables
Retirer un tube de culture d'essai du congélateur (7.9) et laisser s’équilibrer à température ambiante (15 °C à
30 °C). Ajouter (50 � 5) ml de milieu MSB dans une fiole conique néphélométrique (7.17) et réchauffer au moins à
température ambiante (la croissance sera plus rapide si le bouillon de culture est préalablement chauffé à une
température de 37 °C). Régler le spectrophotomètre sur zéro avec le tube latéral rempli. Il est également possible
d’ajouter (50� 5) ml de milieu MSB (A.1) dans une fiole conique simple (7.16) et de transvaser une partie aliquote
dans la cuve optique (7.17), dans des conditions d’asepsie. Régler le spectrophotomètre sur zéro en utilisant cette
cuve. Jeter le bouillon transvasé dans les cuves pour la mesure de l’absorbance.
Ensemencer le milieu MSB avec 0,5 ml de la culture d'essai. Incuber à (36� 2) °C en maintenant une légère
agitation en utilisant un incubateur ou un bain d'eau (7.3) pendant 3,5 h au plus. Mesurer l’absorbance toutes les
30 min comme indiqué ci-dessus et prélever un échantillon de 1 ml pour le dénombrement des bactéries
cultivables, en ayant soin de réduire au minimum la durée de sortie de la fiole de l'incubateur.
�7 �5 �6 �7
Diluer les échantillons à 10 et compter les unités formant colonie (ufc) dans 1 ml des dilutions 10 ,10 et 10
par la procédure normale d'ensemencement en double dans des boîtes contenant de la gélose nutritive ou de
gélose de Scholten modifiée (MSA) (A.2.1). Il est également possible d’effectuer une filtration sur membrane avec
des volumes de 1 ml de ces mêmes dilutions et de compter les ufc par la procédure normale de filtration sur
membrane en double sur gélose nutritive ou milieu MSA (A.2.1). Incuber à (36� 2) °C pendant (20� 4) h (en
utilisant 7.2). Compter le nombre total de colonies dans/sur chaque boîte contenant entre 30 et 300 colonies et
calculer la concentration de ufc/ml (se reporter à l’ISO 8199 si nécessaire).
NOTE 1 Il convient de répéter cette procédure plusieurs fois (environ deux à trois fois) afin d'établir une relation entre les
mesures d’absorbance et le nombre de colonies. Si suffisamment de données ont été obtenues, les essais ultérieurs pourront
être basés uniquement sur les mesures d’absorbance.
8
NOTE 2 Si une densité cellulaire d’environ 10 ufc/ml n’est pas obtenue dans les 3,5 h d’incubation, il est alors également
possible d’ensemencer 1 ml de la culture d’essai au lieu de 0,5 ml.
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11 Mode opératoire
11.1 Préparation des précultures
Retirer un tube de culture d'essai du congélateur (7.9), laisser s’équilibrer à température ambiante (15 °C à 30 °C).
Ajouter (50� 5) ml de milieu MSB dans une fiole conique néphélométrique (7.17) ou une fiole conique simple
(7.16) et réchauffer au moins à température ambiante (la croissance sera plus rapide si le bouillon de culture est
préalablement chauffé à une température de 37 °C). Régler le spectrophotomètre sur zéro comme décrit en 10.2.
Ensemencer 0,5 ml de la culture d'essai dans le milieu MSB. Incuber à (36� 2)°C en maintenant une légère
agitation (7.3). Mesurer l’absorbance toutes les 30 min comme indiqué en 10.2. Lorsque l’absorbance atteint une
8
concentration de l'ordre de 10 ufc/ml (sur la base des données obtenues en 10.2), sortir la préculture de
l'incubateur et la refroidir rapidement sur de la glace fondante. Utiliser la préculture le jour même.
NOTE Les précultures peuvent également être préparées selon le protocole suivant (moins contrôlé):
Ensemencer 0,5 ml de culture d’essai, décongelée comme précédemment décrit, dans (50 � 5) ml de milieu MSB
préalablement chauffé à température ambiante. Incuber pendant (3 � 1) h à (36 � 2) °C en maintenant une agitation douce. Ou
bien, ensemencer soit des colonies typiques provenant d’une boîte de milieu gélosé, soit une culture bactérienne obtenue sur
gélose inclinée [après incubation à (36 � 2) °C pendant (20 � 4) h au maximum et conservée à (5 � 3) °C pendant un jour au
maximum] dans (50 � 5) ml de milieu MSB préalablement chauffé à température ambiante. Incuber pendant (3 � 1) h à
(36 � 2) °C en maintenant une agitation douce. Utiliser immédiatement ou retirer la préculture de l’incubateur et la refroidir
rapidement jusqu'à 5 °C à 10 °C, en la plaçant de préférence sur de la glace fondante. Utiliser cette préculture le jour même.
8
Quel que soit le mode opératoire de préparation, il convient que la concentration de cette préculture soit d’environ 10 ufc/ml.
11.2 Mode opératoire normalisé
Préparer une préculture comme décrit en 11.1.
Faire fondre des flacons contenant 50 ml de gélose de Scholten modifiée semi-solide (ssMSA) (A.3) dans un bain
d'eau bouillante (7.5) et les placer ensuite dans un bain d'eau à (45� 1) °C. Ajouter, dans des conditions d'asepsie,
300 μl d'une solution de chlorure de calcium (A.2.2) préalablement chauffée à température ambiante et répartir par
portions aliquotes de 2,5 ml dans des tubes de culture (7.14) bouchés, placés dans un bain d'eau à (45� 1) °C.
Ajouter 1 ml d'échantillon initial (dilué ou concentré) préalablement chauffé à température ambiante dans chaque
tube de culture. Examiner chaque aliquote au moins en double.
Ajouter 1 ml de préculture dans chaque tube de culture contenant les aliquotes d’échantillon et le milieu ssMSA,
mélanger soigneusement en évitant la formation de bulles d'air et couler le contenu sur une couche de milieu MSA
(A.2.3) dans une boîte de Petri de 9 cm, préalablement chauffée à température ambiante. Répartir de façon
homogène, laisser se solidifier sur une surface froide, horizontale. Sécher les boîtes par incubation en laissant le
couvercle à moitié ouvert si nécessaire. Couvrir ensuite les boîtes et incuber les boîtes retournées à (36� 2) °C
pendant (18� 2) h. Ne pas empiler plus de 6 boîtes.
Compter, sous éclairage oblique indirect, le nombre de plages apparues sur chaque boîte dans les 4 h suivant
l'incubation.
NOTE 1 S'il est prévu de réaliser un grand nombre d'essais, plusieurs fioles coniques peuvent être ensemencées en
parallèle. Dans ce cas, il convient de mélanger les contenus des différentes fioles et d’homogénéiser avant analyse ou de
réaliser un témoin de référence �X174 pour chaque fiole ou préculture.
NOTE 2 Si nécessaire, les boîtes peuvent être lues après 6 h d'incubation. Cela peut être utile si un comptage préliminaire
est requis et également si l’on suppose une importante flore interférente. Si une lecture est effectuée après 6 h, il convient de le
noter lors de l’expression des résultats (article 12).
NOTE 3 Une solution de chlorure de triphényltétrazolium (voir A.3) préparée extemporanément peut être ajoutée au milieu
ssMSA afin d'augmenter le contraste pour le comptage des plages.
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NOTE 4 L’ajout de l’échantillon et de la culture-hôte refroidie dans la glace à la gélose semi-solide peut provoquer une chute
rapide de la température et la solidification du milieu. S’assurer d’un intervalle de temps suffisant entre ces deux étapes afin de
permettre un réchauffement. Cependant, s'assurer que les tubes ensemencés ne restent pas plus de 10 min dans le bain d'eau
à(45 � 1) °C.
11.3 Mode opératoire pour les échantillons présentant une abondante flore bactérienne
Procéder selon 11.2.
Ajouter de l'acide nalidixique au milieu ssMSA (A.3) jusqu'à obtention d'une concentration finale de 250 μg/ml.
Utiliser E.coli CN comme préculture.
NOTE L'acide nalidixique est thermostable. Il peut soit être ajouté sous forme d'une solution stérilisée par filtration après
fusion de la gélose semi-solide, soit être ajouté à cette gélose avant passage à l'autoclave.
11.4 Mode opératoire pour les échantillons contenant un faible nombre de phages
Procéder selon 11.2 mais avec les modifications suivantes:
� 10 ml de milieu ssMSA, 60 μl de solution de chlorure de calcium, 1 ml de culture-hôte et 5 ml d'échantillon en
double;
� couler 50 ml de milieu MSA dans une boîte de Petri de 14 cm à 15 cm de diamètre (ou utiliser deux boîtes de
Petri de 9 cm de diamètre, chacune contenant 20 ml de milieu MSA).
NOTE Ce mode
...