ISO 13969:2003
(Main)Milk and milk products — Guidelines for a standardized description of microbial inhibitor tests
Milk and milk products — Guidelines for a standardized description of microbial inhibitor tests
ISO 13969|IDF 183:2003 gives guidance for a standardized description of microbial inhibitor tests for milk and milk products. It is intended to give a framework and basis for the evaluation/validation of microbial inhibitor tests, allowing the comparison of data obtained from different tests and experimental studies.
Lait et produits laitiers — Lignes directrices pour une description normalisée des méthodes microbiologiques de dépistage d'inhibiteurs microbiens
L'ISO 13969|FIL 183:2003 indique comment établir une description normalisée des méthodes microbiologiques de dépistage d'inhibiteurs microbiens pour le lait et pour les produits laitiers. Elle a pour objet de fournir un cadre et une base d'évaluation/validation des méthodes microbiologiques de dépistage d'inhibiteurs microbiens, permettant la comparaison de données obtenues à partir de différentes méthodes et études expérimentales.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 13969
IDF
183
First edition
2003-10-01
Milk and milk products — Guidelines for
a standardized description of microbial
inhibitor tests
Lait et produits laitiers — Lignes directrices pour une description
normalisée des méthodes microbiologiques de dépistage d'inhibiteurs
microbiens
Reference numbers
ISO 13969:2003(E)
IDF 183:2003(E)
©
ISO and IDF 2003
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ISO 13969:2003(E)
IDF 183:2003(E)
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IDF 183:2003(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has
been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 13969IDF 183 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with AOAC International.
It is being published jointly by ISO and IDF and separately by AOAC International.
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ISO 13969:2003(E)
IDF 183:2003(E)
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a worldwide federation of the dairy sector with a National
Committee in every member country. Every National Committee has the right to be represented on the IDF
Standing Committees carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO and AOAC International in
the development of standard methods of analysis and sampling for milk and milk products.
Draft International Standards adopted by the Action Teams and Standing Committees are circulated to the
National Committees for voting. Publication as an International Standard requires approval by at least 50 % of
IDF National Committees casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the
subject of patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 13969IDF 183 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with AOAC International.
It is being published jointly by ISO and IDF and separately by AOAC International.
All work was carried out by the Joint ISO/IDF/AOAC Action Team Antimicrobials and other veterinary medical
residues, of the Standing Committee on Analytical methods for additives and contaminants, under the aegis of
its project leader, Mrs G. Suhren (DE).
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ISO 13969:2003(E)
IDF 183:2003(E)
Introduction
The parameters outlined in this International Standard may not need to be evaluated completely for every test,
depending on
a) the field of application of the test under study (e.g. screening or reference method, type of milk, i.e. animal
species or raw/heat treated milk),
b) the information needed [e.g. the introduction of a new substance with fixed maximum residue limit (MRL)],
and
c) the detection pattern (e.g. sensitivity of the test microorganism to a broad or narrow variety of
antimicrobial compounds).
Thus “the terms of reference” between the producer and user of a certain test should be agreed upon in the
context of these guidelines omitting, for example, those aspects that are not relevant to the intended field of
application.
A general disadvantage related to the interpretation of microbial inhibitor tests is that they are usually
evaluated in a subjective way and in very few steps, i.e. negative, questionable, and positive by comparison
with positive and/or negative control samples.
In cases where the medium contains an indicator, the type of the resultant colour change can depend upon
the type of antimicrobial present. This sometimes makes it difficult to obtain a clear distinction between
positive and negative results. Test interpretation in few steps also means that small alterations or minor colour
developments, which may be of importance in a validation programme, need major experimental effort.
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ISO 13969:2003(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 183:2003(E)
Milk and milk products — Guidelines for a standardized
description of microbial inhibitor tests
1 Scope
This International Standard gives guidance for a standardized description of microbial inhibitor tests for milk
and milk products. It is intended to give a framework and basis for the evaluation/validation of microbial
inhibitor tests, allowing the comparison of data obtained from different tests and experimental studies.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
false positives
percentage of positive results when testing negative samples
2.2
false negatives
percentage of negative results at the claimed detection level(s)
2.3
limit of detection
concentration level at which a defined percentage of samples is detected
EXAMPLE 95 % together with the respective confidence level.
3 Information needed from the developer/manufacturer
3.1 Methodology
The developer or manufacturer of the test should provide information regarding methodology by mentioning
the following:
a) description of the method;
b) principle of the method;
c) technical design of the procedure (e.g. degree of automation, data processing);
d) evaluation of test results (e.g. scores, scale and definition of what to consider “positive” or “negative”);
e) capacity (e.g. sample throughput);
f) special requirements for sampling, preservation and testing;
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ISO 13969:2003(E)
IDF 183:2003(E)
g) procedure for the purpose of quality assurance by the developer/manufacturer;
h) field of application concerning
1) the intended test use (e.g. screening or confirmation), and
2) the substrate or matrix (e.g. milk from cows or other animals, milk powder or other foods).
3.2 Operating requirements
The following information should be given regarding operating requirements:
a) requirements for user experience and training;
b) requirements for safety and special laboratory service (e.g. electric power, S1-lab, waste disposal and
maximum concentration level);
c) requirements for quality control by the manufacturer and/or user.
3.3 Test specifications
The following information should be given regarding test definitions:
limit of detection: see 2.3.
3.4 Documentation
The following information should be given regarding documentation:
a) user manual, including a trouble-shooting guide;
b) suppliers of instruments, reagents, standards, technical services and customer support;
c) status of official recognition/general introduction in specified countries;
d) availability of reference material;
e) availability of internationally recognized/validated reference from ISO, IDF and AOAC International, or
others;
f) availability of, for example, literature and practical experiences.
4 Evaluation of the attributes of the microbiological inhibitor test
4.1 General
The validation of a method should always be carried out under controlled conditions, i.e. based on defined test
samples. The influence of particular conditions is described in 4.3.6.
4.2 Prerequisites
4.2.1 Milk free from antimicrobials (“negative milk”)
The cows from which milk is collected in order to serve as “negative milk” shall meet the following
requirements. If, however, a test is applied for milk of an animal species other than cows, the requirements
with respect to the status of the animal should be adjusted accordingly.
a) The clinical and sub-clinical health status shall be good, with special emphasis on udder health (less than
150 000 somatic cells per millilitre).
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IDF 183:2003(E)
b) The treatment or feeding with antimicrobial substances shall be prohibited for at least 8 weeks before milk
collection. In the case of dry cow treatment, milk should not be collected earlier than 60 days after calving
provided the dry cow period has been at least 4 weeks.
c) The cows shall be mid-lactation: more than 60 days and less than 200 days after calving, producing more
than 5 kg of milk per day.
d) The milking of at least five to seven cows shall be combined to overcome individual variations in milk
composition.
4
e) The total viable count shall be less than 10 CFU (colony-forming units) per millilitre before the
preservation process (deep-freezing, lyophilization). The possible presence of β-lactamase-producing
microorganisms shall be kept in mind in the case of β-lactam antibiotic testing.
4.2.2 Test substances
The test substances that are used in the testing procedure should be obtained from a recognized
developer/manufacturer, preferably with an analytical certificate with a guaranteed specification. The
concentration required should be calculated based on the free acid or base forms of the drug, corrected for
purity. Special considerations should be given to those substances with stability/potency problems.
Unless otherwise stated, it is preferable that the evaluation of detection limits (4.3.2) should be undertaken
using those antimicrobials and/or concentrations that the developer/manufacturer claims the test will detect.
4.2.3 Solvents
If special solvents or other chemicals are required to dissolve the substances, it should be ensured that these
solvents or chemicals in the test samples have no influence on the test result. The use of solvents other than
water should be restricted.
4.2.4 Preparation of test samples
4.2.4.1 General
The preparation of test samples can cause problems and is a very laborious task for the test evaluation
laboratories. Therefore, it might be appropriate to employ a centralized test sample preparation system, which
agrees to supply interested laboratories with test samples in stable form (e.g. lyophilized).
For large-scale evaluations (e.g. to obtain the data basis for a generalized description), all dilutions required
should be prepared in one batch to avoid day-to-day variations of weighing, diluting and differences in the
status of the “negative milk” (4.2.1).
4.2.4.2 Selection of concentrations
The selection of concentrations for the determination of the detection limits is described in 4.3.2. For
estimated purposes, if not otherwise stated, the concentration found to represent the detection limit should be
tested, together with one concentration step higher and two or three concentration steps lower than the
claimed detection limit and the corresponding negative milk. As an approximate guideline, it is recommended
to divide the concentration range giving 50 % to 100 % positives into three to four equal distant levels (linear
and logarithmic scales respectively) as demonstrated in Figure 1.
4.2.4.3 Dilution
The following precautions should be met when preparing a dilution series of test substances.
a) The preparation of the dilution series should be carried out in such a way that only the final dilution is
prepared with milk in order to avoid protein binding.
b) The proportion of the added aqueous standard solution in the final milk dilution step should be the same
for all dilutions and less than 1 %.
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IDF 183:2003(E)
4.2.4.4 Preservation
The preservation of test samples should preferably be carried out by lyophilization, if this is not deprecated by
the developer/manufacturer of the test under study, or the test principle. The following procedure for
preservation has proved to be feasible.
a) Immediately after the preparation of the various test samples, all dilutions should be dispensed into test
tubes with the desired volume and be frozen at −18 °C ± 2 °C in a sloping position.
b) Lyophilization should be carried out as soon as possible and not later than one week after deep freezing.
During the lyophilization process, the temperature should not exceed 25 °C.
c) Test tubes should be hermetically sealed immediately after lyophilization and stored in the dark at u 6 °C.
d) Test samples should be reconstituted with distilled water. The added volume of water should be 10 %
less than the volume of the sample that was lyophilized in order to compensate for the dry matter of milk.
e) Reconstituted test samples may be used on the day of reconstitution only. They should be kept in a
refrigerator between uses and discarded at the end of the day.
4.2.4.5 Reduction of mistakes during preparation
In most cases, it is not possible to confirm the concentration of antimicrobial in the test samples by an
independent quantitative method. To cope with this problem pragmatically, the following procedure regarding
a reduction in the number of mistakes during preparation is proposed.
a) Each of three to five persons should prepare their own and independent dilution series.
b) Dilution series should be tested with appropriate microbiological inhibitor tests or other suitable methods.
c) Only those dilution series that give similar test results should be chosen for the mixture of the final test
samples.
4.2.5 Experimental design
4.2.5.1 Number of replicates
4.2.5.1.1 Test with subjective reading
For microbial inhibitor tests with subjective reading and few possible outcomes, all experiments should be
performed as blind coded studies. Participating person(s), preferably more than one, responsible for the
analysis receive(s) coded samples without any knowledge of its substance/concentration combination. The
results should be expressed as the positive results, in percent, out of the total number of replicates within
each evaluated concentration step. Calculation of percentages gen
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NORME ISO
INTERNATIONALE 13969
FIL
183
Première édition
2003-10-01
Lait et produits laitiers — Lignes
directrices pour une description
normalisée des méthodes
microbiologiques de dépistage
d'inhibiteurs microbiens
Milk and milk products — Guidelines for a standardized description of
microbial inhibitor tests
Numéros de référence
ISO 13969:2003(F)
FIL 183:2003(F)
©
ISO et FIL 2003
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Publié en Suisse
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ISO 13969:2003(F)
FIL 183:2003(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 13969FIL 183 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL), en collaboration avec l'AOAC
International. Elle est publiée conjointement par l'ISO et la FIL, et séparément par l'AOAC International.
© ISO et FIL 2003 – Tous droits réservés iii
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ISO 13969:2003(F)
FIL 183:2003(F)
Avant-propos
La FIL (Fédération internationale de laiterie) est une fédération mondiale du secteur laitier avec un Comité
National dans chacun de ses pays membres. Chaque Comité National a le droit de faire partie des Comités
permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux techniques. La FIL collabore avec l'ISO et avec
l'AOAC International pour l'élaboration de méthodes normalisées d'analyse et d'échantillonnage pour le lait et
les produits laitiers.
Les projets de Normes internationales adoptés par les Équipes d'Action et les Comités permanents sont
soumis aux Comités Nationaux pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert
l'approbation de 50 % au moins des Comités Nationaux votants.
L'ISO 13969FIL 183 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL), en collaboration avec l'AOAC
International. Elle est publiée conjointement par l'ISO et la FIL, et séparément par l'AOAC International.
L'ensemble des travaux a été confié à l'Équipe d'Action mixte ISO/FIL/AOAC, Antimicrobiens et autres résidus
vétérinaires médicaux, du Comité permanent chargé des Méthodes analytiques pour les additifs et
me
contaminants, sous la conduite de son chef de projet, M G. Suhren (DE).
iv © ISO et FIL 2003 – Tous droits réservés
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ISO 13969:2003(F)
FIL 183:2003(F)
Introduction
Les paramètres dont les grandes lignes sont tracées dans la présente Norme internationale n'ont pas
nécessairement besoin d'être évalués complètement pour chaque essai; ils dépendent en effet
a) du domaine d'application de la méthode étudiée [par exemple méthode d'évaluation ou méthode de
référence, type de lait (c'est-à-dire espèce animale, lait cru/pasteurisé)],
b) des informations recherchées [par exemple l'introduction d'une nouvelle substance avec une limite
maximale de résidus (LMR) fixée], et
c) du schéma de détection (par exemple de la sensibilité des micro-organismes d'essai à une variété plus
ou moins grande de composés antimicrobiens).
Par conséquent, il convient que les «termes de référence» entre le concepteur et l'utilisateur d'une certaine
méthode fassent l'objet d'un accord dans le contexte des présentes lignes directrices, en omettant par
exemple les aspects qui ne relèvent pas du domaine d'application concerné.
L'inconvénient dans l'interprétation des résultats de dépistage d'inhibiteurs microbiens est qu'ils sont
généralement évalués de manière subjective et en très peu d'étapes, à savoir qu'ils sont déclarés négatifs,
douteux ou positifs par comparaison avec des échantillons témoins positifs et/ou négatifs.
Dans les cas où le milieu contient un indicateur, le changement de couleur peut dépendre du mode d'action
de l'antimicrobien présent. Pour cette raison, il est parfois difficile d'établir une distinction claire entre des
résultats positifs et négatifs. L'interprétation des résultats en peu d'étapes signifie également que de petites
altérations ou des colorations mineures, qui peuvent avoir de l'importance dans un programme de validation,
nécessitent un effort expérimental important.
© ISO et FIL 2003 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE
FIL 183:2003(F)
Lait et produits laitiers — Lignes directrices pour une
description normalisée des méthodes microbiologiques de
dépistage d'inhibiteurs microbiens
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale indique comment établir une description normalisée des méthodes
microbiologiques de dépistage d'inhibiteurs microbiens pour le lait et pour les produits laitiers. Elle a pour
objet de fournir un cadre et une base d'évaluation/validation des méthodes microbiologiques de dépistage
d'inhibiteurs microbiens, permettant la comparaison de données obtenues à partir de différentes méthodes et
études expérimentales.
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
faux positifs
pourcentage de résultats positifs lors de tests réalisés sur des échantillons négatifs
2.2
faux négatifs
pourcentage de résultats négatifs au(x) niveau(x) de détection indiqué(s)
2.3
limites de détection
niveau de concentration auquel un pourcentage défini d'échantillons est détecté
EXEMPLE 95 %, avec le niveau de confiance correspondant.
3 Informations à fournir par le concepteur ou par le fabricant
3.1 Méthodologie
Il convient que le concepteur de la méthode ou le fabricant fournisse des informations au moins sur les points
suivants:
a) une description de la méthode;
b) le principe de la méthode;
c) le processus technique (par exemple degré d'automatisation, traitement des données);
d) l'interprétation des résultats (par exemple scores, échelle, définition de ce qui doit être considéré comme
«positif» ou «négatif»);
e) la capacité (par exemple débit d'échantillonnage);
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f) les exigences spécifiques pour l'échantillonnage, la conservation et l'essai;
g) la procédure adoptée pour l'assurance qualité par le concepteur ou par le fabricant;
h) le domaine d'application, à savoir
1) l'utilisation prévue de la méthode (par exemple évaluation ou confirmation);
2) le substrat/la matrice (par exemple lait de vache ou lait d'autres animaux, poudre de lait ou autre
produit alimentaire).
3.2 Exigences de fonctionnement
Il convient que les informations suivantes soient données:
a) les exigences en matière d'expérience et de formation de l'utilisateur;
b) les exigences particulières de sécurité et de service en laboratoire (par exemple puissance électrique,
lab S1, élimination des déchets, niveau de concentration maximal);
c) les exigences de maîtrise de la qualité par le fabricant et/ou par l'utilisateur.
3.3 Spécifications relatives aux essais
Il convient de fournir l'information suivante en ce qui concerne les définitions relatives aux essais:
la limite de détection (voir 2.3).
3.4 Documentation
Il convient de fournir des informations sur les points suivants:
a) le manuel de l'utilisateur, incluant un guide de dépannage;
b) les fournisseurs d'instruments, de réactifs et d'étalons, ainsi que les prestataires de services techniques
et du service à la clientèle;
c) le statut de reconnaissance officielle ou d'introduction générale dans les pays spécifiés;
d) la disponibilité des matériaux de référence;
e) la disponibilité de méthodes internationales de référence reconnues/validées issues de l'ISO, de la FIL,
de l'AOAC International ou d'autres organismes;
f) la disponibilité de textes et d'études pratiques.
4 Évaluation des attributs de la méthode microbiologique de dépistage
d'inhibiteurs microbiens
4.1 Généralités
Il convient que la validation d'une méthode soit toujours effectuée dans des conditions maîtrisées, c'est-à-dire
sur la base d'échantillons pour essai définis. L'influence de conditions particulières est décrite en 4.3.6.
2 © ISO et FIL 2003 – Tous droits réservés
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ISO 13969:2003(F)
FIL 183:2003(F)
4.2 Conditions préalables
4.2.1 Lait exempt d'antimicrobiens («lait négatif»)
Les vaches dont est issu le lait devant servir de «lait négatif» doivent satisfaire aux exigences énumérées ci-
après. Si toutefois la méthode est utilisée avec du lait d'animaux autres que la vache, les exigences relatives
au statut de ces animaux doivent être adaptées en conséquence.
a) Être en bonne santé sur le plan clinique et subclinique, en particulier en ce qui concerne les mamelles
(< 150 000 cellules somatiques par millilitre).
b) Ne pas avoir reçu de traitement ou d'alimentation contenant des substances antimicrobiennes pendant
au moins les huit semaines précédant la traite. En cas de traitement pour non-lactation, il convient de ne
pas recueillir le lait dans les 60 jours qui suivent le vêlage, à condition que la période de non-lactation ait
duré au moins quatre semaines.
c) Être en pleine lactation, c'est-à-dire à plus de 60 jours et à moins de 200 jours du dernier vêlage, avec
une production journalière de lait de plus de 5 kg.
d) Il convient de mélanger les traites d'au moins sept vaches pour compenser les variations individuelles de
composition du lait.
4
e) Le total des cellules viables doit être de 10 UFC (unités formant colonie) par millilitre avant le processus
de conservation (congélation, lyophilisation). Tenir compte de l'éventuelle présence de micro-organismes
produisant des β-lactamases dans le cas d'un essai d'antibiotique de la famille des β-lactamines.
4.2.2 Produits
Il convient que les produits utilisés dans le cadre de la méthode proviennent d'un fournisseur reconnu, avec
de préférence un certificat d'analyse et une spécification garantie. Il convient en outre que la concentration
requise soit calculée d'après les formes basique ou acide libre du produit, moyennant une correction de la
pureté, et qu'une attention particulière soit apportée aux produits présentant des problèmes de
stabilité/efficacité.
Sauf indication contraire, il convient que les limites de détection (4.3.2) soient évaluées en utilisant tous les
antimicrobiens et/ou concentrations que la méthode, d'après les déclarations du concepteur/du fabricant de
celle-ci, permettra de détecter.
4.2.3 Solvants
Si des solvants spéciaux ou autres produits chimiques sont nécessaires pour dissoudre les substances, il
convient de s'assurer que la présence de ces solvants ou autres produits chimiques dans les échantillons
n'influe pas sur les résultats d'essai. Il convient de limiter l'utilisation de solvants autres que l'eau.
4.2.4 Préparation des échantillons pour essai
4.2.4.1 Généralités
La préparation des échantillons pour essai peut entraîner un certain nombre de problèmes et représenter une
lourde charge de travail pour les laboratoires d'évaluation. Il peut donc être avantageux d'employer un
système centralisé de préparation d'échantillons pour essai permettant de fournir aux laboratoires intéressés
des échantillons sous une forme stable (par exemple lyophilisés).
Pour les évaluations à grande échelle (par exemple pour obtenir la base de données permettant de donner
une description généralisée), il convient de préparer toutes les dilutions requises en un seul lot, afin d'éviter
les variations journalières de pesée, de dilution et d'état du «lait négatif» (4.2.1).
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ISO 13969:2003(F)
FIL 183:2003(F)
4.2.4.2 Choix des concentrations
Le choix des concentrations pour la détermination des limites de détection est décrit en 4.3.2. Pour un but
précis, sauf indication contraire, il convient que l'essai porte à la fois sur la concentration représentant la limite
de détection, sur le niveau de concentration immédiatement supérieur à la sensibilité indiquée de l'essai et au
lait négatif correspondant et sur le niveau de concentration correspondant à deux ou trois niveaux en
dessous. Pour avoir un repère, il est recommandé de diviser la plage de concentrations donnant 50 % à
100 % de positifs en trois à quatre portions équidistantes (respectivement à l'échelle linéaire et logarithmique),
comme le démontre l'exemple de la Figure 1.
4.2.4.3 Dilution
Il convient de prendre les précautions suivantes pour la préparation des séries de dilution de produits.
a) Préparer les séries de dilution de sorte que seule la dilution finale soit préparée avec du lait, pour éviter
les liaisons protéiniques.
b) Il convient que la portion de solution étalon aqueuse ajoutée à l'étape finale de dilution du lait soit la
même pour toutes les dilutions et qu'elle soit inférieure à 1 %.
4.2.4.4 Conservation
Il est préférable que la conservation des échantillons soit effectuée par lyophilisation, sauf indication contraire
du concepteur/fabricant de la méthode à l'étude ou du principe de la méthode. Le mode opératoire suivant
s'est avéré praticable.
a) Immédiatement après la préparation des divers échantillons de lait, il convient que toutes les dilutions
soient versées dans les tubes à essai selon le volume souhaité et congelées à −18 °C ± 2 °C en position
inclinée.
b) Il convient de procéder à la lyophilisation le plus tôt possible, et au maximum une semaine après la
congélation. Au cours du processus de lyophilisation, il convient que la température n'excède pas 25 °C.
c) Il est recommandé de fermer hermétiquement les tubes pour essais immédiatement après la
lyophilisation et de les conserver dans l'obscurité à u 6 °C.
d) Il convient de reconstituer les échantillons avec de l'eau distillée. Il convient que le volume d'eau ajouté
soit inférieur de 10 % au volume de l'échantillon qui était lyophilisé, pour compenser la matière sèche du
lait.
e) Les échantillons reconstitués ne peuvent être utilisés que le jour de la reconstitution. Il est recommandé
de les conserver au réfrigérateur avant utilisation, et de les jeter à la fin de la journée.
4.2.4.5 Limitation des erreurs de préparation
Dans la plupart des cas, il ne sera pas possible de confirmer la concentration d'antimicrobiens dans les
échantillons selon une méthode quantitative indépendante. Une approche pragmatique du problème pour
limiter les erreurs de préparation est donnée ci-après.
a) Il convient que de trois à cinq personnes préparent, individuellement, leur propre série de dilution.
b) Il est recommandé que les essais sur les échantillons de ces séries de dilution soient effectués avec des
méthodes de dépistage d'inhibiteurs microbiologiques appropriées ou selon d'autres méthodes
adéquates.
c) Pour le mélange des échantillons finaux, il convient de choisir uniquement les séries de dilution qui
donnent des résultats d'essai similaires.
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4.2.5 Modèle expérimental
4.2.5.1 Nombre d'essais
4.2.5.1.1 Méthode avec lecture subjective
Pour les méthodes microbiologiques de dépistage d'inhibiteurs microbiens avec lecture subjective et peu de
résultats possibles, il convient de mener toutes les expériences en aveugle. La (les) personne(s), de
préférence
...
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