ISO 11702:2009

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11702
First edition
2009-12-15

Animal and vegetable fats and oils —
Enzymatic determination of total sterols
content
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination
enzymatique de la teneur en stérols totaux




Reference number
ISO 11702:2009(E)
©
ISO 2009

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ISO 11702:2009(E)
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ISO 11702:2009(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 11702 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11, Animal
and vegatable fats and oils.

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INTERNATIONAL STANDARD ISO 11702:2009(E)

Animal and vegetable fats and oils — Enzymatic determination
of total sterols content
1 Scope
This International Standard specifies a method for the quantitative determination of the total sterols content by
means of an enzymatic staining test. The method is applicable to free and esterified sterols in animal and
vegetable fats and oils, fatty foods and related products. The determination is applicable to sample quantities
of 1 g to 2 g of fat.
The method is not applicable to dark coloured fats and oils, e.g. crude palm oil. The enzyme is not specific for
cholesterol, but also oxidizes other 3-hydroxysterols. The method has not been tested for products fortified
with sterols at higher levels.
[8] [7]
NOTE The method is technically equivalent to IUPAC method 2.404 and DGF standard method F-III 2 (91) .
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 661, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
total sterols content
w
sterols
mass fraction of sterols determined by the method specified in this International Standard
NOTE 1 For vegetable fats and oils, the sterols content is expressed as β-sitosterol; for animal fats, as cholesterol.
NOTE 2 The total sterols content is expressed in milligrams per 100 g of fat.
4 Principle
The test sample is saponified and the sterols in the unsaponifiable matter are determined enzymatically. They
are oxidized by cholesterol oxidase to cholestenone. The equimolar amount of hydrogen peroxide produced in
the process oxidizes in the presence of catalase methanol to formaldehyde. In the presence of ammonium
ions, with acetylacetone, it forms a yellow lutidine dye (3,5-diacetyl-1,4-dihydrolutidine). The latter is
determined spectrophotometrically in the visible range at 405 nm. The concentration of the dye is equivalent
to the amount of sterols.
NOTE Cholesterol oxidase oxidizes cholesterol and other sterols having a hydroxy group in the 3β-position.
Therefore, phytosterols like stigmasterol and sitosterol are also determined.
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ISO 11702:2009(E)
5 Reagents
WARNING — Attention is drawn to the regulations which specify the handling of hazardous
substances. Technical, organizational and personal safety measures shall be followed.
Unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade.
5.1 Water, complying with ISO 3696, grade 3 or better.
5.2 Isopropanol.
5.3 Acetone.
5.4 Acetyl acetone.
1)
5.5 Suspension of cholesterol oxidase (EC 1.1.3.6) from Nocardia erythropolis, 15 U/ml.
1)
5.6 Suspension of catalase (hydrogen peroxide oxido-reductase) (EC 1.11.1.6) from bovine liver.
5.7 Hydrochloric acid, c(HCl) = 8 mol/l.
5.8 Methanolic potassium hydroxide solution, c(KOH) = 0,5 mol/l.
Dissolve 2,8 g potassium hydroxide in a small amount of hot methanol, cool, and dilute with methanol to
100 ml.
5.9 Ammonium phosphate buffer solution, adjusted to pH 7.
5.10 Solution 1.
Add 19,1 ml acetone (5.3) and 230 000 U catalase (5.6) to 50 ml buffer solution (5.9) in a 100 ml one-mark
volumetric flask (6.4), and make up to the mark with water (5.1).
5.11 Solution 2.
Add 0,26 ml acetylacetone (5.4) and 1,10 ml acetone (5.3) to 25 ml water (5.1) in a 50 ml one-mark volumetric
flask (6.4), and make up to the mark with water.
5.12 Solution 3.
Prior to use, mix 3 volumes of solution 1 (5.10) with 2 volumes of solution 2 (5.11).
NOTE Solution 3 can be kept in amber bottles for 3 months at 4 °C provided it is prepared under sterile conditions.
6 Apparatus
6.1 Test tubes, of diameter 18 mm.
6.2 Filter funnel.
6.3 Fluted filter suitable for the filter funnel (6.2).

1) A suitable ready-made test kid for the colorimetric determination of cholesterol in foodstuffs and other materials is
available from R-Biopharm. This information is given for the convenience of users of this International Standard and does
not constitute an endorsement by ISO of this product. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the
same results.
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ISO 11702:2009(E)
[2]
6.4 One-mark volumetric flasks, of capacities 25 ml, 50 ml, and 100 ml, ISO 1042 class A.
[6] [1]
6.5 Enzyme pipettes, of capacities 0,02 ml, ISO 7550 , to 1 ml, ISO 648 class A.
[1]
6.6 Pipette, of capacity 5 ml, ISO 648 class A.
6.7 Round bottomed flask, standard ground joint, of capacity 50 ml.
6.8 Test tubes with ground stoppers.
6.9 Spectrophotometer, set to 405 nm.
6.10 Glass cuvettes, pathlength 1 cm, suitable for the spectrophotometer (6.9).
6.11 Water bath, thermostatically controlled at 37 °C to 40 °C.
6.12 Refrigerator, capable of maintaining a temperature of 4 °C.
6.13 Glass beads.
6.14 Reflux condenser, standard ground joint.
7 Sampling
A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method
[3]
is given in ISO 5555 .
8 Preparation of the test sample
Prepar
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 11702
Première édition
2009-12-15

Corps gras d'origines animale et
végétale — Détermination enzymatique
de la teneur en stérols totaux
Animal and vegetable fats and oils — Enzymatic determination of total
sterols content




Numéro de référence
ISO 11702:2009(F)
©
ISO 2009

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ISO 11702:2009(F)
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Publié en Suisse

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ISO 11702:2009(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 11702 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 11,
Corps gras d'origines animale et végétale.

© ISO 2009 – Tous droits réservés iii

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NORME INTERNATIONALE ISO 11702:2009(F)

Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination
enzymatique de la teneur en stérols totaux
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode pour la détermination quantitative de la teneur en
stérols totaux à l'aide d'un essai de coloration enzymatique. La méthode s'applique aux stérols libres et
estérifiés, contenus dans les corps gras d'origines animale et végétale, dans les aliments gras et les produits
connexes. La détermination s'applique aux quantités d'échantillon de 1 g à 2 g de matière grasse.
Cette méthode ne s'applique pas aux corps gras de couleur sombre comme l'huile de palme brute. L'enzyme
n'est pas spécifique du cholestérol et oxyde également d'autres 3-hydroxystérols. La méthode n'a pas été
testée pour des produits enrichis avec des stérols à des niveaux plus élevés.
[8]
NOTE La méthode est techniquement équivalente à la méthode IUPAC 2.404 et à la méthode normalisée
[7]
DGF F-III 2 (91) .
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 661, Corps gras d'origines animale et végétale — Préparation de l'échantillon pour essai
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
teneur en stérols totaux
w
sterols
fraction massique de stérols déterminée par la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale
NOTE 1 Pour les corps gras d'origine végétale, la teneur en stérols est exprimée sous forme de β-sitostérol; pour les
matières grasses d'origine animale, elle est exprimée sous forme de cholestérol.
NOTE 2 La teneur en stérols est exprimée en milligrammes par 100 g de matière grasse.
4 Principe
L'échantillon est saponifié et les stérols présents dans la matière insaponifiable sont déterminés par voie
enzymatique. Ils sont oxydés par la cholestérol oxydase en cholesténone. La quantité équimolaire de
peroxyde d'hydrogène produite au cours du processus oxyde le méthanol en formaldéhyde en présence de
catalase. Le formaldéhyde réagit avec l'acétylacétone, en présence d'ions ammonium, pour former de la
lutidine de coloration jaune (3,5-diacétyl-1,4-dihydrolutidine). La lutidine est déterminée par
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ISO 11702:2009(F)
spectrophotométrie dans le domaine visible à 405 nm. La concentration en lutidine est équivalente à la
quantité de stérols.
NOTE La cholestérol oxydase oxyde le cholestérol ainsi que d'autres stérols ayant un groupe hydroxyle à la position
3β. Par conséquent, les phytostérols comme le stigmastérol et le sitostérol sont également déterminés.
5 Réactifs
AVERTISSEMENT — L'attention est attirée sur les règlements qui régissent la manipulation des
substances dangereuses. Des mesures de sécurité d'ordre technique, organisationnel et du personnel
doivent être suivies.
Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
5.1 Eau, conforme à l'ISO 3696, qualité 3 ou mieux.
5.2 Isopropanol.
5.3 Acétone.
5.4 Acétylacétone.
1)
5.5 Cholestérol oxydase en suspension (EC 1.1.3.6) de Nocardia erythropolis, 15 U/ml.
1)
5.6 Catalase en suspension (peroxyde d'hydrogène oxydo-réductase) (EC 1.11.1.6) de foie de bœuf.
5.7 Acide chlorhydrique, c(HCl) = 8 mol/l.
5.8 Solution méthanolique d'hydroxyde de potassium, c(KOH) = 0,5 mol/l.
Dissoudre 2,8 g d'hydroxyde de potassium dans une petite quantité de méthanol chaud, laisser refroidir et
diluer avec du méthanol à 100 ml.
5.9 Solution tampon de phosphate d'ammonium, ajustée à pH 7.
5.10 Solution 1.
Ajouter 19,1 ml d'acétone (5.3) et 230 000 U de catalase (5.6) à 50 ml de la solution tampon (5.9) dans une
fiole jaugée de 100 ml (6.4), et compléter au trait avec de l'eau (5.1).
5.11 Solution 2.
Ajouter 0,26 ml d'acétylacétone (5.4) et 1,10 ml d'acétone (5.3) à 25 ml d'eau (5.1) dans une fiole jaugée de
50 ml (6.4), et compléter au trait avec de l'eau.

1) Un kit d'essai prêt à l'emploi approprié pour un enfant pour la détermination du cholestérol dans les produits
alimentaires et d'autres matériaux est disponible auprès de R-biopharm. Cette information est donnée par souci de
commodité à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne saurait constituer un engagement de
l'ISO à l'égard de ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent aux mêmes
résultats.
2 © ISO 2009 – Tous droits réservés

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ISO 11702:2009(F)
5.12 Solution 3.
Avant utilisation, mélanger 3 parties en volume de la solution 1 (5.10) et 2 parties en volume de la
solution 2 (5.11).
NOTE La solution 3 peut se conserver dans des flacons ambrés pendant 3 mois à 4 °C sous réserve d'avoir été
préparée dans des conditions stériles.
6 Appareillage
6.1 Tubes à essai, de 18 mm de diamètre.
6.2 Entonnoir filtrant.
6.3 Filtre plissé adapté à l'entonnoir filtrant (6.2).
[2]
6.4 Fioles jaugées à un trait, de capacités 25 ml, 50 ml et 100 ml, ISO 1042 classe A.
[6] [1]
6.5 Pipettes pour enzymes, d'une capacité allant de 0,02 ml, ISO 7550 , à 1 ml, ISO 648 classe A.
[1]
6.6 Pipette graduée, d'une capacité de 5 ml, ISO 648 classe A.
6.7 Ballon à fond rond, à col rodé normal, d'une capacité de 50 ml.
6.8 Tubes à essai munis de bouchons rodés.
6.9 Spectrophotomètre, réglé à 405 nm.
6.10 Cuves en verre, trajet optique de 1 cm, convenant pour le spectrophotomètre (6.9).
6.11 Bain d'eau, à commande thermostatique, réglé entre 37 °C et 40 °C.
6.12 Réfrigérateur, permettant de maintenir une température de 4 °C.
6.13 Billes de verre.
6.14 Réfrigérant à reflux, à col rodé normal.
7 Échantillonnage
Il convient qu'un échantillon représentatif ait été envoyé au laboratoire. Il convient qu'il n'ait été ni endommagé
ni modifié au cours du transport ou du stockage.
L'échantillonnage ne faisant pas partie de la méthode spécifiée
...