ISO 6785:2001
(Main)Milk and milk products — Detection of Salmonella spp.
Milk and milk products — Detection of Salmonella spp.
ISO 6785|IDF 93:2001 specifies a method for the detection of Salmonella spp. in milk and milk products.
Lait et produits laitiers — Recherche de Salmonella spp.
L'ISO 6785|FIL 93:2001 spécifie une méthode pour la recherche de Salmonella spp. dans le lait et les produits laitiers.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 6785
IDF
93
Second edition
2001-05-15
Milk and milk products — Detection of
Salmonella spp.
Lait et produits laitiers — Recherche de Salmonella spp.
Reference numbers
ISO 6785:2001(E)
IDF 93:2001(E)
©
ISO and IDF 2001
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IDF 93:2001(E)
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Contents Page
1 Scope . 1
2 Normative reference . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
4.1 General . 1
4.2 Pre-enrichment in non-selective liquid medium . 1
4.3 Enrichment in selective liquid media . 1
4.4 Streaking out and recognition . 2
4.5 Confirmation . 2
5 Culture media, reagents and sera . 2
6 Apparatus and glassware . 12
7 Sampling . 13
8 Preparation of test sample . 13
9 Procedure . 13
9.1 Safety precautions . 13
9.2 Test portion and pre-enrichment . 13
9.3 Enrichment . 14
9.4 Streaking out and recognition . 14
9.5 Confirmation . 15
10 Control cultures . 18
11 Expression of results . 18
12 Safety precautions . 18
13 Test report . 19
Annexes
A Diagram of procedure . 20
B Specification for brilliant green. 21
C Standard method for streaking agar plates. 22
Bibliography. 23
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Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
International Standard ISO 6785�IDF 93 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products,
Subcommittee SC 5, Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with
AOAC International. It is being published jointly by ISO and IDF and separately by AOAC International.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 6785:1985), which has been technically revised.
Annexes A and B form a normative part of this International Standard. Annex C is for information only.
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Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a worldwide federation of the dairy sector with a National Committee in
every member country. Every National Committee has the right to be represented on the IDF Standing Committees
carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO and AOAC International in the development of standard
methods of analysis and sampling for milk and milk products.
Draft International Standards adopted by the Action Teams and Standing Committees are circulated to the National
Committees for voting. Publication as an International Standard requires approval by at least 50 % of National
Committees casting a vote.
International Standard ISO 6785�IDF 93 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products,
Subcommittee SC 5, Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with
AOAC International. It is being published jointly by ISO and IDF and separately by AOAC International.
All work was carried out by the Joint ISO/IDF/AOAC Action Team on Harmonization, of the Standing Committee on
Microbial methods of analysis, under the aegis of its project leader, Mr. H. Becker (DE).
This fourth edition cancels and replaces the third edition (IDF 93:1995).
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INTERNATIONAL STANDARD
IDF 93:2001(E)
Milk and milk products — Detection of Salmonella spp.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the detection of Salmonella spp. in milk and milk products.
2 Normative reference
The following normative document contains provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent edition of the normative document indicated below. For undated
references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC maintain
registers of currently valid International Standards.
ISO 8261�IDF 122, Milk and milk products — General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions
and decimal dilutions for microbiological examination.
3 Terms and definitions
For the purposes of this International Standard, the following terms and definitions apply.
3.1
Salmonella
microorganisms which form typical colonies on solid selective media and which display the biochemical and
serological characteristics described when tests are carried out in accordance with this International Standard
3.2
detection of Salmonella
detection of the presence or absence of these microorganisms, in a particular mass or volume, when tests are
carried out in accordance with this International Standard
4 Principle
4.1 General
The detection of Salmonella necessitates four successive stages (see annex A).
4.2 Pre-enrichment in non-selective liquid medium
�
Inoculation of the pre-enrichment medium with the test portion, and incubation at 37 C for 16 h to 20 h.
4.3 Enrichment in selective liquid media
Inoculation of Rappaport-Vassiliadis modified magnesium chloride/malachite green medium and of selenite/cystine
medium with the culture obtained in 4.2.
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Incubation of the Rappaport-Vassiliadis modified magnesium chloride/malachite green medium in the water bath or
�
incubator (6.4) set at 41,5 C for 24 h and then a further 24 h.
�
Incubation of the selenite/cystine medium in the incubator (6.3) set at 37 C for 24 h and then a further 24 h.
4.4 Streaking out and recognition
From the cultures obtained (4.3), inoculation of two selective solid media (brilliant green/phenol red agar and any
other suitable solid selective medium).
NOTE Suitable media allow the recovery of lactose-fermenting Salmonella strains.
�
Incubation of the brilliant green/phenol red agar in the incubator (6.3) set at 37 C and examination after 20 h to 24 h
and, if necessary, again after 40 h to 48 h to check the presence of colonies which, from their characteristics, are
considered to be presumptive Salmonella.
Incubation of the second selective solid medium at the appropriate temperature and examination after the
appropriate time to check the presence of colonies which, from their characteristics, are considered to be
presumptive Salmonella.
4.5 Confirmation
Subculturing of colonies of presumptive Salmonella (4.4) and confirmation by means of appropriate biochemical and
serological tests.
5 Culture media, reagents and sera
In order to improve the reproducibility of the results, it is recommended that, for the preparation of culture media,
dehydrated basic components or dehydrated complete media are used. In that case, follow the manufacturer's
instructions rigorously.
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
�
The pH values given refer to a temperature of 25 C. Adjustments, if necessary, are made by adding either
hydrochloric acid [c (HCl)= 1 mol/l] or sodium hydroxide solution [c (NaOH)= 1 mol/l].
If not used immediately, store the prepared culture media and reagents under conditions that do not produce any
� �
change in their composition, in the dark at a temperature between 0 C and + 5 C, for no longer than 1 month,
unless otherwise stated.
5.1 Water
Use distilled or demineralized water or water of equivalent purity. The water shall be free from substances that might
inhibit the growth of microorganisms under the test conditions specified in this International Standard.
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5.2 Culture media
5.2.1 Pre-enrichment medium: Buffered peptone water
5.2.1.1 Composition
Peptone 10,0 g
Sodium chloride (NaCl) 5,0 g
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate
(Na HPO ·12H O) 9,0 g
2 4 2
Potassium dihydrogen phosphate (KH PO ) 1,5 g
2 4
Water 1 000 ml
5.2.1.2 Preparation
7,0� 0,1
Dissolve the components in the water by heating. Adjust the pH so that after sterilization it is .
Transfer the medium in quantities of 225 ml into flasks (6.9) of capacity 500 ml (or multiples of 225 ml into flasks of
�
suitable capacity). Sterilize in the autoclave (6.1) set at 121 C for 15 min. Cool to room temperature.
5.2.2 First selective enrichment medium: Rappaport-Vassiliadis modified magnesium chloride/malachite
green medium (RVS broth)
5.2.2.1 Solution A
5.2.2.1.1 Composition
Enzymatic digest of soya 5,0 g
Sodium chloride (NaCl) 8,0 g
Potassium dihydrogen phosphate (KH PO ) 1,4 g
2 4
Dipotassium hydrogen phosphate (K HPO ) 0,2 g
2 4
Water 1 000 ml
5.2.2.1.2 Preparation
�
Dissolve the components in the water by heating to about 70 C. Prepare solution A on the day of preparation of the
complete RVS medium.
5.2.2.2 Solution B
5.2.2.2.1 Composition
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl ·6H O) 400,0 g
2 2
Water 1 000 ml
5.2.2.2.2 Preparation
Dissolve the magnesium chloride in the water. As this salt is very hygroscopic, it is advisable to dissolve the entire
contents of MgCl ·6H O from a newly opened container. For instance, 250 g of MgCl ·6H O is added to 625 ml of
2 2 2 2
water, giving a solution of total volume of 795 ml and a concentration of about 0,3 g/ml of MgCl ·6H O.
2 2
Solution B can be stored in an airtight brown glass bottle at room temperature for at least 2 years.
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5.2.2.3 Solution C
5.2.2.3.1 Composition
Malachite green oxalate 0,4 g
Water 100 ml
5.2.2.3.2 Preparation
Dissolve the malachite green oxalate in the water.
Solution C can be stored in a brown glass bottle at room temperature for at least 8 months.
5.2.2.4 Complete medium
5.2.2.4.1 Composition
Solution A (5.2.2.1) 1 000 ml
Solution B (5.2.2.2) 100 ml
Solution C (5.2.2.3) 10 ml
5.2.2.4.2 Preparation
Add to 1 000 ml of solution A, 100 ml of solutionB and 10 ml of solution C. Adjust the pH, if necessary, so that after
sterilization it is 5,2� 0,1. Dispense 10 ml quantities of the thus-obtained solution into test tubes (6.9) or into sterile
flasks (6.8) of suitable capacity to obtain the portions necessary for the test. Sterilize in the autoclave (6.1) set at
�
115 C for 15 min.
� �
Store the prepared medium in the refrigerator at 3 C� 2 C.
5.2.3 Second selective enrichment medium: Selenite/cystine medium
WARNING — Extreme care should be taken with the laboratory use of selenite solutions because of their
potentially toxic effect. Do not pipette by mouth under any circumstances.
5.2.3.1 Base
5.2.3.1.1 Composition
Tryptone 5,0 g
Lactose 4,0 g
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate
(Na HPO ·12H O) 10,0 g
2 4 2
Sodium hydrogen selenite 4,0 g
Water 1 000 ml
5.2.3.1.2 Preparation
Dissolve the first three basic components in the water by boiling for 5 min. After cooling, add the sodium hydrogen
selenite. Adjust the pH, if necessary, to 7,0� 0,1. Do not sterilize.
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5.2.3.2 L-Cystine solution
5.2.3.2.1 Composition
0,1 g
L-Cystine
Sodium hydroxide solution,c (NaOH)= 1 mol/l 15 ml
Sterile water approx. 85 ml
5.2.3.2.2 Preparation
Add the components to a sterile 100 ml one-mark volumetric flask. Dilute to the mark with sterile water. Do not
sterilize.
5.2.3.3 Complete medium
5.2.3.3.1 Composition
Base (5.2.3.1) 1 000 ml
L-Cystine solution (5.2.3.2) 10 ml
5.2.3.3.2 Preparation
Add the L-cystine solution aseptically to the base. Adjust the pH, if necessary, to 7,0� 0,1. Dispense the medium
aseptically into sterile flasks of suitable capacity to obtain the portions necessary for the test.
The medium may be used until a red precipitate occurs.
5.2.4 First selective solid medium: Brilliant green/phenol red agar (Edel and Kampelmacher)
5.2.4.1 Base
5.2.4.1.1 Composition
Meat extract powder 5,0 g
Peptone 10,0 g
Yeast extract powder 3,0 g
Disodium hydrogen phosphate (Na HPO ) 1,0 g
2 4
Sodium dihydrogen phosphate (NaH PO ) 0,6 g
2 4
a
Agar 12 g to 18 g
Water 900 ml
a
Depending on the gel strength of the agar.
5.2.4.1.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete base in the water by heating, if necessary. Adjust the pH, if
necessary, so that after sterilization it is 7,0� 0,1. Transfer the base to tubes (6.9) or flasks (6.8) of appropriate
�
capacity. Sterilize in the autoclave (6.1) set at 121 C for 15 min.
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5.2.4.2 Sugar/phenol red solution
5.2.4.2.1 Composition
Lactose 10,0 g
Sucrose 10,0 g
Phenol red 0,09 g
Water approx. 80 ml
5.2.4.2.2 Preparation
Dissolve the components in approximately 50 ml of water in a 100 ml one-mark volumetric flask. Dilute to the mark
�
with the water. Heat the solution in a water bath (6.5) set at 70 C for 20 min. Cool in another water bath (6.5) set at
�
55 C. Use the solution immediately after cooling.
5.2.4.3 Brilliant green solution
5.2.4.3.1 Composition
Brilliant green (see specification in annex B) about 0,5 g
Water 100 ml
5.2.4.3.2 Preparation
Dissolve the brilliant green in the water. Store the solution for at least one day in the dark to allow auto-sterilization to
occur.
5.2.4.4 Complete medium
5.2.4.4.1 Composition
Base (5.2.4.1) 900 ml
Sugar/phenol red solution (5.2.4.2) 100 ml
Brilliant green solution (5.2.4.3) 1ml
5.2.4.4.2 Preparation
Add the brilliant green solution (5.2.4.3) aseptically to the sugar/phenol red solution (5.2.4.2) cooled in a water bath
� �
(6.5) to 55C5. Add this to the base, preheated in the water bath to5 C, and mix. The temperature of the water bath
� �
should be kept between 50C5and5 C while mixing.
5.2.4.4.3 Preparation of the agar plates
Place in each of an appropriate number of large Petri dishes (6.12) about 40 ml of the freshly prepared complete
medium (5.2.4.4). If large dishes are not available, place about 15 ml of the medium in small Petri dishes (6.12).
Allow to solidify.
If prepared in advance, store the agar plates for no longer than 4h at room temperature or no longer than 1 week
� �
between 0 C and + 5 C.
Immediately before use, dry the agar plates carefully (preferably with the lids off and the agar surface downwards) in
�
the oven (6.2) set at 50 C or in the laminar airflow cabinet (6.2) until the surface of the agar is dry.
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5.2.5 Second selective solid medium
The choice of the second medium is left to the discretion of the testing laboratory.
5.2.6 Nutrient agar
5.2.6.1 Composition
Meat extract 3,0 g
Peptone 5,0 g
b
Agar 12 g to 18 g
Water 1 000 ml
b
Depending on the gel strength of the agar.
5.2.6.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water, by heating if necessary. Adjust the pH, if
necessary, so that after sterilization it is 7,0� 0,1. Transfer the culture medium into tubes (6.9) or bottles (6.8) of
�
appropriate capacity. Sterilize in the autoclave (6.1) set at 121 C for 15 min.
5.2.6.3 Preparation of agar plates
Transfer about 15 ml of the melted medium to sterile small Petri dishes (6.12) and proceed as in 5.2.4.4.3.
5.2.7 Triple sugar/iron agar (TSI agar)
5.2.7.1 Composition
Meat extract 3,0 g
Yeast extract 3,0 g
Peptone 20,0 g
Sodium chloride 5,0 g
Lactose 10,0 g
Sucrose 10,0 g
Glucose 1,0 g
Iron(III) citrate 0,3 g
Sodium thiosulfate 0,3 g
Phenol red 0,024 g
c
Agar 12 g to 18 g
Water 1 000 ml
c
Depending on the gel strength of the agar.
5.2.7.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water, by heating if necessary. Adjust the pH, if
necessary, so that after sterilization it is 7,4� 0,1. Dispense the medium in quantities of 10 ml into test tubes (6.9) of
�
diameter 17 mm to 18 mm. Sterilize in the autoclave (6.1) set at 121 C for 15 min. Allow to set in a sloping position
to give a butt of depth 2,5 cm and a slant of 4 cm to 5 cm.
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5.2.8 Urea agar (Christensen)
5.2.8.1 Base
5.2.8.1.1 Composition
Peptone 1,0 g
Glucose 1,0 g
Sodium chloride 5,0 g
Potassium dihydrogen phosphate (KH PO ) 2,0 g
2 4
Phenol red 0,012 g
d
Agar 12 g to 18 g
Water 1 000 ml
d
Depending on the gel strength of the agar.
5.2.8.1.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete base in the water, by heating if necessary. Adjust the pH, if
�
necessary, so that after sterilization it is 6,8� 0,1. Sterilize in the autoclave (6.1) set at 121 C for 15 min.
5.2.8.2 Urea solution
5.2.8.2.1 Composition
Urea 400 g
Water, to a final volume of 1 000 ml
5.2.8.2.2 Preparation
Dissolve the urea in the water. Sterilize by filtration and check the sterility. (For details of the technique of sterilization
by filtration, refer to any appropriate textbook on microbiology.)
5.2.8.3 Complete medium
5.2.8.3.1 Composition
Base (5.2.8.1) 950 ml
Urea solution (5.2.8.2) 50 ml
5.2.8.3.2 Preparation
�
Add the urea solution aseptically to the base, previously melted and then cooled in the water bath (6.5) to 45 C.
Dispense the complete medium in quantities of 10 ml into sterile tubes (6.9). Allow to set in a sloping position.
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5.2.9 L-Lystine decarboxylation medium
5.2.9.1 Composition
L-Lystine monohydrochloride 5,0 g
Yeast extract 3,0 g
Glucose 1,0 g
Bromocresol purple 0,015 g
Water 1 000 ml
5.2.9.2 Preparation
Dissolve the components in the water, by heating if necessary. Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization
it is 6,8� 0,1. Transfer the medium in quantities of 5 ml into narrow culture tubes (6.9). Sterilize in the autoclave (6.1)
�
set at 121 C for 15 min.
5.3 Reagents
5.3.1 Saline solution
5.3.1.1 Composition
Sodium chloride 8,5 g
Water 1 000 ml
5.3.1.2 Preparation
Dissolve the sodium chloride in the water, by heating if necessary. Adjust the pH so that after sterilization it is
7,0� 0,1 90 ml 100 ml
. Transfer quantities of the solution to flasks (6.8) or tubes (6.9) so that they will contain to after
�
sterilization. Sterilize in the autoclave (6.1) set at 121 C for 15 min.
5.3.2 Reagents for -galactosidase reaction
5.3.2.1 Toluene
5.3.2.2 Buffer solution
5.3.2.2.1 Composition
Sodium dihydrogen phosphate (NaH PO ) 6,9 g
2 4
e
Sodium hydroxide, 10 mol/l solution approx. 3 ml
Water approx. 50 ml
e
Depending on the volume necessary to adjust the pH.
5.3.2.2.2 Preparation
Dissolve the sodium dihydrogen phosphate in approximately 45 ml of water in a 50 ml one-mark volumetric flask.
Adjust the pH to 7,0� 0,1 with the sodium hydroxide solution. Dilute to the mark with water.
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5.3.2.3 ONPG solution
5.3.2.3.1 Composition
0,08 g
o-Nitrophenyl -D-galactopyranoside (ONPG)
Water 15 ml
5.3.2.3.2 Preparation
� �
Dissolve the ONPG in the water preheated to 50 C� 1 C. Cool the solution to room temperature.
5.3.2.4 Complete reagent
5.3.2.4.1 Composition
Buffer solution (5.3.2.2) 5ml
ONPG solution (5.3.2.3) 15 ml
5.3.2.4.2 Preparation
Add the buffer solution to the ONPG solution.
5.3.3 Reagents for Voges-Proskauer (VP) reaction
5.3.3.1 VP medium
5.3.3.1.1 Composition
Peptone 7,0 g
Glucose 5,0 g
Dipotassium hydrogen phosphate (K HPO ) 5,0 g
2 4
Water 1 000 ml
5.3.3.1.2 Preparation
Dissolve the components in the water, by heating if necessary. Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization
it is 6,9� 0,1. Transfer 3 ml of the thus-obtained VP medium into each of several tubes (6.9). Sterilize in the
�
autoclave (6.1) set at 115 C for 20 min.
5.3.3.2 Creatine solution (N-amidinosarcosine)
5.3.3.2.1 Composition
0,5 g
Creatine monohydrate
Water 100 ml
5.3.3.2.2 Preparation
Dissolve the creatine monohydrate in the water.
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5.3.3.3 1-Naphthol, ethanolic solution
5.3.3.3.1 Composition
1-Naphthol 6g
96 % 100 ml
Ethanol, (volume fraction)
5.3.3.3.2 Preparation
Dissolve the 1-naphthol in the ethanol.
5.3.3.4 Potassium hydroxide solution
5.3.3.4.1 Composition
Potassium hydroxide 40 g
Water 100 ml
5.3.3.4.2 Preparation
Dissolve the potassium hydroxide in the water.
5.3.4 Reagents for indole reaction
5.3.4.1 Tryptone/tryptophan medium
5.3.4.1.1 Composition
Tryptone 10 g
Sodium chloride 5g
DL-Tryptophan 1g
Water 1 000 ml
5.3.4.1.2 Preparation
�
Dissolve the components in the water at 100 C in the boiling water bath (6.5). Adjust the pH, if necessary, so that
after sterilization it is 7,5� 0,1. Dispense 5 ml of the thus-obtained medium into each of several tubes (6.9). Sterilize
�
in the autoclave (6.1) set at 121 C for 15 min.
5.3.4.2 Kovac’s reagent
5.3.4.2.1 Composition
4-Dimethylaminobenzaldehyde 5g
Hydrochloric acid, = 1,18 g/ml to 1,19 g/ml 25 ml
75 ml
2-Methylbutan-2-ol
5.3.4.2.2 Preparation
Mix the above-mentioned components.
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11
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ISO 6785:2001(E)
IDF 93:2001(E)
5.3.5 Semi-solid nutrient agar
5.3.5.1 Composition
Meat extract 3,0 g
Peptone 5,0 g
f
4g 9g
Agar to
Water 1 000 ml
f
Depending on the gel strength of the agar.
5.3.5.2 Preparation
Dissolve the components in the water, by heating if necessary. Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization
it is 7,0� 0,1. Transfer the medium to flasks (6.8) of appropriate capacity. Sterilize in the autoclave (6.1) set at
�
121 C for 15 min.
5.3.5.3 Preparation of agar plates
Place in small sterile Petri dishes (6.12) about 15 ml of the freshly prepared medium. Do not dry the agar plates.
5.4 Sera
Several types of agglutinant sera containing antibodies for one or several O-antigens are available commercially; i.e.
anti-sera containing one or more “O” groups (called monovalent or polyvalent anti-O sera), anti-Vi sera and anti-sera
containing antibodies for one or several H-factors (called monovalent or polyvalent anti-H sera).
Every attempt should be made to ensure that the anti-sera used are adequate to provide for the detection of all
Salmonella serovars. Assistance towards this objective may be obtained by using anti-sera prepared by a supplier
recognized as competent (for example, by an appropriate government agency).
6 Apparatus and glassware
Disposable apparatus is an acceptable alternative to reusable glassware if it has suitable specifications.
Usual microbiological laboratory equipment and, in particular, the following.
� � � �
6.1 Apparatus for wet sterilization (autoclave), capable of operating at 121 C� 1C1and15 C� 1 C.
� �
6.2 Oven, ventilated by convection, capable of operating at 50 C� 5 C, or laminar airflow cabinet.
� �
6.3 Incubator, capable of operating at 37 C� 1 C.
� �
6.4 Water bath or incubator, capable of operating at 41,5 C� 1 C.
� � � � � � � �
6.5 Water baths, capable of operating at , , , , respectively,
37 C� 1 C45 C� 1 C55 C� 1 C70 C� 1 C
and boiling.
6.6 Loops, made of platinum/iridium or nickel/chromium, of diameter approximately 3mm.
�
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 6785
FIL
93
Deuxième édition
2001-05-15
Lait et produits laitiers — Recherche de
Salmonella spp.
Milk and milk products — Detection of Salmonella spp.
Numéros de référence
ISO 6785:2001(F)
FIL 93:2001(F)
©
ISO et FIL 2001
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FIL 93:2001(F)
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quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
soit de l'ISO soit de la FIL, à l'une ou l'autre des adresses ci-après.
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Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Version française parue en 2007
Publié en Suisse
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FIL 93:2001(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Avant-propos. v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principe. 1
4.1 Généralités . 1
4.2 Pré-enrichissement dans un milieu liquide non sélectif . 1
4.3 Enrichissement dans des milieux liquides sélectifs. 2
4.4 Étalement sur gélose et caractérisation. 2
4.5 Confirmation. 2
5 Milieux de culture, réactifs et sérums. 2
5.1 Eau. 2
5.2 Milieux de culture. 3
5.3 Réactifs . 10
5.4 Sérums. 13
6 Appareillage et verrerie. 13
7 Échantillonnage . 14
8 Préparation de l’échantillon pour essai. 14
9 Mode opératoire . 14
9.1 Mesures de sécurité . 14
9.2 Prise d’essai et pré-enrichissement . 14
9.3 Enrichissement . 15
9.4 Étalement sur gélose et caractérisation. 15
9.5 Confirmation. 16
10 Cultures de contrôle. 19
11 Expression des résultats . 20
12 Mesures de sécurité . 20
13 Rapport d’essai . 20
Annexe A (normative) Schéma du mode opératoire . 21
Annexe B (normative) Spécification pour le vert brillant. 22
Annexe C (informative) Méthode normalisée d’étalement sur gélose . 23
Bibliographie . 24
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ISO 6785:2001(F)
FIL 93:2001(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 3.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 6785⎪FIL 93 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL). Elle est publiée conjointement
par l'ISO et la FIL.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 6785:1985), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les Annexes A et B constituent la partie normative de la présente Norme internationale. L’Annexe C est
fournie à titre informatif uniquement.
iv © ISO et FIL 2001 – Tous droits réservés
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ISO 6785:2001(F)
FIL 93:2001(F)
Avant-propos
La FIL (Fédération internationale de laiterie) est une fédération mondiale du secteur laitier avec un Comité
National dans chacun de ses pays membres. Chaque Comité National a le droit de faire partie des Comités
permanents de la FIL, auxquels sont confiés les travaux techniques. La FIL collabore avec l’ISO et avec
l’AOAC International pour l’élaboration de méthodes normalisées d’analyse et d’échantillonnage pour le lait et
les produits laitiers.
Les projets de Normes internationales adoptés par les Équipes d’Action et les Comités permanents sont
soumis aux Comités Nationaux pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert
l’approbation de 50 % au moins des Comités Nationaux votants.
La Norme internationale ISO 6785|FIL 93 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits
alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL), en
collaboration avec l’AOAC International. Elle est publiée conjointement par l’ISO et la FIL, et séparément par
l’AOAC International.
L’ensemble des travaux a été confié à l’Équipe d’Action mixte d’Harmonisation du Comité permanent chargé
des Méthodes microbiologiques d’analyse, sous la conduite de son chef de projet, Monsieur H. Becker (DE).
Cette quatrième édition annule et remplace la troisième édition (FIL 93:1995).
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ISO 6785:2001(F)
NORME INTERNATIONALE
FIL 93:2001(F)
Lait et produits laitiers — Recherche de Salmonella spp.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode pour la recherche de Salmonella spp. dans le lait et
les produits laitiers.
2 Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente Norme internationale. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s'appliquent pas. Toutefois, les parties
prenantes aux accords fondés sur la présente Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité
d’appliquer les éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non
datées, la dernière édition du document normatif en référence s'applique. Les membres de l’ISO et de la CEI
possèdent le registre des Normes internationales en vigueur.
ISO 8261|FIL 122, Lait et produits laitiers — Lignes directrices générales pour la préparation des échantillons
pour essai, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique
3 Termes et définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
Salmonella
micro-organismes qui forment des colonies typiques sur des milieux solides sélectifs et qui possèdent les
caractéristiques biochimiques et sérologiques décrites lorsque les essais sont exécutés suivant la présente
Norme internationale
3.2
recherche des Salmonella
détermination de la présence ou de l’absence de ces micro-organismes dans une masse ou un volume
déterminé de produit, lorsque les essais sont exécutés selon la présente Norme internationale
4 Principe
4.1 Généralités
La recherche des Salmonella nécessite quatre phases successives (voir Annexe A).
4.2 Pré-enrichissement dans un milieu liquide non sélectif
Ensemencement de la prise d’essai dans le milieu de pré-enrichissement, puis incubation à 37 °C pendant
16 h à 20 h.
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FIL 93:2001(F)
4.3 Enrichissement dans des milieux liquides sélectifs
Ensemencement du milieu de Rappaport-Vassiliadis modifié au chlorure de magnésium/vert malachite et du
milieu sélénite/cystine avec la culture obtenue en 4.2.
Incubation du milieu de Rappaport-Vassiliadis modifié au chlorure de magnésium/vert malachite dans un bain
d’eau ou un incubateur (6.4) à 41,5 °C pendant deux périodes successives de 24 h.
Incubation du milieu sélénite/cystine à l’étuve (6.3) à 37 °C pendant deux périodes successives de 24 h.
4.4 Étalement sur gélose et caractérisation
À partir des cultures obtenues (4.3), ensemencement de deux milieux solides sélectifs (gélose au vert brillant
et au rouge de phénol et un autre milieu solide sélectif convenable).
NOTE Des milieux convenables permettent de détecter les souches de Salmonella fermentant le lactose.
Incubation du milieu au vert brillant et au rouge de phénol à l’étuve (6.3) à 37 °C et examen après 20 h à 24 h
et, si nécessaire, après 40 h à 48 h pour contrôler la présence de colonies qui, d’après leurs caractéristiques,
pourraient être des Salmonella.
Incubation du second milieu solide sélectif à température appropriée et examen après une durée appropriée
pour contrôler la présence de colonies qui, d’après leurs caractéristiques, pourraient être des Salmonella.
4.5 Confirmation
Repiquage des colonies présumées de Salmonella (4.4) et confirmation au moyen de tests biochimiques et
sérologiques appropriés.
5 Milieux de culture, réactifs et sérums
Pour améliorer la reproductibilité des résultats, il est recommandé d’utiliser, pour la préparation des milieux de
culture, des composants de base déshydratés ou des milieux complets déshydratés. Dans ce cas, suivre
scrupuleusement les prescriptions du fabricant.
N'utiliser que des réactifs de qualité analytique reconnue, sauf indication contraire.
Les valeurs de pH indiquées se réfèrent à une température de 25 °C. Les ajustements éventuels sont faits par
addition soit d’une solution d’acide chlorhydrique [c(HCl) = 1 mol/l], soit d’une solution d’hydroxyde de sodium
[c(NaOH) = 1 mol/l].
Si les milieux de culture préparés et les réactifs ne sont pas utilisés extemporanément, les conserver, sauf
spécifications contraires, à l’obscurité, à une température comprise entre 0 °C et +5 °C, pendant un mois au
maximum, dans des conditions qui évitent toute modification de leur composition.
5.1 Eau
Utiliser de l’eau utilisée, déminéralisée ou de l'eau de pureté équivalente. Elle doit être exempte de
substances pouvant inhiber le développement de micro-organismes dans les conditions d’essai spécifiées
dans la présente Norme internationale.
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5.2 Milieux de culture
5.2.1 Milieu de pré-enrichissement: eau peptonée tamponnée
5.2.1.1 Composition
Peptone 10,0 g
Chlorure de sodium (NaCl) 5,0 g
Hydrogéno-orthophosphate disodique (Na HPO ,12H O) 9,0 g
2 4 2
Dihydrogéno-orthophosphate de potassium (KH PO) 1,5 g
2 4
Eau 1 000 ml
5.2.1.2 Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau en chauffant. Ajuster le pH de sorte qu’il soit, après stérilisation, de
7,0 ± 0,1.
Répartir le milieu par quantités de 225 ml dans des flacons (6.8) de 500 ml de capacité (ou par quantités
multiples de 225 ml dans des flacons de capacité convenable). Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 °C
pendant 15 min. Laisser refroidir à température ambiante.
5.2.2 Premier milieu sélectif d’enrichissement: milieu de Rappaport-Vassiliadis modifié au chlorure
de magnésium/vert malachite (bouillon RVS)
5.2.2.1 Solution A
5.2.2.1.1 Composition
Digestat enzymatique de soja 5,0 g
Chlorure de sodium (NaCl) 8,0 g
Dihydrogéno-orthophosphate de potassium (KH PO) 1,4 g
2 4
Hydrogéno-phosphate dipotassique (K HPO) 0,2 g
2 4
Eau 1 000 ml
5.2.2.1.2 Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau en chauffant à environ 70 °C. Préparer la solution A le jour de la
préparation du milieu RVS.
5.2.2.2 Solution B
5.2.2.2.1 Composition
Chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl ,6HO) 400,0 g
2 2
Eau 1 000 ml
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5.2.2.2.2 Préparation
Dissoudre le chlorure de magnésium dans l’eau. Du fait que le sel est très hygroscopique, il est conseillé de
dissoudre le contenu entier d’un flacon fraîchement ouvert de MgCl ,6H O. Par exemple, 250 g de
2 2
MgCl ,6H O sont ajoutés à 625 ml d’eau, donnant une solution d’un volume total de 795 ml et une
2 2
concentration d’environ 0,3 g/ml de MgCl ,6H O.
2 2
La solution B peut être conservée dans un flacon en verre brun étanche à l’air à température ambiante
pendant au moins 2 ans.
5.2.2.3 Solution C
5.2.2.3.1 Composition
Oxalate de vert malachite 0,4 g
Eau 100 ml
5.2.2.3.2 Préparation
Dissoudre l’oxalate de vert malachite dans l’eau.
La solution C peut être conservée dans un flacon en verre brun à température ambiante pendant au moins
8 mois.
5.2.2.4 Milieu complet
5.2.2.4.1 Composition
Solution A (5.2.2.1) 1 000 ml
Solution B (5.2.2.2) 100 ml
Solution C (5.2.2.3) 10 ml
5.2.2.4.2 Préparation
Ajouter à 1 000 ml de solution A, 100 ml de solution B et 10 ml de solution C. Ajuster le pH, si nécessaire, de
sorte qu’il soit, après stérilisation, de 5,2 ± 0,1. Répartir avant utilisation dans des tubes de culture (6.9) par
quantités de 10 ml ou dans des flacons stériles (6.8) de capacité convenable pour obtenir les quantités
nécessaires. Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 115 °C pendant 15 min.
Conserver le milieu préparé au réfrigérateur à 3 °C ± 2 °C.
5.2.3 Second milieu sélectif d’enrichissement: milieu sélénite/cystine
AVERTISSEMENT — Il convient d’être très prudent lors de l’utilisation en laboratoire de solutions de
sélénite en raison de leur effet toxique potentiel. Il ne faut en aucun cas pipetter à la bouche.
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5.2.3.1 Milieu de base
5.2.3.1.1 Composition
Tryptone 5,0 g
Lactose 4,0 g
Hydrogéno-orthophosphate disodique (Na HPO ,12HO) 10,0 g
2 4 2
Hydrogénosélénite de sodium 4,0 g
Eau 1 000 ml
5.2.3.1.2 Préparation
Dissoudre les trois premiers ingrédients dans l’eau en portant à ébullition pendant 5 min. Après
refroidissement, ajouter l’hydrogénosélénite de sodium. Ajuster le pH, si nécessaire, à 7,0 ± 0,1. Ne pas
stériliser.
5.2.3.2 Solution de L-cystine
5.2.3.2.1 Composition
L-Cystine 0,1 g
Solution d’hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 1 mol/l 15 ml
Eau stérile environ 85 ml
5.2.3.2.2 Préparation
Dissoudre les composants dans un flacon jaugé stérile. Compléter à 100 ml avec de l’eau stérile. Ne pas
stériliser.
5.2.3.3 Milieu complet
5.2.3.3.1 Composition
Milieu de base (5.2.3.1) 1 000 ml
Solution de L-cystine (5.2.3.2) 10 ml
5.2.3.3.2 Préparation
Ajouter aseptiquement la solution L-cystine au milieu de base. Ajuster, si nécessaire, le pH à 7,0 ± 0,1.
Répartir aseptiquement le milieu dans des flacons stériles de capacité convenable pour obtenir les quantités
nécessaires à l’essai.
Le milieu peut être utilisé jusqu’à apparition d’un précipité rouge.
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5.2.4 Premier milieu solide sélectif: gélose au vert brillant et au rouge de phénol (Edel et
Kampelmacher)
5.2.4.1 Milieu de base
5.2.4.1.1 Composition
Extrait de viande en poudre 5,0 g
Peptone 10,0 g
Extrait de levure en poudre 3,0 g
Hydrogéno-orthophosphate disodique (Na HPO) 1,0 g
2 4
Dihydrogéno-orthophosphate de sodium (NaH PO) 0,6 g
2 4
a
Agar-agar de 12 g à 18 g
Eau 900 ml
a
Selon les propriétés gélifiantes de l’agar-agar.
5.2.4.1.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau les composants ou le milieu de base complet déshydraté, en chauffant si nécessaire.
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’il soit, après stérilisation, de 7,0 ± 0,1. Répartir le milieu de base dans
des tubes (6.9) ou des flacons (6.8) de capacité appropriée. Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 °C
pendant 15 min.
5.2.4.2 Solution de sucres au rouge de phénol
5.2.4.2.1 Composition
Lactose 10,0 g
Saccharose 10,0 g
Rouge de phénol 0,09 g
Eau environ 80 ml
5.2.4.2.2 Préparation
Dissoudre les composants dans approximativement 50 ml d’eau, dans un flacon jaugé. Compléter à 100 ml
avec de l’eau. Chauffer la solution au bain d’eau (6.5) à 70 °C pendant 20 min. Refroidir dans un autre bain
d’eau (6.5) à 55 °C. Utiliser la solution immédiatement après le refroidissement.
5.2.4.3 Solution de vert brillant
5.2.4.3.1 Composition
Vert brillant (voir la spécification dans l’Annexe B) environ 0,5 g
Eau 100 ml
5.2.4.3.2 Préparation
Dissoudre le vert brillant dans l’eau. Conserver la solution au moins une journée dans l’obscurité pour
permettre l’autostérilisation.
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5.2.4.4 Milieu complet
5.2.4.4.1 Composition
Milieu de base (5.2.4.1) 900 ml
Solution de sucres au rouge de phénol (5.2.4.2) 100 ml
Solution de vert brillant (5.2.4.3) 1 ml
5.2.4.4.2 Préparation
Ajouter aseptiquement la solution de vert brillant (5.2.4.3) à la solution de sucres au rouge de phénol (5.2.4.2)
refroidie dans un bain d’eau (6.5) à 55 °C. Ajouter ce mélange au milieu de base préchauffé dans un bain
d’eau à 55 °C et mélanger. Il convient que la température du bain d’eau soit maintenue entre 50 °C et 55 °C
pendant le mélange.
5.2.4.4.3 Préparation des boîtes de gélose
Placer dans chacune des grandes boîtes de Petri (6.12) en nombre voulu, environ 40 ml du milieu complet
fraîchement préparé (5.2.4.4). Si l’on ne dispose pas de grandes boîtes de Petri, verser environ 15 ml du
milieu dans des petites boîtes de Petri (6.12). Laisser solidifier.
Les boîtes ainsi préparées ne doivent pas être conservées plus de 4 h à température ambiante ou plus d’une
semaine entre 0 °C et +5 °C.
Immédiatement avant usage, faire sécher les boîtes soigneusement (de préférence avec le couvercle enlevé
et la surface de la gélose tournée vers le bas) dans un four (6.2) réglé à 50 °C ou dans une enceinte à flux
laminaire (6.2) jusqu’à ce que la surface de la gélose soit sèche.
5.2.5 Second milieu solide sélectif
Le choix du second milieu est laissé à l’appréciation du laboratoire d’essai.
5.2.6 Gélose nutritive
5.2.6.1 Composition
Extrait de viande 3,0 g
Peptone 5,0 g
b
Agar-agar de 12 g à 18 g
Eau 1 000 ml
b
Selon les propriétés gélifiantes de l’agar-agar.
5.2.6.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau les composants ou le milieu complet déshydraté, en chauffant si nécessaire. Ajuster le
pH, si nécessaire, de sorte qu’il soit, après stérilisation, de 7,0 ± 0,1. Répartir le milieu de culture dans des
tubes (6.9) ou des flacons (6.8) de capacité appropriée. Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 °C pendant
15 min.
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FIL 93:2001(F)
5.2.6.3 Préparation des boîtes de gélose
Verser environ 15 ml du milieu fondu dans des petites boîtes de Petri stériles (6.12) et procéder comme en
5.2.4.4.3.
5.2.7 Gélose au citrate de fer et aux trois sucres (gélose TSI)
5.2.7.1 Composition
Extrait de viande 3,0 g
Extrait de levure 3,0 g
Peptone 20,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Lactose 10,0 g
Saccharose 10,0 g
Glucose 1,0 g
Citrate de fer(III) 0,3 g
Thiosulfate de sodium 0,3 g
Rouge de phénol 0,024 g
c
Agar-agar de 12 g à 18 g
Eau 1 000 ml
c
Selon les propriétés gélifiantes de l’agar-agar.
5.2.7.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau les composants ou le milieu complet déshydraté, en chauffant si nécessaire. Ajuster le
pH, si nécessaire, de sorte qu’il soit, après stérilisation, de 7,4 ± 0,1. Répartir le milieu par quantités de 10 ml
dans des tubes à essai (6.9) de 17 mm à 18 mm de diamètre. Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 °C
pendant 15 min. Laisser reposer en position inclinée de façon à obtenir un culot de 2,5 cm de profondeur et
une pente de 4 cm à 5 cm de longueur.
5.2.8 Gélose à l’urée (Christensen)
5.2.8.1 Milieu de base
5.2.8.1.1 Composition
Peptone 1,0 g
Glucose 1,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Dihydrogéno-orthophosphate de potassium (KH PO) 2,0 g
2 4
Rouge de phénol 0,012 g
d
Agar-agar de 12 g à 18 g
Eau 1 000 ml
d
Selon les propriétés gélifiantes de l’agar-agar.
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5.2.8.1.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau les composants ou le milieu de base complet déshydraté, en chauffant si nécessaire.
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’il soit, après stérilisation, de 6,8 ± 0,1. Stériliser à l’autoclave (6.1)
réglé à 121 °C pendant 15 min.
5.2.8.2 Solution d’urée
5.2.8.2.1 Composition
Urée 400 g
Eau, quantité nécessaire pour 1 000 ml
5.2.8.2.2 Préparation
Dissoudre l’urée dans l’eau. Stériliser par filtration et contrôler la stérilité. (Pour les détails relatifs à la
technique de stérilisation par filtration, se référer à tout document approprié de microbiologie.)
5.2.8.3 Milieu complet
5.2.8.3.1 Composition
Milieu de base (5.2.8.1) 950 ml
Solution d’urée (5.2.8.2) 50 ml
5.2.8.3.2 Préparation
Ajouter aseptiquement la solution d’urée au milieu de base préalablement fondu, puis refroidi dans un bain
d’eau (6.5) à 45 °C. Répartir le milieu complet, par quantités de 10 ml dans des tubes stériles (6.9). Laisser
reposer en position inclinée.
5.2.9 Milieu de décarboxylation de la L-lysine
5.2.9.1 Composition
Monohydrochlorure de la L-lysine 5,0 g
Extrait de levure 3,0 g
Glucose 1,0 g
Pourpre de bromocrésol 0,015 g
Eau 1 000 ml
5.2.9.2 Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau, en chauffant si nécessaire. Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’il
soit, après stérilisation, de 6,8 ± 0,1. Répartir le milieu par quantités de 5 ml dans des tubes de culture étroits
(6.9). Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 °C pendant 15 min.
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5.3 Réactifs
5.3.1 Solution saline
5.3.1.1 Composition
Chlorure de sodium 8,5 g
Eau 1 000 ml
5.3.1.2 Préparation
Dissoudre le chlorure de sodium dans l’eau, en chauffant si nécessaire. Ajuster le pH de sorte qu’il soit, après
stérilisation, de 7,0 ± 0,1. Répartir la solution dans des flacons (6.8) ou dans des tubes (6.9) de sorte qu’après
stérilisation, ils contiennent de 90 ml à 100 ml de solution. Stériliser à l’autoclave (6.1) réglé à 121 °C pendant
15 min.
5.3.2 Réactifs pour la réaction de la β-galactosidase
5.3.2.1 Toluène
5.3.2.2 Solution tampon
5.3.2.2.1 Composition
Dihydrogéno-orthophosphate de sodium (NaH PO) 6,9 g
2 4
e
Hydroxyde de sodium, solution à 10 mol/l environ 3 ml
Eau environ 50 ml
e
Selon le volume nécessaire pour ajuster le pH.
5.3.2.2.2 Préparation
Dissoudre le dihydrogéno-orthophosphate de sodium dans environ 45 ml d’eau dans un flacon jaugé de 50 ml.
Ajuster le pH à 7,0 ± 0,1 avec la solution d’hydroxyde de sodium. Compléter à la marque avec de l’eau.
5.3.2.3 Solution d’ONPG
5.3.2.3.1 Composition
o-Nitrophényl β-D-galactopyranoside (ONPG) 0,08 g
Eau 15 ml
5.3.2.3.2 Préparation
Dissoudre l’ONPG dans l’eau préchauffée à 50 °C ± 1 °C. Laisser refroidir à température ambiante.
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5.3.2.4 Réactif complet
5.3.2.4.1 Composition
Solution tampon (5.3.2.2) 5 ml
Solution d’ONPG (5.3.2.3) 15 ml
5.3.2.4.2 Préparation
Ajouter la solution tampon à la solution d’ONPG.
5.3.3 Réactifs pour la réaction de Voges-Proskauer (VP)
5.3.3.1 Milieu VP
5.3.3.1.1 Composition
Peptone 7,0 g
Glucose 5,0 g
Hydrogéno-phosphate dipotassique (K HPO) 5,0 g
2 4
Eau 1 000 ml
5.3.3.1.2 Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau, en chauffant si nécessaire. Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’il
soit, après stérilisation, de 6,9 ± 0,1. Répartir 3 ml de milieu VP dans chacun des tubes (6.9). Stériliser à
l’autoclave (6.1) réglé à 115 °C pendant 20 min.
5.3.3.2 Solution de créatine (N-amidinosarcosine)
5.3.3.2.1 Composition
Créatine monohydratée 0,5 g
Eau 100 ml
5.3
...
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