ISO/TS 15495:2010

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 15495
IDF/RM
230
First edition
2010-11-01

Milk, milk products and infant formulae —
Guidelines for the quantitative
determination of melamine and cyanuric
acid by LC-MS/MS
Lait, produits laitiers et formules infantiles — Lignes directrices pour la
détermination quantitative de la mélamine et de l'acide cyanurique par
CL-SM/SM




Reference numbers
ISO/TS 15495:2010(E)
IDF/RM 230:2010(E)
©
ISO and IDF 2010

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ISO/TS 15495:2010(E)
IDF/RM 230:2010(E)
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IDF/RM 230:2010(E)
Contents Page
Foreword .iv
Foreword .v
1 Scope.1
2 Normative references.1
3 Terms and definitions .1
4 Principle .2
5 Sampling .2
6 Preparation of test sample .2
7 Procedure.2
7.1 LC-MS/MS analysis — Chromatography.2
7.2 LC-MS/MS analysis — Mass spectrometry.3
8 Performance criteria.3
8.1 General .3
8.2 Minimum required sensitivity.3
8.3 Trueness and recovery .3
8.4 Repeatability .3
8.5 Within-laboratory reproducibility.3
9 Test report.4
Annex A (informative) Example A — Cow milk and milk-based infant formula — Simultaneous
quantitative determination of melamine and cyanuric acid by liquid chromatography
electrospray ionization tandem mass spectrometry .5
Annex B (informative) Example B — Quantitative analysis of melamine and cyanuric acid in milk-
based infant formula and cow milk by liquid chromatography using linear ion-trap mass
spectrometry.19
Bibliography.29

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ISO/TS 15495:2010(E)
IDF/RM 230:2010(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has
been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a
technical committee may decide to publish other types of document:
— an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) represents an agreement between technical experts in
an ISO working group and is accepted for publication if it is approved by more than 50 % of the members
of the parent committee casting a vote;
— an ISO Technical Specification (ISO/TS) represents an agreement between the members of a technical
committee and is accepted for publication if it is approved by 2/3 of the members of the committee casting
a vote.
An ISO/PAS or ISO/TS is reviewed after three years in order to decide whether it will be confirmed for a
further three years, revised to become an International Standard, or withdrawn. If the ISO/PAS or ISO/TS is
confirmed, it is reviewed again after a further three years, at which time it must either be transformed into an
International Standard or be withdrawn.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 15495⎪IDF/RM 230 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee
SC 5, Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO
and IDF.
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ISO/TS 15495:2010(E)
IDF/RM 230:2010(E)
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit organization representing the dairy sector worldwide.
IDF membership comprises National Committees in every member country as well as regional dairy
associations having signed a formal agreement on cooperation with IDF. All members of IDF have the right to
be represented on the IDF Standing Committees carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO in
the development of standard methods of analysis and sampling for milk and milk products.
The main task of Standing Committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the Standing Committees are circulated to the National Committees for endorsement prior to
publication as an International Standard. Publication as an International Standard requires approval by at least
50 % of IDF National Committees casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a
Standing Committee may decide to publish an other type of normative document which is called by IDF:
Reviewed method. Such a method represents an agreement between the members of a Standing Committee
and is accepted for publication if it is approved by at least 50 % of the committee members casting a vote.
A Reviewed method is equal to an ISO/PAS or ISO/TS and will, therefore, also be published jointly under ISO
conditions.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 15495⎪IDF/RM 230 was prepared by the International Dairy Federation (IDF) and Technical
Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is being published
jointly by IDF and ISO.
All work was carried out by a Joint Project Group on Determination of melamine of the Standing Committee on
Analytical methods for additives and contaminants under the aegis of its project leaders, Dr S.E. Holroyd (NZ)
and Dr T. Delatour (CH).

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ISO/TS 15495:2010(E)
TECHNICAL SPECIFICATION
IDF/RM 230:2010(E)

Milk, milk products and infant formulae — Guidelines for the
quantitative determination of melamine and cyanuric acid by
LC-MS/MS
1 Scope
This Technical Specification gives guidance for the quantitative determination of melamine and cyanuric acid
content in milk, powdered milk products, and infant formulae by electrospray ionization liquid chromatography
tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).
NOTE Examples of LC-MS/MS methods are given in Annexes A and B.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 3534 (all parts), Statistics — Vocabulary and symbols
ISO 5725-1, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results — Part 1: General
principles and definitions
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 3534, ISO 5725-1, and the following
apply.
3.1
melamine content
mass fraction of substance determined by the procedures specified in this Technical Specification
NOTE The melamine content is expressed in milligrams per kilogram of product.
3.2
cyanuric acid content
mass fraction of substance determined by the procedures specified in this Technical Specification
NOTE The cyanuric content is expressed in milligrams per kilogram of product.
3.3
maximum limit
ML
maximum content of either melamine or cyanuric acid permitted or acceptable in milk, powdered milk products
or infant formulae
NOTE The ML can either be a nationally or internationally stated limit or a defined level of concern.
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ISO/TS 15495:2010(E)
IDF/RM 230:2010(E)
4 Principle
The sample is made homogenous and optionally reconstituted in the case of powdered samples. A suitable
solvent is added to the test sample to precipitate proteins from the matrix and to extract melamine and
cyanuric acid. After centrifugation, an aliquot of the supernatant is analysed by LC-MS/MS.
For the purposes of this Technical Specification, LC-MS/MS designates any method combining either
high-performance liquid chromatography (HPLC) or ultra-performance liquid chromatography (UPLC), with
either triple quadrupole or ion-trap mass spectrometric detection. Chromatographic separation is based on
hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) to ensure good separation of melamine and cyanuric
acid. Ionization of the substance is accomplished by electrospray ionization (ESI) and detection operates in
the selected reaction monitoring (SRM) mode.
NOTE Other ionization techniques with sufficient performance can be used. Other mass analysers can be used as
long as they comply with the performance criteria (identification points) in 2002/657/EC (Reference [8]).
Quantification of both melamine and cyanuric acid is based on isotope dilution using stable isotope internal
standards for both analytes.
5 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this Technical Specification. A recommended sampling method
[1]
is given in ISO 707⎪IDF 50 .
It is important the laboratory receive a truly representative sample which has not been damaged or changed
during transport or storage.
6 Preparation of test sample
The mass of the test sample for analysis or optional reconstitution should be representative of the product and
should be appropriate to allow effective extraction of the target analytes.
Isotope-labelled standards should be spiked directly to the dry or wet sample in the first step of analysis.
Concentration of internal standards added should be of the same order of magnitude as that of interest for
melamine and cyanuric acid. Extraction may be done with a minimum of 5 ml of extraction solvent per gram of
sample material, to give a final percentage mass fraction of organic solvent in the extraction mixture of at least
70 %. Extraction should take place for at least 5 min by either vigorous shaking or a combination of
ultrasonification and vortexing. The sample should then be centrifuged under appropriate conditions and
filtered through a syringe filter.
Any alternative is acceptable as long as performance criteria and validation match the requirements specified
in this Technical Specification.
7 Procedure
7.1 LC-MS/MS analysis — Chromatography
Perform the liquid chromatographic separation using a column dedicated to this purpose.
The minimum acceptable retention time for melamine and cyanuric acid shall be twice the retention time
corresponding to the void volume of the column. The retention time in the sample extract shall match that of
the calibration standard within a specified retention time window.
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IDF/RM 230:2010(E)
The ratio of the relative retention time of the analyte to that of the internal standard shall correspond to that of
calibration standards to within ±2,5 %.
7.2 LC-MS/MS analysis — Mass spectrometry
Mass spectrometric detection of melamine and cyanuric acid shall be carried out preferably by employing a
triple quadropole LC-MS/MS instrument.
Quantitative determination and identification shall be achieved in SRM mode. When using a triple quadropole
instrument for each compound, a minimum of two mass transitions shall be used for the detection of the
analyte, while at least one shall be used for the internal standard. However, it is also recommended that two
mass transitions be monitored for the internal standard.
The most appropriate transition (most intense) shall be used for quantification (quantifier), and the second one
for confirmation (qualifier). The ratio of qualifier intensity to quantifier intensity (Rq/Q) shall be checked and
tolerance criteria applied depending on the value of Rq/Q (Table 1).
Table 1 — Maximum permitted relative tolerance for ratio
of qualifier intensity to quantifier intensity (Rq/Q)
Rq/Q Tolerance
(% of quantifer) (relative in %)
>50 ±20
>20 to 50 ±25
>10 to 20 ±30
u10 ±50
8 Performance criteria
8.1 General
Each laboratory should validate the implemented method to demonstrate fitness for purpose. The procedure
specified in EU Commission Decision 2002/657/EC (Reference [8]) is recommended for validation. Maximum
and minimum limits for performance characteristics, as adopted from this procedure, are defined in 8.2 and
8.5.
8.2 Minimum required sensitivity
The required limit of quantification (LoQ) should at least be 10-fold lower than the maximum limit (ML) to
ensure reliable quantification at ML.
8.3 Trueness and recovery
Following this guideline, trueness and recovery are typically between 95 % and 105 %. For acceptance of
analytical methods, trueness and recovery shall fall between 80 % and 110 %.
8.4 Repeatability
The coefficient of variation of repeatability is typically 3 % to 6 %, with limit <15 %.
8.5 Within-laboratory reproducibility
The coefficient of variation of within-laboratory reproducibility is typically 5 % to 10 %, with limit <15 %.
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IDF/RM 230:2010(E)
9 Test report
The test report shall contain at least the following information:
a) all information necessary for the complete identification of the sample;
b) the sampling method used, if known;
c) the test method used, together with reference to this Technical Specification
(ISO/TS 15495⎪IDF/RM 230:2010);
d) all operating details not specified in this Technical Specification, or regarded as optional, together with
details of any incidents which may have influenced the test result(s);
e) the test result(s) obtained;
f) if the repeatability has been checked, the final quoted result obtained.
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IDF/RM 230:2010(E)
Annex A
(informative)

Example A — Cow milk and milk-based infant formula — Simultaneous
quantitative determination of melamine and cyanuric acid by liquid
chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry
A.1 Scope
This annex specifies an in-house validated method for the quantitative determination of melamine and
cyanuric acid contents in cow milk (CM) and milk-based powdered infant formula (PIF) by electrospray
ionization liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) using the selected reaction
monitoring (SRM) mode.
The positive identification of melamine and cyanuric acid in the sample is conducted according to the
confirmation criteria defined in EU Commission Decision 2002/657/EC (Reference [8]).
13 15
The quantification is performed by an isotopic dilution approach using labelled ( C , N )-melamine and
3 3
13 15
labelled ( C , N )-cyanuric acid as internal standards (ISs). For technical details, validation data and
3 3
proficiency-test results, see Reference [10].
The method allows an accurate quantification at the following reporting limits and higher:
a) melamine and cyanuric acid contents in CM at levels of 0,05 mg/kg and 0,10 mg/kg, respectively.
b) melamine and cyanuric acid contents in PIF at levels of 0,05 mg/kg and 0,10 mg/kg, respectively.
c) melamine and cyanuric acid contents in PIF at a level of 1,00 mg/kg.
A.2 Terms and definitions
See Clause 3.
A.3 Principle
The analytical procedure encompasses a dilution of the sample in an acetonitrile:water solution, leading to the
precipitation of proteins and allowing melamine and cyanuric acid to be extracted at the same time. After
centrifugation, the supernatant is analysed by LC-MS/MS in SRM mode, operating in both positive and
negative ionization mode. The polarity switching is done within the same run.
A.4 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled or demineralized
water or water of equivalent purity.
NOTE CAS numbers are given for each reagent.
Before using chemicals, refer to adequate manuals or safety data sheets approved by your local authorities.
A.4.1 Water, for chromatography use (CAS No. 7732-18-5).
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ISO/TS 15495:2010(E)
IDF/RM 230:2010(E)
A.4.2 Acetonitrile (CH CN), gradient grade for liquid chromatography (CAS No. 75-05-8).
3
A.4.3 Ammonium acetate (CH COONH ), GR for analysis (CAS No. 631-61-8).
3 4
A.4.4 Cyanuric acid (CNOH) , >98 % mass fraction (CAS No. 108-80-5).
3
A.4.4.1 Cyanuric acid stock standard solution, corresponding to 0,25 mg of cyanuric acid per millilitre.
Weigh, to the nearest 0,1 mg, 63,8 mg of cyanuric acid (A.4.4) into a 250 ml one-mark volumetric flask
(A.5.12), making appropriate correction for any impurity as per the certificate of analysis. Dissolve and make
up to the mark with water (A.4.1). Sonificate for at least 15 min until complete dissolution.
Store the cyanuric acid stock standard solution at room temperature away from light. Prepare a fresh stock
standard solution weekly.
A.4.4.2 Cyanuric acid working solution I, corresponding to 20 µg of cyanuric acid per millilitre.
Pipette 4 ml of the cyanuric acid stock standard solution (A.4.4.1) into a 50 ml one-mark volumetric
flask (A.5.12). Make up to the mark with water (A.4.1) and mix. Store the cyanuric acid working solution I at
room temperature away from light. Prepare a fresh working solution I weekly.
A.4.4.3 Cyanuric acid working solution II, corresponding to 2 µg of cyanuric acid per millilitre.
Pipette 1 ml of the cyanuric acid working solution I (A.4.4.2) into a 10 ml one-mark volumetric flask (A.5.12).
Make up to mark with water (A.4.1) and mix. Store the cyanuric acid working solution II at room temperature
away from light. Prepare a fresh working solution II weekly.
A.4.4.4 Cyanuric acid working solution III, corresponding to 200 ng of cyanuric acid per millilitre.
Pipette 0,5 ml of the cyanuric acid working solution I (A.4.4.2) into a 50 ml one-mark volumetric flask (A.5.12).
Make up to mark with water (A.4.1) and mix. Store cyanuric acid working solution III at room temperature
away from light. Prepare a fresh working solution III weekly.
13 15 13 15
A.4.5 Labelled cyanuric acid ( C H N O ), isotopic purity: C = 99 %; ring N > 98 %; chemical
3 3 3 3 3 3
purity 90 % mass fraction, 100 µg/ml in water −1,2 ml.
A.4.5.1 Labelled cyanuric acid stock standard solution, corresponding to 100 µg of labelled cyanuric
acid per millilitre.
Ready-to-use labelled cyanuric acid stock standard solution is commercially available. Store at room
temperature away from light.
Use the same batch of IS for both making the calibration standard solutions in A.6.2 and spiking the extracts
as described in the extraction procedure (A.9.1).
A.4.5.2 Labelled cyanuric acid working solution I, corresponding to 20 µg of labelled cyanuric acid per
millilitre.
Pipette 1 ml of the labelled cyanuric acid stock standard solution (A.4.5.1) into a 5 ml one-mark volumetric
flask (A.5.12). Make up to mark with water (A.4.1) and mix. Store the labelled cyanuric acid working solution I
at room temperature away from light.
A.4.5.3 Labelled cyanuric acid working solution II, corresponding to 2 µg of labelled cyanuric acid per
millilitre.
Pipette 0,5 ml of the labelled cyanuric acid working solution I (A.4.5.2) into a 5 ml one-mark volumetric
flask (A.5.12). Make up to mark with water (A.4.1) and mix. Store the labelled cyanuric acid working solution II
at room temperature away from light.
6 © ISO and IDF 2010 – All rights reserved

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ISO/TS 15495:2010(E)
IDF/RM 230:2010(E)
A.4.5.4 Labelled cyanuric acid working solution III, corresponding to 200 ng of labelled cyanuric acid
per millilitre.
Pipette 0,5 ml of the labelled cyanuric acid working solution I (A.4.5.2) into a 50 ml one-mark volumetric
flask (A.5.12). Make up to mark with water (A.4.1) and mix. Store the labelled cyanuric acid working solution III
at room temperature away from light.
A.4.6 Melamine (C H N ), >99 % mass fraction (CAS No. 108-78-1).
3 6 6
A.4.6.1 Melamine stock standard solution, corresponding to 0,25 mg of melamine per millilitre.
Weigh, to the nearest 0,1 mg, 62,5 mg of melamine (A.4.6) into a 250 ml one-mark volumetric flask (A.5.12).
Dissolve and make up to the mark with water (A.4.1). Sonificate for at least 15 min until complete dissolution.
Store at room temperature away from light. Prepare a fresh stock solution weekly.
A.4.6.2 Melamine working solution I, corresponding to 20 µg of melamine per millilitre.
Pipette 4 ml of the melamine stock standard solution (A.4.6.1) into a 50 ml one-mark volumetric flask (A.5.12).
Make up to mark with water (A.4.1) and mix. Store the melamine working solution I at room temperature away
from light. Prepare a fresh working solution I weekly.
A.4.6.3 Melamine working solution II, corresponding to 2 µg of melamine per millilitre.
Pipette 1 ml of the melamine working solution I (A.4.6.2) into a 10 ml one-mark volumetric flask (A.5.12). Make
up to mark with water (A.4.1) and mix. Store the melamine working solution II at room temperature away from
light. Prepare a fresh working solution II weekly.
A.4.6.4 Melamine working solution III, corresponding to 200 ng of melamine per millilitre.
Pipette 0,5 ml of the melamine working solution I (A.4.6.2) into a 50 ml one-mark volumetric flask (A.5.12).
Make up to mark with water (A.4.1) and mix. Store the melamine working solution III at room temperature
away from light. Prepare a fresh working solution weekly.
13 15 13 15
A.4.7 Labelled melamine [ C N ( NH ) ], isotopic purity: C = 99 %; amino- N = 98 %; chemical
3 3 2 3 3 3
1)
purity W98 % mass fraction, 100 µg/ml water −1,2 ml, e.g. CNLM-8150-1.2 .
A.4.7.1 Labelled melamine stock solution, corresponding to 10 µg of labelled melamine per millilitre.
Labelled melamine stock solution is available commercially. Store at room temperature away from light. Use
the same batch of the IS for both making the calibration solutions in A.6.2 and spiking the extracts as
described in the extraction procedure (A.9.1).
A.4.7.2 Labelled melamine working solution I, corresponding to 20 µg of labelled melamine per
millilitre.
Pipette 1 ml of the labelled melamine stock solution (A.4.7.1) into a 5 ml one-mark volumetric flask (A.5.12).
Make up to mark with water (A.4.1) and mix. Store the labelled melamine working solution I at room
temperature away from light.
A.4.7.3 Labelled melamine working solution II, corresponding to 2 µg of labelled melamine per millilitre.
Pipette 0,5 ml of the labelled melamine working solution I (A.4.7.2) into a 5 ml one-mark volumetric
flask (A.5.12). Make up to mark with water (A.4.1) and mix. Store the labelled melamine working solution II at
room temperature away from light.

1) CNLM-8150-1.2 is the trade name of a product supplied by Cambridge Isotope Laboratories. This information is given
for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of this product.
Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
© ISO and IDF 2010 – All rights reserved 7

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ISO/TS 15495:2010(E)
IDF/RM 230:2010(E)
A.4.7.4 Labelled melamine working solution III, corresponding to 200 ng of labelled melamine per
millilitre.
Pipette 0,5 ml of the labelled melamine working solution I (A.4.7.2) into a 50 ml one-mark volumetric
flask (A.5.12). Make up to mark with water (A.4.1) and mix. Store the labelled melamine working solution III at
room temperature away from light.
A.5 Apparatus
Glassware (e.g. volumetric flasks, A.5.12) used for the preparation of the standard stock and working
solutions can be contaminated, especially with melamine, and should be cleaned by the following procedure:
a) use warm tap water and laboratory detergent for manual washing of glassware;
b) manually clean glassware using a laboratory brush;
c) thoroughly rinse all glassware including stoppers with warm tap water followed by three rinses with
distilled water;
d) rinse the glassware with ethanol and allow the glassware to dry in air.
Use usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
A.5.1 Conical tubes, polypropylene, of capacity 50 ml.
A.5.2 Centrifuge, equipped with a rotor, adapted for tubes of 50 ml, with acceleration of 4 000g.
[2]
A.5.3 Volumetric pipettes, of capacities 0,5 ml, 1 ml, and 4 ml, ISO 835 , class A (or AS).
[6]
A.5.
...

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 15495
FIL/MR
230
Première édition
2010-11-01


Lait, produits laitiers et formules
infantiles — Lignes directrices pour la
détermination quantitative de la mélamine
et de l'acide cyanurique par CL-SM/SM
Milk, milk products and infant formulae — Guidelines for the quantitative
determination of melamine and cyanuric acid by LC-MS/MS




Numéros de référence
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quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
soit de l'ISO soit de la FIL, à l'une ou l'autre des adresses ci-après.
ISO copyright office Fédération Internationale de Laiterie
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20 Diamant Building • Boulevard Auguste Reyers 80 • B-1030 Bruxelles
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ISO/TS 15495:2010(F)
FIL/MR 230:2010(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Avant-propos .v
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives.1
3 Termes et définitions .1
4 Principe .2
5 Échantillonnage.2
6 Préparation de l'échantillon pour essai .2
7 Mode opératoire.3
7.1 Analyse CL-SM/SM — Chromatographie .3
7.2 Analyse CL-SM/SM — Spectrométrie de masse .3
8 Critères de performance.3
8.1 Généralités .3
8.2 Sensibilité minimale requise .3
8.3 Exactitude et recouvrement .4
8.4 Répétabilité .4
8.5 Reproductibilité interlaboratoires.4
9 Rapport d'essai.4
Annexe A (informative) Exemple A — Lait de vache et formule infantile à base de lait —
Détermination quantitative simultanée de la teneur en mélamine et en acide cyanurique
par chromatographie en phase liquide avec ionisation par électrospray et spectrométrie
de masse en tandem .5
Annexe B (informative) Exemple B — Analyse quantitative de la mélamine et de l'acide
cyanurique dans une formule infantile à base de lait et dans du lait de vache par
chromatographie en phase liquide à l'aide de la spectrométrie de masse à piège ionique
linéaire .20
Bibliographie.31

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ISO/TS 15495:2010(F)
FIL/MR 230:2010(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
Dans d'autres circonstances, en particulier lorsqu'il existe une demande urgente du marché, un comité
technique peut décider de publier d'autres types de documents:
⎯ une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts dans
un groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 % des
membres votants du comité dont relève le groupe de travail;
⎯ une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d'un comité technique
et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.
Une ISO/PAS ou ISO/TS fait l'objet d'un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour trois
nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu'une ISO/PAS ou
ISO/TS a été confirmée, elle fait l'objet d'un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa
transformation en Norme internationale soit de son annulation.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO/TS 15495⎪FIL/MR 230 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de Laiterie (FIL). Elle est publiée
conjointement par l'ISO et la FIL.

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ISO/TS 15495:2010(F)
FIL/MR 230:2010(F)
Avant-propos
La FIL (Fédération Internationale de Laiterie) est une organisation sans but lucratif représentant le secteur
laitier mondial. Les membres de la FIL se composent des Comités Nationaux dans chaque pays membre et
des associations laitières régionales avec lesquelles la FIL a signé des accords de coopération. Tout membre
de la FIL a le droit de faire partie des Comités permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux
techniques. La FIL collabore avec l'ISO pour l'élaboration de méthodes normalisées d'analyse et
d'échantillonnage pour le lait et les produits laitiers.
La tâche principale des Comités permanents est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de
Normes internationales adoptés par les Comités permanents sont soumis aux Comités Nationaux pour
approbation avant publication en tant que Norme internationale. La publication comme Norme internationale
requiert l'approbation de 50 % au moins des Comités Nationaux de la FIL votants.
Dans d'autres circonstances, particulièrement quand une demande urgente du marché survient pour de tels
documents, un Comité permanent peut décider de publier un autre type de document à valeur de norme que
la FIL appelle Méthode révisée. Une telle méthode illustre un consensus entre les membres d'un Comité
permanent et est acceptée pour publication si elle est approuvée par au moins 50 % des Comités Nationaux
émettant un vote. Une Méthode révisée est équivalente à une ISO/PAS ou à une ISO/TS et sera donc aussi
publiée conjointement selon les conditions ISO.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO/TS 15495⎪FIL/MR 230 a été élaborée par la Fédération Internationale de Laiterie (FIL) et le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Elle est publiée
conjointement par la FIL et l'ISO.
L'ensemble des travaux a été réalisé par un Groupe de projet mixte sur la Détermination de la mélamine du
Comité permanent sur les Méthodes d'analyse pour les additifs et les contaminants sous la conduite de ses
chefs de projet, Dr S.E. Holroyd (NZ) et Dr T. Delatour (CH).

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SPÉCIFICATION TECHNIQUE
FIL/MR 230:2010(F)

Lait, produits laitiers et formules infantiles — Lignes directrices
pour la détermination quantitative de la mélamine et de l'acide
cyanurique par CL-SM/SM
1 Domaine d'application
La présente Spécification technique fournit des lignes directrices pour la détermination quantitative de la
teneur en mélamine et en acide cyanurique dans le lait, les produits laitiers en poudre et les formules
infantiles par chromatographie en phase liquide avec ionisation par électrospray et spectrométrie de masse
en tandem (CL-SM/SM).
NOTE Des exemples de méthodes CL-SM/SM sont donnés dans les Annexes A et B.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 3534 (toutes les parties), Statistique — Vocabulaire et symboles
ISO 5725-1, Exactitude (justesse et fidélité) des résultats et méthodes de mesure — Partie 1: Principes
généraux et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l'ISO 3534 et l'ISO 5725-1, ainsi
que les suivants s'appliquent.
3.1
teneur en mélamine
fraction massique de substance déterminée par les modes opératoires spécifiés dans la présente
Spécification technique
NOTE La teneur en mélamine est exprimée en milligrammes par kilogramme de produit.
3.2
teneur en acide cyanurique
fraction massique de substance déterminée par les modes opératoires spécifiés dans la présente
Spécification technique
NOTE La teneur en acide cyanurique est exprimée en milligrammes par kilogramme de produit.
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ISO/TS 15495:2010(F)
FIL/MR 230:2010(F)
3.3
limite maximale
LM
teneur maximale en mélamine ou en acide cyanurique autorisée ou acceptable dans le lait, les produits
laitiers en poudre ou les formules infantiles
NOTE La LM peut être une limite spécifiée nationalement ou internationalement ou un seuil de danger défini.
4 Principe
L'échantillon est homogénéisé et facultativement reconstitué en cas d'échantillons pulvérulents. Un solvant
approprié est ajouté à l'échantillon pour essai pour précipiter les protéines de la matrice et extraire la
mélamine et l'acide cyanurique. Après centrifugation, une aliquote du surnageant est analysée par CL-SM/SM.
Pour les besoins de la présente Spécification technique, le terme CL-SM/SM désigne toute méthode
combinant soit la chromatographie liquide haute performance (CLHP) soit la chromatographie liquide
ultraperformance (CLUP) et la détection spectrométrique de masse triple quadripôle ou à piège ionique. La
séparation chromatographique s'appuie sur la chromatographie liquide d'interaction hydrophile (CLIH) pour
garantir une bonne séparation de la mélamine et de l'acide cyanurique. L'ionisation de la substance est
effectuée par ionisation par électrospray (IES) et la détection est réalisée en mode SRM («selected reaction
monitoring»).
NOTE D'autres techniques d'ionisation suffisamment performantes peuvent être utilisées. D'autres analyseurs de
masse peuvent être utilisés à condition qu'ils remplissent les critères de performance (points d'identification) de la
décision 2002/657/CE (Référence [8]).
La quantification de la mélamine et de l'acide cyanurique repose sur la dilution isotopique utilisant des étalons
internes isotopiques stables pour les deux analytes.
5 Échantillonnage
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Spécification technique. Une
[1]
.
méthode d'échantillonnage recommandée est donnée dans l'ISO 707⎪FIL 50
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié
lors du transport ou de l'entreposage.
6 Préparation de l'échantillon pour essai
Il convient que la masse de l'échantillon pour essai destiné à être analysé ou soumis à la reconstitution
facultative soit représentative du produit et appropriée à l'extraction efficace des analytes cibles.
Lors de la première étape d'analyse, il convient de supplémenter directement les étalons isotopiques marqués
dans l'échantillon sec ou humide.
Il convient que la concentration en étalons internes ajoutés soit du même ordre de grandeur que celui étudié
pour la mélamine et l'acide cyanurique. L'extraction peut être effectuée avec au moins 5 ml de solvant
d'extraction par gramme de matériau échantillon afin de donner une fraction massique finale de solvant
organique en pourcentage dans le mélange d'extraction d'au moins 70 %. Il convient que l'extraction dure au
moins 5 min en agitant énergiquement ou en combinant passage aux ultrasons et passage au vortex. Il
convient ensuite de centrifuger l'échantillon dans des conditions appropriées et de le filtrer à l'aide d'un filtre
pour seringue.
Toute autre alternative est acceptable à condition que les critères de performance et de validation soient
conformes aux exigences spécifiées dans la présente Spécification technique.
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FIL/MR 230:2010(F)
7 Mode opératoire
7.1 Analyse CL-SM/SM — Chromatographie
Effectuer la séparation par chromatographie liquide à l'aide d'une colonne réservée à cet effet.
Le temps de rétention minimal acceptable pour la mélamine et l'acide cyanurique doit être deux fois supérieur
au temps de rétention correspondant au volume mort de la colonne. Le temps de rétention dans l'extrait
d'échantillon doit correspondre à celui de l'étalon dans une plage de temps de rétention spécifiée.
Le rapport du temps de rétention relatif de l'analyte à celui de l'étalon interne doit correspondre à celui des
étalons, avec une tolérance de ±2,5 %.
7.2 Analyse CL-SM/SM — Spectrométrie de masse
La détection spectrométrique de masse de la mélamine et de l'acide cyanurique doit être effectuée en utilisant
de préférence un instrument CL-SM/SM triple quadripôle.
La détermination quantitative et l'identification doivent être réalisées en mode SRM. Lorsqu'un instrument
triple quadripôle est utilisé pour chaque composé, au moins deux transitions de masse doivent être
employées pour la détection de l'analyte, alors qu'au moins une seule doit être utilisée pour l'étalon interne.
Toutefois, il est également recommandé d'enregistrer deux transitions de masse pour l'étalon interne.
La transition la plus appropriée (la plus intense) doit être utilisée pour la quantification (quantificateur) et la
deuxième pour la confirmation (qualificateur). Le rapport intensité du qualificateur sur intensité du
quantificateur (Rq/Q) doit être contrôlé et des critères de tolérance doivent être appliqués en fonction de la
valeur de Rq/Q (Tableau 1).
Tableau 1 — Tolérance relative autorisée maximale pour le rapport intensité
du qualificateur sur intensité du quantificateur (Rq/Q)
Rq/Q Tolérance
(% de quantificateur) (relative, en %)
> 50 ±20
> 20 à 50 ±25
> 10 à 20 ±30
u 10
±50
8 Critères de performance
8.1 Généralités
Il convient que chaque laboratoire valide la méthode mise en place afin de démontrer son adéquation avec les
objectifs. Le mode opératoire de validation spécifié dans la décision 2002/657/CE (Référence [8]) de la
Commission européenne est recommandé. Les limites maximale et minimale pour les caractéristiques de
performance adoptées de ce mode opératoire sont définies de 8.2 à 8.5.
8.2 Sensibilité minimale requise
Il convient que la limite de quantification (LQ) requise soit au moins 10 fois inférieure à la limite maximale (LM)
de façon à garantir une quantification fiable au niveau de la LM.
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FIL/MR 230:2010(F)
8.3 Exactitude et recouvrement
D'après cette ligne directrice, l'exactitude et le recouvrement seront en général compris entre 95 % et 105 %.
Pour que les méthodes d'analyse soient acceptées, l'exactitude et le recouvrement doivent être compris entre
80 % et 110 %.
8.4 Répétabilité
Le coefficient de variation de la répétabilité est en général de 3 % à 6 %, avec une limite <15 %.
8.5 Reproductibilité interlaboratoires
Le coefficient de variation de la reproductibilité interlaboratoires est en général de 5 % à 10 %, avec une limite
<15 %.
9 Rapport d'essai
Le rapport d'essai doit contenir au moins les informations suivantes:
a) toutes les informations nécessaires à l'identification complète de l'échantillon;
b) la méthode d'échantillonnage utilisée, si elle est connue;
c) la méthode d'essai utilisée, ainsi qu'une référence à la présente Spécification technique
(ISO/TS 15495⎪FIL/MR 230:2010);
d) tous les détails opératoires non spécifiés dans la présente Spécification technique, ou considérés comme
facultatifs, ainsi que les incidents susceptibles d'avoir influencé le(s) résultat(s) d'essai;
e) le(s) résultat(s) d'essai obtenu(s);
f) si la répétabilité a été vérifiée, le résultat final cité qui a été obtenu.

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Annexe A
(informative)

Exemple A — Lait de vache et formule infantile à base de lait —
Détermination quantitative simultanée de la teneur en mélamine et en
acide cyanurique par chromatographie en phase liquide avec ionisation
par électrospray et spectrométrie de masse en tandem
A.1 Domaine d'application
La présente annexe spécifie une méthode validée en interne pour la détermination quantitative des teneurs en
mélamine et en acide cyanurique dans le lait de vache (LV) et les formules infantiles en poudre (FIP) à base
de lait par chromatographie en phase liquide avec ionisation par électrospray et spectrométrie de masse en
tandem (CL-SM/SM) en utilisant le mode SRM («selected reaction monitoring»).
L'identification positive de la mélamine et de l'acide cyanurique dans l'échantillon est effectuée d'après les
critères de confirmation définis dans la décision 2002/657/CE (Référence [8]) de la Commission européenne.
La quantification est effectuée à l'aide d'une approche de dilution isotopique utilisant de la mélamine marquée
13 15 13 15
au ( C , N ) et de l'acide cyanurique marqué au ( C , N ) comme étalons internes (EI). Pour obtenir
3 3 3 3
des informations techniques, des données de validation ainsi que des résultats de l'essai d'aptitude, voir la
Référence [10].
La méthode permet d'effectuer une quantification précise aux limites de rapport suivantes et supérieures:
a) teneurs en mélamine et en acide cyanurique dans le LV à des taux de 0,05 mg/kg et 0,10 mg/kg,
respectivement;
b) teneurs en mélamine et en acide cyanurique dans la FIP à des taux de 0,05 mg/kg et 0,10 mg/kg,
respectivement;
c) teneurs en mélamine et en acide cyanurique dans la FIP à un taux de 1,00 mg/kg.
A.2 Termes et définitions
Voir l'Article 3.
A.3 Principe
Le mode opératoire d'analyse inclut une dilution de l'échantillon dans une solution d'acétonitrile et d'eau,
laquelle provoque la précipitation des protéines et l'extraction simultanée de la mélamine et de l'acide
cyanurique. Après centrifugation, le surnageant est analysé par CL-SM/SM en mode SRM, avec ionisation
positive et négative. La commutation de polarité est effectuée simultanément.
A.4 Réactifs
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l'eau distillée
ou déminéralisée ou de l'eau de pureté équivalente.
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NOTE Des numéros CAS sont donnés pour chaque réactif.
Avant d'utiliser des produits chimiques, se reporter aux manuels appropriés ou aux fiches de données de
sécurité approuvées par vos autorités locales.
A.4.1 Eau, pour chromatographie (n° CAS: 7732-18-5).
A.4.2 Acétonitrile (CH CN), qualité gradient pour chromatographie en phase liquide (n° CAS: 75-05-8).
3
A.4.3 Acétate d'ammonium (CH COONH ), GR pour analyse (n° CAS: 631-61-8).
3 4
A.4.4 Acide cyanurique [(CNOH) ], fraction massique >98 % (n° CAS: 108-80-5).
3
A.4.4.1 Solution mère étalon d'acide cyanurique, correspondant à 0,25 mg d'acide cyanurique par
millilitre.
Peser, à 0,1 mg près, 63,8 mg d'acide cyanurique (A.4.4) dans une fiole jaugé à un trait de 250 ml (A.5.12) en
effectuant une correction appropriée des impuretés, conformément au certificat d'analyse. Dissoudre et
compléter au volume avec de l'eau (A.4.1). Passer aux ultrasons pendant au moins 15 min jusqu'à dissolution
complète.
Conserver la solution mère étalon d'acide cyanurique à température ambiante et à l'abri de la lumière.
Préparer une nouvelle solution mère étalon chaque semaine.
A.4.4.2 Solution de travail d'acide cyanurique I, correspondant à 20 µg d'acide cyanurique par millilitre.
Transférer à la pipette 4 ml de la solution mère étalon d'acide cyanurique (A.4.4.1) dans une fiole jaugée à un
trait de 50 ml (A.5.12). Compléter au volume avec de l'eau (A.4.1) et mélanger. Conserver la solution de
travail d'acide cyanurique I à température ambiante et à l'abri de la lumière. Préparer une nouvelle solution de
travail I chaque semaine.
A.4.4.3 Solution de travail d'acide cyanurique II, correspondant à 2 µg d'acide cyanurique par millilitre.
Transférer à la pipette 1 ml de la solution de travail d'acide cyanurique I (A.4.4.2) dans une fiole jaugée de
10 ml à un trait (A.5.12). Compléter au volume avec de l'eau (A.4.1) et mélanger. Conserver la solution de
travail d'acide cyanurique II à température ambiante et à l'abri de la lumière. Préparer une nouvelle solution
de travail II chaque semaine.
A.4.4.4 Solution de travail d'acide cyanurique III, correspondant à 200 ng d'acide cyanurique par
millilitre.
Transférer à la pipette 0,5 ml de la solution de travail d'acide cyanurique I (A.4.4.2) dans une fiole jaugée à un
trait de 50 ml (A.5.12). Compléter au volume avec de l'eau (A.4.1) et mélanger. Conserver la solution de
travail d'acide cyanurique III à température ambiante et à l'abri de la lumière. Préparer une nouvelle solution
de travail III chaque semaine.
13 15 13 15
C H N O ), pureté isotopique: C = 99 %; cycle N > 98 %;
A.4.5 Acide cyanurique marqué (
3 3 3 3 3 3
pureté chimique = 90 % en fraction massique, 100 µg/ml dans l'eau −1,2 ml.
A.4.5.1 Solution mère étalon d'acide cyanurique marqué, correspondant à 100 µg d'acide cyanurique
marqué par millilitre.
Une solution mère étalon d'acide cyanurique marquée prête à l'emploi est disponible dans le commerce.
Conserver à température ambiante et à l'abri de la lumière.
Utiliser le même lot d'étalons isotopiques pour préparer les solutions d'étalonnage en A.6.2 et pour
supplémenter les extraits comme décrit dans le mode opératoire d'extraction (A.9.1).
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FIL/MR 230:2010(F)
A.4.5.2 Solution de travail d'acide cyanurique marqué I, correspondant à 20 µg d'acide cyanurique
marqué par millilitre.
Transférer à la pipette 1 ml de la solution mère étalon d'acide cyanurique marqué (A.4.5.1) dans une fiole
jaugée à un trait de 5 ml (A.5.12). Compléter au volume avec de l'eau (A.4.1) et mélanger. Conserver la
solution de travail d'acide cyanurique marqué I à température ambiante et à l'abri de la lumière.
A.4.5.3 Solution de travail d'acide cyanurique marqué II, correspondant à 2 µg d'acide cyanurique
marqué par millilitre.
Transférer à la pipette 0,5 ml de la solution de travail d'acide cyanurique marqué I (A.4.5.2) dans une fiole
jaugée à un trait de 5 ml (A.5.12). Compléter au volume avec de l'eau (A.4.1) et mélanger. Conserver la
solution de travail d'acide cyanurique marqué II à température ambiante et à l'abri de la lumière.
A.4.5.4 Solution de travail d'acide cyanurique marqué III, correspondant à 200 ng d'acide cyanurique
marqué par millilitre.
Transférer à la pipette 0,5 ml de la solution de travail d'acide cyanurique marqué I (A.4.5.2) dans une fiole
jaugée à un trait de 50 ml (A.5.12). Compléter au volume avec de l'eau (A.4.1) et mélanger. Conserver la
solution de travail d'acide cyanurique marqué III à température ambiante et à l'abri de la lumière.
A.4.6 Mélamine (C H N ), fraction massique > 99 % (n° CAS: 108-78-1).
3 6 6
A.4.6.1 Solution mère étalon de mélamine, correspondant à 0,25 mg de mélamine par millilitre.
Peser, à 0,1 mg près, 62,5 mg de mélamine (A.4.6) dans une fiole jaugée à un trait de 250 ml (A.5.12).
Dissoudre et compléter au volume avec de l'eau (A.4.1). Passer aux ultrasons pendant au moins 15 min
jusqu'à dissolution complète. Conserver à température ambiante et à l'abri de la lumière. Préparer une
nouvelle solution mère chaque semaine.
A.4.6.2 Solution de travail de mélamine I, correspondant à 20 µg de mélamine par millilitre.
Transférer à la pipette 4 ml de la solution mère étalon de mélamine (A.4.6.1) dans une fiole jaugée à un trait
de 50 ml (A.5.12). Compléter au volume avec de l'eau (A.4.1) et mélanger. Conserver la solution de travail de
mélamine I à température ambiante et à l'abri de la lumière. Préparer une nouvelle solution de travail I chaque
semaine.
A.4.6.3 Solution de travail de mélamine II, correspondant à 2 µg de mélamine par millilitre.
Transférer à la pipette 1 ml de la solution de travail de mélamine I (A.4.6.2) dans une fiole jaugée à un trait de
10 ml (A.5.12). Compléter au volume avec de l'eau (A.4.1) et mélanger. Conserver la solution de travail de
mélamine II à température ambiante et à l'abri de la lumière. Préparer une nouvelle solution de travail II
chaque semaine.
A.4.6.4 Solution de travail de mélamine III, correspondant à 200 ng de mélamine par mil
...