ISO 15141:2018
(Main)Cereals and cereal products — Determination of ochratoxin A — High performance liquid chromatographic method with immunoaffinity column cleanup and fluorescence detection
Cereals and cereal products — Determination of ochratoxin A — High performance liquid chromatographic method with immunoaffinity column cleanup and fluorescence detection
This document specifies a high performance liquid chromatographic method with immunoaffinity column cleanup for the determination of ochratoxin A in cereals and cereal products. The limit of quantification is 0,2 μg/kg. The method detection limit is dependent on the sample matrix as well as on the instrument.
Céréales et produits céréaliers — Dosage de l'ochratoxine A — Méthode par chromatographie en phase liquide à haute performance avec purification sur colonne d'immunoaffinité et détection par fluorescence
Le présent document expose en détail une méthode par chromatographie liquide à haute performance avec purification sur colonne d'immunoaffinité pour le dosage de l'ochratoxine A dans les céréales et les produits céréaliers. Le seuil de quantification est de 0,2 μg/kg. La limite de la méthode de détection dépend de la matrice de l'échantillon ainsi que de l'instrument.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15141
First edition
2018-07
Cereals and cereal products —
Determination of ochratoxin A — High
performance liquid chromatographic
method with immunoaffinity column
cleanup and fluorescence detection
Céréales et produits céréaliers — Dosage de l'ochratoxine A —
Méthode par chromatographie en phase liquide à haute performance
avec purification sur colonne d'immunoaffinité et détection par
fluorescence
Reference number
©
ISO 2018
© ISO 2018
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Published in Switzerland
ii © ISO 2018 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 2
6 Apparatus and equipment . 3
7 Procedure. 5
7.1 General . 5
7.2 Sampling . 5
7.3 Preparation of the test samples . 5
7.4 Extraction of ochratoxin A from the sample . 5
7.4.1 Extraction . 5
7.4.2 Dilution. 5
7.5 Immunoaffnity column cleanup . 5
7.6 HPLC operating conditions . 6
7.7 Calibration graph . 6
7.8 Identification . 6
7.9 Determination . 6
7.10 Confirmation . 6
8 Calculation . 7
9 Precision . 7
9.1 General . 7
9.2 Repeatability . 8
9.3 Reproducibility . 8
10 Test report . 8
Annex A (informative) Results of interlaboratory tests. 9
Bibliography .12
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: www .iso .org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 4,
Cereals and pulses.
This first edition cancels and replaces ISO 15141-1:1998 and ISO 15141-2:1998, which have been
technically revised.
The main change compared to the previous edition is that the principle of the extraction and purification
has been changed.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 15141:2018(E)
Cereals and cereal products — Determination of
ochratoxin A — High performance liquid chromatographic
method with immunoaffinity column cleanup and
fluorescence detection
1 Scope
This document specifies a high performance liquid chromatographic method with immunoaffinity
column cleanup for the determination of ochratoxin A in cereals and cereal products.
The limit of quantification is 0,2 μg/kg. The method detection limit is dependent on the sample matrix
as well as on the instrument.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
4 Principle
Ochratoxin A (OTA) is extracted by acetonitrile-water. The extract is purified using an immunoaffinity
column and ochratoxin A is determined by high performance liquid chromatography (HPLC) on a
reverse-phase column and fluorescence detection. The result is verified, if required, by derivatization
with boron trifluoride in methanolic solution.
WARNING — Ochratoxin A causes kidney and liver damage and is a probable carcinogen. Observe
[1]
appropriate safety precautions for handling such compounds and in particular avoid handling
in dry form as the electrostatic nature can result in dispersion and inhalation. Glassware can
be decontaminated with 4 % sodium hypochlorite solution. Attention is drawn to the statement
[2][3]
made by the International Agency for Research on Cancer (WHO) .
5 Reagents
During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and only
distilled water or water of grade 1 in accordance with ISO 3696. Solvents shall be of quality for HPLC
analysis.
5.1 Acetonitrile.
5.2 Methanol.
5.3 Sodium chloride (NaCl).
5.4 Glacial acetic acid, φ(CH COOH) ≥ 98 %.
5.5 Tween-20.
5.6 Sodium bicarbonate (NaHCO ).
5.7 Disodium hydrogen phosphate (Na HPO ).
2 4
5.8 Potassium dihydrogen phosphate (KH PO ).
2 4
5.9 Potassium chloride (KCl).
5.10 Hydrochloric acid, c(HCl) = 12 mol/l.
5.11 Ochratoxin A, in crystal form or as a film in ampoules.
5.12 Extraction solvent, mix 60 volume parts of acetonitrile (5.1) and 40 volume parts of water.
5.13 Phosphate buffered saline (PBS), dissolve 8 g NaCl (5.3), 1,2 g Na HPO (5.7), 0,2 g KH PO (5.8)
2 4 2 4
and 0,2 g KCl (5.9) in about 990 ml water. Adjust pH to 7 with HCl (5.10) and dilute to 1 l with water.
5.14 Washing solution, dissolve 25 g NaCl (5.3), 5 g NaHCO (5.6) and 0,1 ml Tween-20 (5.5) in 1 l water.
5.15 Mobile phase, mix 48 volume parts of acetonitrile (5.1) with 51 volume parts of water and 1
volume parts of glacial acetic acid (5.4) and degas this solution before use.
5.16 Toluene.
5.17 Solvent mixture, mix 99 volume parts of toluene (5.16) with 1 volume parts of glacial acetic
acid (5.4).
5.18 Ochratoxin A stock solution.
Dissolve 1 mg of the ochratoxin A (crystals) (5.11) or the contents of 1 ampoule (if ochratoxin A has
been obtained as a film) (5.11) in solvent mixture (5.17) to give a solution containing approximately
20 μg/ml to 30 μg/ml of ochratoxin A.
To determine the exact concentration, record the absorption curve between a wavelength of 300 nm
and 370 nm in 5 nm steps in a 1 cm quartz cell (6.12) with solvent mixture (5.17) as reference. Identify
the wavelength for maximum absorption by recording in 1 nm steps around the maximum as reference.
2 © ISO 2018 – All rights reserved
Calculate the mass concentration of ochratoxin A, ρ , in micrograms per millilitre of solution using
OTA
Formula (1):
M×100
ρ =×A (1)
OTAmax
κδ×
where
A is the absorption determined at the maximum of the absorption curve
max
(here: at 333 nm);
M is the relative molecular mass of ochratoxin A (M = 403 g/mol);
κ is the molar absorption coefficient of ochratoxin A, in solvent mixture
(here: 544 m /mol);
δ is the path length of the cell in centimetres.
Store this solution at approximately −18 °C. A solution stored in this way is usually stable for 12 months.
Check the concentration of the solution if it is older than 6 months.
5.19 Ochratoxin A standard solution, ρ = 1 μg/ml.
OTA
Evaporate under a nitrogen flow 1 ml of the stock solution (5.18) or the aliquot portion which is
equivalent to an absolute amount of 100 μg of ochratoxin A to dryness and dilute to 100 ml with the
mobile phase (5.15).
This solution can be stored in a refrigerator at 4 °C. Stability shall be checked.
5.20 Ochratoxin A calibration solutions.
Pipette suitable volumes of ochrato
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 15141
Première édition
2018-07
Céréales et produits céréaliers —
Dosage de l'ochratoxine A — Méthode
par chromatographie en phase liquide
à haute performance avec purification
sur colonne d'immunoaffinité et
détection par fluorescence
Cereals and cereal products — Determination of ochratoxin A — High
performance liquid chromatographic method with immunoaffinity
column cleanup and fluorescence detection
Numéro de référence
©
ISO 2018
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2018 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Réactifs . 2
6 Appareillage et équipement . 4
7 Mode opératoire. 5
7.1 Généralités . 5
7.2 Échantillonnage . 5
7.3 Préparation des échantillons pour essai . 5
7.4 Extraction de l'ochratoxine A de l'échantillon . 5
7.4.1 Extraction . 5
7.4.2 Dilution. 5
7.5 Purification sur colonne d’immunoaffinité . 5
7.6 Conditions de fonctionnement de la CLHP . 6
7.7 Courbe d’étalonnage . 6
7.8 Identification . 6
7.9 Détermination . 6
7.10 Confirmation . 7
8 Calculs . 7
9 Fidélité . 8
9.1 Généralités . 8
9.2 Répétabilité . 8
9.3 Reproductibilité . 8
10 Rapport d'essai . 8
Annexe A (informative) Résultats des essais interlaboratoires . 9
Bibliographie .12
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, Sous-
comité SC 4, Céréales et légumineuses.
Cette première édition annule et remplace l'ISO 15141-1:1998 et l'ISO 15141-2:1998 qui ont fait l’objet
d'une révision technique.
Le principal changement par rapport à l’édition précédente réside dans le fait que le principe de
l’extraction et de la purification a été modifié.
iv © ISO 2018 – Tous droits réservés
NORME INTERNATIONALE ISO 15141:2018(F)
Céréales et produits céréaliers — Dosage de l'ochratoxine
A — Méthode par chromatographie en phase liquide
à haute performance avec purification sur colonne
d'immunoaffinité et détection par fluorescence
1 Domaine d’application
Le présent document expose en détail une méthode par chromatographie liquide à haute performance
avec purification sur colonne d’immunoaffinité pour le dosage de l’ochratoxine A dans les céréales et les
produits céréaliers.
Le seuil de quantification est de 0,2 μg/kg. La limite de la méthode de détection dépend de la matrice de
l’échantillon ainsi que de l’instrument.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
3 Termes et définitions
Aucun terme n'est défini dans le présent document.
L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l'adresse http: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l'adresse http: //www .electropedia .org/
4 Principe
L'ochratoxine A (OTA) est extraite par un mélange acétonitrile/eau. L'extrait est purifié en utilisant
une colonne d’immunoaffinité, et l'ochratoxine A est déterminée par chromatographie liquide à haute
performance sur colonne en phase inverse, avec détection par fluorescence. Le résultat peut être vérifié,
si nécessaire, par dérivation avec du trifluorure de bore en solution dans du méthanol.
AVERTISSEMENT — L'ochratoxine A provoque des lésions au niveau des reins et du foie, et elle
[1]
est probablement cancérigène. Il est nécessaire de respecter les précautions de sécurité lors
des manipulations de ce produit et d’éviter notamment toute manipulation du produit sous
forme déshydratée du fait de sa nature électrostatique qui peut occasionner une dispersion
et une inhalation. Il est possible de décontaminer la verrerie avec une solution d'hypochlorite
de sodium à 4 %. L’attention du lecteur est attirée sur la déclaration formulée par l'Agence
[2][3]
Internationale de Recherche sur le Cancer (OMS) .
5 Réactifs
Au cours de cette analyse et sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité
analytique reconnue et de l'eau distillée de qualité 1, conformément à l'ISO 3696. Les solvants doivent
être de qualité pour analyse CLHP.
5.1 Acétonitrile.
5.2 Méthanol.
5.3 Chlorure de sodium (NaCI).
5.4 Acide acétique glacial, φ(CH3COOH) ≥ 98 %.
5.5 Tween 20.
5.6 Bicarbonate de sodium (NaHCO ).
5.7 Hydrogénophosphate de sodium (Na HPO ).
2 4
5.8 Dihydrogénophosphate de potassium (KH PO ).
2 4
5.9 Chlorure de potassium (KCI).
5.10 Acide chlorhydrique, c(HCl) =12 mol/l.
5.11 Ochratoxine A, sous forme de cristaux ou de film en ampoule.
5.12 Solvant d'extraction, mélanger 60 volumes d’acétonitrile (5.1) et 40 volumes d’eau.
5.13 Tampon phosphate salin (tampon PBS), dissoudre 8 g de NaCl (5.3), 1,2 g de Na HPO (5.7),
2 4
0,2 g de KH PO (5.8) et 0,2 g de KCl (5.9) dans environ 990 ml d’eau. Ajuster le pH à 7 avec du HCI (5.10)
2 4
et compléter à 1 l avec de l'eau.
5.14 Solution de lavage, dissoudre 25 g de NaCl (5.3), 5 g de NaHCO (5.6) et 0,1 ml de Tween 20 (5.5)
dans 1 l d’eau.
5.15 Phase mobile, mélanger 48 volumes d’acétonitrile (5.1), 51 volumes d’eau et 1 volume d’acide
acétique glacial (5.4). Dégazer cette solution avant utilisation.
5.16 Toluène.
5.17 Mélange de solvants, mélanger 99 volumes de toluène (5.16) avec 1 volume d'acide acétique
glacial (5.4).
5.18 Solution-mère d'ochratoxine A
Dissoudre 1 mg d'ochratoxine A (cristaux) (5.11) ou le contenu d’une ampoule (si l’ochratoxine A est
sous forme de film) (5.11) dans le mélange de solvants (5.17) pour obtenir une solution contenant
environ 20 μg/ml à 30 μg/ml d’ochratoxine A.
Pour déterminer la concentration exacte, enregistrer la courbe d’absorption entre une longueur d’onde
de 300 nm et 370 nm par pas de 5 nm dans une cuve en quartz de 1 cm (6.12) avec le mélange de
2 © ISO 2018 – Tous droits réservés
solvants (5.17), comme référence. Identifier la longueur d'onde de l'absorption maximale en effectuant
un enregistrement par palier de 1 nm autour du maximum comme référence. Calculer la concentration
massique d’ochratoxine A, ρ , exprimée en microgrammes par millilitre de solution, à l'aide de la
OTA
Formule (1):
M×100
ρ =
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.