ISO 16778:2015
(Main)Water quality — Calanoid copepod early-life stage test with Acartia tonsa
Water quality — Calanoid copepod early-life stage test with Acartia tonsa
ISO 16778:2015 specifies an early-life stage test procedure for determination of the toxic effects of a chemical substance, effluent, or water sample on a cold-water marine and brackish water copepod species under semi-static conditions. The biological endpoints include survival and development of the early-life stages. The exposure starts with eggs and is continued until emergence of juvenile stages. Copepods occur widely in marine, brackish, and fresh water ecosystems. They represent important prey items for the larvae of many fish and larger invertebrates and are increasingly used as a live food source in aquaculture. They feed on phytoplankton and, thus, are an ecologically important energy-transfer link between primary producers and higher trophic levels.
Qualité de l'eau — Essai aux premiers stades de la vie de copépodes calanoïdes avec Acartia tonsa
ISO 16778:2015 spécifie un mode opératoire d'essai aux premiers stades de la vie pour la détermination, en conditions semi-statiques, des effets toxiques d'un échantillon de substance chimique, d'effluent ou d'eau sur une espèce de copépode d'eaux marines froides et d'eaux saumâtres. Les critères d'effet biologiques incluent la survie et le développement des animaux aux premiers stades de leur vie. L'exposition commence avec les ?ufs et se poursuit jusqu'à l'émergence des stades juvéniles. Les copépodes sont des espèces largement répandues dans les écosystèmes marins, saumâtres et d'eau douce. Ils constituent des proies importantes pour les larves de nombreuses espèces de poissons et de grands invertébrés et sont de plus en plus utilisés comme source d'alimentation vivante en aquaculture. Se nourrissant de phytoplancton, ils représentent un maillon écologique important en ce qui concerne le transfert d'énergie entre les producteurs primaires et les niveaux trophiques supérieurs.
General Information
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16778
First edition
2015-06-15
Water quality — Calanoid copepod
early-life stage test with Acartia
tonsa
Qualité de l’eau — Essai aux premiers stades de la vie de
copépodes calanoïdes avec Acartia tonsia
Reference number
ISO 16778:2015(E)
©
ISO 2015
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ISO 16778:2015(E)
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ISO 16778:2015(E)
Contents Page
Foreword .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Apparatus . 2
6 Reagents . 3
6.1 Water . 3
6.2 Culture and test media . 3
6.3 Dilution water . 3
7 Test organism . 3
8 Procedure. 4
8.1 Preparation of culture medium . 4
8.2 Choice of test concentrations . 4
8.3 Preparation of test substance stock solution . 4
8.4 Preparation of test solutions . 5
8.5 Incubation/Exposure . 5
8.5.1 Test organisms and loading . 5
8.5.2 Control of hatching . . 5
8.5.3 Larval development ratio (Early-life stages development). 6
8.5.4 Duration. 6
8.5.5 Handling of test vessels . 6
8.5.6 Feeding . 6
8.5.7 Light and temperature . 6
8.5.8 Aeration . 6
8.5.9 Dilution water and test solutions renewal or addition . 6
8.6 Measurements/Observations . 7
8.6.1 Concentration of the test substance . 7
8.6.2 Physical-chemical parameters .
oxygen, pH, salinity, and temperature . 8
9 Validity criteria . 8
10 Expression of results . 8
11 Denotion of results . 9
12 Interpretation of results . 9
13 Reference substance . 9
14 Test report . 9
Annex A (informative) Defined culture and test media .11
Annex B (informative) Specific details on renewal of test solution, feeding regime, and an
example of a flow diagram for a larval development test (early-life stage test) with
Acartia tonsa .13
Annex C (informative) Sampling for chemical analyses .17
Annex D (informative) Lugol’s solution .18
Annex E (informative) Data collection sheet for Acartia tonsa early-life stage test .19
Annex F (informative) Calculations .21
Annex G (informative) Culturing of Acartia tonsa .23
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ISO 16778:2015(E)
Annex H (informative) Specific details on secondary sexual characteristics for Acartia tonsa .28
Annex I (informative) General safety precautions and techniques for handling
environmental samples .30
Bibliography .36
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ISO 16778:2015(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16778:2015(E)
Water quality — Calanoid copepod early-life stage test with
Acartia tonsa
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if any,
associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and
health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document
be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This International Standard specifies an early-life stage test procedure for determination of the
toxic effects of a chemical substance, effluent, or water sample on a cold-water marine and brackish
water copepod species under semi-static conditions. The biological endpoints include survival and
development of the early-life stages. The exposure starts with eggs and is continued until emergence of
juvenile stages.
Copepods occur widely in marine, brackish, and fresh water ecosystems. They represent important prey
items for the larvae of many fish and larger invertebrates and are increasingly used as a live food source
in aquaculture. They feed on phytoplankton and, thus, are an ecologically important energy-transfer
link between primary producers and higher trophic levels.
2 Normative references
There are no normative references cited in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
EC
effect concentration
3.2
EC
x
calculated concentration from which an effect of x % is expected
3.3
larval development ratio
LDR
fraction of animals that have turned into a copepodite stage compared to the total number of surviving
nauplii and copepodites within a given period of time (5 d to 6 d)
3.4
lowest observed effect concentration
LOEC
lowest concentration within the experimental range at which a significant effect is observed
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ISO 16778:2015(E)
3.5
no observed effect concentration
NOEC
tested concentration just below the LOEC
[SOURCE: ISO/TS 20281:2006, 3.18]
3.6
x % confidence intervals
interval of values within which the measured or calculated value is likely to be present with a
probability of x %
3.7
dilution water
water with defined properties (e.g. salinity) or natural seawater used for stepwise dilution of the test
sample or used as control
4 Principle
The test is an early-life stage test, where the organisms are exposed to various concentrations of a
chemical substance, effluent, or water sample, from the egg stage to the juvenile stages. Survival and
development of early-life stages [larval development ratio (LDR)] are dependent on the investigated
parameters. The total test duration is about 5 d to 6 d, which is sufficient time to investigate the
development from nauplii to copepodites.
The naupliar (larval) and copepodite (juvenile) stages are morphologically distinct, and therefore, the
transition from the last naupliar to the first copepodite stage is easily observed. Larval development
ratio (LDR) is recorded after 5 d to 6 d, when about 60 % of the control animals have reached a copepodite
stage, and is expressed as the ratio of copepodites to the total number of surviving early-life stages
(nauplii + copepodites) at the end of the LDR test. Hatching success and mortality of the early stages
should be presented along with the LDR.
The outcome of the test is either the no observed effect concentration and the lowest observed effect
concentration (NOEC-LOEC) values or the effect concentrations with a certain degree (x %) of inhibition
(EC ) (e.g. EC and EC ).
x 50 10
5 Apparatus
Test vessels and other apparatus, which will come into contact with the dilution water and test solutions,
should be made entirely of glass or other materials chemically inert to the test chemical.
5.1 Standard laboratory apparatus, e.g. measurements of pH, dissolved oxygen concentration,
salinity, and temperature.
5.2 Glass flasks, volume 1 l, 2 l, and 5 l.
5.3 Air pumps.
5.4 Air filters, pore size 0,2 µm.
5.5 Peristaltic pump for food supply.
5.6 Temperature-controlled cabinet or room.
5.7 Low-magnifying stereomicroscope, preferably with dark field illumination.
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ISO 16778:2015(E)
5.8 Apparatus for membrane filtration.
5.9 Filters, 0,2 µm (6.2) and eventually filters with grids (8.5.1).
5.10 Nets, mesh sizes 50 µm and 180 µm to 200 µm, for isolation of eggs, for capture and transfer of
animals, and as filters when medium is changed.
5.11 Adequate apparatus for the control of the lighting regime.
6 Reagents
6.1 Water
All water used in preparation of culture medium shall be clean natural seawater or deionized water
or of equivalent purity. Take special care to avoid contamination of the water by inorganic or organic
substances during preparation and storage.
Equipment made of copper shall not be used.
6.2 Culture and test media
Culture and test media are prepared from either reconstituted salt water or filtered (0,2 µm) natural
marine water from an unpolluted location. An example of reconstituted salt water suitable for cultivation
and testing is given in Annex A. Reconstituted salt water media with a known composition in which the
copepods show suitable long-term survival, normal behaviour, development, and fecundity can be used
as culture and test media, i.e. dilution water.
6.3 Dilution water
The salinity of the dilution water should be the same as that of the culture medium (see Annex A). The
dilution water shall have a dissolved oxygen concentration above 70 % of the air saturation value and a
pH of 8,0 ± 0,3 before being used to prepare the test solutions. If there is evidence of marked change of
pH at the highest test concentration, it is advisable to adjust the pH of the stock solution/environmental
sample to that of the dilution water before preparing the dilution series. The pH adjustment of the stock
solution or test concentrations shall not change the concentration to any significant extent or lead to
chemical reaction or precipitation of the test substance. HCl and NaOH are preferred for pH adjustments.
If the physical conditions or the salinity of the salt water to be used in the test differ more than 5 °C in
temperature or 10 ‰ salinity from those used for routine culturing, it is good practice to include an
adequate pre-test acclimation period at the same temperature (20 ± 1) °C and salinity (20 ± 2) ‰ of 2
to 3 weeks to avoid stressing the eggs and animals. Use of another temperature or salinity, which can be
more appropriate in oceanic or brackish water situations, shall be justified in the test report.
7 Test organism
The species to be used is the marine calanoid copepod Acartia tonsa Dana (see Annex G and Annex H).
Eggs used in the test should be collected from a healthy stock (i.e. showing no signs of stress such as
high mortality, poor fecundity, etc.). The stock animals shall be maintained in culture conditions (light,
temperature, medium, and feeding) similar to those to be used in the test (culturing method for A. tonsa
is described in Annex G).
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ISO 16778:2015(E)
8 Procedure
8.1 Preparation of culture medium
Natural seawater or a reconstituted medium can be used. A suitable reconstituted culture medium is
described in Annex A. However, alternative reconstituted media can be used as long as the validity
criteria for the test are met (see Clause 9). The defined medium described in Annex A contains a
chelating agent and therefore, might not be appropriate for testing of samples that contain metals. The
salinity can be varied by choosing a desired amount of the 10 % salinity solution. The salinity of natural
seawater and environmental samples can be raised by using the same 10 % salinity solution (Table A.1)
or lowered by adding an appropriate volume of M7 (see Reference [1] and Annex A) or deionized water.
8.2 Choice of test concentrations
[1]
Prior knowledge of the toxicity of the test substance (e.g. from an acute test ) or from range-finding
studies) should help in selecting appropriate test concentrations. As a rule of thumb, the highest
concentration in the early-life stage test should be chosen within the interval between LC and LC of
10 20
the acute 48 h test to avoid significant effect on survival.
At least 5 different concentrations should be tested in a geometric series with a factor between
concentrations not exceeding 3,2. Justification should be provided if fewer than five concentrations are
used. Substances should not be tested above their solubility limits in dilution water. A dilution water
control shall be included and, if a solvent is used, a solvent-control shall also be included (8.3), containing
the same concentration of solvent as the test series.
If there are substantial reason to assume that a high concentration of a chemical or an environmental
sample will have low/no toxicity at a high concentration (e.g. at 10 mg/l or 100 ml/l), the early-life stage
test can be performed as a limit test, using a test concentration of, for example, 10 mg/l (or 100 ml
sample/l) and the control. The usual number of replicates should be used for both the treatment and
the control groups. A limit test can show that there is no statistically significant effect at the limit
concentration when compared to the controls, but if significant effects are recorded, a full test will
normally be required.
8.3 Preparation of test substance stock solution
The test solutions are usually prepared by diluting a stock solution of a test chemical or of an
environmental sample with dilution water. Stock solutions of chemicals shall be prepared by dissolving
the substance in dilution water. The preferred options for preparing test solutions are physical methods,
[2][3]
such as stirring and sonication. Saturation columns (solubility columns) can be used for achieving
a suitably concentrated stock solution.
The use of organic solvents might be required in some cases in order to produce a suitably concentrated
stock solution, but every effort should be made to avoid the use of such carrier solvents. The only
recommended solvent for this test is acetone. Acetone shall be used to produce a stock solution that
can be dosed accurately into water. The recommended maximum acetone concentration in the dilution
water and test solutions is 0,01 ml/l. The concentration shall be the same in all test vessels. If another
solvent or a higher acetone concentration is used, it shall be documented that it has no effects. Acetone
will not be toxic at 0,01 ml/l and will not increase the water solubility of a substance. Acetone might
be essential in handling some substances; for example, for preparing stock solutions of hydrolytically
[4]
unstable or highly viscous substances.
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8.4 Preparation of test solutions
1)
In the LDR test, the control should comprise of at least 10 control replicates and preferably more, and
as a minimum 6 replicates of each test concentration. The demand for replicates is higher if the ANOVA
statistic is used whereas regression analysis generally demands more concentrations.
The number of replicates depends on the statistical endpoint (ANOVA or EC ). When planning the test, it
x
should be taken into consideration whether the aim is to achieve a NOEC/LOEC (by use of ANOVA) or an
EC value (by use of regression technique).
x
For the use of ANOVA technique or regression analysis, see Reference [5].
In setting the range of concentrations, the following should be borne in mind:
If the aim is to obtain the NOEC, the lowest test concentration shall be low enough so that the biological
endpoint at that concentration is not significantly different from that of the control. If this is not the
case, the test will have to be repeated with a reduced lowest concentration. If the aim is to obtain the
NOEC, the highest test concentration shall be high enough to cause a statistically significant effect when
compared to the control on the biological endpoint. If this is not the case, the test will have to be repeated
with an increased highest concentration.
If EC for effects on development is estimated, it is optimal that the lowest concentration has no
x
effects (optimally the only one without effects), and the highest concentration is greater than EC ,
50
and that sufficient concentrations are used to define the EC with the appropriate level of confidence.
x
If the highest concentration is below the EC , it is recommended also to report the EC and/or the
50 10
NOEC/LOEC values.
The range of test concentrations should preferably not include any concentrations that have a significant
effect on survival since the main objective of the test is to measure sublethal effects (e.g. development).
8.5 Incubation/Exposure
A recommended schedule for an early-life stage test is given in Annex B.
8.5.1 Test organisms and loading
Fresh eggs produced by the copepod stock culture are preferred but eggs stored for a maximum of one
week at 4 °C can be used (see Table B.1). 60 to 90 eggs are counted by use of a stereomicroscope and
added to the test solution in each test vessel. Eggs shall be counted individually on a filter with grids or
in a drop of water (filters and water drops can be placed in a Petri dish with marked graduations) and
after counting be flushed into the test vessel (see Table B.1).
Newly hatched nauplii present at counting can be crushed with a preparation needle while counting
the eggs or if added together with the eggs, the nauplii shall be counted as well. The number of newly
hatched nauplii shall not exceed 5 % of the number of added eggs.
A data collection sheet suitable for holding the recorded data are given in Annex E.
8.5.2 Control of hatching
Complementary to the LDR control vessels, an additional control for hatching may be set up. Four
replicates with 60 to 90 eggs in 40 ml to 80 ml (same volume as in test replicates – see 8.5.3) of dilution
water are started at the same time as the LDR test with eggs from the same batch (see Table B.1). This
hatching control will only run for 2 d to 3 d and, at that time, the number of larvae and unhatched eggs
are counted to check the hatching percentage.
1) It is recommended to start with at least 12 control replicates since some will probably be used for inspection of
the development at a time where the LDR is below the 60 % ±20 % criterion for the copepodite fraction. To find the
optimal time to terminate the LDR test 1 to 2, controls are taken and counted at regular intervals when it is expected
that the LDR approaches 60 %.
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8.5.3 Larval development ratio (Early-life stages development)
Eggs (60 to 90) are exposed in each replicate vessel holding the same volume of test solution (40 ml
to 80 ml). The exact number of eggs (and newly hatched nauplii) added is recorded. Test solutions are
renewed on day 2 or 3 or the volume is increased by adding new test solution using the principle from
Footnote 3 (see also Annex B, Table B.1). Observation of the larval development is normally recorded
after 5 d to 6 d, when about 60 % of the control animals have reached a copepodite stage, and is expressed
as the ratio of copepodites to the total number (sum) of larvae (nauplii) and juveniles (copepodites) alive
at that point of the test. Animals dying during the test disappear quickly and all animals counted at the
end of the test are assumed to be alive when Lugol’s solution is added (see 8.6 and Annex D). Additional
replicates of the controls should be prepared to catch the most optimal time for stopping the test as
close as possible to the 60 % copepodite ratio (see Footnote 1). Mortality (animals dead and missing
during the test) should be presented along with the LDR (see Annex F for calculation examples).
8.5.4 Duration
Time needed to complete (at 20 °C and 20‰ salinity) larval development test is 5 d to 6 d. At lower
temperatures or higher salinities, the development might be slower and, thus, testing at these conditions
might last longer. See, for example, Reference [6] which presents a study of the length of time elapsed
until 50 % of the early-life stages reach a copepodite stage at different salinity and temperature regimes.
8.5.5 Handling of test vessels
Handling of the test vessels should be done in a random fashion. Failure to do this may result in bias
that could be construed as being a concentration effect. In particular, if experimental units are handled
in treatment or concentration order, some time-related effect, such as operator fatigue or other error,
could lead to greater effects at the higher concentrations. Care should be taken that environmental
conditions, such as position in the laboratory, are uniform for all test vessels independently of their
physical position in the test setup. It is also important to stress that the time given for each repli
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16778
Première édition
2015-06-15
Qualité de l’eau — Essai aux premiers
stades de la vie de copépodes
calanoïdes avec Acartia tonsia
Water quality — Calanoid copepod early-life stage test
with Acartia tonsa
Numéro de référence
ISO 16778:2015(F)
©
ISO 2015
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ISO 16778:2015(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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Publié en Suisse
ii © ISO 2015 – Tous droits réservés
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ISO 16778:2015(F)
Sommaire Page
Avant-propos .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Appareillage . 2
6 Réactifs . 3
6.1 Eau . 3
6.2 Milieux de culture et d’essai . 3
6.3 Eau de dilution . 3
7 Organisme pour essai . 3
8 Mode opératoire. 4
8.1 Préparation du milieu de culture . 4
8.2 Choix des concentrations d’essai . 4
8.3 Préparation de la solution mère des substances d’essai . 4
8.4 Préparation des solutions d’essai . 5
8.5 Incubation/Exposition . 5
8.5.1 Organismes pour essai et charge . 5
8.5.2 Témoin d’éclosion . 6
8.5.3 Taux de développement larvaire (développement des premiers stades de la vie) 6
8.5.4 Durée . 6
8.5.5 Manipulation des récipients d’essai . 6
8.5.6 Alimentation . 6
8.5.7 Lumière et température . 7
8.5.8 Aération . 7
8.5.9 Eau de dilution, renouvellement ou addition des solutions d’essai . 7
8.6 Mesurages/observations . 7
8.6.1 Concentration de la substance d’essai . 8
8.6.2 Paramètres physico-chimiques .
oxygène, pH, salinité et température . 8
9 Critères de validité . 8
10 Expression des résultats. 9
11 Représentation des résultats. 9
12 Interprétation des résultats . 9
13 Substance de référence . 9
14 Rapport d’essai .10
Annexe A (informative) Milieux de culture et d’essai définis .12
Annexe B (informative) Détails spécifiques concernant le renouvellement de la solution
d’essai et le régime d’alimentation, et exemple d’organigramme pour un essai de
développement larvaire (essai aux premiers stades de la vie) avec Acartia tonsa .14
Annexe C (informative) Échantillonnage en vue des analyses chimiques .18
Annexe D (informative) Solution de Lugol .19
Annexe E (informative) Feuille de collecte de données pour l’essai aux premiers stades de
la vie d’Acartia tonsa .20
Annexe F (informative) Calculs .22
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ISO 16778:2015(F)
Annexe G (informative) Culture d’Acartia tonsa .25
Annexe H (informative) Détails spécifiques concernant les caractéristiques sexuelles
secondaires d’Acartia tonsa .31
Annexe I (informative) Précautions de sécurité générales et techniques de manipulation
des échantillons environnementaux .33
Bibliographie .39
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ISO 16778:2015(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de
la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’OMC concernant
les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos — Informations
supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité 5,
Méthodes biologiques.
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NORME INTERNATIONALE ISO 16778:2015(F)
Qualité de l’eau — Essai aux premiers stades de la vie de
copépodes calanoïdes avec Acartia tonsia
AVERTISSEMENT — Il convient que les personnes utilisant la présente Norme internationale
connaissent bien les pratiques normales de laboratoire. La présente Norme internationale n’a pas
pour but de traiter tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation.
L’utilisateur est tenu d’établir des pratiques de sécurité et d’hygiène appropriées et de s’assurer
de leur conformité aux réglementations nationales existantes.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément au présent
document soient exécutés par un personnel suffisamment formé.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie un mode opératoire d’essai aux premiers stades de la vie
pour la détermination, en conditions semi-statiques, des effets toxiques d’un échantillon de substance
chimique, d’effluent ou d’eau sur une espèce de copépode d’eaux marines froides et d’eaux saumâtres.
Les critères d’effet biologiques incluent la survie et le développement des animaux aux premiers stades
de leur vie. L’exposition commence avec les œufs et se poursuit jusqu’à l’émergence des stades juvéniles.
Les copépodes sont des espèces largement répandues dans les écosystèmes marins, saumâtres et d’eau
douce. Ils constituent des proies importantes pour les larves de nombreuses espèces de poissons et de
grands invertébrés et sont de plus en plus utilisés comme source d’alimentation vivante en aquaculture.
Se nourrissant de phytoplancton, ils représentent un maillon écologique important en ce qui concerne le
transfert d’énergie entre les producteurs primaires et les niveaux trophiques supérieurs.
2 Références normatives
Aucune référence normative n’est citée dans le présent document.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
CE
concentration avec effet
3.2
CEx
concentration calculée pour laquelle un effet de x % est prévu
3.3
taux de développement larvaire
LDR
fraction des animaux ayant atteint un stade copépodide par rapport au nombre total de nauplies et
copépodites survivants dans une période de temps donnée (5 j à 6 j)
3.4
concentration minimale avec effet observé
CMEO
plus faible concentration de la plage expérimentale à laquelle un effet significatif est observé
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3.5
concentration sans effet observé
CSEO
concentration d’essai juste en dessous de la CMEO
[SOURCE: ISO/TS 20281:2006, 3.18]
3.6
intervalles de confiance de x %
intervalle de valeurs dans lequel la probabilité de trouver la valeur mesurée ou calculée est de x %
3.7
eau de dilution
eau ayant des propriétés définies (par exemple, salinité) ou eau de mer naturelle utilisée pour la dilution
échelonnée de l’échantillon d’essai ou comme témoin
4 Principe
L’essai est un essai aux premiers stades de la vie, où les organismes sont exposés à différentes
concentrations d’une substance chimique, d’effluent ou d’eau, du stade d’œufs aux stades juvéniles.
La survie et le développement des premiers stades de la vie [taux de développement larvaire (LDR)]
dépendent des paramètres étudiés. La durée totale de l’essai est de 5 jours à 6 jours environ, ce qui donne
suffisamment de temps pour étudier le développement des stades naupliens aux stades copépodites.
Les stades naupliens (larves) et copépodites (juvéniles) présentent des morphologies distinctes; par
conséquent, il est aisé d’observer la transition du dernier stade nauplien au premier stade copépodite.
Le taux de développement larvaire (LDR) est enregistré au bout de 5 jours à 6 jours, lorsque 60 %
environ des animaux témoins ont atteint un stade copépodite. Il est exprimé comme étant le rapport des
copépodites au nombre total de survivants aux premiers stades de la vie (nauplies + copépodites) à la
fin de l’essai de développement larvaire. Il convient de mentionner, avec le LDR, les éclosions réussies et
la mortalité aux premiers stades de la vie.
L’essai donne pour résultat soit les valeurs de la concentration sans effet observé et de la concentration
minimale avec effet observé (CSEO-CMEO), soit les concentrations d’effet donnant lieu à un certain degré
(x %) d’inhibition (CEx) (par exemple, CE et CE ).
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5 Appareillage
Il convient que les récipients d’essai et autres matériels destinés à entrer en contact avec l’eau de dilution
et les solutions d’essai soient entièrement fabriqués en verre ou autres matériaux chimiquement inertes
vis-à-vis de la substance chimique d’essai.
5.1 Appareillage courant de laboratoire, par exemple pour le mesurage du pH, de la concentration
en oxygène dissous, de la salinité et de la température.
5.2 Fioles en verre, d’une capacité de 1 l, 2 l et 5 l.
5.3 Pompes à air.
5.4 Filtres à air, porosité de 0,2 µm.
5.5 Pompe péristaltique pour l’alimentation.
5.6 Armoire ou pièce à température contrôlée.
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5.7 Stéréomicroscope à faible grossissement, muni de préférence d’un système d’illumination à
fond noir.
5.8 Appareillage pour filtration sur membrane.
5.9 Filtres, 0,2 µm (6.2) et, à la fin, filtres quadrillés (8.5.1).
5.10 Filets, ouverture de maille 50 µm et 180 µm à 200 µm, pour l’isolation des œufs, la capture et le
transfert des animaux; servent de filtres lorsque le milieu est changé.
5.11 Dispositif approprié pour régler le régime d’éclairage.
6 Réactifs
6.1 Eau
L’eau utilisée pour préparer le milieu de culture doit toujours être de l’eau de mer naturelle propre ou de
l’eau déionisée, ou une eau de pureté équivalente. Prendre particulièrement soin d’éviter la contamination
de l’eau par des substances inorganiques ou organiques pendant la préparation et le stockage.
Aucun matériel en cuivre ne doit être utilisé.
6.2 Milieux de culture et d’essai
Les milieux de culture et d’essai sont préparés soit à partir d’eau de mer synthétique, soit à partir d’eau
de mer naturelle filtrée (0,2 µm) provenant d’un site non pollué. Un exemple d’eau de mer synthétique
appropriée pour la culture et les essais est donné à l’Annexe A. Des milieux constitués d’eau de mer
synthétique de composition connue, se prêtant à la survie à long terme des copépodes et où ces derniers
se comportent, se développent et se reproduisent normalement, peuvent servir de milieux de culture et
d’essai, c’est-à-dire d’eau de dilution.
6.3 Eau de dilution
Il convient que l’eau de dilution ait une salinité identique à celle du milieu de culture (voir Annexe A).
Avant d’être utilisée pour préparer les solutions d’essai, l’eau de dilution doit avoir une concentration
en oxygène dissous supérieure à 70 % de la valeur de saturation dans l’air et un pH de 8,0 ± 0,3. Si un
changement notable du pH à la concentration d’essai la plus élevée est mis en évidence, il est conseillé
d’ajuster le pH de la solution mère/l’échantillon environnemental au pH de l’eau de dilution avant de
préparer la série de dilutions. L’ajustement du pH de la solution mère ou des concentrations d’essai ne
doit pas induire de changement significatif de la concentration; il ne doit pas non plus entraîner une
réaction chimique ou la précipitation de la substance d’essai. HCl et NaOH sont utilisés de préférence
pour ajuster le pH.
Si, par rapport à une culture de routine, les conditions physiques sont telles que la température de l’eau
de mer devant servir pour l’essai diffère de plus de 5 °C, ou si la salinité diffère de plus de 10 ‰, une
bonne pratique consiste à faire précéder l’essai d’une période adéquate d’acclimatation dans les mêmes
conditions de température (20 ± 1) °C et de salinité (20 ± 2) ‰, d’une durée de 2 semaines à 3 semaines,
pour éviter de stresser les œufs et les animaux. L’utilisation d’une autre température ou d’une autre
salinité pouvant mieux convenir en présence d’eau océanique ou d’eau saumâtre doit être justifiée dans
le rapport d’essai.
7 Organisme pour essai
L’espèce à utiliser est le copépode calanoïde marin Acartia tonsa Dana (voir Annexe G et Annexe H).
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Il convient que les œufs utilisés durant l’essai proviennent d’une culture saine (c’est-à-dire une culture ne
présentant aucun signe de stress tel qu’une mortalité élevée, une fécondité médiocre, etc.). Les animaux
de réserve doivent être maintenus dans des conditions de culture (lumière, température, milieu et
alimentation) similaires aux conditions de l’essai (une méthode de mise en culture d’A. tonsa est décrite
à l’Annexe G).
8 Mode opératoire
8.1 Préparation du milieu de culture
Il est possible d’utiliser de l’eau de mer naturelle ou un milieu synthétique. Un milieu de culture synthétique
approprié est décrit à l’Annexe A. Toutefois, il est possible d’utiliser d’autres milieux synthétiques à
condition que les critères de validité de l’essai soient respectés (voir Article 9).Le milieu défini décrit à
l’Annexe A contient un chélateur; il peut donc ne pas convenir aux essais sur des échantillons contenant
des métaux. La salinité peut être modifiée en choisissant une quantité voulue de la solution à 10 ‰ de
salinité. La salinité des échantillons d’eau de mer naturelle et des échantillons environnementaux peut
être augmentée en utilisant la même solution à 10 ‰ de salinité (Tableau A.1) ou diminuée en ajoutant
un volume approprié de M7 (voir Référence [1] et Annexe A) ou d’eau déionisée.
8.2 Choix des concentrations d’essai
Il convient de s’appuyer sur une connaissance préalable de la toxicité de la substance d’essai (par exemple
[1]
à partir d’un essai de toxicité aiguë ou d’études préliminaires) pour sélectionner des concentrations
d’essai appropriées. L’expérience montre qu’il convient de choisir la concentration maximale de l’essai
aux premiers stades de la vie dans l’intervalle compris entre la CL et la CL de l’essai de toxicité aiguë
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en 48 h, ceci afin d’éviter un effet significatif sur la survie.
Il convient de soumettre à essai au moins cinq concentrations différentes en progression géométrique
de raison inférieure ou égale à 3,2. Si l’on utilise moins de cinq concentrations, il convient d’en apporter
la justification. Il convient que les substances ne soient pas soumises à essai au-dessus de leurs limites de
solubilité dans l’eau de dilution. L’essai doit inclure une eau de dilution témoin. Si un solvant est utilisé,
il doit inclure également un témoin contenant un solvant (8.3) en concentration identique à celle de la
série d’essai.
S’il y a matière à supposer qu’une concentration élevée d’une substance chimique ou qu’un échantillon
environnemental à concentration élevée (par exemple, à 10 mg/l ou 100 ml/l) sera peu ou pas du tout
toxique, l’essai aux premiers stades de la vie peut être réalisé en tant qu’essai limite, mettant en œuvre
une concentration d’essai de 10 mg/l (ou 100 ml d’échantillon/l), par exemple, et le témoin. Il convient
d’utiliser le nombre habituel de réplicats pour le groupe de traitement et pour le groupe témoin. Un essai
limite peut montrer l’absence d’effet statistiquement significatif à la concentration limite, comparé aux
témoins. Toutefois, si des effets significatifs sont enregistrés, un essai complet est normalement requis.
8.3 Préparation de la solution mère des substances d’essai
Les solutions d’essai sont habituellement préparées par dilution d’une solution mère d’une substance
chimique d’essai ou d’un échantillon environnemental avec l’eau de dilution. Les solutions mères de
substances chimiques doivent être préparées par dissolution de la substance dans l’eau de dilution. Les
options préférées de préparation des solutions d’essai sont des méthodes physiques, telles que l’agitation
[2][3]
et la sonication . Des colonnes de saturation (colonnes de solubilité) peuvent être utilisées pour
obtenir une solution mère de concentration appropriée.
L’utilisation de solvants organiques peut s’avérer nécessaire dans certains cas pour produire une solution
mère de concentration appropriée; il convient toutefois d’éviter, autant que faire se peut, l’utilisation
de ces solvants porteurs. L’unique solvant recommandé pour cet essai est l’acétone. L’acétone doit être
utilisée pour produire une solution mère pouvant être dosée avec précision dans l’eau. La concentration
maximale d’acétone recommandée dans l’eau de dilution et les solutions d’essai est de 0,01 ml/l. La
concentration doit être identique dans tous les récipients d’essai. Si un autre solvant est utilisé ou
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si la concentration en acétone est plus élevée, l’absence d’effets doit être démontrée et documentée.
L’acétone n’est pas toxique à la concentration de 0,01 ml/l et n’augmente pas la solubilité d’une substance
dans l’eau. L’acétone peut s’avérer essentielle pour manipuler certaines substances; par exemple, pour
préparer des solutions mères de substances présentant une instabilité hydrolitique ou de substances à
[4]
haute viscosité.
8.4 Préparation des solutions d’essai
1)
Dans l’essai de développement larvaire, il convient que le témoin comprenne au moins 10 réplicats
témoins, et davantage de préférence, et au minimum 6 réplicats de chaque concentration d’essai. Le
besoin en réplicats est plus important si la méthode statistique de l’ANOVA est utilisée, tandis que la
technique de l’analyse de régression requiert généralement plus de concentrations.
Le nombre de réplicats dépend du critère d’effet statistique (ANOVA ou CEx). Lors de la planification de
l’essai, il convient d’apprécier si l’objectif est d’obtenir une valeur de la CSEO/CMEO (par la méthode de
l’ANOVA) ou une valeur de la CEx (par une technique de régression).
Pour l’utilisation de la technique de l’ANOVA ou d’une analyse de régression, voir Référence [5].
En définissant la gamme de concentrations, il convient de garder à l’esprit les points suivants:
Si l’objectif est d’obtenir la CSEO, la concentration d’essai minimale doit être suffisamment faible pour
que le critère d’effet biologique à cette concentration ne diffère pas de manière significative de celui
du témoin. Dans le cas contraire, l’essai devra être répété avec une concentration minimale réduite. Si
l’objectif est d’obtenir la CSEO, la concentration d’essai maximale doit être suffisamment élevée pour
induire un effet statistiquement significatif sur le critère d’effet biologique, comparé au témoin. Dans le
cas contraire, l’essai devra être répété avec une concentration maximale augmentée.
S’il s’agit d’estimer la CEx ayant des effets sur le développement, les conditions optimales sont les
suivantes: la concentration minimale est sans effet (idéalement, la seule sans effet), la concentration
maximale est supérieure à la CE et des concentrations suffisantes sont utilisées pour définir la CEx
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avec le niveau de confiance approprié. Si la concentration maximale est inférieure à la CE , il est
50
recommandé de rapporter également les valeurs de la CE et/ou de la CSEO/CMEO.
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Il convient de préférence qu’aucune concentration ayant un effet significatif sur la survie ne soit incluse
dans la gamme de concentrations d’essai puisque l’objet principal de l’essai est la mesure des effets
sublétaux (par exemple, développement).
8.5 Incubation/Exposition
Un calendrier recommandé pour un essai aux premiers stades de la vie est donné à l’Annexe B.
8.5.1 Organismes pour essai et charge
Il est préférable d’utiliser des œufs frais issus de la culture mère de copépodes, mais des oeufs conservés
au maximum une semaine à 4 °C peuvent être utilisés (voir Tableau B.1). 60 œufs à 90 œufs sont comptés
au moyen d’un stéréomicroscope et ajoutés à la solution d’essai dans chaque récipient d’essai. Les œufs
doivent faire l’objet d’un comptage individuel sur un filtre quadrillé ou dans une goutte d’eau (les filtres
et les gouttes d’eau peuvent être placés dans une boîte de Petri graduée); après le comptage, ils doivent
être transvasés dans le récipient d’essai (voir Tableau B.1).
Les nauplies récemment écloses présentes au comptage peuvent être écrasées au moyen d’une aiguille
de préparation pendant le comptage; si elles sont ajoutées avec les œufs, les nauplies doivent être
comptées également. Le nombre de nauplies récemment écloses ne doit pas dépasser 5 % du nombre
d’œufs ajoutés.
1) Il est conseillé de démarrer avec au moins 12 réplicats témoins car certains d’entre eux vont probablement
servir au contrôle du développement à un stade où le LDR est inférieur au critère des (60 ± 20) % pour la fraction de
copépodites. Pour déterminer le meilleur moment d’arrêter l’essai de développement larvaire 1 ou 2, des témoins
sont prélevés et comptés à intervalles réguliers lorsqu’on estime que le LDR s’app
...
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