ISO 8261:1989
(Main)Milk and milk products — Preparation of test samples and dilutions for microbiological examination
Milk and milk products — Preparation of test samples and dilutions for microbiological examination
Lait et produits laitiers — Préparation des échantillons pour essai et des dilutions en vue de l'examen microbiologique
General Information
Relations
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL
ISO
STANDARD 8261
First edition
1989-07-01
Milk and milk products - Preparation of test
samples and dilutions for microbiological
examination
tion des 6chan tillons pour essai et des dilutions en
Lait et produits laitiers - Prdpara
vue de / ‘examen microbiologique
Reference number
ISO 8261 : 1989 (EI
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ISO 8261 : 1989 (El
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of
national Standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International
Standards is normally carried out through ISO technical committees. Esch member
body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to
the member bodies for approval before their acceptance as International Standards by
the ISO Council. They are approved in accordance with ISO procedures requiring at
least 75 % approval by the member bodies voting.
International Standard ISO 8261 was prepared by Technical Committee lSO/TC 34,
Agricultural food products, in collaboration with the International Dairy Federation
(IDF) and the Association of Official Analytical Chemists (AOAC), and will also be
published by these organizations.
0 ISO 1989
All rights reserved. No part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any
means, electronie or mechanical, including photocopying and microfilm, without Permission in
writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case postale 56 l CH-121 1 Geneve 20 l Switzerland
Printed in Switzerland
ii
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ISO 8261 :1989 (E)
Introduction
This International Standard is based on ISO 6887 : 1983, Microbiology - General
guidance for the preparation of dilutions for microbiological examination. The
necessary adaptations to microbiological laboratory practice in the dairy industry and
instructions specific to dairy products, especially in relation to Sample preparation,
have been introduced.
The question of which diluent or diluents to specify has been the subject of discussion
for some time. In this International Standard the peptonekaline Solution, adopted in
ISO 6887, has been specified but three other commonly used diluents are also
specified for general use, these being diluents commonly used in dairy microbiological
Ia boratories.
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This page intentionally left blank
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INTERNATIONAL STANDARD
ISO 8261 : 1989 (E)
Milk and milk products - Preparation of test samples and
dilutions for microbiological examination
to relate to certain specification criteria, a primary dilution more con-
1 Scope
centrated than 1 + 9 may be required. These factors should be taken
into account for subsequent operations and/or in the expression of
This International Standard lays down general guidelines for
results.
the preparation of
-
3.2 further decimal dilutions : The suspensions, solutions
test samples,
or emulsions obtained by mixing a specific volume of the
primary dilution (3.1) with a ninefold volume of diluent (see the
-
primary dilutions, and
note to 3.11, and by repeating this Operation with every dilution
thus prepared until a decimal dilution series, suitable for the
- further dilutions
inoculation of culture media, is obtained.
for microbiological examination of milk and milk products.
4 Principle
2 Normative reference
Preparation of the primary dilution (initial Suspension) (3.1)
and, if necessary, of further decimal dilutions (3.2) to reduce
the number of micro-organisms per unit volume to facilitate
The following Standard contains provisions which, through
microbiological examination.
reference in this text, constitute provisions of this International
Standard. At the time of publication, the edition indicated was
valid. All Standards are subject to revision, and Parties to agree-
ments based on this International Standard are encouraged to
5 Diluents
investigate the possibility of applying the most recent edition of
the Standard indicated below. Members of IEC and ISO main-
tain registers of currently valid International Standards.
5.1 Basic materials
ISO 707 : 1985, Milk and mik products - Methods of sam-
In Order to improve the precision of the results, it is recom-
pling.
mended that, for the preparation of the diluent, dehydrated
basic components or a dehydrated complete preparation
should be used. The manufacturer’s instructions shall be
rigorously followed.
3 Def initions
Chemical reagents shall be of recognized analytical grade.
For the purposes of this International Standard, the following
definitions apply.
The water used shall be water distilled from glass apparatus, or
deionized water. lt shall be free from substances that might
influence the growth of micro-organisms under the test con-
3.1 primary dilution (initial suspension) : The suspen-
ditions. This shall be periodically checked, particularly in the
sion, Solution or emulsion obtained after a weighed or
case of deionized water.
measured quantity of the product under examination (or of
a test Sample prepared from the product) has been mixed,
NOTE - Tests to determine the suitability of water for microbiological
if necessary using a blender and observing appropriate pre-
applications have been published in MARTH, E.H. (editor), Standard
cautions (see the notes to clause 81, with a ninefold quantity of
methods for the examination of dairy products, 15th edition, 1984,
dilution fluid (diluent, see clause 51, allowing large particles, if
Washington D.C., USA : American Public Health Association.
present, to settle.
Solutions of sodium hydroxide or hydrochloric acid (approxi-
NOTE - It may be necessary in certain cases, particularly for products
giving an initial 1 + 9 Suspension which is too viscous or too thick, mately 0,l mol/11 shall be used to adjust the pH of diluents,
to add more diluent. In some other cases, for the results of the tests unless otherwise specified.
1
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ISO8261:1989 (EI
Before use, add 1 ml of this stock Solution (at 20 “C) to
5.2 Diluents for general use
1 000 ml of water for use as diluent.
5.2.1 Peptonekaline Solution
5.3 Diluents for special purposes
Composition
,n (for cheese, processed
5.3.1 Sodium citrate solutic
Peptone 1,o 9
cheese and roller-dried milk)
Sodium chloride (NaCI) 83 g
1000 ml
Water Composition
Trisodium citrate dihydrate
Prepara tion 20,o g
Water 1 000 ml
Dissolve the components in the water, by heating if
Prepara tion
necessary.
Dissolve the salt in the water by heating at 45 OC to 50 OC.
Adjust the pH so that, after sterilization, it is 7,0 + 0,l at
25 OC.
Adjust the pH so that, after sterilization, it is 7,5 + 0,l at
25 OC.
5.2.2 Quarter-strength Ringer’s Solution
5.3.2 Dipotassium hydrogenphosphate Solution (for
Composition
cheese, processed cheese, acid casein and lactic casein
powders, caseinates, acid whey powder and sour cream)
Sodium chloride (NaCI) 2,25 g
0,105 g
Potassium chloride (KCI)
Composition
Calcium chloride, anhydrous (CaC12)
0106 g
Sodium hydrogencarbonate (NaHC03) 0105 g
Dipotassium hydrogenphosphate (K2HP04)
mo g
1000 ml
Water
Water 1 000 ml
Prepara tion
Prepara tion
Dissolve the salts in the water.
Dissolve the salt in the water by heating at 45 OC to 50 OC.
Adjust the pH so that, after sterilization, it is 6,9 + 0,l at
Adjust the pH. For primary dilution of acid casein, lactic
25 OC.
casein and acid whey powder, the pH at 25 OC after
sterilization shall be 8,4 I!I 0,l; for caseinates, cheese, pro-
cessed cheese and sour cream, it shall be 7,5 + OJ.
5.2.3 Peptone Solution
NOTE - The most suitable diluent for rennet casein remains to be
Composition
esta blished.
Peptone Ir0 g
5.4 Distribution, sterilization and storage of
Water 1 000 ml
diluent
Prepara tion
Dispense the diluent (5.2 or 5.3) for the primary dilution into
flasks or bottles (6.4). Dispense the diluent for decimal dilutions
Dissolve the peptone in the water.
(5.2) into the test tubes (flasks or bottles) (6.5). The quantities
Adjust the pH so that, after sterilization, it is 7,0 -t 0,l at dispensed shall be such that, after sterilization, each flask or
25 OC. bottle (6.4) contains 90 ml of diluent or a multiple of 90 ml (or
other required quantities) and each test tube (flask or bottle)
(6.5) contains 9,0 ml of diluent or a multiple of 9,0 ml (or other
5.2.4 Phosphate buffer Solution
required quantities).
Composition o f stock solu tion
Stopper the test tubes, flasks or bottles.
Potassium dihydrogenphosphate ( KH2P04)
42,5 g
Sterilize by autoclaving at 121 OC + 1 OC for 15 min (a longer
1000 ml
Water
period may be necessary for larger volumes).
Prepara tion
If the diluent is not to be used immediately, store it in the dark
at a temperature between 0 OC and 5 OC, for no longer than 1
Dissolve the salt in 500 ml of water.
month, in conditions which do not allow any Change in its
volume or composition.
Adjust the pH using 1,0 mol/1 sodium hydroxide or hydro-
chloric acid Solution so that, after sterilization, it is 7,2 + 0,l
NOTE - If it is necessary to count several groups of micro-organisms
at 25 OC.
using different culture media, it may be necessary to distribute all the
diluents (or some of them) in quantities greater than 9,0 ml; the size of
Dilute to 1 000 ml with water. Store the stock Solution the test tubes, flasks and bottles (6.4 and 6.5) should be specified
under refrigeration. accordingly.
2
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ISO 8261 : 1989 (E)
NOTE - Use only pipettes with unbroken tips and, when appropriate,
6 Apparatus and glassware
having gradua tions distinctly ma rked to contrast sharply with the con-
NOTE - Disposable apparatus is an acceptable alternative to re-
tents.
usable glassware, if it has suitable specifications. Re-usable glassware
should be capable of undergoing repeated sterilization and should be
6.7 Graduated pipettes (plugged with cotton wool), of
chemically inert.
relatively large capacity, for example 10 ml or 20 ml.
microbi ologica I laboratory apparatus and, in particular,
Usual
NOTE - Use only pipettes with unbroken tips and, when appropriate,
the fol lowing.
having graduations distinctly marked to contrast sharply with the con-
tents.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet
sterilization (autoclave) (autoclave operating either separ-
6.8 Glass beads, of diameter about 6 mm.
ately or as part of an apparatus for preparing and distributing
media).
6.9 pH meter, with temperature compensation, accurate to
Apparatus that will come into contact with the diluent, the test 0,l pH unit.
Sample, or the dilutions, except for apparatus that
...
NORME
ISO
INTERNATIONALE
8261
Première édition
1989-07-01
Lait et produits laitiers - Préparation des
échantillons pour essai et des dilutions en vue
de l’examen microbiologique
Milk and mik products - Prepara tion of test samples and dilutions for
microbiological examina tion
Numéro de référence
ISO 8261 : 1989 (FI
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ISO8261 :1989 (FI
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale
d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration
des Normes internationales est en général confiée aux comités techniques de I’ISO.
Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO col-
labore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis
aux comités membres pour approbation, avant leur acceptation comme Normes inter-
nationales par le Conseil de I’ISO. Les Normes internationales sont approuvées confor-
mément aux procédures de I’ISO qui requièrent l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 8261 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34,
Produits agricoles alimentaires, conjointement avec la Fédération internationale de lai-
terie (FIL) et l’Association des chimistes analytiques officiels (AOAC) et sera également
publiée par ces organisations.
0 ISO 1989
Droits de reproduction réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni
utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit de l’éditeur.
Organisation interna tionale de normalisation
Genève 20 l Suisse
Case postale 56 l C H-121 1
Imprimé en Suisse
ii
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ISO 8261 : 1989 (FI
Introduction
La présente Norme internationale est basée sur I’ISO 6887 : 1983, Microbiologie -
Directives générales pour la préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologi-
que. Les adaptations nécessaires aux pratiques des laboratoires de microbiologie de
l’industrie laitière et les instructions spécifiques aux produits laitiers, particulièrement
pour la préparation de l’échantillon, ont été introduites.
La question du ou des diluants à prescrire, a été un sujet important de discussion. Dans
la présente Norme internationale, la solution peptone-sel, adoptée dans I’ISO 6887 a
été mentionnée, de même que trois autres diluants couramment employés, du fait de
leur emploi fréquent dans les laboratoires de microbiologie laitière.
---------------------- Page: 3 ----------------------
Page blanche
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE
ISO 8261 : 1989 (F)
Préparation des échantillons
Lait et produits laitiers -
vue de l’examen
pour essai et des dilutions en
microbiologique
1 Domaine d’application résultats d’essai en rapport avec certains critères de spécification, une
dilution primaire plus concentrée que 1 + 9 peut être demandée. II
devra être tenu compte de ces facteurs dans la suite des opérations
La présente Norme internationale prescrit les directives généra-
et/ou dans l’expression des résultats.
les pour la préparation
- des échantillons pour essai, 3.2 dilutions décimales suivantes : Suspensions, émul-
sions ou solutions obtenues en mélangeant un volume déter-
- des dilutions primaires, et
miné de la dilution primaire (3.1) avec neuf fois le même volume
de diluant approprié (voir note en 3.1), et en répétant cette opé-
- des dilutions suivantes ration sur chaque dilution ainsi préparée jusqu’à obtention
d’une gamme de dilutions décimales appropriée pour I’ense-
en vue de l’examen microbiologique du lait et des produits
mencement des milieux de culture.
laitiers.
4 Principe
2 Référence normative
Préparation de la dilution primaire (suspension mère) (3.1) et, si
nécessaire, des dilutions décimales suivantes (3.2) en vue de
La norme suivante contient des dispositions qui, par suite de la
réduire le nombre de micro-organismes par unité de volume,
référence qui en est faite, constituent des dispositions valables
pour faciliter l’examen microbiologique.
pour la présente Norme internationale. Au moment de la publi-
cation, l’édition indiquée était en vigueur. Toute norme est
sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés
sur la présente Norme internationale sont invitées à rechercher
5 Diluants
la possibilité d’appliquer l’édition la plus récente de la norme
indiquée ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO possèdent
5.1 Composants de base
le registre des Normes internationales en vigueur à un moment
donné.
Pour améliorer la fidélité des résultats, il est recommandé d’uti-
liser, pour la préparation du diluant, des composants de base
ISO 707 : 1985, Lait et produits laitiers - Méthodes d’échantil-
déshydratés ou une préparation complète déshydratée. Les
lonnage.
prescriptions du fabricant doivent être suivies scrupuleu-
sement.
Les produits chimiques doivent être de qualité analytique
3 Définitions
reconnue.
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les défini-
L’eau utilisée doit être de l’eau distillée avec un appareillage en
tions suivantes s’appliquent.
verre, ou de l’eau déminéralisée. Elle doit être exempte de subs-
tances susceptibles d’inhiber la croissance des micro-
3.1 dilution primaire (suspension mère) : Suspension, organismes dans les conditions de l’essai. Ceci doit être con-
solution ou émulsion obtenue après qu’une quantité pesée ou
trôlé périodiquement, en particulier dans le cas de l’eau démi-
mesurée du produit à analyser (ou de l’échantillon pour essai néralisée.
préparé à partir de ce produit) ait été mélangée, si nécessaire en
utilisant un homogénéisateur et en observant des précautions
NOTE - Des essais pour déterminer si l’eau convient pour les applica-
appropriées (voir les notes de l’article 81, avec neuf fois la même tions microbiologiques ont été publiés dans MARTH, E.H. (éditeur),
Standard methods for the examthation of dahy products, 1 !jbme édition,
quantité de diluant (voir article 51, en laissant les grosses parti-
1984, Washington D.C., USA : American Public Health Association.
cules se déposer, si elles existent.
Des solutions d’hydroxyde de sodium ou d’acide chlorhydrique
NOTE - II peut être nécessaire dans certains cas, notamment pour les
produits donnant une suspension mère 1 + 9 très visqueuse ou trop (à 0,l mol/1 environ) doivent être utilisées pour ajuster le pH
épaisse, d’ajouter davantage de diluant. Dans d’autres cas, pour les des diluants, sauf spécifications contraires.
1
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ISO 8261 : 1989 (FI
Diluer à 1 000 ml avec de l’eau. Conserver cette solution
5.2 Diluants pour emploi général
mère au réfrigérateur.
5.2.1 Solution peptone-sel
Avant e mploi, ajouter 1 ml de cette solution mère ( à 20 OC)
ml d’eau pour l’utiliser en tant que diluant
à 1000
Composition
Peptone 5.3 Diluants pour emplois particuliers
IfO g
Chlorure de sodium (NaCI)
83 g
Eau 1 000 ml
5.3.1 Solution de titra te de sodiu m (pour fromage,
fromage fondu et lait sec Hatmaker)
Préparation
Composition
Dissoudre les composants dans l’eau, en chauffant, si
nécessaire.
Citrate trisodique dihydraté (Na&H,0,,2H,O)
20,o g
Eau 1 000 ml
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
7,0 + 0,I à 25 OC.
Préparation
5.2.2 Solution de Ringer diluée au quart Dissoudre le sel dans l’eau en chauffant entre 45 OC et 50 OC.
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
Composition
7,5 + 0,l à 25 OC.
Chlorure de sodium (NaCI) 2,25 g
Chlorure de potassium (KCI) 0,105 g
5.3.2 Solution de monohydrogéno-phosphate de
Chlorure de calcium, anhydre (CaCl*)
06 9
potassium (pour le fromage, le fromage fondu, la caséine
Hydrogénocarbonate de sodium ( NaHC03)
0105 g
acide, les poudres de caséine lactique, les caséinates,
Eau 1000 ml
les poudres de lactosérums acides et la crème aigre)
Préparation
Composition
Dissoudre les sels dans l’eau.
Monohydrogéno-phosphate de potassium
(K,HP04) mo g
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
1 000 ml
Eau
6,9 If: 0,I à 25 OC.
Prépara tion
5.2.3 Solution de peptone
Dissoudre le sel dans l’eau en chauffant entre 45 OC et 50 OC.
Composition
Ajuster le pH. Pour la dilution primaire de la caséine acide,
Peptone
LO g
de la caséine lactique et de la poudre de lactosérum acide, le
Eau 1000 ml
pH après stérilisation, doit être de 8,4 k 0,l à 25 OC. Pour
les caséinates, les fromages, les fromages fondus et la
Préparation
crème aigre, il doit être de 7,5 + 0,l.
Dissoudre la peptone dans l’eau.
encore à établir le diluant qui convient le mieux pour la
NOTE - II reste
caséine présure.
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
7,0 rt 0,I à 25 OC.
5.4 Répartition, stérilisation et conservation
5.2.4 Solution tampon de phosphate
du diluant
Composition de la solution mère Répartir le diluant (5.2 ou 5.3) dans des fioles (6.4) pour la dilu-
tion primaire et dans des tubes à essais (6.5) pour les dilutions
Dihydrogéno-orthophosphate de potassium décimales (5.2) en quantités telles qu’après stérilisation, chaque
fiole (6.4) contienne 90 ml (ou d’autres quantités demandées)
KH2P04) 42,5 9
Eau 1 OOOml et chaque tube à essais (6.5) contienne 9,0 ml de diluant ou un
multiple de 9,0 ml (ou d’autres quantités demandées).
Préparation
Boucher les tubes et les fioles.
Dissoudre le sel dans 500 ml d’eau. Ajuster le pH de sorte
Stériliser à l’autoclave à 121 OC & 1 OC pendant 15 min (un
qu’après stérilisation, il soit de 7,2 + 0,I à 25 OC, à l’aide
d’une solution d’hydroxyde de sodium ou d’acide chlorhy- temps plus long peut être nécessaire pour des volumes plus
importants).
drique à 1 mol/l.
2
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ISO 8261 : 1989 (FI
Si le diluant n’est pas utilisé extemporanément, le conserver à 6.4 Fioles, ayant une capacité suffisante pour contenir, en
laissant un espace libre suffisant pour permettre l’agitation,
l’obscurité entre 0 OC et 5 OC, pendant 1 mois au maximum,
dans des conditions évitant toute modification de son volume 90 ml de diluant utilisés pour la suspension mère, ou des multi-
ou de sa composition. ples de 90 ml.
NOTE - Si l’on doit dénombrer plusieurs groupes de micro-
Tubes à essais, ayant une capacité suffisante pour con-
6.5
organismes en utilisant des milieux de cultures différents, il peut être
nécessaire de répartir tous les diluants (ou quelques-uns) en quantités tenir, en laissant un espace libre suffisant pour permettre I’agi-
supérieures à 9,0 ml. La dimension des tubes à essais et des fioles (6.5
tation, 10 ml (ou un multiple de 10 ml, si nécessaire) de I’échan-
et 6.4) doit être prévue en conséquence.
tillon pour essai (s’il est liquide) ou de la dilution primaire
(autres cas), ou des dilutions décimales suivantes.
6 Appareillage et verrerie
6.6 Pipettes (bouchées avec du coton), ayant une capacité
NOTE - Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que nominale de 1 ml et une ouverture d’écoulement de 1,75 mm à
la verrerie réutilisable, si ses spécifications sont similaires. La verrerie
3 mm de diamètre.
doit pouvoir résister à des stérilisations répétées et être chimiquement
inerte.
NOTE - N’utiliser que des pipettes non ébréchées et, quand cela est
nécessaire, avec des graduations bien marquées pour les distinguer
courant de laboratoire de microbiologie, et notam-
Matériel
nettement du contenu.
ment :
6.7 Pipettes graduées (bouchées avec du coton), de relati-
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche
vement grande capacité, par exemple de 10 ml ou 20 ml.
(four) ou en chaleur humide (autoclave) (autoclave is
...
NORME
ISO
INTERNATIONALE
8261
Première édition
1989-07-01
Lait et produits laitiers - Préparation des
échantillons pour essai et des dilutions en vue
de l’examen microbiologique
Milk and mik products - Prepara tion of test samples and dilutions for
microbiological examina tion
Numéro de référence
ISO 8261 : 1989 (FI
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ISO8261 :1989 (FI
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale
d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration
des Normes internationales est en général confiée aux comités techniques de I’ISO.
Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO col-
labore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis
aux comités membres pour approbation, avant leur acceptation comme Normes inter-
nationales par le Conseil de I’ISO. Les Normes internationales sont approuvées confor-
mément aux procédures de I’ISO qui requièrent l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 8261 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34,
Produits agricoles alimentaires, conjointement avec la Fédération internationale de lai-
terie (FIL) et l’Association des chimistes analytiques officiels (AOAC) et sera également
publiée par ces organisations.
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Droits de reproduction réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni
utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit de l’éditeur.
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Introduction
La présente Norme internationale est basée sur I’ISO 6887 : 1983, Microbiologie -
Directives générales pour la préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologi-
que. Les adaptations nécessaires aux pratiques des laboratoires de microbiologie de
l’industrie laitière et les instructions spécifiques aux produits laitiers, particulièrement
pour la préparation de l’échantillon, ont été introduites.
La question du ou des diluants à prescrire, a été un sujet important de discussion. Dans
la présente Norme internationale, la solution peptone-sel, adoptée dans I’ISO 6887 a
été mentionnée, de même que trois autres diluants couramment employés, du fait de
leur emploi fréquent dans les laboratoires de microbiologie laitière.
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NORME INTERNATIONALE
ISO 8261 : 1989 (F)
Préparation des échantillons
Lait et produits laitiers -
vue de l’examen
pour essai et des dilutions en
microbiologique
1 Domaine d’application résultats d’essai en rapport avec certains critères de spécification, une
dilution primaire plus concentrée que 1 + 9 peut être demandée. II
devra être tenu compte de ces facteurs dans la suite des opérations
La présente Norme internationale prescrit les directives généra-
et/ou dans l’expression des résultats.
les pour la préparation
- des échantillons pour essai, 3.2 dilutions décimales suivantes : Suspensions, émul-
sions ou solutions obtenues en mélangeant un volume déter-
- des dilutions primaires, et
miné de la dilution primaire (3.1) avec neuf fois le même volume
de diluant approprié (voir note en 3.1), et en répétant cette opé-
- des dilutions suivantes ration sur chaque dilution ainsi préparée jusqu’à obtention
d’une gamme de dilutions décimales appropriée pour I’ense-
en vue de l’examen microbiologique du lait et des produits
mencement des milieux de culture.
laitiers.
4 Principe
2 Référence normative
Préparation de la dilution primaire (suspension mère) (3.1) et, si
nécessaire, des dilutions décimales suivantes (3.2) en vue de
La norme suivante contient des dispositions qui, par suite de la
réduire le nombre de micro-organismes par unité de volume,
référence qui en est faite, constituent des dispositions valables
pour faciliter l’examen microbiologique.
pour la présente Norme internationale. Au moment de la publi-
cation, l’édition indiquée était en vigueur. Toute norme est
sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés
sur la présente Norme internationale sont invitées à rechercher
5 Diluants
la possibilité d’appliquer l’édition la plus récente de la norme
indiquée ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO possèdent
5.1 Composants de base
le registre des Normes internationales en vigueur à un moment
donné.
Pour améliorer la fidélité des résultats, il est recommandé d’uti-
liser, pour la préparation du diluant, des composants de base
ISO 707 : 1985, Lait et produits laitiers - Méthodes d’échantil-
déshydratés ou une préparation complète déshydratée. Les
lonnage.
prescriptions du fabricant doivent être suivies scrupuleu-
sement.
Les produits chimiques doivent être de qualité analytique
3 Définitions
reconnue.
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les défini-
L’eau utilisée doit être de l’eau distillée avec un appareillage en
tions suivantes s’appliquent.
verre, ou de l’eau déminéralisée. Elle doit être exempte de subs-
tances susceptibles d’inhiber la croissance des micro-
3.1 dilution primaire (suspension mère) : Suspension, organismes dans les conditions de l’essai. Ceci doit être con-
solution ou émulsion obtenue après qu’une quantité pesée ou
trôlé périodiquement, en particulier dans le cas de l’eau démi-
mesurée du produit à analyser (ou de l’échantillon pour essai néralisée.
préparé à partir de ce produit) ait été mélangée, si nécessaire en
utilisant un homogénéisateur et en observant des précautions
NOTE - Des essais pour déterminer si l’eau convient pour les applica-
appropriées (voir les notes de l’article 81, avec neuf fois la même tions microbiologiques ont été publiés dans MARTH, E.H. (éditeur),
Standard methods for the examthation of dahy products, 1 !jbme édition,
quantité de diluant (voir article 51, en laissant les grosses parti-
1984, Washington D.C., USA : American Public Health Association.
cules se déposer, si elles existent.
Des solutions d’hydroxyde de sodium ou d’acide chlorhydrique
NOTE - II peut être nécessaire dans certains cas, notamment pour les
produits donnant une suspension mère 1 + 9 très visqueuse ou trop (à 0,l mol/1 environ) doivent être utilisées pour ajuster le pH
épaisse, d’ajouter davantage de diluant. Dans d’autres cas, pour les des diluants, sauf spécifications contraires.
1
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ISO 8261 : 1989 (FI
Diluer à 1 000 ml avec de l’eau. Conserver cette solution
5.2 Diluants pour emploi général
mère au réfrigérateur.
5.2.1 Solution peptone-sel
Avant e mploi, ajouter 1 ml de cette solution mère ( à 20 OC)
ml d’eau pour l’utiliser en tant que diluant
à 1000
Composition
Peptone 5.3 Diluants pour emplois particuliers
IfO g
Chlorure de sodium (NaCI)
83 g
Eau 1 000 ml
5.3.1 Solution de titra te de sodiu m (pour fromage,
fromage fondu et lait sec Hatmaker)
Préparation
Composition
Dissoudre les composants dans l’eau, en chauffant, si
nécessaire.
Citrate trisodique dihydraté (Na&H,0,,2H,O)
20,o g
Eau 1 000 ml
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
7,0 + 0,I à 25 OC.
Préparation
5.2.2 Solution de Ringer diluée au quart Dissoudre le sel dans l’eau en chauffant entre 45 OC et 50 OC.
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
Composition
7,5 + 0,l à 25 OC.
Chlorure de sodium (NaCI) 2,25 g
Chlorure de potassium (KCI) 0,105 g
5.3.2 Solution de monohydrogéno-phosphate de
Chlorure de calcium, anhydre (CaCl*)
06 9
potassium (pour le fromage, le fromage fondu, la caséine
Hydrogénocarbonate de sodium ( NaHC03)
0105 g
acide, les poudres de caséine lactique, les caséinates,
Eau 1000 ml
les poudres de lactosérums acides et la crème aigre)
Préparation
Composition
Dissoudre les sels dans l’eau.
Monohydrogéno-phosphate de potassium
(K,HP04) mo g
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
1 000 ml
Eau
6,9 If: 0,I à 25 OC.
Prépara tion
5.2.3 Solution de peptone
Dissoudre le sel dans l’eau en chauffant entre 45 OC et 50 OC.
Composition
Ajuster le pH. Pour la dilution primaire de la caséine acide,
Peptone
LO g
de la caséine lactique et de la poudre de lactosérum acide, le
Eau 1000 ml
pH après stérilisation, doit être de 8,4 k 0,l à 25 OC. Pour
les caséinates, les fromages, les fromages fondus et la
Préparation
crème aigre, il doit être de 7,5 + 0,l.
Dissoudre la peptone dans l’eau.
encore à établir le diluant qui convient le mieux pour la
NOTE - II reste
caséine présure.
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
7,0 rt 0,I à 25 OC.
5.4 Répartition, stérilisation et conservation
5.2.4 Solution tampon de phosphate
du diluant
Composition de la solution mère Répartir le diluant (5.2 ou 5.3) dans des fioles (6.4) pour la dilu-
tion primaire et dans des tubes à essais (6.5) pour les dilutions
Dihydrogéno-orthophosphate de potassium décimales (5.2) en quantités telles qu’après stérilisation, chaque
fiole (6.4) contienne 90 ml (ou d’autres quantités demandées)
KH2P04) 42,5 9
Eau 1 OOOml et chaque tube à essais (6.5) contienne 9,0 ml de diluant ou un
multiple de 9,0 ml (ou d’autres quantités demandées).
Préparation
Boucher les tubes et les fioles.
Dissoudre le sel dans 500 ml d’eau. Ajuster le pH de sorte
Stériliser à l’autoclave à 121 OC & 1 OC pendant 15 min (un
qu’après stérilisation, il soit de 7,2 + 0,I à 25 OC, à l’aide
d’une solution d’hydroxyde de sodium ou d’acide chlorhy- temps plus long peut être nécessaire pour des volumes plus
importants).
drique à 1 mol/l.
2
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ISO 8261 : 1989 (FI
Si le diluant n’est pas utilisé extemporanément, le conserver à 6.4 Fioles, ayant une capacité suffisante pour contenir, en
laissant un espace libre suffisant pour permettre l’agitation,
l’obscurité entre 0 OC et 5 OC, pendant 1 mois au maximum,
dans des conditions évitant toute modification de son volume 90 ml de diluant utilisés pour la suspension mère, ou des multi-
ou de sa composition. ples de 90 ml.
NOTE - Si l’on doit dénombrer plusieurs groupes de micro-
Tubes à essais, ayant une capacité suffisante pour con-
6.5
organismes en utilisant des milieux de cultures différents, il peut être
nécessaire de répartir tous les diluants (ou quelques-uns) en quantités tenir, en laissant un espace libre suffisant pour permettre I’agi-
supérieures à 9,0 ml. La dimension des tubes à essais et des fioles (6.5
tation, 10 ml (ou un multiple de 10 ml, si nécessaire) de I’échan-
et 6.4) doit être prévue en conséquence.
tillon pour essai (s’il est liquide) ou de la dilution primaire
(autres cas), ou des dilutions décimales suivantes.
6 Appareillage et verrerie
6.6 Pipettes (bouchées avec du coton), ayant une capacité
NOTE - Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que nominale de 1 ml et une ouverture d’écoulement de 1,75 mm à
la verrerie réutilisable, si ses spécifications sont similaires. La verrerie
3 mm de diamètre.
doit pouvoir résister à des stérilisations répétées et être chimiquement
inerte.
NOTE - N’utiliser que des pipettes non ébréchées et, quand cela est
nécessaire, avec des graduations bien marquées pour les distinguer
courant de laboratoire de microbiologie, et notam-
Matériel
nettement du contenu.
ment :
6.7 Pipettes graduées (bouchées avec du coton), de relati-
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche
vement grande capacité, par exemple de 10 ml ou 20 ml.
(four) ou en chaleur humide (autoclave) (autoclave is
...
Questions, Comments and Discussion
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