ISO 5541-2:1986
(Main)Milk and milk products — Enumeration of coliforms — Part 2: Most probable number technique at 30 degrees C
Milk and milk products — Enumeration of coliforms — Part 2: Most probable number technique at 30 degrees C
Specifies a method for enumerating bacteria which cause fermentation of lactose with the production of gas and form characteristic growth under the operational conditions describes. Uses a culture technique involving a liquid medium. The calculation of the most probable number is made after incubation at 30 degrees centigrade.
Lait et produits laitiers — Dénombrement des coliformes — Partie 2: Technique du nombre le plus probable après incubation à 30 degrés C
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
International Standard
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATIONWklElKAYHAPOfiHAR OPrAHM3AL&lR IlO CTAH~APTM3AlJWl~ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATlON
Milk and milk products - Enumeration of coliforms -
Part 2: Most probable number technique at 30 *C
Lait et produits laitiers - Denombremen t des coliformes - Partie 2: Technique du nombre Ie plus probable apr&s incubation &
30 *c
First edition - 1986-12-01
F?ef. No. ISO 5541/2-1986 (E)
UDC 637.V.3 : 637.075
Descriptors : agricultural products, dairy products, milk, tests, microbiological analysis, determination, coliform bacteria.
Price based on 8 pages
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Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of
national Standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International
Standards is normally carried out through ISO technical committees. Esch member
body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to
the member bodies for approval before their acceptance as International Standards by
the ISO Council. They are approved in accordance with ISO procedures requiring at
least 75 % approval by the member bodies voting.
International Standard ISO 5541/2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34,
Agricultural food products,
NOTE - The method specified in this International Standard has been developed jointly with the
International Dairy Federation (IDF) and the Association of Official Analytical Chemists (AOAC)
and will also be published by these organizations.
Users should note that all International Standards undergo revision from time to time
and that any reference made herein to any other International Standard implies its
latest edition, unless otherwise stated.
0
0 International Organkation for Standardization, 1986
Printed in Switzerland
---------------------- Page: 2 ----------------------
~~
ISO 5541/2-1986 (E)
INTERNATIONAL STANDARD
Enumeration of coliforms -
ilk and milk products -
Part 2: Most probable number technique at 30 *C
Incubation of the tubes at 30 *C for 48 h.
4.2
1 Scope and field of application
This part of ISO 5541 specifies a method for the enumeration of
4.3 From presumed positive tubes, i.e. those tubes showing
coliforms by means of the culture technique involving a liquid
gas production in the Durharn tube in lactose bile brilliant green
medium, and calculation of the most probable number (MPN)
broth, inoculation on eosin-methylene blue agar.
after incubation at 30 *C.
4.4 Incubation at 30 *C for 24 h.
The method is applicable to
4.5 From confirmed positive tubes, i.e. those tubes showing
-
milk, and liquid milk products;
gas production in lactose bile brilliant green broth and
characteristic growth on eosin-methylene blue agar, calculation
- dried milk, dried sweet whey, dried buttermilk, and
lactose; of the number of coliforms per millilitre or per gram of Sample
(i.e. the MPN) using a table.
-
acid casein, lactic casein and rennet casein;
-
caseinate and dried acid whey;
5 Diluents and media
-
cheese and processed cheese;
5.1 Basic materiak
- butter;
In Order to improve the reproducibility of the results, it is
recommended that, for the preparation of diluents and culture
- frozen milk products (including edible ices);
media, dehydrated basic components or complete dehydrated
-
media should be used. The manufacturer’s instructions shall be
custard, desserts and cream.
rigorously followed.
This method is to be preferred for samples in which com-
The Chemical products used shall be of recognized analytical
paratively low numbers of coliforms (less than 100 per gram or
quality.
10 per millilitre) are suspected.
The water used shall be distilled from glass apparatus or shall
NOTE - For samples with larger numbers of coliforms (more than 100
per gram or 10 per millilitre) see ISO 5541 /l. be deionized water. lt shall be free from substances that might
influence the growth of micro-organisms under the test con-
ditions. This shall be periodically checked, particularly in the
2 Reference
case of deionized water.
ISO 707, Mifk and mik products - Methods of sampling.
Solutions of sodium hydroxide and hydrochloric acid (approx-
imately 0,l mol/litre) should be used to adjust the pH of
diluents and media.
3 Definition
5.2 Diluents for general use
For the purpose of this part of ISO 5541, the following defini-
tion applies.
52.1 Peptondsaline solution
eoliforms: Bacteria which, at 30 *C, Cause fermentation of
NOTE - Peptonekaline Solution is the diluent selected by ISO for
Iactose with the production of gas and form characteristic
general use.
growth under the operational conditions described.
Composition
4 Principle
Peptone
1,o g
4.1 Inoculation of a test Portion and/or a series of decimal Sodium chloride ( NaCI)
85 g
dilutions of the Sample in triplicate into the selective liquid
Water 1 000 ml
medium prescribed in test tubes containing Durharn tubes.
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ISO 5541/2-1986 (El
Prepara tion
Prepara tion
Dissolve the components in water, heating if necessary. Adjust
Dissolve the salt in the water by heating at 45 to 50 OC. Adjust
the pH so that, after sterilization, it is 7,0 I!I 0,l at 25 OC.
the pH so that, after sterilization, it is 7,5 + 0,l at 25 OC.
5.2.2 Quarter-strength Ringer’s Solution
5.3.2 Dipotassium hydrogenphosphate solution (for
cheese, processed cheese, casein, acid casein, dried lactic ca-
Composition
Seins, rennet casein, caseinates, dried acid whey and roller-
Sodium chloride (NaCI) dried mil k).
2,25 g
Potassium chloride (KCI) 0,105 g
Composition
Calcium chloride, anhydrous (CaCl$
0,06 g
Dipotassium hydrogenphosphate K2HP0,)
20 g
Sodium hydrogencarbonate (NaHC03)
0,05 g
1 000 ml
Water 1 000 ml
Prepara tion
Prepara tion
Dissolve the salts in the water. Adjust the pH so that, after Dissolve the salt in the water by heating at 45 to 50 OC. Adjust
the pH. For primary dilution of acid casein and lactic casein, the
sterilization, it is 6,9 + 0,l at 25 OC.
pH after sterilization should be 8,4 + 0,l at 25 OC. For ca-
seinates, cheese, processed cheese, dried acid whey and roller-
5.2.3 Peptone solution
dried milk, it should be 7,5 + 0,l at 25 OC.
Composition
5.4 Distribution, steriliration and storage
Peptone lt0 g
of diluent
1 000 ml
Water
Dispense the diluent (5.2 or 5.3) for the primary dilution into
flasks or bottles (6.4). Dispense the diluent for further decimal
Prepara tion
dilutions (5.2) into test tubes or bottles (6.6). The quantities
dispensed shall be such that, after sterilization, each flask or
Dissolve the peptone in the water. Adjust the pH so that, after
bottle (6.4) contains 90 ml of diluent or a multiple of 90 ml, and
sterilization, it is 7,0 I!I 0,l at 25 OC.
each test tube or bottle (6.6) contains 9,0 ml of diluent or a
multiple of 9,0 ml (or other required quantities). Stopper the
5.2.4 Phosphate buffer solution
test tubes, flasks or bottles.
Composition
Sterilize by autoclaving at 121 + 1 OC for 15 min (a longer
period may be necessary for larger volumes). If the diluent is
Potassium dihydrogenphosphate (KH2P0,) 425 g
not to be used immediately, store it in the dark at 0 to 5 OC, for
no longer than one month, in conditions which do not allow
Water 1000 ml
any Change in its volume or composition.
Prepara tion
Dissolve the salt in 500 ml of water. Adjust the pH so that, after
5.5 Culture media
sterilization, it is 7,2 + 0,l at 25 OC. Dilute to 1 000 ml. Store
this stock Solution at 0 to 5 OC.
5.5.1 Lactose bile brilliant green broth, liquid selective
Add 1,0 ml of this solution to 1 000 ml of water.
medium.
Composition
5.3 ,Diluents for special purposes
Peptone
10 Cl
ution (for cheese, processed
5.3.1 Sod ium citrate sol
cheese roller-dried milk).
and
Lactose QH~OJJ-H~O)
10 g
Composition
Dehydrated ox bile
20 Cl
Trisodium citrate dihydrate
Brilliant green 0,013 3 g
( Na3C6H507m2H20)
20 9
1000 ml
Water
Water 1 OOOml
2
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ISO 5541/2-1986 (EI
Usual microbiological laboratory equipment and in particular :
Prepara tion
complete medium
Dissolve the components or the dehydrated
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet
in the water.
sterilization (autoclave) (autoclave operating either separ-
ately or as part of an apparatus for preparing and distributing
lf necessary, adjust the pH so that, after sterilization, it is
media). Apparatus that will come into contact with the diluent,
7,2 I- 0,l at 25 OC.
the test Sample, or the dilutions, except for apparatus that is
supplied sterile (plastic bags, plastic pipettes, etc.) shall be
Dispense the medium, in quantities of 10 ml, in test tubes (6.7)
sterilized by one of the following methods:
containing Durharn tubes (6.8).
a) by being kept at 170 to 175 OC for not less than 1 h in an
Sterilize in an autoclave (6.1) at 121 + 1 OC for 15 min.
oven ;
steriliza-
The Durharn tubes shall not contain air after
b) by being kept at 121 + 1 OC for not less than 20 min in
tion.
an autoclave.
5.5.2 Double-strength broth
6.2 Blending equipment
Proceed as described in 5.5.1, but use half the quantity of
One of the following shall be used:
water and distribute in 20 x 200 mm test tubes without
Durharn tubes.
a) a rotary blender, operating at a rotational frequency
between 8 000 and 45 000 min - ‘, with glass or metal bowls
5.5.3 Eosin-methylene blue agar, confirmatory medium.
fitted with lids, resistant to the conditions of sterilization ;
Composition
b) a peristaltic-type blender (stomacher), with sterile
plastic bags ;
Peptone
10 9
mortar with pestle.
Cl
Lactose (C12HZ011=H~O)
10 9
NOTE - The bowls, plastic bags or mortar shouid have sufficient
Dipotassium hydrogenphosphate (KZHPO,) 2 g
capacity to aliow the sample to be properiy mixed with the appropriate
amount of diluent. in generai, the voiume of the Container shouid be
Eosin Y 0,4 g
equai to about twice the volume of the test Sample plus diiuent.
Methylene blue 0,065 9
6.3 Mixer, capable of mixing 1 or 2 ml of the test Sample (in
12 to 18 g’,
Agar
the case of liquid products), or the decimal dilutions, in a tube
of adequate dimensions with 9 or 18 ml of diluent, in Order to
1 000 ml
Water
obtain a homogeneous Suspension, and working on the prin-
ciple of eccentric rotation of the contents of the test tube (Vor-
Prepara tion tex mixer).
Suspend the solid components in the water. Adjust the pH, if
6.4 Flasks or bottles, of sufficient capacity to contain the
necessary, so that, after sterilization, it is 6,8 k 0,2 at 25 OC.
90 ml of diluent used for the initial Suspension, or multiples sf
Bring to the boil to dissolve completely. Dispense the medium
90 ml, and leave adequate head-space for mixing.
in 100 to 150 ml quantities into flasks (6.5). Sterilize in an
autoclave at 121 -5 1 OC for 15 min. Cool to 60 OC and Shake
the medium in Order to oxidize the methylene blue (i.e. restore
6.5 Flasks, of capacity 1 50 to 250 ml, to hold the eosin-
its blue colour) and to suspend the precipitate, which is an
methylene blue agar (5.5.3).
essential part of the medium.
Prepare plates containing 10 to 15 ml sf medium for use in 8.6.
6.6 Test tubes or flasks or bottles, of sufficient capacity to
contain, and leave adequate head-space for mixing, 10 ml (or a
multiple of 10 ml, if necessary) of the test Sample (if it is liquid)
6 Apparatus and glassware
or of the primary dilution (in other cases) or further decimal
dilutions.
NOTE - Disposabie apparatus is an acceptabie alternative to re-usable
giassware if it has suitabie specifications. Re-usabie giassware shouid
be capabie of undergoing repeated steriiization and should be 6.7 Test tubes, of capacity 20 ml, to hold the lactose bile
chemicaiiy inert.
brilliant green broth (5.5.1).
1) According to the manufacturer’s instructions.
3
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ISO 5541124986 (E)
8.1.1 Milk, and liquid milk products
6.8 Durharn tubes, of appropriate dimensions for use with
the test tubes (6.7).
Agitate the test Sample thoroughly so that the micro-organisms
are distributed as evenly as possible, by rapidly inverting the
nominal ca-
6.9 Pipettes (plugged with cotton wool)
I Qf
Sample Container 25 times. Foaming should be avoided or foam
3 mm.
pacity 1 ml and having an outlet of diameter 2 to
allowed to disperse. The interval between mixing and removing
the test Portion should not exceed 3 min.
NOTE - Use oniy pipettes with unbroken tips and, when appropriate,
having graduations distinctiy marked to contrast sharpiy with the
Remove 1 ml of the test Sample with a pipette and add to 9 ml
contents.
of diluent (5.2) (or 10 ml of test Sample to 90 ml of diluent or
11 ml of test Sample to 99 ml of diluent). Shake this primary
with cotton wool), of
6.10 Gradua ted pipettes (plugged
dilution (for example, 25 times, with a movement of about
0 or 20 ml
large capacity, for example 1
300 mm, in about 10 s). A 10-’ dilution is thus obtained.
NOTE - Use oniy pipettes with unbroken tips and, when appropriate,
Prepare further dilutions in accordance with 8-2.
having graduations distinctiy marked to contrast sharpiy with the
contents.
8.1.2 Dried milk, dried sweet whey, dried buttermilk,
6.11 Petri dishes, made of glass or plastic, diameter 96 to
and lactose
100 ml.
Thoroughly mix the contents sf the closed Container by
6.12 Glass beads, diameter about 6 mm.
repeatedly shaking and inverting. If the test Sample is in the
original unopened Container, too
...
rme internatio
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION~ME~~YHAPO,QHAR OPTAHM3AkJklR fl0 CTAHfiAPTl43Al&lL4.ORGANISAilON INTERNATIONALE DE NORMALISATION
Dénombrement des coliformes -
Lait et produits laitiers -
Partie 2: Technique du nombre le plus probable après
incubation à 30 OC
Milk and milk products - Enumeration of coliforms - Part 2: Most probable number technique at 30 OC
Première édition - 1986-12-01
Réf m n* : ISO 5641/2-1986 (F)
CDU 637X3 : 637.075
Descripteurs : produit agricole, produit laitier, lait, essai, analyse microbiologique, détermination, bactérie coiiforme.
Prix basé sur 8 pages
---------------------- Page: 1 ----------------------
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale
d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration
des Normes internationales est confiée aux comités techniques de I’ISO. Chaque
comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique
créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouverne-
mentales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis
aux comités membres pour approbation, avant leur acceptation comme Normes inter-
nationales par le Conseil de I’ISO. Les Normes internationales sont approuvées confor-
mément aux procédures de I’ISO qui requièrent l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 5541/2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34,
Produits agricoles alimentaires.
NOTE - La méthode spécifiée dans la présente Norme internationale a été élaborée conjointe-
ment avec la Fédération internationale de laiterie (FIL) et l’Association des chimistes analytiques
(AOAC) et sera également publiée par ces organisations.
L’attention des utilisateurs est attirée sur le fait que toutes les Normes internationales
sont de temps en temps soumises à révision et que toute référence faite à une autre
Norme internationale dans le présent document implique qu’il s’agit, sauf indication
contraire, de la derniére édition.
0 Organisation internationale de normalisation, 1986
Imprimé en Suisse
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ISO 5541/2-1986 (F)
NORME INTERNATIONALE
it et produits laitiers - Dénombrement des coliformes -
Partie 2: Technique du nombre le plus probable après
incubation à 30 OC
1 Objet et domaine d’application 4 Principe
La présente partie de I’ISO 5541 spécifie une méthode pour le
4.1 Ensemencement en triple d’une prise d’essai et/ou des
dénombrement des coliformes par la technique du nombre le
séries de dilutions décimales de l’échantillon dans des tubes de
plus probable (NPP) après incubation à 30 OC en milieu liquide.
milieu sélectif liquide, contenant des cloches de Durham.
La méthode est applicable
4.2 Incubation des tubes à 30 OC pendant 48 h.
-
au lait et aux produits laitiers liquides;
4.3 À partir des tubes présumés positifs (c’est-à-dire pour
-
au lait sec, à la poudre de lactosérum sucré, au
lesquels on observe une production de gaz dans la cloche de
babeurre en poudre et au lactose;
Durham dans le bouillon lactosé bilié au vert brillant), repiquage
sur gélose à I’éosine et au bleu de méthylène.
-
à la caséine acide, à la caséine lactique et à la caséine
présure;
4.4 Incubation à 30 OC pendant 24 h.
-
au caséinate et à la poudre de lactosérum acide;
- 4.5 À partir du nombre de tubes confirmés positifs (c’est-à-
au fromage et au fromage fondu;
dire pour lesquels on observe une production de gaz dans la
- cloche de Durham dans le bouillon lactosé bilié au vert brillant
au beurre;
et des colonies caractéristiques sur gélose à I’éosine et au bleu
- de méthylène), calcul du nombre le plus probable de coliformes
aux produits laitiers congelés (y compris les glaces de
par millilitre ou par gramme d’échantillon au moyen d’une table.
consommation) ;
-
aux flans, aux desserts et à la crème.
5 Diluants et milieux de culture
Cette méthode doit être préférée pour des échantillons suspec-
tés contenir de petits nombres de coliformes (moins de 100 par
5.1 Composants de base
gramme ou 10 par millilitre).
Pour améliorer la reproductibilité des résultats, il est recom-
- Pour les échantillons de grands nombres de coliformes (plus
NOTE
mandé d’utiliser pour la préparation des diluants et des milieux
de 100 par gramme ou 10 par millilitre), voir I’ISO 5541/ 1.
de culture, des composants de base déshydratés ou des milieux
complets déshydratés. Les instructions du fabricant doivent
être suivies rigoureusement.
2 Référence
Les produits chimiques doivent être de qualité analytique
reconnue.
I S 0 707, Lait et produits laitiers - M&ode d’échantillonnage,
L’eau utilisée doit être de l’eau distillée avec un appareil en
verre, ou de l’eau déminéralisée. Elle doit être exempte de subs-
3 Définition tances susceptibles d’inhiber la croissance des micro-
organismes dans les conditions de l’essai. Cela doit être con-
Dans le cadre de la présente partie de I’ISO 5541, la définition trôlé périodiquement, en particulier dans le cas de l’eau déminé-
suivante est applicable.
ralisée.
coliformes: Bactéries qui, à 30 OC, provoquent la fermenta-
Des solutions d’hydroxyde de sodium et d’acide chlorhydrique
tion du lactose avec production de gaz et qui forment des colo-
(environ 0,l mol/litre) doivent être utilisées pour ajuster le pH
nies caractéristiques dans les conditions opératoires décrites.
des diluants et des milieux.
1
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5541/2-1986 (FI
ISO
Ajouter 1,O ml de cette solution à 1 000 ml d’eau.
5.2 Diluants d’emploi général
52.1 Solution peptone-sel
5.3 Diluants d’emploi particulier
comme diluant
NOTE - La solution peptone-sel a été retenue par I’ISO
générai,
d’emploi
5.3.1 Solution de citrate de sodium (pour le fromage, le
fromage fondu et la poudre de lait hatmaker).
Composition
Composition
Peptone 1,o g
Citrate trisodique dihydraté
Chlorure de sodium (NaCI)
8,5 g
(Na3C6Hs07.2HzO) 20 g
Eau 1 000 ml
Eau 1 000 ml
Préparation
Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau, en chauffant si néces-
saire. Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
Dissoudre le sel dans l’eau en chauffant à 45-50 OC. Ajuster le
7,0 I!I 0,l à 25 OC.
pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de 7,5 &- 0,l à 25 OC.
5.2.2 Solution de Ringer diluée au quart
5.3.2 Solution de monohydrogénophosphate de potas-
sium (pour le fromage, le fromage fondu, la caséine, la caséine
Composition
acide, la poudre de caséine lactique, la caséine présure, les
caséinates, la poudre de sérum acide et la poudre de lait hatma-
Chlorure de sodium (NaCI)
225 g ker).
Chlorude de potassium (KCI) 0,105 g
Composition
Chlorure de calcium, anhydre (CaCl*)
606 g
Monohydrogénophosphate de potassium
Hydrogénocarbonate de sodium ( NaHC03) 0,05 g
(K,HP04) 20 9
Eau 1000 ml
1000 ml
Eau
Préparation
Préparation
Dissoudre les sels dans l’eau. Ajuster le pH de sorte qu’après
Dissoudre le sel dans l’eau en chauffant à 45-50 OC. Ajuster le
stérilisation, il soit de 6,9 + 0,l à 25 OC.
pH. Pour la dilution primaire de la caséine acide et de la caséine
lactique, le pH, après stérilisation, doit être de 8,4 + 0,l à
Solution de peptone
5.2.3
25 OC. Pour les caséinates, le fromage, le fromage fondu, la
poudre acide de sérum et la poudre de lait hatmaker, il doit être
Composition
de 7,5 II: 0,l à 25 OC.
Peptone Jr0 g
5.4 Répartition, stérilisation et conservation du
1 000 ml
Eau
diluant
Préparation
Répartir le diluant (5.2 ou 5.3) pour la dilution primaire dans des
fioles (6.4). Répartir le diluant pour les dilutions décimales sui-
Dissoudre la peptone dans l’eau. Ajuster le pH de sorte
vantes (5.2) dans des tubes à essais ou dans des fioles (6.6).
qu’aprés stérilisation, il soit de 7,0 + 0,l à 25 OC.
Les quantités ainsi réparties doivent être telles qu’après stérili-
sation, chaque fiole ou tube à essais (6.4) contienne 90 ml de
5.2.4 Solution tampon de phosphate
diluant ou un multiple de 90 ml (ou tout autre quantité requise)
et que chaque fiole ou tube à essais (6.6) contienne 9,0 ml de
Composition
diluant ou un multiple de 9,0 ml (ou tout autre quantité
requise). Boucher les tubes à essais et les fioles.
Dihydrogénophosphate de potassium (KHzP04) 42,5 g
Stériliser à l’autoclave à 121 + l°C durant 15 min (un temps
Eau 1 000 ml
plus long peut être nécessaire pour les volumes plus grands).
Préparation
Si le diluant n’est pas utilisé extemporanément, le conserver à
Dissoudre le sel dans 500 ml d’eau. Ajuster le pH de sorte l’obscurité entre 0 et 5 OC pendant 1 mois au maximum, dans
qu’après stérilisation, il soit de 7,2 &- 0,l à 25 OC. Diluer à des conditions évitant toute modification de son volume ou de
1 000 ml. Conserver cette solution mère entre 0 et + 5 OC. sa composition.
2
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ISO 5541/2-1986 (FI
5.5 Milieux de culture
Préparation
Mettre en suspension les composants dans l’eau. Ajuster le pH
5.5.1 Bouillon lactosé bilié au vert brillant, milieu liquide
de sorte qu’après stérilisation il soit de 6,8 + 0,2 à 25 OC. Por-
sélectif.
ter à ébullition pour une dissolution complète. Répartir le milieu
par quantités de 160 à 150 ml dans des fioles (6.5). Stériliser à
Composition
l’autoclave à 121 k 1 OC pendant 15 min. Refroidir à 60 OC et
agiter le milieu pour oxyder le bleu de méthylène (c’est-à-dire lui
Peptone 10 g
redonner sa couleur bleue) et former le précipité qui constitue
une partie importante du milieu.
Lactose K,~H~O+i~O) 10 9
Préparer des boîtes contenant 10 à 15 ml du milieu
pour leur
Bile de boeuf déshydratée
20 g
utilisation en 8.6.
0,013 3 g
Vert brillant
1 000 ml
Eau
6 Appareillage et verrerie
Préparation
NOTE - Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que
la verrerie réutilisable, si ses spécifications sont convenables. La verre-
complet dés-
Dissoudre dans l’eau les composan ts ou le milieu
rie réutilisable doit être capable de résister à des stérilisations répétées
hydrate, en portant à ébullition. et être chimiquement inerte.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’aprés stérilisation il soit Matériel courant de laboratoire de microbiologie et notamment:
de 7,2 + 0,l à 25 OC.
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche
Répartir le milieu, par quantités de 10 ml dans des tubes à
(four) ou en chaleur humide (autoclave) (autoclave auto-
essais (6.7) contenant des cloches de Durham (6.8).
nome ou faisant partie d’un appareillage pour préparer et répar-
tir les milieux).
Stériliser l’autoclave à 121 + 1 OC pendant 15 min.
Le matériel en contact avec le diluant, l’échantillon pour essai,
Les cloches de Durham ne doivent pas contenir des bulles d’air
les dilutions, sauf s’il est livré stérile (sacs en plastique, pipettes
après stérilisation.
en plastique, etc.) doit être stérilisé par l’une des méthodes
suivantes :
5.5.2 Bouillon double concentration
a) soit au four, en le maintenant à une température de 170
à 175 OC pendant au moins 1 h;
Opérer selon 5.5.1, mais en n’utilisant que la moitié de
la quantité d’eau et répartir dans des tubes à essais de
b) soit à l’autoclave, en le maintenant à une température
20 x 200 mm sans cloches de Durham.
de 121 It 1 OC pendant au moins 20 min.
5.5.3 Gélose à I’éosine et au bleu de méthylène, milieu de
6.2 Appareillage pour I’homogétvZisation
confirmation
Un des appareils suivants doit être utilisé:
Composition
a) un homogénéisateur rotatif, dont la fréquence de rota-
Peptone
10 g
tion est comprise entre 8 000 et 45 000 min - ‘, avec des
bols en verre ou en métal, munis de préférence de couver-
Lactose (C~~H~O~J*H~O)
10 g
cles, résistant aux conditions de stérilisation;
Monohydrogénophosphate de potassium
b) un homogénéisateur péristaltique stomacher),
de type
K,HPO,)
2g
avec des sacs stériles en plastiqu
e;
Eosine Y
0,4 g
c) un mortier avec pilon.
Bleu de méthylène
0,065 g
NOTE - Les bols, les sacs en plastique ou le mortier doivent avoir une
capacité suffisante pour permettre de mélanger correctement I’échan-
Agar-agar
12 à 18 g”
tillon avec la quantité appropriée de diluant. En général, le volume du
récipient doit être environ le double du volume de l’échantillon pour
Eau 1000 ml
essai additionné du diluant.
1) Selon les prescriptions
du fabricant.
3
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 5541/2-1986 (FI
6.3 Agitateur, capable de mélanger 1 ou 2 ml de I’échantil- 8 Mode opératoire
Ion pour essai (cas des produits liquides) ou des dilutions déci-
NOTES
males, dans un tube de dimensions suffisantes, avec 9 ou 18 ml
de diluant, afin d’obtenir une suspension homogène, et dont le
Les opérations décrites en 8.1 à 8.5 ne nt pas être effectuées à
principe de fonctionnement est basé sur un mouvement de rota-
la lumière directe du soleil
tion excentré du contenu des tubes à essais (agitateur Vortex).
2 Des précautions normales d’aseptie doivent être prises toutes les
6.4 Fioles, de capacité suffisante pour contenir les 90 ml de
fois que c’est nécessaire.
diluant utilisés pour la suspension-mère, ou des multiples de
90 ml, en laissant un espace suffisant pour l’agitation.
8.1 Préparation de l’échantillon pour essai et de
6.5 Fioles, de 150 à 250 ml de capacité, pour contenir la
la dilution primaire
gélose à I’éosine et au bleu de méthylène (5.5.3).
Pour éviter d’endommager les micro-organismes par de brus-
6.6 Tubes à essais ou fioles, de capacité suffisante pour
ques changements de température, la température du diluant
contenir 10 ml (ou un multiple de 10 ml, si nécessaire), de
pendant les opérations décrites ci-après doit être du même
l’échantillon pour essai (s’il est liquide) ou de la dilution primaire
ordre que celle de l’échantillon pour essai, sauf prescriptions
(autres cas) ou des dilutions décimales suivantes et laisser un
contraires.
espace libre adéquat pour permettre une agitation convenable.
6.7 Tubes à essais, de 20 ml de capacité, pour contenir le
8.1.1 Lait et produits laitiers liquides
bouillon lactosé bilié au vert brillant (5.5.1).
Agiter vigoureusement l’échantillon pour essai, afin d’assurer
6.8 C loches de Durham, de dimensions appropriées en vue
une répartition aussi uniforme que possible des micro-
utilisation dans les tubes à essais (6
de leur .7).
organismes, en inversant rapidement 25 fois le récipient conte-
nant l’échantillon. II faut éviter la formation de mousse ou bien
6.9 Pipettes (bouchées avec du coton), de 1 ml de capacité
la laisser se disperser. L’intervalle entre le mélange et le prélève-
nominale et ayant un orifice d’écoulement de 2 à 3 mm de
ment de la prise d’essai ne doit pas dépasser 3 min.
diamètre.
Prélever 1 ml de l’échantillon pour essai à la pipette et l’ajouter
NOTE - N’utiliser que des pipettes non ébréchées et, quand cela est
à 9 ml de diluant (5.2) (ou 10 ml d’échantillon pour essai à 90 ml
nécessaire, avec des graduations bien marquées pour les distinguer
de diluant ou 11 ml à 99 ml). Agiter cette dilution primaire (par
nettement du contenu.
exemple 25 fois avec un mouvement d’environ 300 mm pen-
dant environ 10 s). Une dilution IO- ’ est ainsi obtenue.
6.10 Pipettes graduées ( bouchées avec du coton), de
grande capacité, par exemple 10 ou 20 ml.
Préparer les dilutions suivantes selon 8.2.
NOTE - N’utiliser que des pipettes non ébréchées et, quand cela est
nécessaire, avec des graduations bien marquées pour les distinguer
8.1.2 Lait sec, poud re de lactosé lrum sucré,
babeurre en
nettement du contenu.
poudre et lactose
6.11 Boîtes de Petri, en verre ou en plastique, de 90 à
Mélanger soigneusement le contenu du récipient fermé en le
100 mm de diamètre.
secouant de facon répétée par inversion. Si l’échantillon pour
essai enfermé dans son emballage d’origine est trop plein pour
6.12 Billes de verre, d’environ 6
...
rme internatio
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION~ME~~YHAPO,QHAR OPTAHM3AkJklR fl0 CTAHfiAPTl43Al&lL4.ORGANISAilON INTERNATIONALE DE NORMALISATION
Dénombrement des coliformes -
Lait et produits laitiers -
Partie 2: Technique du nombre le plus probable après
incubation à 30 OC
Milk and milk products - Enumeration of coliforms - Part 2: Most probable number technique at 30 OC
Première édition - 1986-12-01
Réf m n* : ISO 5641/2-1986 (F)
CDU 637X3 : 637.075
Descripteurs : produit agricole, produit laitier, lait, essai, analyse microbiologique, détermination, bactérie coiiforme.
Prix basé sur 8 pages
---------------------- Page: 1 ----------------------
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale
d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration
des Normes internationales est confiée aux comités techniques de I’ISO. Chaque
comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique
créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouverne-
mentales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis
aux comités membres pour approbation, avant leur acceptation comme Normes inter-
nationales par le Conseil de I’ISO. Les Normes internationales sont approuvées confor-
mément aux procédures de I’ISO qui requièrent l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 5541/2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34,
Produits agricoles alimentaires.
NOTE - La méthode spécifiée dans la présente Norme internationale a été élaborée conjointe-
ment avec la Fédération internationale de laiterie (FIL) et l’Association des chimistes analytiques
(AOAC) et sera également publiée par ces organisations.
L’attention des utilisateurs est attirée sur le fait que toutes les Normes internationales
sont de temps en temps soumises à révision et que toute référence faite à une autre
Norme internationale dans le présent document implique qu’il s’agit, sauf indication
contraire, de la derniére édition.
0 Organisation internationale de normalisation, 1986
Imprimé en Suisse
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 5541/2-1986 (F)
NORME INTERNATIONALE
it et produits laitiers - Dénombrement des coliformes -
Partie 2: Technique du nombre le plus probable après
incubation à 30 OC
1 Objet et domaine d’application 4 Principe
La présente partie de I’ISO 5541 spécifie une méthode pour le
4.1 Ensemencement en triple d’une prise d’essai et/ou des
dénombrement des coliformes par la technique du nombre le
séries de dilutions décimales de l’échantillon dans des tubes de
plus probable (NPP) après incubation à 30 OC en milieu liquide.
milieu sélectif liquide, contenant des cloches de Durham.
La méthode est applicable
4.2 Incubation des tubes à 30 OC pendant 48 h.
-
au lait et aux produits laitiers liquides;
4.3 À partir des tubes présumés positifs (c’est-à-dire pour
-
au lait sec, à la poudre de lactosérum sucré, au
lesquels on observe une production de gaz dans la cloche de
babeurre en poudre et au lactose;
Durham dans le bouillon lactosé bilié au vert brillant), repiquage
sur gélose à I’éosine et au bleu de méthylène.
-
à la caséine acide, à la caséine lactique et à la caséine
présure;
4.4 Incubation à 30 OC pendant 24 h.
-
au caséinate et à la poudre de lactosérum acide;
- 4.5 À partir du nombre de tubes confirmés positifs (c’est-à-
au fromage et au fromage fondu;
dire pour lesquels on observe une production de gaz dans la
- cloche de Durham dans le bouillon lactosé bilié au vert brillant
au beurre;
et des colonies caractéristiques sur gélose à I’éosine et au bleu
- de méthylène), calcul du nombre le plus probable de coliformes
aux produits laitiers congelés (y compris les glaces de
par millilitre ou par gramme d’échantillon au moyen d’une table.
consommation) ;
-
aux flans, aux desserts et à la crème.
5 Diluants et milieux de culture
Cette méthode doit être préférée pour des échantillons suspec-
tés contenir de petits nombres de coliformes (moins de 100 par
5.1 Composants de base
gramme ou 10 par millilitre).
Pour améliorer la reproductibilité des résultats, il est recom-
- Pour les échantillons de grands nombres de coliformes (plus
NOTE
mandé d’utiliser pour la préparation des diluants et des milieux
de 100 par gramme ou 10 par millilitre), voir I’ISO 5541/ 1.
de culture, des composants de base déshydratés ou des milieux
complets déshydratés. Les instructions du fabricant doivent
être suivies rigoureusement.
2 Référence
Les produits chimiques doivent être de qualité analytique
reconnue.
I S 0 707, Lait et produits laitiers - M&ode d’échantillonnage,
L’eau utilisée doit être de l’eau distillée avec un appareil en
verre, ou de l’eau déminéralisée. Elle doit être exempte de subs-
3 Définition tances susceptibles d’inhiber la croissance des micro-
organismes dans les conditions de l’essai. Cela doit être con-
Dans le cadre de la présente partie de I’ISO 5541, la définition trôlé périodiquement, en particulier dans le cas de l’eau déminé-
suivante est applicable.
ralisée.
coliformes: Bactéries qui, à 30 OC, provoquent la fermenta-
Des solutions d’hydroxyde de sodium et d’acide chlorhydrique
tion du lactose avec production de gaz et qui forment des colo-
(environ 0,l mol/litre) doivent être utilisées pour ajuster le pH
nies caractéristiques dans les conditions opératoires décrites.
des diluants et des milieux.
1
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5541/2-1986 (FI
ISO
Ajouter 1,O ml de cette solution à 1 000 ml d’eau.
5.2 Diluants d’emploi général
52.1 Solution peptone-sel
5.3 Diluants d’emploi particulier
comme diluant
NOTE - La solution peptone-sel a été retenue par I’ISO
générai,
d’emploi
5.3.1 Solution de citrate de sodium (pour le fromage, le
fromage fondu et la poudre de lait hatmaker).
Composition
Composition
Peptone 1,o g
Citrate trisodique dihydraté
Chlorure de sodium (NaCI)
8,5 g
(Na3C6Hs07.2HzO) 20 g
Eau 1 000 ml
Eau 1 000 ml
Préparation
Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau, en chauffant si néces-
saire. Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
Dissoudre le sel dans l’eau en chauffant à 45-50 OC. Ajuster le
7,0 I!I 0,l à 25 OC.
pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de 7,5 &- 0,l à 25 OC.
5.2.2 Solution de Ringer diluée au quart
5.3.2 Solution de monohydrogénophosphate de potas-
sium (pour le fromage, le fromage fondu, la caséine, la caséine
Composition
acide, la poudre de caséine lactique, la caséine présure, les
caséinates, la poudre de sérum acide et la poudre de lait hatma-
Chlorure de sodium (NaCI)
225 g ker).
Chlorude de potassium (KCI) 0,105 g
Composition
Chlorure de calcium, anhydre (CaCl*)
606 g
Monohydrogénophosphate de potassium
Hydrogénocarbonate de sodium ( NaHC03) 0,05 g
(K,HP04) 20 9
Eau 1000 ml
1000 ml
Eau
Préparation
Préparation
Dissoudre les sels dans l’eau. Ajuster le pH de sorte qu’après
Dissoudre le sel dans l’eau en chauffant à 45-50 OC. Ajuster le
stérilisation, il soit de 6,9 + 0,l à 25 OC.
pH. Pour la dilution primaire de la caséine acide et de la caséine
lactique, le pH, après stérilisation, doit être de 8,4 + 0,l à
Solution de peptone
5.2.3
25 OC. Pour les caséinates, le fromage, le fromage fondu, la
poudre acide de sérum et la poudre de lait hatmaker, il doit être
Composition
de 7,5 II: 0,l à 25 OC.
Peptone Jr0 g
5.4 Répartition, stérilisation et conservation du
1 000 ml
Eau
diluant
Préparation
Répartir le diluant (5.2 ou 5.3) pour la dilution primaire dans des
fioles (6.4). Répartir le diluant pour les dilutions décimales sui-
Dissoudre la peptone dans l’eau. Ajuster le pH de sorte
vantes (5.2) dans des tubes à essais ou dans des fioles (6.6).
qu’aprés stérilisation, il soit de 7,0 + 0,l à 25 OC.
Les quantités ainsi réparties doivent être telles qu’après stérili-
sation, chaque fiole ou tube à essais (6.4) contienne 90 ml de
5.2.4 Solution tampon de phosphate
diluant ou un multiple de 90 ml (ou tout autre quantité requise)
et que chaque fiole ou tube à essais (6.6) contienne 9,0 ml de
Composition
diluant ou un multiple de 9,0 ml (ou tout autre quantité
requise). Boucher les tubes à essais et les fioles.
Dihydrogénophosphate de potassium (KHzP04) 42,5 g
Stériliser à l’autoclave à 121 + l°C durant 15 min (un temps
Eau 1 000 ml
plus long peut être nécessaire pour les volumes plus grands).
Préparation
Si le diluant n’est pas utilisé extemporanément, le conserver à
Dissoudre le sel dans 500 ml d’eau. Ajuster le pH de sorte l’obscurité entre 0 et 5 OC pendant 1 mois au maximum, dans
qu’après stérilisation, il soit de 7,2 &- 0,l à 25 OC. Diluer à des conditions évitant toute modification de son volume ou de
1 000 ml. Conserver cette solution mère entre 0 et + 5 OC. sa composition.
2
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ISO 5541/2-1986 (FI
5.5 Milieux de culture
Préparation
Mettre en suspension les composants dans l’eau. Ajuster le pH
5.5.1 Bouillon lactosé bilié au vert brillant, milieu liquide
de sorte qu’après stérilisation il soit de 6,8 + 0,2 à 25 OC. Por-
sélectif.
ter à ébullition pour une dissolution complète. Répartir le milieu
par quantités de 160 à 150 ml dans des fioles (6.5). Stériliser à
Composition
l’autoclave à 121 k 1 OC pendant 15 min. Refroidir à 60 OC et
agiter le milieu pour oxyder le bleu de méthylène (c’est-à-dire lui
Peptone 10 g
redonner sa couleur bleue) et former le précipité qui constitue
une partie importante du milieu.
Lactose K,~H~O+i~O) 10 9
Préparer des boîtes contenant 10 à 15 ml du milieu
pour leur
Bile de boeuf déshydratée
20 g
utilisation en 8.6.
0,013 3 g
Vert brillant
1 000 ml
Eau
6 Appareillage et verrerie
Préparation
NOTE - Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que
la verrerie réutilisable, si ses spécifications sont convenables. La verre-
complet dés-
Dissoudre dans l’eau les composan ts ou le milieu
rie réutilisable doit être capable de résister à des stérilisations répétées
hydrate, en portant à ébullition. et être chimiquement inerte.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu’aprés stérilisation il soit Matériel courant de laboratoire de microbiologie et notamment:
de 7,2 + 0,l à 25 OC.
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche
Répartir le milieu, par quantités de 10 ml dans des tubes à
(four) ou en chaleur humide (autoclave) (autoclave auto-
essais (6.7) contenant des cloches de Durham (6.8).
nome ou faisant partie d’un appareillage pour préparer et répar-
tir les milieux).
Stériliser l’autoclave à 121 + 1 OC pendant 15 min.
Le matériel en contact avec le diluant, l’échantillon pour essai,
Les cloches de Durham ne doivent pas contenir des bulles d’air
les dilutions, sauf s’il est livré stérile (sacs en plastique, pipettes
après stérilisation.
en plastique, etc.) doit être stérilisé par l’une des méthodes
suivantes :
5.5.2 Bouillon double concentration
a) soit au four, en le maintenant à une température de 170
à 175 OC pendant au moins 1 h;
Opérer selon 5.5.1, mais en n’utilisant que la moitié de
la quantité d’eau et répartir dans des tubes à essais de
b) soit à l’autoclave, en le maintenant à une température
20 x 200 mm sans cloches de Durham.
de 121 It 1 OC pendant au moins 20 min.
5.5.3 Gélose à I’éosine et au bleu de méthylène, milieu de
6.2 Appareillage pour I’homogétvZisation
confirmation
Un des appareils suivants doit être utilisé:
Composition
a) un homogénéisateur rotatif, dont la fréquence de rota-
Peptone
10 g
tion est comprise entre 8 000 et 45 000 min - ‘, avec des
bols en verre ou en métal, munis de préférence de couver-
Lactose (C~~H~O~J*H~O)
10 g
cles, résistant aux conditions de stérilisation;
Monohydrogénophosphate de potassium
b) un homogénéisateur péristaltique stomacher),
de type
K,HPO,)
2g
avec des sacs stériles en plastiqu
e;
Eosine Y
0,4 g
c) un mortier avec pilon.
Bleu de méthylène
0,065 g
NOTE - Les bols, les sacs en plastique ou le mortier doivent avoir une
capacité suffisante pour permettre de mélanger correctement I’échan-
Agar-agar
12 à 18 g”
tillon avec la quantité appropriée de diluant. En général, le volume du
récipient doit être environ le double du volume de l’échantillon pour
Eau 1000 ml
essai additionné du diluant.
1) Selon les prescriptions
du fabricant.
3
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ISO 5541/2-1986 (FI
6.3 Agitateur, capable de mélanger 1 ou 2 ml de I’échantil- 8 Mode opératoire
Ion pour essai (cas des produits liquides) ou des dilutions déci-
NOTES
males, dans un tube de dimensions suffisantes, avec 9 ou 18 ml
de diluant, afin d’obtenir une suspension homogène, et dont le
Les opérations décrites en 8.1 à 8.5 ne nt pas être effectuées à
principe de fonctionnement est basé sur un mouvement de rota-
la lumière directe du soleil
tion excentré du contenu des tubes à essais (agitateur Vortex).
2 Des précautions normales d’aseptie doivent être prises toutes les
6.4 Fioles, de capacité suffisante pour contenir les 90 ml de
fois que c’est nécessaire.
diluant utilisés pour la suspension-mère, ou des multiples de
90 ml, en laissant un espace suffisant pour l’agitation.
8.1 Préparation de l’échantillon pour essai et de
6.5 Fioles, de 150 à 250 ml de capacité, pour contenir la
la dilution primaire
gélose à I’éosine et au bleu de méthylène (5.5.3).
Pour éviter d’endommager les micro-organismes par de brus-
6.6 Tubes à essais ou fioles, de capacité suffisante pour
ques changements de température, la température du diluant
contenir 10 ml (ou un multiple de 10 ml, si nécessaire), de
pendant les opérations décrites ci-après doit être du même
l’échantillon pour essai (s’il est liquide) ou de la dilution primaire
ordre que celle de l’échantillon pour essai, sauf prescriptions
(autres cas) ou des dilutions décimales suivantes et laisser un
contraires.
espace libre adéquat pour permettre une agitation convenable.
6.7 Tubes à essais, de 20 ml de capacité, pour contenir le
8.1.1 Lait et produits laitiers liquides
bouillon lactosé bilié au vert brillant (5.5.1).
Agiter vigoureusement l’échantillon pour essai, afin d’assurer
6.8 C loches de Durham, de dimensions appropriées en vue
une répartition aussi uniforme que possible des micro-
utilisation dans les tubes à essais (6
de leur .7).
organismes, en inversant rapidement 25 fois le récipient conte-
nant l’échantillon. II faut éviter la formation de mousse ou bien
6.9 Pipettes (bouchées avec du coton), de 1 ml de capacité
la laisser se disperser. L’intervalle entre le mélange et le prélève-
nominale et ayant un orifice d’écoulement de 2 à 3 mm de
ment de la prise d’essai ne doit pas dépasser 3 min.
diamètre.
Prélever 1 ml de l’échantillon pour essai à la pipette et l’ajouter
NOTE - N’utiliser que des pipettes non ébréchées et, quand cela est
à 9 ml de diluant (5.2) (ou 10 ml d’échantillon pour essai à 90 ml
nécessaire, avec des graduations bien marquées pour les distinguer
de diluant ou 11 ml à 99 ml). Agiter cette dilution primaire (par
nettement du contenu.
exemple 25 fois avec un mouvement d’environ 300 mm pen-
dant environ 10 s). Une dilution IO- ’ est ainsi obtenue.
6.10 Pipettes graduées ( bouchées avec du coton), de
grande capacité, par exemple 10 ou 20 ml.
Préparer les dilutions suivantes selon 8.2.
NOTE - N’utiliser que des pipettes non ébréchées et, quand cela est
nécessaire, avec des graduations bien marquées pour les distinguer
8.1.2 Lait sec, poud re de lactosé lrum sucré,
babeurre en
nettement du contenu.
poudre et lactose
6.11 Boîtes de Petri, en verre ou en plastique, de 90 à
Mélanger soigneusement le contenu du récipient fermé en le
100 mm de diamètre.
secouant de facon répétée par inversion. Si l’échantillon pour
essai enfermé dans son emballage d’origine est trop plein pour
6.12 Billes de verre, d’environ 6
...
Questions, Comments and Discussion
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