oSIST prEN 14526:2025
(Main)Foodstuffs - Determination of saxitoxin-group toxins in shellfish - HPLC method using pre-column derivatization with peroxide or periodate oxidation
Foodstuffs - Determination of saxitoxin-group toxins in shellfish - HPLC method using pre-column derivatization with peroxide or periodate oxidation
This document specifies a method [1] for the quantitative determination of saxitoxin (STX), decarbamoyl saxitoxin (dcSTX), neosaxitoxin (NEO), decarbamoyl neosaxitoxin (dcNEO), gonyautoxin 1 and 4 (GTX1,4; sum of isomers), gonyautoxin 2 and 3 (GTX2,3; sum of isomers), gonyautoxin 5 (GTX5 also called B1), gonyautoxin 6 (GTX6 also called B2), decarbamoyl gonyautoxin 2 and 3 (dcGTX2,3; sum of isomers), N sulfocarbamoyl gonyautoxin 2 and 3 (C1,2; sum of isomers) and N-sulfocarbamoyl gonyautoxin 1 and 4 (C3,4; sum of isomers) in (raw) mussels, oysters, scallops and clams. Laboratory experience has shown that this document can also be applied to other marine invertebrates [2], [3] and processed products of those species, however, no complete interlaboratory validation study according to ISO 5725 2:1994 has been carried out so far. The method described was validated in an interlaboratory study [4], [5] and was also verified in a European Union Reference Laboratory for Marine Biotoxins (EURLMB)-performance test aiming the total toxicity of the samples [6]. Toxins which were not available in the first interlaboratory study [4], [5] as dcGTX2,3 and dcNEO were validated in two additional interlaboratory studies [7], [8]. The lowest validated levels [4], [5], [8], are given in µg toxin (free base)/kg shellfish tissue and also as µmol/kg shellfish tissue and are listed in Table 1.
[Table 1]
A quantitative determination of GTX6 was not included in the first interlaboratory study but several laboratories detected this toxin directly after solid phase extraction with ion-exchange (SPE-COOH) clean-up and reported a mass concentration of 30 µg/kg or higher in certain samples. For that reason, the present method is applicable to quantify GTX6 directly, depending on the availability of the standard substance. Whenever GTX6 standard is not commercially available, it is possible to determine GTX6 after hydrolysis of Fraction 2 of the SPE-COOH clean-up, described in 6.4, as NEO. The indirect quantification of GTX6 was validated in two additional interlaboratory studies [7], [8]. A study to compare direct and indirect GTX6 quantification was conducted at the EURLMB [16].
A quantitative determination of C3,4 was included in the first interlaboratory study. The present method is applicable to quantify C3,4 directly, depending on the availability of the standard substance. If no standard substances are available, C3,4 can only be quantified as GTX1,4 if the same hydrolysis protocol used for GTX6 (6.4) is applied to Fraction 1 of the SPE-COOH clean-up [10]. A study to compare direct and indirect C3,4 quantification was conducted at the EURLMB [16].
Lebensmittel - Bestimmung von Toxinen der Saxitoxingruppe in Schalentieren - HPLC-Verfahren mit Vorsäulenderivatisierung und Peroxid- oder Periodatoxidation
Dieses Dokument legt ein Verfahren [1] für die quantitative Bestimmung von Saxitoxin (STX), Decarbamoyl-Saxitoxin (dcSTX), Neosaxitoxin (NEO), Decarbamoyl-Neosaxitoxin (dcNEO), Gonyautoxin 1 und 4 (GTX1,4; Summe der Isomere), Gonyautoxin 2 und 3 (GTX2,3; Summe der Isomere), Gonyautoxin 5 (GTX5, auch als B1 bezeichnet), Gonyautoxin 6 (GTX6, auch als B2 bezeichnet), Decarbamoyl-Gonyautoxin 2 und 3 (dcGTX2,3; Summe der Isomere), N-Sulfocarbamoyl-Gonyautoxin 2 und 3 (C1,2; Summe der Isomere) und N-Sulfocarbamoyl-Gonyautoxin 1 und 4 (C3,4; Summe der Isomere) in (rohen) Miesmuscheln, Austern, Jakobsmuscheln und Venusmuscheln fest. Laborerfahrungen haben gezeigt, dass das Verfahren auch auf andere wirbellose Meerestiere [2], [3] und aus diesen Arten hergestellte Verarbeitungserzeugnisse angewendet werden kann; jedoch wurde bisher noch kein vollständiger Ringversuch zur Validierung nach ISO 5725 2:1994 durchgeführt. Das beschriebene Verfahren wurde in einem Ringversuch [4], [5] validiert und auch in einer Leistungsprüfung des EU-Referenzlabors für Marine Biotoxine (European Union Laboratory for Marine Biotoxins, EURLMB) verifiziert, die auf die Gesamttoxizität der Proben ausgerichtet war [6]. Toxine, die nicht im ersten Ringversuch [4], [5] verfügbar waren, wie z. B. dcGTX2,3 und dcNEO, wurden in zwei weiteren Ringversuchen [7], [8] validiert. Die niedrigsten validierten Werte [4], [5], [8] sind in µg Toxin (freie Base)/kg Schalentiergewebe und auch in µmol/kg Schalentiergewebe angegeben und in Tabelle 1 aufgeführt.
[Tabelle 1]
GTX6 wurde im ersten Ringversuch nicht quantitativ bestimmt, jedoch wiesen mehrere Laboratorien dieses Toxin direkt nach der Reinigung mit Festphasenextraktion an einem Ionenaustauscher (SPE-COOH) nach. Diese Laboratorien gaben eine Massenkonzentration von 30 µg/kg oder höher in einigen Proben an. Aus diesem Grund ist das vorliegende Verfahren, abhängig von der Verfügbarkeit der Standardsubstanz, für die direkte Quantifizierung von GTX6 anwendbar. Wenn keine Standardsubstanz für GTX6 kommerziell verfügbar ist, besteht die Möglichkeit, GTX6 nach einer Hydrolyse der Fraktion 2 der SPE-COOH-Reinigung als NEO zu bestimmen, wie in 6.4 beschrieben. Die indirekte Quantifizierung von GTX6 wurde in zwei zusätzlichen Ringversuchen [7], [8] validiert. Eine Studie zum Vergleich zwischen direkter und indirekter Quantifizierung von GTX6 wurde am EURLMB durchgeführt [16].
C3,4 wurde im ersten Ringversuch quantitativ bestimmt. Das vorliegende Verfahren ist, abhängig von der Verfügbarkeit der Standardsubstanz, für die direkte Quantifizierung von C3,4 anwendbar. Wenn keine Standardsubstanz verfügbar ist, kann C3,4 nur als GTX1,4 quantifiziert werden, wenn die gleiche Hydrolysevorschrift wie für GTX6 (6.4) auf die Fraktion 1 der SPE-COOH-Reinigung angewendet wird [10]. Eine Studie zum Vergleich zwischen direkter und indirekter Quantifizierung von C3,4 wurde am EURLMB durchgeführt [16].
GTX6 wurde im ersten Ringversuch nicht quantitativ bestimmt, jedoch wiesen mehrere Laboratorien dieses Toxin direkt nach der Reinigung mit Festphasenextraktion an einem Ionenaustauscher (SPE-COOH) nach. Diese Laboratorien gaben eine Massenkonzentration von 30 µg/kg oder höher in einigen Proben an. Aus diesem Grund ist das vorliegende Verfahren, abhängig von der Verfügbarkeit der Standardsubstanz, für die direkte Quantifizierung von GTX6 anwendbar. Wenn keine Standardsubstanz für GTX6 kommerziell verfügbar ist, besteht die Möglichkeit, GTX6 nach einer Hydrolyse der Fraktion 2 der SPE-COOH-Reinigung als NEO zu bestimmen, wie in 6.4 beschrieben. Die indirekte Quantifizierung von GTX6 wurde in zwei zusätzlichen Ringversuchen [7], [8] validiert. Eine Studie zum Vergleich zwischen direkter und indirekter Quantifizierung von GTX6 wurde am EURLMB durchgeführt [16].
C3,4 wurde im ersten Ringversuch quantitativ bestimmt. [...]
Produits alimentaires - Détermination de la teneur en toxines du groupe de la saxitoxine dans les coquillages - Méthode par CLHP avec dérivation pré-colonne et par oxydation au peroxyde ou au periodate
Živila - Določevanje toksinov iz skupine saksitoksina v školjkah - Metoda HPLC z uporabo predkolonske derivatizacije s peroksidno ali perjodatno oksidacijo
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
SLOVENSKI STANDARD
01-januar-2025
Živila - Določevanje toksinov iz skupine saksitoksina v školjkah - Metoda HPLC z
uporabo predkolonske derivatizacije s peroksidno ali perjodatno oksidacijo
Foodstuffs - Determination of saxitoxin-group toxins in shellfish - HPLC method using
pre-column derivatization with peroxide or periodate oxidation
Lebensmittel - Bestimmung von Toxinen der Saxitoxingruppe in Schalentieren - HPLC-
Verfahren mit Vorsäulenderivatisierung und Peroxid- oder Periodatoxidation
Produits alimentaires - Détermination de la teneur en toxines du groupe de la saxitoxine
dans les coquillages - Méthode par CLHP avec dérivation pré-colonne et par oxydation
au peroxyde ou au periodate
Ta slovenski standard je istoveten z: prEN 14526
ICS:
67.050 Splošne preskusne in General methods of tests and
analizne metode za živilske analysis for food products
proizvode
67.120.30 Ribe in ribji proizvodi Fish and fishery products
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
DRAFT
EUROPEAN STANDARD
NORME EUROPÉENNE
EUROPÄISCHE NORM
November 2024
ICS 67.120.30 Will supersede EN 14526:2017
English Version
Foodstuffs - Determination of saxitoxin-group toxins in
shellfish - HPLC method using pre-column derivatization
with peroxide or periodate oxidation
Produits alimentaires - Détermination de la teneur en Lebensmittel - Bestimmung von Toxinen der
toxines du groupe de la saxitoxine dans les coquillages Saxitoxingruppe in Schalentieren - HPLC-Verfahren mit
- Méthode par CLHP avec dérivation pré-colonne et par Vorsäulenderivatisierung und Peroxid- oder
oxydation au peroxyde ou au periodate Periodatoxidation
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Contents Page
European foreword . 4
Introduction . 5
1 Scope . 6
2 Normative references . 7
3 Terms and definitions . 7
4 Principle . 7
5 Reagents . 10
6 Apparatus . 14
7 Procedure . 15
7.1 Sample preparation . 15
7.2 Extraction procedure . 15
7.3 Sample purification . 16
7.3.1 SPE-C18 clean-up . 16
7.3.2 SPE-COOH clean-up (fractionation). 16
7.3.3 Alternative weak cation exchange SPE clean-up [2], [11] . 17
7.4 Conversion of GTX6 into NEO and/or C3,4 into GTX1,4 . 18
7.4.1 General. 18
7.4.2 Hydrolysis of SPE-COOH Fraction 1 or 2 . 18
7.5 Oxidation procedure . 18
7.5.1 General. 18
7.5.2 Periodate oxidation . 18
7.5.3 Peroxide oxidation . 19
8 HPLC determination . 20
9 Calibration curve . 22
10 Identification . 22
11 Calculation . 22
11.1 General. 22
11.2 Toxin calculation . 23
11.2.1 General. 23
11.2.2 Calculation method with standard calibration curve . 23
11.3 Calculation of NEO in the presence of dcSTX [4], [5] . 23
11.3.1 General. 23
11.3.2 Method 1 . 24
11.3.3 Method 2 . 25
11.3.4 Method 3 . 26
11.4 Calculation of GTX6 . 26
11.5 Calculation of C3,4 . 26
11.6 Calculation of dcNEO in the presence of dcSTX . 27
11.6.1 General. 27
11.6.2 Method 4 . 28
11.6.3 Method 5 . 28
11.7 Calculation of GTX1,4 in the presence of GTX2,3 and dcGTX2,3 . 29
11.7.1 General . 29
11.7.2 Method 6 . 30
11.8 Calculation of NEO in the presence of dcSTX, dcNEO and STX (optional) . 31
11.8.1 General . 31
11.8.2 Method 7 . 32
11.8.3 Method 8 . 33
11.9 Conversion to STX 2HCl equivalents . 34
12 Quality controls . 35
12.1 General . 35
12.2 Acceptance criteria series of analysis . 35
12.3 Overall recovery . 36
13 Precision . 36
14 Test report . 36
Annex A (informative) Precision data . 37
Annex B (informative) Chromatograms . 65
Bibliography . 69
European foreword
This document (prEN 14526:2024) has been prepared by Technical Committee CEN/TC 275 “Food
analysis – Horizontal methods”, the secretariat of which is held by DIN.
This document is currently submitted to the CEN Enquiry.
This document will supersede EN 14526:2017.
— new Figure 2 detailing a procedure for a large numbers of test samples added;
— mandatory Clause 3 Terms and definitions added;
— new Clause 12 specifying quality controls added;
— new Annex B with example chromatograms added.
Introduction
Paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins are derivatives of saxitoxin. These toxins have been detected in
filter-feeding bivalve molluscs in various parts of the world. Paralytic shellfish poisoning is characterized
by symptoms varying from slight tingling sensation or numbness around the lips to fatal respiratory
paralysis. This document describes an analytical method for the quantification of these PSP toxins by
extraction from shellfish tissue followed by several clean-up steps and a separation by high performance
liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection (FLD).
WARNING — The use of this document can involve hazardous materials, operations and equipment. This
document does not purport to address all the
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.